基于水解探針法的快速檢測地中海貧血罕見缺失型的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于水解探針法的快速檢測地中海 貧血罕見缺失型的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血也稱珠蛋白合成障礙性貧血，簡稱地貧。地中海貧血是廣西地區(qū)最常 見的單基因遺傳疾病之一，常見的地貧種類有a-地貧和0-地貧。中國人群中，a-地貧 的基因型常見的為缺失型一SE\-a17和-a4^2。申請人在日常檢測中發(fā)現(xiàn)a地貧中的泰國 型缺失（一THAI)W及0地貧中的HPFH-SEA和中國型缺失（G丫+ (A丫 5 0)0，簡寫為DBT)在 相對罕見的缺失型地貧中占有較高的比例，而運(yùn)些地貧等位基因并未在常規(guī)地貧檢測試劑 盒W內(nèi)。為了避免運(yùn)些罕見等位基因的漏篩，需要建立一種可W快速診斷一THAI、HPFH-SEA 和DBT等位基因的檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于水解探針法的快速檢測地中海貧血罕 見缺失型的試劑盒。采用該試劑盒可W實(shí)現(xiàn)該試劑盒可W實(shí)現(xiàn)單管單次反應(yīng)完成一THAI、 HPFH-SEA和DBT運(yùn)3種罕見缺失型地中海貧血等位基因的檢測，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定 性和準(zhǔn)確性，W及較高的特異性。
[0004] 本發(fā)明所述的基于水解探針法的快速檢測地中海貧血罕見缺失型的試劑盒，包括 擴(kuò)增引物和巧光探針，其特征在于：
[0005] 所述的擴(kuò)增引物為：一對擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的 引物THAI-F和THAI-R，一對擴(kuò)增0 -珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和 HPFH-R，一對擴(kuò)增0 -珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R，W及一對擴(kuò)增 a-珠蛋白基因簇中a1區(qū)段等位基因的引物Al-F和Al-R; 陽006] 所述的巧光探針為：一條特異性檢測THAI-F和THAI-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針 THAI-Prob, -條特異性檢測HPFH-F和HPFH-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針HPFH-Prob, -條特異性 檢測DBT-F和DBT-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針DBT-Prob,W及一條特異性檢測Al-F和Al-R擴(kuò) 增產(chǎn)物的巧光探針Al-Prob;
[0007]其中： 陽00引擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R為：
[0009] THAI-F :5' -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3' ；
[0010] THAI-R :5,-CTTGGATCTGCACCTCTG-3,；
[0011] 擴(kuò)增0 -珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R為：
[0012] HPFH-F :5' -TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3,；
[0013] HPFH-R :5'-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3,；
[0014] 擴(kuò)增e-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R為：
[0015] DBT-F:5' -GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3,；
[0016] DBT-R:5,-ACCACATCCCTAACACAAC-3,；
[0017] 擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中Ql區(qū)段等位基因的引物Al-F和Al-R為： 陽0化]Al-F:5, -GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3,；
[0019] Al-R:5,-CACGTTTGCTGAGGGAAA-3,；
[0020] 所述特異性檢測THAI-F和THAI-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針THAI-Prob為：
[0021] THAI-Prob:5, -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-B冊-2-3,；
[0022] 所述特異性檢測HPFH-F和HPFH-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針HPFH-Prob為：
[0023] HPFH-Prob:5' -6-FAM-TGTTTGCCTGCTTTAAGTTCCAGACCT-B冊-2-3';
[0024] 所述的特異性檢測DBT-F和DBT-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針DBT-Prob為： 陽0巧]DBT-Prob:5, -ROX-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-B冊-2-3,；
[0026] 所述的特異性檢測Al-F和Al-R擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光探針Al-Prob為：
[0027] Al-Prob: 5，-HEX-ACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTA-B冊-2-3，。
[0028] 本發(fā)明所述的巧光探針中，F(xiàn)AM指簇基巧光素，肥X指六氯-6-甲基巧光素，ROX指 簇基-X-羅丹明，CY5是指花青染料分子5,B冊-2是指巧光澤滅基團(tuán)。
[0029] 本發(fā)明所述的試劑盒，還包括一些現(xiàn)有試劑盒中常規(guī)且必須的組分，如緩沖液、酶 液、MgClz和dNTP。具體地，酶液為Taq聚合酶體系，包括可用于水解探針法的熱啟動酶體 系等；所述緩沖液為常規(guī)的PCR緩沖液。當(dāng)酶液選擇采用康為世紀(jì)所生產(chǎn)的GoldStarTaq DNAPolymerase時，緩沖液則優(yōu)選為與GoldStarTaqDNAPolymerase配套的緩沖液。
[0030] 采用上述試劑盒快速檢測一THAI、HP即-SEA和DBT的方法，包括W下步驟： 陽03U 1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板； 陽〇3引。配制反應(yīng)體系，具體為：
[0033] 將引物THAI-F、THAI-R、HPFH-F、HPFH-R、DBT-F、DBT-R、Al-F和A1-R，探針 THAI-Prob、HPFH-Prob、DBT-Prob和Al-Prob;W及PCR緩沖液、酶液、MgC12、dNTP、水和DNA 模板配制成反應(yīng)體系；
[0034] 3)樣本檢測：分別將配制的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的巧 光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)Cq(Cq值的大小可W反映所檢測模板數(shù)的多 少）；
[0035] 4)數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定：根據(jù)實(shí)時巧光定量PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結(jié) 果；內(nèi)參基因?yàn)锳l,若肥X通道顯示有Cq值，則代表該樣本正常擴(kuò)增。具體判定如下：
[0036] 在肥X通道顯示有Cq值前提下，當(dāng)CY5通道有Cq值讀數(shù)時，則表示該樣本攜 帶-THAI等位基因.
[0037] 在肥X通道顯示有Cq值前提下，當(dāng)FAM通道有Cq值讀數(shù)時，則表示該樣本攜帶 HPFH-SEA等位基因；
[0038] 在肥X通道顯示有Cq值前提下，當(dāng)ROX通道有讀數(shù)時，則表示該樣本攜帶DBT等 位基因； W39] 僅有肥X通道顯示有Cq值，其余通道無Cq值，則表示該樣本不攜帶一THAI、 HPFH-SEA和DBT等位基因；
[0040] 在極少數(shù)基因型的情況下Al是沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的，如基因型等，運(yùn)需要再進(jìn) 一步地分析。
[0041] 上述方法的步驟2)中，反應(yīng)體系中各組分的濃度優(yōu)選為：待檢測DNA:1~化g/ 化；各引物：〇. 3~0. 5ymol/L;各巧光探針濃度為0. 3~0. 5ymol/L;DNA模板：20~ 2(K)ng;儀離子：1. 5~1. 9mmol/L;反應(yīng)體系的終體積優(yōu)選為20yL。 陽0創(chuàng)上述方法的步驟3)中，PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性8~12分鐘，然后95°C15~ 30秒，60°C退火50~70秒，39~49個循環(huán)，于60°C退火步驟末采集巧光信號。
[0043]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)在于： W44] 1、本發(fā)明所述試劑盒可W實(shí)現(xiàn)單管單次反應(yīng)完成一THAI、HPFH-SEA和DBT運(yùn)3種 罕見缺失型地中海貧血等位基因的檢測，且具有高度的靈敏性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，W及較高 的特異性。
[0045] 2、本發(fā)明所述試劑盒基于溶解法進(jìn)行檢測時無需開管操作，極大限度地降低實(shí)驗(yàn) 室PCR產(chǎn)物污染的可能；另一方面，采用溶解曲線分析法，該方法是目前使用實(shí)時巧光定量 PCR儀中最廉價的實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建方法，成本更低也更易于推廣。
【附圖說明】
[0046] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中1#樣本的擴(kuò)增曲線；
[0047] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中2#樣本的擴(kuò)增曲線； W48] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中3#樣本的擴(kuò)增曲線； W例 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中4#樣本的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，W更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于W下實(shí)施例。
[0051] 實(shí)施例1 :采用本發(fā)明所述試劑盒在已知基因型樣本中的檢測結(jié)果
[0052] 1、試劑盒的組成：
[0053] (1)擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中一THAI等位基因的特征序列的引物對THAI-F和 THAI-R：
[0054] THAI-F:5, -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3'(SEQIDNO:1); 陽化5] THAI-R:5, -CTTGGATCTGCACCTCTG-3'（SEQIDNO:2);
[0056] (2)擴(kuò)增HPFH-SEA等位基因的特征序列的引物對HPFH-F和HPFH-R:
[0057] HPFH-F:5'-TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3'（SEQIDNO:3);
[0058] HPFH-R:5, -AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3,（SEQIDNO:4);
[0059] (3)擴(kuò)增0 -珠蛋白基因簇中DBT等位基因征序列的引物對DBT-F和DBT-R:
[0060] DBT-F:5, -GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3,（SEQIDNO:5);
[0061] DBT-R:5, -ACCACATCCCTAACACAAC-3,（SEQIDNO:6); 陽06引 （4)擴(kuò)增a-珠蛋白基因簇中a1等位基因區(qū)段特征序列的引物對Al-F和Al-R:
[0063] Al-F:5' -GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3'（沈QIDNO:7);
[0064] Al-R:5, -CACGTTTGCTGAGGGAAA-3'（SEQIDNO:8); 陽0化]所述aI等位基因區(qū)段特征序列為：
[0066] Ctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtg gccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaat aaa邑tct邑a邑t邑邑邑C邑邑Ca邑CCt邑t邑