鼠spata16基因多克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及一種鼠SPATA16基因多克隆抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] SPATA16基因是一個(gè)新基因，研究表明，其在小鼠精子發(fā)生過程中具有一定的功能 作用，因此，有必要對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種新的鼠SPATA16基因多克隆抗體及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明提供一種鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0005] a)用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQIDNO: 1所示的SPATA16基因和序列如SEQIDNO: 2 所示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒；
[0006] b)將SPATA16基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0007] c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異 性目的蛋白；
[0008] d)免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。
[0009] 所述步驟a)中，PCR擴(kuò)增時(shí)，SPATA16基因上游引物如SEQIDNO: 3所示，SPATA16 基因下游引物如SEQIDNO:4所示；pET32a質(zhì)粒上游引物如SEQIDNO: 5所示，pET32a質(zhì)粒 下游引物如SEQIDNO:6所示。
[0010] 所述步驟C)中，培養(yǎng)時(shí)，將含有所述重組質(zhì)粒的菌液加入到高壓滅菌的無抗生素 LB培養(yǎng)基中，并加入氨芐抗生素。
[0011] 所述步驟c)中，通過IPTG誘導(dǎo)。
[0012] 所述步驟c)中，利用裂解液進(jìn)行裂解，所述裂解液包括TrisHCl、NaCl和EDTA。
[0013] 所述步驟c)中，所述純化包括包涵體蛋白處理和梯度透析。
[0014] 一種鼠SPATA16基因多克隆抗體，所述抗體識(shí)別的蛋白序列如SEQIDN0:7所示。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：通過制備基因SPATA16的多克隆抗體，該抗體能夠特異性 識(shí)別目的蛋白，從而便于研究目的蛋白的表達(dá)和定位等。
【附圖說明】
[0016] 圖1是SPATA16克隆鑒定圖，其中，SPATA16截取片段大小為450bp;片段大小與 spatal6大小一致；
[0017] 圖2是NovagenIDA-Ni樹脂純化His-Spatal6_150aa蛋白純化后的電泳圖；
[0018] 圖3是SPATA16在不同小鼠辜丸細(xì)胞系中的表達(dá)特征圖，其中，1表TK小鼠辜丸總 蛋白；2表示TM4細(xì)胞系（小鼠睪丸支持細(xì)胞）；3表示CRL-2053細(xì)胞系（小鼠精原細(xì)胞）； 4表示CRL-2196細(xì)胞系（小鼠精母細(xì)胞）；
[0019] 圖4是SPATA16在293T的亞細(xì)胞定位圖；在293T細(xì)胞中，SPATA16主要定位在細(xì) 胞核中；
[0020] 圖5是SPATA16在小鼠睪丸組織中的亞細(xì)胞定位分析圖；在小鼠組織中，胞核中表 達(dá)信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于胞楽，表明SPATA16定位于小鼠睪丸組織細(xì)胞核；
[0021] 圖6是SPATA16-150aa抗體檢測mSPATA16亞細(xì)胞定位圖，其中，mSPATA16主要表 達(dá)于HEK293細(xì)胞的細(xì)胞核。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0023] 在一種實(shí)施方式中，鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法包括如下步驟：
[0024]a)用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQID NO: 1所示的SPATA16基因和序列如SEQID NO: 2 所示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒；其中，SPATA16基因序列是現(xiàn)有序列，其登錄信息是：NM_027583， 該基因的蛋白序列如SEQID N0:8所示，其登錄號(hào)是：NP_081859。
[0025]b)將SPATA16基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；連接時(shí)，可以采用T4 連接酶。
[0026]c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異 性目的蛋白。
[0027] d)免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。
[0028] 如圖1至圖6所示，在另一種實(shí)施方式中，鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法 包括如下步驟：
[0029] 1、通過不依賴連接酶的克隆方法（LIC)重組質(zhì)粒
[0030]a)設(shè)計(jì)質(zhì)粒pET32a以及基因SPATA16mRNA的引物，引物如表1所示：
[0031] 表1質(zhì)粒pET32a和基因SPATA16的合成引物
[0032]
[0033]b)通過PCR的方法擴(kuò)增目的片段SPATA16和表達(dá)質(zhì)粒pET32a(采用TAKARA公司 的PrimeSTARGXLDNAPolymerase)，GXL高保真PCR反應(yīng)體系如表2所示：
[0034]表2 :PCR反應(yīng)體系
[0035]

[0036]PCR反應(yīng)條件是：1. 98°C5min;2、98°CIOsec;3、6(TC15sec;4、68°C17min;5、2 ~ 4 循環(huán) 30 次；6、6(TCIOmin;7、12°C0/N(overnight，過夜）
[0037]PCR反應(yīng)體系中，dNTPMixture為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每種的濃 度均為2. 5mM
[0038]c)通過膠純化試劑盒純化所得SPATA16片段和pET32a表達(dá)載體。
[0039]d)T4DNA連接酶（TAKARAT4DNAPolymerase2040A)處理pET32a表達(dá)載體和 SPATA16 片段。
[0040] dl)每20ul反應(yīng)液加入0? 037pmol的pET32a表達(dá)載體；
[0041] d2)每20ul反應(yīng)液加入0. 12-0. 48pmol的膠回收純化產(chǎn)物；
[0042]d3)用T4連接酶處理pET32a表達(dá)載體與SPATA16片段，其反應(yīng)體系如表3所示；
[0043] 表3T4連接酶處理時(shí)的反應(yīng)體系
[0044]
[0045] d4)在 22°C條件下孵育 30min;
[0046]d5) 75°C孵育20min以滅活T4連接酶。
[0047]e)表達(dá)載體與目的片段連接
[0048]el)將樣品（表達(dá)載體和目的片段的混合液）離心處理；
[0049]e2)根據(jù)表達(dá)載體與目的片段的所得的濃度將兩者以1:1的拷貝數(shù)混合于一管；
[0050] e3)22°C孵育 5min;
[0051] e4)加 2. 5EDTA(25mM)并混勻；
[0052]e5)22°C孵育 5min;
[0053]e6)將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌。
[0054] 2、表達(dá)融合蛋白pET32a_SPATA16
[0055]a)挑選轉(zhuǎn)化后的單克隆于5MLLB培養(yǎng)基中，37°C，280rpm培養(yǎng)箱搖菌16h。
[0056]b)用500ML錐形瓶裝入100mL的無抗生素LB培養(yǎng)基，高壓滅菌。
[0057] c)將含有重組質(zhì)粒的Iml菌液加入到高壓滅菌的無抗生素LB培養(yǎng)基中，加入 IOOul濃度lOOug/ml的氨芐抗生素。
[0058]d) 37°C，280rpm搖菌兩小時(shí)45分鐘后，檢測其OD595~0? 6。
[0059]e)冰上冷卻15分鐘。
[0060] f)加入IPTG(原濃度24mg/ml，終濃度1/100)。
[0061]g)37°C，280rpm搖菌三小時(shí)。
[0062]h) 12000rpm，4°C，離心 30min。收集沉菌，稱凈重。
[0063]i)每Ig加入 2 ~5ml buffer W(K)OMm Tris HCl ph8.0,IOOmM NaCl，ImM EDTA)，吹 打混勻，于功率17%~20%超聲破碎，至懸液澄清為宜。
[0064] j)12000rpm，4°C，離心lOmin。收集上清液以及沉淀。
[0065] 3、包涵體蛋白處理：
[0066]a)配置8M的尿素（融于1XPBS)冰上預(yù)冷。
[0067]b)將超聲破碎后的沉菌融于8M尿素中，吹打混勻，4°C垂直旋轉(zhuǎn)8h~0/N。
[0068] c) 4°C，12000rcf離心15min，收集上清，上清即為可溶蛋白。
[0069]d)用兩倍體積的8M尿素加IOmM咪唑溶解可溶蛋白，加入預(yù)先準(zhǔn)備的帶特定標(biāo)簽 的beadz〇
[0070] 6)4。0搖晃1~211。
[0071] f) 1000 Orcf離心IOmin。
[0072]g)用預(yù)裝柱收集beadz。
[0073]h)用8M尿素配制300mM咪唑，將吸附在beadz的目的蛋白洗脫下來。
[0074] 4、梯度透析：
[0075]a)用IXPBS分別配制 7]?、611、511、4]\^1、011尿素，預(yù)冷。
[0076]b)組裝半透膜透析袋，將目的蛋白密封在透析袋中，分別從高濃度的尿素到底濃 度的尿素進(jìn)行透析，每一個(gè)濃度透析4~6h。
[0077]c)回收蛋白溶液，用超濾管進(jìn)行超濾濃縮。
[0078]d)最后將濃縮蛋白-80 C保持，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
[0079] 上述梯度透析和包涵體蛋白處理都用于純化蛋白。
[0080] 5、獲取特異性目的蛋白，皮下注射入兔子體內(nèi)。
[0081]a)配制I. 5mmSDS-PAGE蛋白膠若干塊。
[0082]b)將蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE跑膠分析。
[0083]c)配制2M KC1500ml，冰上孵育。
[0084]d)將蛋白膠完全浸泡入預(yù)先準(zhǔn)備好的冰鎮(zhèn)KCL溶液，搖床搖晃5min后，既能看到 在目的條帶大小附近有特異的白色條帶出現(xiàn)。確定為目的條帶后將其切害IJ，收集于4ml的 離心管中。
[0085]e)用400~500ulIXPBS溶解，攪拌器或勻漿器將切割下來的蛋白膠研磨成漿。
[0086]f)收集漿液。
[0087] g)用三通管注射器將漿液與佐劑以1:1的比例混勻。以見乳白色混勻液為宜。[0088] h)充分混勻后，收集混合液，注射入兔子體內(nèi)。每次2ml，每周一次，持續(xù)1.5個(gè)月。 兔子是新西蘭大白兔。
[0089] i)兩個(gè)月后，抽取兔子耳靜脈血。室溫過夜。提取血清即為該目的蛋白的多克隆 抗體。
[0090] j)用westernblot進(jìn)行抗體鑒定。
[0091] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā) 明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQ ID NO: 1所示的SPATA16基因和序列如SEQ ID NO: 2所 示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒； b) 將SPATA16基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒； c) 將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)菌中，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異 性目的蛋白； d) 免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。2. 如權(quán)利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步 驟a)中，PCR擴(kuò)增時(shí)，SPATA16基因上游引物如SEQ ID N0:3所示，SPATA16基因下游引物如 SEQ ID NO:4所示；pET32a質(zhì)粒上游引物如SEQ ID NO: 5所示，pET32a質(zhì)粒下游引物如SEQ ID NO:6 所示。3. 如權(quán)利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步 驟c)中，培養(yǎng)時(shí)，將含有所述重組質(zhì)粒的菌液加入到高壓滅菌的無抗生素LB培養(yǎng)基中，并 加入氨芐抗生素。4. 如權(quán)利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，通過IPTG誘導(dǎo)。5. 如權(quán)利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，利用裂解液進(jìn)行裂解，所述裂解液包括Tris HCl、NaCl和EDTA。6. 如權(quán)利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 c)中，所述純化包括包涵體蛋白處理和梯度透析。7. -種鼠SPATA16基因多克隆抗體，其特征在于，所述抗體識(shí)別的蛋白序列如SEQ ID NO:7所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鼠SPATA16基因多克隆抗體及其制備方法，包括步驟：a)用PCR方法擴(kuò)增序列如SEQ？ID？NO:1所示的SPATA16基因和序列如SEQ？ID？NO:2所示的pET32a表達(dá)質(zhì)粒；b)將SPATA16基因連接到pET32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒；c)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)、裂解和純化，得到特異性目的蛋白；d)免疫兔子后，采血，純化抗體血清，得到多克隆抗體。通過制備基因SPATA16的多克隆抗體，該抗體能夠特異性識(shí)別目的蛋白，從而便于研究目的蛋白的表達(dá)和定位等。
【IPC分類】C07K16/18, C07K16/06
【公開號(hào)】CN105085675
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410203598
【發(fā)明人】黃衛(wèi)人, 余州, 吳漢偉, 桂耀庭, 蔡志明
【申請(qǐng)人】深圳市第二人民醫(yī)院
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2014年5月14日