一種制劑、其制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及再生醫(yī)學和生物學技術領域，尤其設及一種制劑、其制備方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 外泌體（exosomes)是一種由真核細胞的多泡內(nèi)涵體(multivesicular bodies， MVBs)與細胞膜融合后釋放到細胞外環(huán)境中的納米量級的膜性小囊泡，可由多種類型細胞 分泌，其內(nèi)含有不同種類的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、microRNAsW及信號分子等具有生物學活 性的物質(zhì)，較易與鄰近細胞的細胞膜發(fā)生融合，將生物學活性物質(zhì)選擇性地遞送至受體細 胞，在不同細胞間進行信息傳遞，調(diào)節(jié)細胞間的信號傳導，發(fā)揮多種生物學功能。
[0003] 糖尿病患者因周圍神經(jīng)病變與外周血管疾病合并過高的機械壓力，可引起足部軟 組織及骨關節(jié)系統(tǒng)的破壞與崎形形成，進而引發(fā)一系列足部問題，從輕度的神經(jīng)癥狀到嚴 重的潰瘍、感染、血管疾病、Charcot關節(jié)病和神經(jīng)病變性骨折。對于糖尿病足的治療，一般 采用藥物或手術治療，更甚者采取截肢等手段，治療效果一般，且對病人產(chǎn)生的創(chuàng)傷較大， 糖尿病足的治療還采用足靜脈細胞注射，但在注射過程中細胞會隨血液而流失，起效時間 長，治療效果一般。
[0004] 現(xiàn)有研究已證明廝帶干細胞(MSC)分泌的外泌體在減少屯、肌損傷范圍、保護急性 腎小管損傷、促進神經(jīng)再生W及減少肺損傷等方面有重要作用。而對外泌體的生物特性與 功能機制的深入研究對認識并解決MSC應用中產(chǎn)生的問題有重要作用。并且，外泌體的應用 較之MSC直接應用更為安全，可W開啟非細胞治療的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的技術問題在于提供一種制劑，本申請?zhí)峁┑闹苿┛捎糜陬A防和/或 治療糖尿病足。
[0006] 有鑒于此，本申請?zhí)峁┝艘环N制劑，包括:外泌體、白蛋白與醫(yī)學上可接受的溶劑， 所述外泌體由廝帶干細胞依次經(jīng)過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和提取得到。
[0007] 優(yōu)選的，所述溶劑為生理鹽水。
[000引優(yōu)選的，所述外泌體為所述制劑的2vol %~5vol %，所述白蛋白為所述制劑的 0.5vol%~5vol%，所述生理鹽水為余量，所述外泌體的含量為lX106~lX107cells所提 取出來的外泌體總量。
[0009] 優(yōu)選的，所述外泌體的含量為5 X IO6Cells所提取出來的外泌體總量。
[0010] 優(yōu)選的，所述外泌體由所述廝帶干細胞傳代培養(yǎng)至3~5代后提取得到。
[00川本申請還提供了一種制劑的制備方法，包括W下步驟：
[0012] 在醫(yī)學上可接受的溶劑中加入白蛋白；
[0013] 在上述得到的溶液中加入外泌體;所述外泌體由廝帶干細胞依次經(jīng)過原代培養(yǎng)、 傳代培養(yǎng)和提取得到。
[0014] 優(yōu)選的，所述溶劑為生理鹽水。
[0015] 本申請還提供了上述方案所述的或上述方案所制備的所述的制備方法所制備的 制劑在預防和/或治療糖尿病足上的應用。
[0016] 本申請?zhí)峁┝艘环N制劑，其包括外泌體、白蛋白和生理鹽水，所述外泌體由廝帶干 細胞依次經(jīng)過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和提取得到。本申請所述制劑中的外泌體中含有多種活 性細胞因子，可刺激和促進足部的血管、神經(jīng)末梢的修復再生，改善足部營養(yǎng)和觸感的恢 復，從而使得潰爛的皮膚組織再生，因此對糖尿病足具有預防與治療作用。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明廝帶干細胞2代培養(yǎng)后不同放大倍數(shù)下的形貌照片；
[0018] 圖2為本發(fā)明外泌體不同放大倍數(shù)下的形貌照片；
[0019] 圖3為本發(fā)明廝帶干細胞對照組流式檢測圖；
[0020] 圖4為本發(fā)明廝帶干細胞樣品組流式檢測圖。
【具體實施方式】
[0021] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是 應當理解，運些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權利要求的 限制。
[0022] 本發(fā)明實施例公開了一種制劑，其包括:外泌體、白蛋白與醫(yī)學上可接受的溶劑， 所述外泌體由廝帶干細胞依次經(jīng)過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和提取得到。
[0023] 本申請所述制劑包括外泌體、白蛋白與醫(yī)學上可接受的溶劑，本申請所述制劑中 由于包含外泌體，因此其可用于預防和/或治療糖尿病足。
[0024] 按照本發(fā)明，所述外泌體是由廝帶干細胞依次經(jīng)過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)與提取制 備得到。所述廝帶干細胞的原代培養(yǎng)按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述廝帶干細 胞經(jīng)過原代培養(yǎng)后進行傳代培養(yǎng)，所述傳代培養(yǎng)的方式為本領域技術人員熟知的，本申請 不進行特別的限制。作為優(yōu)選方案，本申請所采用的廝帶干細胞均為P2~P5代。所述廝帶干 細胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后進行提取，得到外泌體。本申請所述外泌體的提取優(yōu)選按照 invitrogen試劑盒說明書提取。廝帶干細胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后提取，得到了外泌體。將所述外 泌體進行保存W備用。
[0025] 本申請?zhí)峁┑闹苿ㄍ饷隗w、白蛋白與醫(yī)學上可接受的溶劑。由于本申請?zhí)峁?的制劑用于治療糖尿病足，所述制劑的溶劑優(yōu)選為生理鹽水。在所述制劑中，所述外泌體為 優(yōu)選為所述制劑體積濃度的2%~5%，更優(yōu)選為2.5%~4.5%，具體的，所述外泌體的含量 為所述制劑體積濃度的2.5%、3%、3.2%、3.5%、4%、4.3%或4.5%。本申請所述外泌體的 含量為1 X IO6~1 X IO7廝帶干細胞所提取出來的外泌體總量，優(yōu)選為5 X IO6~1 X IO7廝帶 干細胞所提取出來的外泌體總量。本領域技術人員熟知的，臨床應用外泌體時，不會計算外 泌體的具體數(shù)量，只對提取外泌體的細胞數(shù)目進行控制，運是由于用于提取外泌體的培養(yǎng) 基都是基礎培養(yǎng)基，其不含血清等營養(yǎng)物質(zhì)，目的就是為了讓細胞不再分裂增殖，使細胞 "同步化"；在營養(yǎng)相對缺少的微環(huán)境下，干細胞自身會分泌很多的活性因子到胞外，即外泌 體。所W，當細胞性質(zhì)一致時，同種類型、相同數(shù)量的細胞分泌的外泌體的數(shù)量差異不大。
[0026] 所述白蛋白為本領域技術人員熟知的人血白蛋白，其為市售產(chǎn)品或按照現(xiàn)有已知 的方法提取得到。本申請所述白蛋白優(yōu)選為所述制劑總體積濃度的0.5%~5%，更優(yōu)選為 1 %~4%，具體的所述白蛋白的含量為所述制劑體積濃度的1%、1.2%、1.5%、1.8、2%、 2.5%、2.8%、3%、3.2%、3.5%、3.8%或4%。如果人血白蛋白的濃度過大，制劑進入到人 體組織中，會產(chǎn)生較大的滲透壓，足部會形成局部水腫；如果人血白蛋白的濃度過小，不利 于組織的愈合修復。
[0027] 本申請還提供了所述制劑的制備方法，包括W下步驟：
[0028] 在醫(yī)學上可接受的溶劑中加入白蛋白；
[0029] 在上述得到的溶液中加入外泌體。
[0030] 在制備所述制劑的過程中，將保存的外泌體取出，在4°C環(huán)境中溶解。本申請所述 制劑的溶劑優(yōu)選為生理鹽水。
[0031] 按照本發(fā)明，首先在生理鹽水中添加人血白蛋白，配制含有人血白蛋白的生理鹽 水，然后再含有人血白蛋白的生理鹽水中添加外泌體，得到制劑。本申請所述制劑的劑型為 本領域技術人員熟知的，對此本申請不進行特別的限制。
[0032] 本申請?zhí)峁┝艘环N制劑，其包括外泌體、白蛋白與醫(yī)學可接受的溶劑。本申請采用 干細胞外泌體進行組織注射，其可避免血液流動而造成外泌體的損失，外泌體可直接修復 損傷組織，增強未損傷組織的抵抗能力，大大縮短組織的修復時間上。同時外泌體制劑不具 有免疫原性，可適用于任何個體，在提取后可長時間保存，在應用時制劑制備更為方便，避 免了細胞治療方案需要重新培養(yǎng)細胞等的操作。
[0033] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明提供的制劑及其應用進行詳細 說明，本發(fā)明的保護范圍不受W下實施例的限制。
[0034] 實施例1
[0035] 1)廝帶干細胞原代培養(yǎng)