一種篩選人類egfr基因多態(tài)性的引物組、試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及由等位基因特異性擴增(ASA)、重組酶聚合酶擴增 (RPA)、肽核酸(PNA)結(jié)合DNA技術(shù)以及SYBR GreenI顯色組合而成的一種快速且準(zhǔn)確篩選人 類EGFR基因多態(tài)性(單個核苷酸多態(tài)性和基因缺失）的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 快速、準(zhǔn)確并且簡便的基因多態(tài)性篩查方法一直受到廣泛的重視。人類基因組是 一個十分穩(wěn)定的體系，不同的民族、群體和個體都有46條染色體，有相同數(shù)目的基因和基因 分布，也有基本相同的核苷酸序列。正是基因組結(jié)構(gòu)的這種穩(wěn)定性保證了人類作為一個物 種的共同性和穩(wěn)定性，也決定了目前基因組測定是有意義的，即有代表性的。
[0003] 然而人類基因組又是一個變異的體系。在長期進化的過程中，基因組的DNA序列不 斷地發(fā)生變異。這些變異可能是有害的、有益的或中性的，它們其中的一些被保存下來，導(dǎo) 致了不同種族、群體和個體間基因組的差異或多態(tài)性。除了同卵雙生子外，沒有兩個個體的 基因組是完全相同的。
[0004] 表皮生長因子受體(EGFR)的基因多態(tài)性通常是發(fā)生在19號染色體缺失（E746-A750)和21號染色體L858R點突變(最普遍的單個核苷酸多態(tài)性），到目前為止，基于聚合酶 鏈反應(yīng)(PCR)擴增DNA的測序技術(shù)已成為一個標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，然而，由于該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)需要大型的 設(shè)備和復(fù)雜的實驗步驟，包括熱循環(huán)設(shè)備和DNA測序設(shè)備等，目前的分子篩選方法仍然大大 阻礙該基因多態(tài)性檢測的效果。
[0005] 目前，等溫酶擴增DNA系統(tǒng)包括基于核酸序列的擴增，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP)，滾 環(huán)擴增和解旋酶依賴性擴增。最近，智能擴增方法(SMAP)被開發(fā)用于篩選EGFR多態(tài)性，但其 復(fù)雜的引物設(shè)計，大型設(shè)備和對操作人員的專業(yè)性高要求是其操作缺點。與此相反，重組酶 聚合酶擴增(RPA)是一種較為先進的DNA擴增方法，反應(yīng)溫度為37°C，引物設(shè)計簡便，并具有 更快的擴增速度，能得到大量產(chǎn)物。此外，通過ATP水解作用來促進鏈置換擴增使基因擴增 方法變得更為有趣和實用。RPA可以適用于擴增不同的DNA和RNA，隨著等溫擴增核酸新技術(shù) 的逐漸產(chǎn)生，重組酶聚合酶擴增以其極快的擴增速度備受矚目。
[0006] 重組酶聚合酶擴增(RPA)最突出的特點是利用重組酶與引物寡DNA的結(jié)合，尋找到 目的序列，在單鏈結(jié)合等蛋白作用下低溫（36-40°C)打開雙鏈DNA，具有高特異性、高敏感 性，能夠快速產(chǎn)出目的DNA片段。遺憾的是，RPA擴增方法還沒有被用于快速篩選人類基因 多態(tài)性。并且，在單個核苷酸多態(tài)性的篩選中更是需要大型、精密的儀器或者高端科學(xué)及人 才。目前基因多態(tài)性的篩選都還停留在以實時定量PCR為基礎(chǔ)的方法中，而且并不能普及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種實用可靠的篩選基因多態(tài)性的引物 組、其試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明在特異性、敏感性、簡便性和即時篩選等方面都具有很 大優(yōu)勢。本發(fā)明是基于等位基因特異性擴增(ASA)，重組酶聚合酶擴增(RPA)，肽核酸(PNA)， 和SYBR Green I染料，即AS-RPA-PNA-SYBR(ARPS)系統(tǒng)的基因篩選新方法，目的是識別EGFR 基因多態(tài)性，這可用于對EGFR多態(tài)性的篩選。該系統(tǒng)中的ASA/AS理論，RPA擴增，PNA和SYBR Green的結(jié)合，不需要任何大型設(shè)備，或側(cè)流篩選試紙等的精密試劑。只需要用本試劑盒中 已設(shè)計好的引物組和擴增緩沖液，即可進行篩選檢測。預(yù)計這種方法將是未來篩選基因多 態(tài)性，與基因篩查發(fā)展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速篩選方法。
[0008] 本發(fā)明組合運用了等位基因特異性擴增(ASA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、肽核酸 (PNA)結(jié)合DNA和SYBR GreenI顯色四種分子生物學(xué)方法。以EGFR多態(tài)性為篩選對象，進行基 因多態(tài)性篩選方法的研究。
[0009] 在本發(fā)明的引物篩選方面，重組酶聚合酶擴增引物的設(shè)計要求是
[0010] (1)引物長度在30-40個堿基內(nèi)
[0011] (2)擴增片段長度最好在150-300個堿基內(nèi)
[0012] (3)引物的3'端避開第三位密碼子(正向和反向引物最好都避免）
[0013] (4)PNA的設(shè)計以PNA與非靶序列結(jié)合的Tm值(熔解溫度，主要由PNA的長度和堿基 序列決定)和設(shè)計的PNA片段的特異性(不與其他序列結(jié)合)為標(biāo)準(zhǔn)。
[0014] 根據(jù)上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明所述的篩選人類EGFR基因多態(tài)性的引物組，其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1~2或者SEQ ID N0.3~5所示。
[0015] 本發(fā)明還設(shè)計一種篩選人類EGFR基因多態(tài)性的試劑盒，其包括上文所述的引物組 之外，還包括檢測試劑，即：核苷酸序列為SEQ ID NO. 1~2和/或者SEQ ID N0.3~5所示的 引物，重泡脹緩沖液、醋酸鎂溶液、SYBR GreenI溶液及含有凍干擴增酶的EP管。
[0016] 此外，在上文所述的試劑盒中，還可以包括記載檢測待測樣品方法的說明書。
[0017] 同時，上文所述的試劑盒中，還可以包括陽性質(zhì)控DNA:濃度為150ng/2yL的HCC-827細胞系DNA;陰性質(zhì)控DNA:濃度為150ng/2yL的A549細胞系DNA。
[0018] 在檢測篩選15個堿基缺失的EGFR19Del(2)多態(tài)性中，不需要利用PNA-DNA抑制背 景擴增，即只需要利用等位基因特異性重組酶擴增技術(shù)即可;在檢測篩選單個核苷酸多態(tài) 性如EGFRL858R多態(tài)性中，由于重組酶擴增速度非?？?，需要預(yù)先利用PNA與樣本DNA中非點 多態(tài)性的片段結(jié)合，使其形成的PNA-DNA復(fù)合體在36-40°CRPA擴增中不會因為單鏈結(jié)合蛋 白等因素而分開，使聚合酶不能識別并打開PNA-DNA復(fù)合物以抑制非特異性擴增。而SYBR也 不能識別PNA，所以不必擔(dān)心因為PNA而產(chǎn)生假陽性結(jié)果(應(yīng)為陰性黃色結(jié)果而顯綠色）。
[0019]利用上文所述的篩選人類EGFR基因（15個堿基缺失的EGFR19De 1⑵）多態(tài)性的引 物組SEQ ID NO. 1~2的檢測方法，其操作步驟包括：
[0020] 將12yL雙蒸水、2yL的濃度為10μΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的濃度為10μΜ的反 向引物SEQ ID N0.2、2yL的濃度為150ng/yL的樣本DNA和29.5yL重泡脹緩沖液 (rehydration buffer)加入到含有凍干擴增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的EP管中，混勾后 再向其中加入2.5yL濃度為280mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少5min，再按照每20yL產(chǎn)物應(yīng) 用1 yL的比例，加入濃度為200X的SYBR Green I。優(yōu)選的情況下，應(yīng)用上述檢測方法的時候， 除了樣本DNA外，還可以包括對陽性質(zhì)控DNA和陰性質(zhì)控DNA的檢測，且更為優(yōu)選的擴增時間 為15min〇
[0021] 利用上文所述的篩選人類EGFR基因（EGFRL858R)多態(tài)性的引物組SEQ ID NO. 3~5 的檢測方法，其操作步驟包括：
[0022] 將 10yL雙蒸水、2yL的濃度為20μΜ的PNA SEQ ID Ν0.5、2μΙ^?度為 150ng/yL的樣本 DNA，預(yù)先進行99°C解鏈2min，66°C結(jié)合2min，再加入2yL的濃度為ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID NO. 3、2yL的濃度為ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO. 4，和29.5yL重泡脹緩沖液加入到含有凍干 擴增酶的E P管中，混勻后再向其中加入2.5 μ L濃度為2 8 0mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少 lOmin后獲得擴增產(chǎn)物，再按照每20yL擴增產(chǎn)物應(yīng)用lyL的比例，加入濃度為200X的SYBR GreenI〇
[0023] 優(yōu)選的情況下，應(yīng)用上述檢測方法的時候，除了樣本DNA外，還可以包括對陽性質(zhì) 控DNA和陰性質(zhì)控DNA的檢測，且更為優(yōu)選的擴增時間為15min。
[0024] 為了進一步驗證采用SYBR GreenI顯色結(jié)果是否準(zhǔn)確，可以輔以瓊脂糖凝膠電泳 檢測的方法進行驗證，即：將利用上述方法擴增15min后獲得的擴增產(chǎn)物中取出30yL加入 100yL無水乙醇后12000rpm/min，離心5min，去除液體純化RPA擴增產(chǎn)物(此步驟目的為去除 擴增緩沖液，便于瓊脂糖凝膠電泳的檢測）后，再加入30yL雙蒸水，最后進行瓊脂糖凝膠電 泳檢測條帶結(jié)果。
[0025]利用上文所述的試劑盒及試劑盒的使用方法篩選組織標(biāo)本時?？梢砸躁栃再|(zhì)控 DNA和陰性質(zhì)控DNA為對照品，白色背景為篩選環(huán)境，篩選冰凍組織樣本中基因多態(tài)性情況。 混勻SYBR顯色劑之后，結(jié)果顯示陽性質(zhì)控DNA產(chǎn)生肉眼可見的綠色熒光并且陰性質(zhì)控DNA顯 示黃色，表明本實驗結(jié)果可靠，樣品DNA的陽性結(jié)果為肉眼可見的綠色熒光，陰性結(jié)果為不 變的黃色(不變色）。
[0026]本發(fā)明另一目的在于，利用上文所述的引物組在制備篩選人類EGFR基因多態(tài)性的 檢測試劑中的應(yīng)用。
[0027]有益效果
[0028]本發(fā)明方法利用RPA極為快速的擴增技術(shù)，并結(jié)合ASA特異性方法可在最短5min內(nèi) (樣本中無干擾組織的理想情況下)篩選出EGFR19Del多態(tài)性。
[0029]本發(fā)明方法將PNA預(yù)先與模板DNA結(jié)合，然后利用RPA極為快速的擴增技術(shù)，并結(jié)合 ASA特異性擴增方法可在最短1 Omin內(nèi)（樣本中無干擾組織的理想情況下）篩選出EGFRL858R 點多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)RPA主要擴增酶gp32和Bsu無法區(qū)別多態(tài)性與正常樣本DNA(結(jié)果顯色均為陽 性），但是擴增酶無法打開預(yù)先與非多態(tài)性DNA結(jié)合的PNA-DNA復(fù)合物，從而RPA擴增反應(yīng)無 法擴