栝樓仁二醇降低dna甲基轉移酶表達水平的新功能的制作方法
【技術領域】
[0001] 本申請屬于藥材活性成分新功能的技術領域，尤其設及于一種分離于中藥材瓜萎 子的活性成分可降低海馬神經(jīng)元DNMT1基因表達水平的新功能。
【背景技術】
[0002] DNA甲基轉移酶1，即面MT1，是一種催化DNA胞喀晚甲基化的關鍵酶。DNA甲基化是 生命體感受外界輸入信號、調控結構基因表達的重要修飾手段，是表觀遺傳學的主要范疇 之一。m#Tl在維持DNA甲基化特征及DNA的復制修復方面都有重要的作用。在不同的生理病 理背景下，DNMT1表達量的改變指示著目標基因的整體改變，體現(xiàn)出機體整體上的適應性或 損傷性變化。
[0003] 瓜萎子為葫蘆科植物括樓Trichosanrhes kirilowii Maxim.或雙邊括樓 T虹chosanrhes rosthornii化rms的干燥成熟種子。前者主產山東長清、肥城等地，河北、 山西、陜西、江蘇等地均產。后者分布于四川、貴州、云南、廣西、廣東等地。瓜萎子是一種重 要的中藥藥材，具有潤肺化疲、滑腸通便之功效，常用于燥咳疲勃，腸燥便秘。瓜萎子主要含 有油脂、醬醇、Ξ祗等成分，其中括樓仁二醇是最早得到分離鑒定的一種Ξ祗化合物。研究 表明，瓜萎子在抗屯、腦血管疾病、抗炎癥、抗腫瘤及延緩衰老等方面都存在有益效果。但瓜 萎子活性成分，尤其是括樓仁二醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能作用目前尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 瓜萎子為常用中藥材，其購自安徽省中醫(yī)院藥房。括樓仁二醇標準品購自上海生 工有限公司。
[0005] 瓜萎子活性成分的分離過程為：
[0006] 取瓜萎子樣品20g，置于150ml平底燒瓶中，加入5%氨氧化鐘甲醇溶液100ml，稱 定重量，置75°C恒溫水浴中加熱回流化，冷卻至室溫后加5%氨氧化鐘甲醇溶液補足至反 應前的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液50ml,減壓回收至干。W蒸饋水100ml溶解轉移至 分液漏斗中，W水飽和的乙酸乙醋提取4次(40 ml X 1，30 ml X 3)，合并乙酸乙醋液。 乙酸乙醋層W蒸饋水洗涂，洗至下層水液pH為中性，用適量無水硫酸鋼干燥過夜。濾過， 濾液減壓回收至干，用甲醇溶解轉移至10ml容量瓶中定容。所獲得的液體成分利用HPLC進 行分析，并與括樓仁二醇標準品的流出峰進行比較。HPLC的條件為:樣品吸取2 ml進樣，甲 醇：1111〇1/1氨水(85:15)洗脫，每2111111收集一份，收集20份后，改用甲醇：1111〇1/1(90:10)洗 脫，每2 min收集一份。經(jīng)比較，瓜萎子活性成分含有括樓仁二醇。所購得括樓仁二醇的分子 式為：
。因此，我們w括樓仁二醇標準品作 為研究對象來進行后續(xù)的神經(jīng)系統(tǒng)功能試驗。
[0007]括樓仁二醇的生理活性檢測：
[000引將出生2地內的SD大鼠處死并取海馬組織原代培養(yǎng)。將海馬組織放在200目篩網(wǎng) 上，用眼科剪剪小塊過篩，經(jīng)過1000巧m離屯、8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培養(yǎng)基并加入 10%胎牛血清，己氏管吹打后種6孔板。培養(yǎng)條件為37°C 5%水平的二氧化碳。每隔Ξ天更換 培養(yǎng)基。在培養(yǎng)至第7天時，向其中Ξ孔的原代培養(yǎng)細胞加入終濃度為50 μΜ的括樓仁二醇， 另外Ξ孔加入同樣體積的無菌水作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)至14天時，回收細胞。使用本領域常 規(guī)的技術手段提取細胞中總mRNA、反轉錄為cDNA，并使用切cle480(Roche)巧光定量PCR儀 (使用SybrGreen染料)對面MT1的表達量進行定量分析。所使用的PCR條件為:95°C預變性 5min，然后是95°C 10s，60°C 10s，72°C 30s擴增共40個循環(huán)。所使用的引物為：上游 agtcaagacccttctaaata;下游ccgaggcttgggcctggatc。所獲得的定量數(shù)值為DNMT1 表達量 與內參基因 β-actin的相對比值。
[0009] 實驗組和對照組所獲得的mRNA相對定量結果如圖1所示。
[0010] 從圖1中可W看出，經(jīng)過括樓仁二醇的處理，D醒T1基因的表達量有所下降，其表達 量為對照組的0.86倍。
[0011] 本申請首次證明了瓜萎子活性成分括樓仁二醇對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)表觀遺傳學 機制的調控作用，該結果意味著括樓仁二醇可W對神經(jīng)系統(tǒng)施加全局性的影響，有利于進 一步探討該活性物質對機體情感、記憶、運動等能力的影響。
【附圖說明】
[0012]圖1括樓仁二醇的添加導致大鼠海馬區(qū)DNMT1 mRNA表達水平的變化。
[0013] Con化〇1指對照組；substances ' addition指括樓仁二醇處理組；縱坐標為相對 mRNA水平。
【具體實施方式】
[0014]
[00巧]實施例1
[0016]括樓仁二醇的生理活性檢測過程為：
[0017] 將出生24h內的SD大鼠處死并取海馬組織原代培養(yǎng)。將海馬組織放在200目篩網(wǎng) 上，用眼科剪剪小塊過篩，經(jīng)過1000巧m離屯、8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培養(yǎng)基并加入 10%胎牛血清，己氏管吹打后種6孔板。培養(yǎng)條件為37°C 5%水平的二氧化碳。每隔Ξ天更換 培養(yǎng)基。在培養(yǎng)至第7天時，向其中Ξ孔的原代培養(yǎng)細胞加入終濃度為50 μΜ的括樓仁二醇， 另外Ξ孔加入同樣體積的無菌水作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)至14天時，回收細胞。使用本領域常 規(guī)的技術手段提取細胞中總mRNA、反轉錄為cDNA，并使用切cle480(Roche)巧光定量PCR儀 (使用SybrGreen染料)對面MT1的表達量進行定量分析。所使用的PCR條件為:95°C預變性 5min，然后是95°C 10s，60°C 10s，72°C 30s擴增共40個循環(huán)。所使用的引物為：上游 agtcaagacccttctaaata;下游ccgaggcttgggcctggatc。所獲得的定量數(shù)值為DNMT1 表達量 與內參基因 β-actin的相對比值。
【主權項】
1. 一種分離于瓜蔞子的活性成分，其特征在于，其分子化學本質為栝樓仁二醇。2. -種栝樓仁二醇的新功能，其特征在于，該成分的加入可促使大鼠海馬原代培養(yǎng)神 經(jīng)元的DNA甲基轉移酶1基因·ΜΤ1減量表達，與對照組相比，·ΜΤ1的mRNA水平減少為對照 組的0.86倍。
【專利摘要】栝樓仁二醇是來自于中藥材瓜蔞子的重要活性成分。本申請介紹栝樓仁二醇的一種新功能，通過其對大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元的作用實驗，我們發(fā)現(xiàn)栝樓仁二醇的加入能夠降低<i>DNMT1</i>基因的表達水平。DNMT1是造成DNA甲基化的關鍵酶，而DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，其變化表征神經(jīng)系統(tǒng)對栝樓仁二醇做出了全局性的應激反應，表明栝樓仁二醇對神經(jīng)系統(tǒng)的活動具有顯著的調節(jié)作用。
【IPC分類】C07J63/00, A61P25/00, A61K36/428, A61K31/56
【公開號】CN105596352
【申請?zhí)枴緾N201610042949
【發(fā)明人】徐毅
【申請人】徐毅
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月22日