179, 391，Leach等，2007年2月20日公開；美國專利號 7, 992, 725, Leach 等，2011 年 8 月 9 日公開；美國專利號 7, 806, 276, Leach 等，2010 年 10 月5日公開；和美國專利號8,048,297，Leach等，2011年11月1日公開。諸如GPS?血 小板濃縮系統(tǒng)的裝置市售獲自巴奧米特公司（美國印第安納州華沙），能用于分離脂肪細(xì) 胞。例如，可用于在步驟610和615分級分離BM的分離器和方法還描述于美國申請公開 號2006/0278588, Woodell-May, 2006年12月14日公開。根據(jù)各種實施方式，BMA可在步 驟610中置于分離器內(nèi)。一旦BM置于分離器內(nèi)，選定部分的BM可在步驟615中與BM 分咼。
[0128] 一旦BMA置于分離器內(nèi)，分離器在離心機(jī)中以約1,000-約8, 000RPM范圍旋轉(zhuǎn)。這 對分離器和BMA生成比正常重力高約65-約4500倍的力，如本領(lǐng)域通常所計算。在此力作 用下，BM樣品中密度較高的物質(zhì)被推向管底部。因此，分離器能用于從骨髓樣品移出有核 細(xì)胞。在各種實施方式中，濃縮BM的有核細(xì)胞濃度是BM中有核細(xì)胞濃度的至少2倍、至 少3倍、至少4倍、或至少5倍。
[0129] 從血凝塊獲得細(xì)胞因子細(xì)胞懸液
[0130] 在包括使用血液的其它實施方式中，含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體可陷于血凝塊 內(nèi)。通過壓縮（"擠壓"）、血塊破碎或離心能從血凝塊產(chǎn)生細(xì)胞釋放物。通過聯(lián)合血或成 分血與凝血劑，血凝塊能用或未用抗凝劑且用或未用外源性凝血酶制備。合適的凝血劑包 括凝血酶（如牛、重組人、混和人或自體）、自體凝血蛋白和聚乙二醇。鈣可采用鈣鹽形式， 如氯化鈣。
[0131] 在一些實施方式中，所述凝血劑包括凝血蛋白。合適的凝血部分能通過如下方法 獲得：用鈣溶液（如溶于乙醇的氯化鈣）將全血或血漿加樣到血分離裝置；可選加熱全血 或血漿至少約20分鐘，溫度為至少約20°C ;和分離凝血部分。通過離心加熱的全血或血漿 可完成分離。合適的分離裝置作為Clotalyst?自體凝血酶收集系統(tǒng)（下文的"Clotalyst 系統(tǒng)"）市售可得，由美國印第安納州華沙的巴奧米特公司銷售。
[0132] 用圖4的裝置400生成凝血劑的示例性過程起始于將含氯化鈣和乙醇的試劑經(jīng)第 一端口 410注入主室405。玻璃珠也置于主室405。注入試劑后，第一端口 410用第一替換 帽415密封。將帶抗凝劑的血液經(jīng)第二端口 420注入主室405。注入血液后，第二端口 420 用第二替換帽425密封。可選地，注射器和血分離裝置400預(yù)熱到約25°C的溫度。
[0133] 血組分分離裝置400的內(nèi)容物通過重復(fù)翻轉(zhuǎn)裝置400來混合，例如約12次，從而 使血液接觸玻璃珠。混合后，溫育裝置。溫育過程采用一定溫度和持續(xù)時間，從而允許裝置 400的內(nèi)容物在約25°C加熱約15分鐘。完成溫育階段后，紅細(xì)胞、血漿和玻璃珠的凝結(jié)團(tuán) 在主室405的第二末端406形成。完成溫育后，充分振蕩裝置400以去除和破壞任何可能 存在的凝膠。
[0134] 用非離心方法獲得細(xì)胞因子懸液
[0135] 如上所述，含白細(xì)胞的液體能通過非離心方法如培養(yǎng)獲得。如本文所示，"非離心 方法"包括從組織獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的組織部分的方法，而不采用離心。在一些實施 方式中，方法是"非重力的"，其中基于密度以外的細(xì)胞物理、化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)，其中所 述部分的白細(xì)胞濃度高于組織中的白細(xì)胞濃度。特別地，這種非重力方法不同于白細(xì)胞部 分通過離心全血或其它組織而產(chǎn)生的方法。在一些實施方式中，所述非離心方法包括僅基 于密度以外的所述白細(xì)胞性質(zhì)的方法。非離心方法包括過濾、抗體結(jié)合和電泳法。
[0136] 例如，如上所討論，可通過過濾從全血、骨髓抽吸物或其它組織制備白細(xì)胞。獲自 血液、骨髓、脂肪組織或其它來源的白細(xì)胞和其它細(xì)胞因子生成細(xì)胞還能用本領(lǐng)域已知方 法培養(yǎng)。然后，所述細(xì)胞懸于合適介質(zhì)如血漿，從而維持其活力并促進(jìn)與固相提取材料混合 或其它接觸。含所述細(xì)胞的液體還可通過壓縮或破壞血凝塊來生成，如上所述。
[0137] 將細(xì)胞因子細(xì)胞懸液接觸提取材料并分離蛋白質(zhì)溶液
[0138] 進(jìn)一步參考圖1的示例過程，溫育細(xì)胞因子細(xì)胞懸液或另外與固相提取材料接觸 (步驟140)以生成含蛋白質(zhì)的液體。隨后，從固相提取材料分離此液體（步驟150)，作為 本技術(shù)的蛋白質(zhì)溶液。不意在限制本技術(shù)的范圍、機(jī)制或功能，本文所用的固相提取材料濃 縮液體體積白細(xì)胞中的細(xì)胞因子或其它蛋白質(zhì)，在一些實施方式中，可活化、刺激或另外增 加細(xì)胞因子生成，包括IL-lra。因此，在一些實施方式中，方法包括用固相提取材料活化細(xì) 胞因子細(xì)胞懸液。
[0139] 固相提取材料能包括提供特定表面積以接觸細(xì)胞的多種物質(zhì)。固相提取材料可以 是連續(xù)材料或不連續(xù)，且包括多種單獨顆粒。例如，固相提取材料可采用多種珠、纖維、粉 末、多孔材料或容器表面形式，所述容器包括含所述細(xì)胞的液體。固相提取材料可包括具有 多種橫截面形狀的幾何體，如球形、橢圓形或多邊形等。固相提取材料還能包括類似海綿的 連續(xù)多孔網(wǎng)絡(luò)，或能包括多種個體多孔顆粒。相較非多孔材料，固相提取材料還可因多孔而 提供更大的表面積。
[0140] 在一些實施方式中，固相提取材料包括具有大長寬比的顆粒，例如其中顆粒為針 樣形狀。固相提取材料還可形成為長纖維且可以是或采用類似玻璃棉的形式。
[0141] -些情況下，固相提取材料能包括保持細(xì)胞因子細(xì)胞懸液的容器內(nèi)壁。例如，固相 提取材料可包括含有細(xì)胞因子細(xì)胞懸液的注射器腔。其它容器包括管如離心管，或血液分 級分離裝置或濃縮器組件，如本文他處所述。
[0142] 固相提取材料是連續(xù)材料如多孔海綿樣材料時，該固相提取材料使用的量足以在 固相提取材料的孔或間隙內(nèi)吸收或吸附或納入基本完整液體體積的白細(xì)胞。固相提取材 料是不連續(xù)材料如多種顆粒時，該固相提取材料能與含所述細(xì)胞的液體聯(lián)合形成漿樣組合 物。從具有高固體部分的似膏體到具有低固體部分的易流動漿體，所述漿體的稠度可變，。
[0143] 固相提取材料能提供大表面積與細(xì)胞接觸。然而，一些情況下，固相提取材料能進(jìn) 一步處理以增加其表面積，例如通過物理或化學(xué)蝕刻或侵蝕固相提取材料表面。關(guān)于化學(xué) 侵蝕，根據(jù)材料性質(zhì)，能采用腐蝕劑修飾固相提取材料表面。經(jīng)修飾表面可用堿或酸生成， 例如色磺酸（chromosulphonic acid)，特別是約20% -約80%強(qiáng)度，優(yōu)選約50%色磺酸。 固相提取材料能用腐蝕劑溫育約5分鐘-約30分鐘以化學(xué)蝕刻表面并增加表面積。然后， 可洗滌固相提取材料去除腐蝕劑。例如，固相提取材料能包括保持細(xì)胞因子細(xì)胞懸液的容 器內(nèi)壁，其中內(nèi)壁蝕刻從而隨后增加接觸液體的表面積。
[0144] 多種聚合物、金屬、陶瓷和玻璃能用作固相提取材料。在一些實施方式中，固相提 取材料包括吸濕材料。合適固相提取材料的示例包括玻璃、礦物、聚合物、金屬和多糖。礦物 包括剛玉和石英。聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙烯酰胺。金屬包 括鈦。多糖包括葡聚糖和瓊脂糖。優(yōu)選的固相提取材料包含聚丙烯酰胺或基本由其組成， 如下進(jìn)一步所述。
[0145] 例如，固相提取材料可包括玻璃的連續(xù)固相提取材料或多種玻璃顆粒、玻璃棉，金 屬如鈦的連續(xù)固相提取材料、多種金屬珠、金屬粉末，和其組合。金屬的連續(xù)固相提取材料 能包括塊狀或其它三維形狀，由帶開口細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多孔金屬或金屬合金形成。固相提取材 料可包括多個珠或多種尺寸的顆粒，包含大致球形珠。珠包括聚苯乙烯珠、聚丙烯酰胺珠、 玻璃珠、金屬（如鈦）珠、或任何其它合適的珠。珠可以是適合容器和所用細(xì)胞因子懸液量 的任何尺寸。一些情況下，珠尺寸范圍可為約〇. 001毫米-約3毫米直徑。珠尺寸足夠小 時，所述珠看上去更像粉末。
[0146] 用作固相提取材料的聚丙烯酰胺珠能通過聚合丙烯酰胺單體而形成，使用本領(lǐng)域 已知的可控和標(biāo)準(zhǔn)操作以生成由聚丙烯酰胺凝膠形成的相對均勻珠。一般，聚丙烯酰胺通 過用合適雙功能交聯(lián)劑聚合丙烯酰胺來形成，最常見為Ν，Ν'-亞甲基雙丙烯酰胺（雙丙 烯酰胺）。凝膠聚合通常用過硫酸銨起始，通過加入催化劑如Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二 胺（TEMED)來提高反應(yīng)速率。在各種實施方式中，聚丙烯酰胺珠包括0.5微摩爾羧基/毫 升珠，賦予輕微陰離子特性（負(fù)電荷）。所述珠通常還抗pH變化，且在許多水性和有機(jī)溶 液中穩(wěn)定。通過調(diào)整總丙烯酰胺濃度，聚丙烯酰胺凝膠可以廣泛范圍的孔徑形成。此外，聚 丙烯酰胺珠可以多種尺寸形成且能具有相對均勻的大小分布。珠尺寸范圍為數(shù)微米直徑到 數(shù)毫米直徑。例如，不同類型的Bio-Gel?聚丙烯酰胺凝膠珠（美國加利福尼亞州赫拉克勒 斯的伯樂公司（Bio-Rad Laboratories))的粒徑范圍是小于約45 μπι-約180 μπι。聚丙稀 酰胺珠還可獲自法國愛森（SNF Floerger)(美國喬治亞州Riceboro)、皮爾斯公司（Pierce Biotechnology, Inc.)(美國伊利諾伊州羅克福德）和聚合物公司（Polymers, Inc.)(美國 阿肯色州費耶特維爾）。
[0147] -旦聚合，聚丙烯酰胺珠可干燥并以粉末樣形式保存。干珠不溶于水，但再水合后 能顯著膨脹。再水合使聚丙烯酰胺珠恢復(fù)膠稠度，可為干燥狀態(tài)尺寸的約2-約3倍。因此， 干的聚丙烯酰胺珠（即使聚丙烯酰胺珠脫水）可用于吸收部分液體體積，包括小于珠孔徑 的溶質(zhì)，且能用于濃縮IL-Ira和其它由白細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)。例如，聯(lián)合干聚丙烯酰胺珠 與血液和/或富血小板血漿可通過白細(xì)胞激活I(lǐng)L-Ira生成，并且隨著干珠再水合和膨脹， 還降低總液體體積。
[0148] 不意在限制本技術(shù)的范圍、機(jī)制或功能，已發(fā)現(xiàn)與固相提取材料接觸的表面能激 活細(xì)胞，一些情況下，固相提取材料協(xié)助分離和濃縮所得蛋白質(zhì)溶液，所述溶液富含包括 IL-Ira在內(nèi)的細(xì)胞因子。例如，在多孔固相提取材料的情況中，含所述細(xì)胞的部分液體能進(jìn) 入孔并保留在其中。所述液體中的細(xì)胞可接觸此額外表面積。在一些實施方式中，孔過小 以至于細(xì)胞無法進(jìn)入，但部分液體能進(jìn)入孔。例如，液體能通過離心從固相提取材料和孔中 移除。
[0149] 固相提取材料優(yōu)選用本領(lǐng)域已知技術(shù)滅菌，以防止細(xì)胞因子細(xì)胞懸液污染。例如， 加熱和加壓滅菌法如高壓滅菌法可根據(jù)固相提取材料的具體組成來使用。能使用替代方法 如化學(xué)滅菌或輻照，其中固相提取材料可能受到高壓滅菌過程的不利影響。
[0150] 在一些實施方式中，所述細(xì)胞因子細(xì)胞懸液用固相提取材料溫育一段時間以有效 移出部分液體。溫育可在約30秒-約72小時階段內(nèi)完成且可在約20°C -約41°C溫度下 完成。例如，溫育可以是24小時或更少，10小時或更少，5小時或更少，2小時或更少，1小 時或更少，30分鐘或更少，15分鐘或更少，10分鐘或更少，5分鐘或更少，4分鐘或更少，3分 鐘或更少，2分鐘或更少。溫育可以是至少約15秒，至少約30秒，至少約1分鐘，至少約90 秒，至少約2分鐘，至少約10分鐘，或至少約30分鐘。在一些實施方式中，溫育是約1分 鐘-約3分鐘。在一些實施方式中，溫育在約37°C進(jìn)行。在一些實施方式中，所述液體不溫 育，但只在必須時與固相提取材料接觸以進(jìn)行后續(xù)處理。所述接觸可在周圍條件下進(jìn)行，例 如約20-25°C的溫度。
[0151] 在一些實施方式中，攪拌所述細(xì)胞因子細(xì)胞懸液和固相提取材料以在接觸期間 更充分混合這些組分。所述攪拌可通過翻轉(zhuǎn)、振蕩、搖動、攪拌或渦旋液體和固相提取材 料來完成。攪拌可增加液體內(nèi)細(xì)胞與固相提取材料的接觸。攪拌可進(jìn)行一次，重復(fù)多 次，定期重復(fù)，或可連續(xù)。當(dāng)含所述細(xì)胞的液體用電磁場刺激時，還可攪拌該液體和固相 提取材料。涉及用聚丙烯酰胺珠和其它固相提取材料生成富含蛋白質(zhì)溶液的另外方面 和特征參見：美國專利申請公開號2009/0220482, Higgins等，2009年9月3日公開；美 國專利申請公開號2010/0055087, Higgins等，2010年3月4日公開；美國專利申請公 開 2011/0052561，Ho印pner, 2011 年 3 月 3 日公開；國際申請公開 2012/030593, Higgins 等，2012年3月8日公開；和美國專利申請公開2012/0172836, Higgins等，2012年7月5日 公開。本技術(shù)方面所用的組合物和方法還描述于和本公開同時提交的下列申請：美國專利 申請序列號13/841083Landrigan等；《用蛋白質(zhì)溶液治療炎癥性呼吸道疾病》（Treatment of Inflammatory Respiratory Disease Using Protein Solutions);美國專利申請序 列號13/83700, Woodell-May等；《治療炎癥性疾病的方法和非細(xì)胞組合物》（Methods and Acellular Compositions for Treating Inflammatory Disorders);美國專利申請序列 號 13/837480,0'Shaughnessey 等·《用蛋白質(zhì)溶液治療疼痛》（Treatment of Pain Using Protein Solutions);美國專利申請序列號13/839280, Leach等，《用非離心法從組織制 備細(xì)胞因子組合物的方法》（Methods for Making Cytokine Compositions from Tissue Using Non-Centrifugal Methods);美國專利申請序列號 13/840129，Matusuka 等，《用蛋 白質(zhì)溶液治療膠原缺陷》（Treatment of Collagen Defects Using Protein Solutions); 和美國專利申請序列號13/841103Landrigan等，《用蛋白質(zhì)溶液治療周圍血管疾病》 (Treatment of Peripheral Vascular Disease Using Protein Solutions);所有專利都 通過引用納入本文。
[0152] 含白細(xì)胞的液體與固相提取材料接觸可用合適容器或?qū)崿F(xiàn)接觸的其它裝置進(jìn) 行。接觸能在連續(xù)過程中進(jìn)行，其中液體流越過或穿過固相提取材料，或液體和固相提取 材料可包含于容器。如上所討論，所述容器能包括固相提取材料，或僅用作保持珠或其它 形式材料的容器。本技術(shù)所用的容器包括本領(lǐng)域已知的那些，如Plasmax? Plus血漿濃 縮器，市售獲自巴奧米特公司（美國印第安納州華沙），且可包括以下專利所述的那些裝 置和應(yīng)用方法：美國專利號7, 553, 413, Dorian等，2009年6月30日公開；和美國專利號 7, 694, 828, Swift 等，2010 年 4 月 13 日公開。
[0153] 這類裝置如圖3A和3B所示，用于與聚丙烯酰胺凝膠珠固相提取材料示例性應(yīng)用。 裝置300具有上室305和下室310。上室305具有端壁315,凝膠珠攪拌器325的攪拌器閥 桿320沿著其延伸。裝置300還具有沿著端壁315延伸并進(jìn)入上室305的入口 330。裝置 300還包括連通血漿濃縮物回路340的出口 335。上室305基底包括濾器345,其上表面支 撐干的濃縮聚丙烯酰胺珠350。
[0154] 使用中，含白細(xì)胞的液體355和可選的血小板經(jīng)入口 330注入上室305并與聚丙 烯酰胺珠350混合。流體355和聚丙烯酰胺珠350可通過旋轉(zhuǎn)攪拌器閥桿320和凝膠珠攪 拌器325來混合，以幫助混合流體355和聚丙烯酰胺珠350。然后，混合的流體355和聚丙 烯酰胺珠350在所需溫度下溫育所需時間。隨后，裝置300進(jìn)行離心，從而液體傳到下室 310,而聚丙烯酰胺珠350被濾器345保留，由此分離聚丙烯酰胺珠350與IL-Ira和其它蛋 白質(zhì)的所得溶液360，所述溶液收集于下室310。溶液360可經(jīng)出口 335從裝置移出。
[0155] 在一些實施方式中，蛋白質(zhì)溶液能以某一方法制備，其中含白細(xì)胞的液體從組織 中分離，隨后在連續(xù)過程中接觸固相提取材料。再次參考圖1，在一些實施方式中，分離 110、120、135和接觸140用單一設(shè)備進(jìn)行，本文稱為單一分離和濃縮裝置（"S/C裝置"）。 一個這種裝置參見美國專利申請序列號13/434, 245, 0' Connell，2012年3月29日提交。
[0156] S/C裝置包括分離區(qū)、第一濃縮區(qū)、第二濃縮區(qū)、浮標(biāo)系統(tǒng)、入口、止回閥、第一回收 端口和第二回收端口。圖5顯示S/C裝置500能從全血產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子組合物。例 如，所述方法可起始于獲得一定體積的全血，其經(jīng)入口 510注射填入S/C裝置500的分離 區(qū)505。浮標(biāo)系統(tǒng)515位于分離區(qū)505內(nèi)。浮標(biāo)系統(tǒng)包括第一浮標(biāo)組件520、第二浮標(biāo)組 件525以及連接第一浮標(biāo)組件520與第二