治療炎癥性疾病的方法和非免疫原性組合物的制作方法
【專利說明】治療炎癥性疾病的方法和非免疫原性組合物
【背景技術(shù)】
[0001] 本技術(shù)涉及治療炎癥性疾病的方法，包括骨關(guān)節(jié)炎。特別地，方法特定包括使用含 細(xì)胞因子的溶液，包括源自血液和其它組織的非免疫原性溶液。
[0002] 炎癥是復(fù)雜的細(xì)胞和生化過程，在受影響的血管和鄰近組織中出現(xiàn)，響應(yīng)損傷或 者物理、化學(xué)或生物學(xué)劑如病原體、過敏原或刺激物所導(dǎo)致的異常刺激而出現(xiàn)。所述炎癥過 程包括局部反應(yīng)和導(dǎo)致組織內(nèi)形態(tài)變化；破化或移除致病物；引起修復(fù)和治愈的反應(yīng)。大 部分情況下，炎癥是有益和暫態(tài)過程，其隨著機(jī)體攻擊和克服傳染劑或其它有害試劑而減 少。然而，一些情況下，炎癥可以是慢性自保持過程，例如作為持續(xù)退化過程（如關(guān)節(jié)炎）或 自身免疫疾病的一部分，導(dǎo)致組織損壞。慢性炎癥與多種疾病相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 動脈粥樣硬化、局部缺血性心臟病、牙周炎、結(jié)腸炎和一些癌癥。
[0003] 炎性反應(yīng)由涉及局部血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的生化事件以及受損組織內(nèi)的多種細(xì) 胞級聯(lián)組成。所述過程涉及釋放多種細(xì)胞來源的調(diào)節(jié)劑，包括組胺、干擾素-γ、白介素-8、 白三烯、一氧化氮、前列腺素、腫瘤壞死因子-α和白介素-1。特別地，白介素-I(IL-I)包 括細(xì)胞因子家族，所述細(xì)胞因子能刺激淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，活化吞噬細(xì)胞，增加前列腺素 生成，引起骨關(guān)節(jié)退化，提高骨髓細(xì)胞增殖，且參與許多慢性炎性病癥。IL-I能由巨噬細(xì)胞、 單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生，且可以是抵御感染的炎性反應(yīng)一部分。
[0004] IL-I作用模式可由白介素-1受體拮抗蛋白（IL-Ira ;也稱為" IRAP"）調(diào) 節(jié)。IL-Ira在細(xì)胞表面結(jié)合的受體與IL-I相同，因此防止IL-I向該細(xì)胞發(fā)送信號。 E-Ira從白細(xì)胞中分泌，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞（PMN)和其 它細(xì)胞，且能調(diào)節(jié)多種IL-I相關(guān)免疫和炎性反應(yīng)，如Arend WP，Malyak Μ，Guthridge CJ, Gabay C (1998)''Interleukin-lreceptor antagonist :role in biology^Annu. Rev. Immunol. 16:27-55所述。IL-Ira的生成由數(shù)種物質(zhì)刺激，包括粘附的免疫球蛋白G(IgG)、 其它細(xì)胞因子和細(xì)菌或病毒組分。IL-Ira以及其它細(xì)胞因子如可溶性腫瘤壞死因子受體 I (sTNF-Rl)、可溶性腫瘤壞死因子受體2(sTNF-R2)和可溶性白介素受體I (SlL-IRII)，是 關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎和肉芽腫性肺疾病中的重要天然抗炎蛋白質(zhì)。
[0005] IL-Ira能用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中IL-I起關(guān)鍵作用的自身免疫疾病，減 少與該疾病相關(guān)的炎癥和軟骨降解。例如，Kineret?(阿那白滯素）是IL-Ira的重組、 非糖基化形式（加利福尼亞州千橡市的安進(jìn)公司（Amgen Manufacturing, Ltd.))。多種 重組白介素-1抑制劑和治療方法參見美國專利號6, 599, 873, Sommer等，2003年7月29 日公開；美國專利號5, 075, 222, Hannum等，1991年12月24日公開；和美國申請公開號 2005/0197293，Mellis等，2005年9月8日公開。另外，包括使用自身體液在內(nèi)的從體液生 成IL-Ira的方法參見美國專利號6, 623, 472, Reinecke等，2003年9月23日公開；美國專 利號 6, 713, 246, Reinecke 等，2004 年 3 月 30 日公開；和美國專利號 6, 759, 188, Reinecke 等，2004年7月6日公開。
[0006] 許多這類炎癥治療為本領(lǐng)域已知。本領(lǐng)域已知療法可涉及移除導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的潛 在刺激物或試劑，或通過調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)炎性反應(yīng)方面。示例包括糖皮質(zhì)激素留體（如氫 化可的松、可的松、強(qiáng)的松和倍氯米松）、非留體抗炎藥物（如阿司匹林、布洛芬和萘普生） 和免疫選擇性抗炎藥。然而，許多這類治療呈現(xiàn)副作用，特別是在慢性施用期間，或具有限 制其應(yīng)用的藥理學(xué)特性。例如，使用IL-Ira的組合物和方法為本領(lǐng)域已知，同時(shí)其可能與 涉及IL-Ira穩(wěn)定性和半衰期以及所提供IL-Ira量和速率的問題相關(guān)。此外，許多治療對炎 癥過程的根本病因沒有作用。因此，需要改善的炎癥治療方法，提供一種或多種改進(jìn)功效、 減少副作用和提升給藥特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本技術(shù)提供富含抗炎性細(xì)胞因子的溶液產(chǎn)生方法以用于治療炎癥和其它由白介 素-1和腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的疾病。產(chǎn)生這類溶液的方法包括將液體體積的細(xì)胞因子 生成細(xì)胞（如白細(xì)胞）接觸固相提取材料，從液體移出固相提取材料。所述方法進(jìn)一步包 括以下一種或兩種：在液體與固相提取材料接觸期間或之后從液體移出細(xì)胞，從液體移出 固相提取材料后冷凍干燥（凍干）溶液。在一些實(shí)施方式中，液體體積的細(xì)胞獲自多種哺 乳動物對象。此技術(shù)的組合物是非免疫原性的，能用于治療哺乳動物對象，無論制備溶液所 用的細(xì)胞來源如何。
[0008] 特別地，本技術(shù)提供制備非免疫原性抗炎性細(xì)胞因子組合物的方法，包括含有以 下步驟的方法：
[0009] (a)從哺乳動物供體獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體，所述細(xì)胞如白細(xì)胞；
[0010] (b)將液體接觸固相提取材料以產(chǎn)生富含白介素 -1受體拮抗劑的組合物；和
[0011] (c)從組合物中移出細(xì)胞。
[0012] 方法還包括
[0013] (a)從哺乳動物供體獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體；
[0014] (b)將液體接觸固相提取材料以產(chǎn)生富含白介素 -1受體拮抗劑的組合物；和
[0015] (c)冷凍組合物以生成非免疫原性抗炎性細(xì)胞因子組合物。
[0016] 在其它實(shí)施方式中，方法包括：
[0017] (a)從哺乳動物供體獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體；
[0018] (b)將液體接觸固相提取材料以產(chǎn)生富含白介素 -1受體拮抗劑的組合物；和
[0019] (C)從固相提取材料分離液體；
[0020] (d)將所述組合物與儲液混合以制備貯存穩(wěn)定化的溶液；和
[0021] (e)冷藏穩(wěn)定化溶液。
[0022] 在各種實(shí)施方式中，含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體可包括全血、骨髓抽吸物、脂肪組 織、尿、其部分（如富血小板血漿和骨髓濃縮物）及其混合物，含有（例如）白細(xì)胞、脂肪基 質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞。所述固相提取材料可選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂 糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和其組合。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體由包括以下步驟的方法制備：
[0024] (1)將含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的組織加樣到置有浮標(biāo)的管內(nèi)，其中所述浮標(biāo)的密度 使得浮標(biāo)能在管內(nèi)組織離心后可操作達(dá)到平衡位置，所述平衡位置在含細(xì)胞因子生成細(xì)胞 的第一部分和第二部分之間，第二部分的細(xì)胞濃度大于第一部分的細(xì)胞濃度；
[0025] (2)對管進(jìn)行離心，從而所述浮標(biāo)界定第一與第二部分之間的界面；和
[0026] (3)移出細(xì)胞部分以形成含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體。
[0027] 在各種實(shí)施方式中，所述獲得和接觸步驟包括：
[0028] (1)將含全血、骨髓抽吸物或兩者和抗凝劑的組織加樣到置有浮標(biāo)的管內(nèi)，其中所 述浮標(biāo)的密度使得浮標(biāo)能在管內(nèi)組織離心后達(dá)到平衡位置，所述平衡位置在含細(xì)胞因子生 成細(xì)胞的第一部分和第二部分之間，第二部分的細(xì)胞濃度大于第一部分的細(xì)胞濃度；
[0029] (2)對管進(jìn)行離心，從而所述浮標(biāo)界定第一與第二部分之間的界面；和
[0030] (3)收集第二部分，作為含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體；
[0031] (4)將第二部分加樣到含固相提取材料的濃縮器組件，溫育與固相提取材料接觸 的第二部分；和
[0032] (5)旋轉(zhuǎn)濃縮器組件，采用的離心速度能分離固相提取材料和富含白介素-1受體 拮抗劑的溶液，所述溶液的白介素-1受體拮抗劑濃度大于全血。
[0033] 在各種實(shí)施方式中，所述抗炎性細(xì)胞因子組合物包含
[0034] (i)白介素-1受體拮抗劑（IL-Ira)，濃度為至少約10, 000pg/ml ;
[0035] (ii)可溶性腫瘤壞死因子受體I (sTNF-Rl)，濃度為至少約1，200pg/ml ;和
[0036] (iii)蛋白質(zhì)，選自sTNF-RII (可溶性腫瘤壞死因子受體2)、IGF_I(胰島素樣生長 因子I)、EGF (表皮生長因子）、HGF (肝細(xì)胞生長因子）、TOGF-AB (來源于血小板的生長因 子AB)、TOGF-BB(來源于血小板的生長因子BB)、VEGF (血管內(nèi)皮生長因子）、TGF-β 1(轉(zhuǎn) 化生長因子β I)、sIL-lRII (可溶性白介素受體II)和其混合物，其中所述蛋白質(zhì)在所述組 合物中的濃度大于所述蛋白質(zhì)在正常血液中的濃度。
[0037] 在一些實(shí)施方式中，所述組合物額外包括白細(xì)胞、血小板或其組合。
[0038] 在人或其他哺乳動物對象中治療白介素-1受體所介導(dǎo)病癥如炎癥的方法，包括 局部施用本技術(shù)的組合物。在各種實(shí)施方式中，所述組合物用細(xì)胞因子細(xì)胞懸液制備，所述 懸液獲自哺乳動物對象或待治療對象之外的多種對象。
【附圖說明】
[0039] 圖1的框圖描述生成抗炎性細(xì)胞因子組合物的方法；
[0040] 圖2是分級分離裝置的圖；
[0041] 圖3顯示在離心之前（圖3A)和之后（圖3B)激活樣品產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子的裝 置；
[0042] 圖4是產(chǎn)生血凝塊的裝置的圖；
[0043] 圖5是能產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子組合物的單一裝置的圖；
[0044] 對應(yīng)的參考數(shù)字指示附圖數(shù)個(gè)視圖中的對應(yīng)部分。應(yīng)指出，本文所列圖意在舉例 說明本技術(shù)材料、組合物、裝置和方法的一般特征，以用于描述某些實(shí)施方式的目的。這些 圖不一定精確反映任意給定實(shí)施方式的特征，且不必定用于完整定義或限制本技術(shù)范圍內(nèi) 的特定實(shí)施方式。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 下列技術(shù)描述僅示例一種或多種發(fā)明的組合物性質(zhì)、制造和應(yīng)用，且不意在限制 本申請或所述其他申請中要求權(quán)利的任何特定發(fā)明的范圍、實(shí)施和應(yīng)用，所述其他申請可 能提交要求對本申請的優(yōu)先權(quán)，或其中公開的專利。在本詳細(xì)描述的結(jié)尾處提供關(guān)于術(shù)語 和短語的非限制性討論，用于協(xié)助理解本技術(shù)。
[0047] 本技術(shù)涉及組合物、制備組合物的方法、使用組合物治療炎癥性疾病和由白介 素-1所介導(dǎo)其它疾病的方法。一般地，這類組合物由包括以下步驟的方法制備：
[0048] (a)從一個(gè)或多個(gè)哺乳動物對象獲得含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的液體（"細(xì)胞因子細(xì) 胞懸液"，如下進(jìn)一步所討論）；和
[0049] (b)分級分離液體以生成含一種或多種蛋白質(zhì)如白介素-1受體拮抗劑的蛋白質(zhì) 溶液。
[0050] 蛋白質(zhì)組合物
[0051] 本技術(shù)提供在人或其它哺乳動物對象中治療由白介素-1所介導(dǎo)的炎癥性疾病和 其它疾病的方法，所述方法使用包含溶解、懸浮或另外攜帶從而以生理學(xué)可接受介質(zhì)形式 遞送給哺乳動物對象的蛋白質(zhì)的組合物（本文稱為"蛋白質(zhì)溶液"）。在各種實(shí)施方式中， 所述組合物包含產(chǎn)自正常哺乳動物對象全血的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子）。所述組合物還包含 活細(xì)胞，包括血小板、白細(xì)胞、和其組合。
[0052] 在各種實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液包含至少2種選自以下的蛋白質(zhì)：IL_lra、 sTNF-RI、sTNF-RII (可溶性腫瘤壞死因子受體2)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、EGF(表皮 生長因子）、HGF (肝細(xì)胞生長因子）、TOGF-AB (來源于血小板的生長因子AB)、TOGF-BB (來 源于血小板的生長因子BB)、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子）、TGF- β 1 (轉(zhuǎn)化生長因子β I )、 sIL-lRII (可溶性白介素受體II)，其中所述組合物的2種蛋白質(zhì)各自濃度均大于正常血液 中各蛋白質(zhì)的濃度。為清晰起見，所述蛋白質(zhì)溶液可包含來自所述組的3種或更多蛋白質(zhì)。 盡管所述組合物中每一種蛋白質(zhì)濃度可大于正常血液中其各自濃度，但不必定2種以上蛋 白質(zhì)的濃度大于正常血液中其各自濃度。
[0053] 在各種實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)溶液包括下列組分。
[0054] 表1.蛋白質(zhì)溶液示例性蛋白質(zhì)組分
[0055]

[0057] 蛋白質(zhì)濃度能用實(shí)施例4所示方法測量。
[0058] 優(yōu)選地，所述組合還包含活的白細(xì)胞、裂解的白細(xì)胞或兩者。在優(yōu)選組合物中，所 述蛋白質(zhì)溶液包含單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板。在各種實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)溶液包含下列組 分。
[0059] 表2.蛋白質(zhì)溶液示例性細(xì)胞組分
[0061] 應(yīng)理解該濃度為種特異性。此外，應(yīng)理解濃度可隨著個(gè)體對象而變化。因此，在包 括從含細(xì)胞因子生成細(xì)胞的血液或其它組織生成蛋白質(zhì)溶液的方法中，所述蛋白質(zhì)溶液的 蛋白質(zhì)和細(xì)胞濃度可與上述不同；上述值是濃度均值，如對象群體中所見。
[0062] 在各種實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液中一種或多種蛋白質(zhì)或其它組分的濃度大于 正常血液中該組分的濃度。（具有所述更高組分濃度的組合物被稱為"富含"這些組分。） 如本文所示，"正常"血液或其它組織中的組分濃度是獲得組織的哺乳動物對象一般群體中 所見濃度，例如正常全血中。在抗炎性細(xì)胞因子組合物獲自特定對象組織的方法中，蛋白質(zhì) 或細(xì)胞的"正常"濃度可以是進(jìn)行加工獲得蛋白質(zhì)或細(xì)胞之前的個(gè)體血液中的濃度。
[0063] 因此，在各種實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)溶液中一種或多種組分的濃度比正常血液 中該組分濃度高大于約1. 5倍、約2倍或約3倍。例如，相對于正常（全）血，組合物中的 組分可具有更高濃度，如下所示：
[0064] · IL-lra，濃度高至少2. 5倍、或至少3倍或至少5倍；
[0065] · sTNF-RI，濃度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0066] · sTNF-RII，濃度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0067] · SlL-IRII，濃度高至少1. 5倍、或至少1. 8倍或至少2倍；
[0068] · EGF，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0069] · HGF，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少4倍；
[0070] · H)GF-AB，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0071 ] · PDGF-BB，濃度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0072] · TGF- β 1，濃度高至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0073] · IGF-I，濃度高至少1. 2倍、或至少1. 4倍或至少1. 5倍；
[0074] · VEGF，濃度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0075] ?白細(xì)胞，濃度高至少約2倍、或至少約3倍或至少約4倍；
[0076] ?血小板，濃度高至少約2倍、或至少約3倍或至少約4倍；
[0077] ?中性粒細(xì)胞，濃度高至少1. 5倍、或至少2倍或至少3倍；
[0078] ?單核細(xì)胞，濃度高至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0079] ?淋巴細(xì)胞，濃度高至少5倍、或至少8倍或至少10倍；和
[0080] ?嗜堿性細(xì)胞，濃度高至少2倍、或至少4倍或至少6倍。
[0081 ] 同樣，所述蛋白質(zhì)溶液中的紅細(xì)胞濃度優(yōu)選是正常血液中紅細(xì)胞濃度的至少一 半，或至少三分之一。
[0082] 例如，蛋白質(zhì)溶液可包含：
[0083] (a)至少約 10, 000pg/ml ILl-ra ;
[0084] (b)至少約 1，200pg/ml sTNF-RI ;和
[0085] (c)蛋白質(zhì)，選自 sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β 1、 和sIL-lRII以及其混合物，其中所述蛋白質(zhì)的濃度大于正常血液中該蛋白質(zhì)的基線濃度。 另一示例中，蛋白質(zhì)溶液包含：
[0086] (a)白介素-1受體拮抗劑（IL-Ira)，濃度比正常血液中IL-Ira濃度高至少3倍；
[0087] (b)可溶性組織壞死因子因子-rl (sTNF-rl)，濃度比正常血液中IL-Ira濃度高至 少2倍；
[0088] (c)白細(xì)胞，濃度比正常血液中白細(xì)胞濃度高至少2倍；和
[0089] (d)血小板，濃度比正常血液中血小板濃度高至少2倍。