一種粒細胞樣髓源性抑制細胞來源exosomes及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種粒細胞樣髓源性抑制細胞來源exosomes及其應用，屬細胞生物學、分子生物學領域及臨床應用領域，具體涉及荷瘤小鼠脾臟分離的G-MDSC exo的制備、生物學功能研究及其在小鼠自身免疫性疾病治療中的應用。
【背景技術】
[0002]骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derivedsuppressor cells, MDSCs)是一群骨髓來源的異質(zhì)性細胞，在腫瘤、炎癥及病原體感染等病理情況下大量擴增(GabrilovichDIj Nagaraj S.Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immunesystem.Nat Rev Immunol.2009; 9 (3): 162-74.)。小鼠的 MDSCs 是 Gr_l (由 Ly6G和Ly6C組成)和⑶Ilb雙陽性的細胞，按細胞形態(tài)及Ly6G、Ly6C表達量高低，可分為CDllb+Ly6G+Ly6Cl0W 粒細胞樣 MDSCs (G-MDSCs)和 CDllb+Ly6GTy6Chi單核細胞樣 MDSCs(M-MDSCs)兩個亞型。在腫瘤及感染等疾病狀態(tài)下，G-MDSCs和M-MDSCs均會擴增，而G-MDSCs明顯多于M-MDSCs。G-MDSCs主要通過表達精氨酸酶I (arginase l，Arg_l)和活性氧(reactive oxygen species, R0S)抑制T細胞介導的適應性免疫應答和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、巨噬細胞介導的天然抗腫瘤免疫應答。研究表明MDSCs也可以通過干擾素 g (interferon g, INF_g)和白細胞介素 10 (interlenkin 10, IL-10)依賴的途徑誘導Treg細胞分化從而下調(diào)效應性T細胞的功能。近年來相關研究表明MDSCs在自身免疫性疾病的治療方面有巨大的潛能。因此，人們對MDSCs的治療價值有了新的認識，已有實驗利用MDSCs治療小鼠膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-1nduced arthritis, CIA),并取得一定療效。但是，由于MDSCs來源不足、儲存不便及成分復雜等缺點限制了其應用。
[0003]自身免疫性疾病是因機體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應答而導致的疾病，在人群中有較高的發(fā)病率。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn，s disease, CD),主要是由于機體對本處于耐受狀態(tài)的正常菌群發(fā)生異常免疫應答所致的非特異性炎性腸道疾病，該病臨床表現(xiàn)為腹痛、腹灣、黏液膿血便，病久可發(fā)生癌變。類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種臨床常見系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為對稱性小關節(jié)病變，以多關節(jié)持續(xù)性炎癥為特征。大量研究表明促炎性細胞Thl和Thl7及其來源的炎癥因子在自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Treg細胞在維持腸道機體免疫穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用，Treg細胞作用失衡往往是自身免疫學疾病發(fā)生的原因之一，并且研究證實自身免疫性疾病患者體內(nèi)Treg細胞比正常人低。近年來自身免疫性疾病在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，針對該類疾病，臨床上主要以對癥治療為主，尚沒有一種行之有效的治療手段，因此迫切需要探索一種從根本上治愈的方法。
[0004]Exosomes是細胞內(nèi)多胞體與質(zhì)膜融合后釋放到細胞外環(huán)境中的一種膜性囊泡。研究表明幾乎所有的活細胞都能分泌exosomes,并且其廣泛存在于各種體液中(BeninsonLA, M.Fleshner.Exosomes: an emerging factor in stress-1nducedimmunomodul at1n [J].Semin Immunol, 2014.26(5): 394-401.)。exosomes 攜帶來源細胞的蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA等成分，使之不易受外界環(huán)境降解，利于相關活性成分發(fā)揮生物學功能。通過巨胞飲作用，脂質(zhì)筏和受體介導的內(nèi)吞作用等方式，exosomes被受體細胞內(nèi)化，內(nèi)化的exosomes可以調(diào)控受體細胞的多種生物學功能，在細胞間交流過程中發(fā)揮重要作用。exosomes在免疫應答、凋亡、血管生成、炎癥反應及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中的作用均有報道。研究顯示對疾病進行干預時，exosomes比其來源細胞更有優(yōu)勢。利用樹突狀細胞來源的exosomes治療腫瘤的報道較多，并顯示出良好療效(Pitt JM, Charrier M,Viaud S，et al.Dendritic cell-derived exosomes as immunotherapies in the fightagainst cancer [J].J Immunol, 2014; 193 (3): 1006-11.)。但是有關 G-MDSC exo 的功能研究，以及在自身免疫性疾病中的應用尚未見報道。
[0005]我們發(fā)現(xiàn)G-MDSC exo直徑為40_100nm，攜帶生物活性成分，與G-MDSC分泌的其他囊泡相比，G-MDSC exo的生物學特性更清晰。G-MDSC exo能抑制⑶4+T細胞增殖并減輕DTH小鼠足墊腫脹程度，并且能促進TGF-β誘導的⑶4+ T細胞向Treg細胞擴增。體內(nèi)應用G-MDSC exo能減緩小鼠遲發(fā)型超敏反應(DTH)、IBD和CIA的病情，并進一步證實，并且這種作用一定程度上依賴于G-MDSC exo攜帶的Arg-1。
[0006]近年來有關exosomes在疾病治療方面的研究多集中在樹突狀細胞和干細胞來源的exosomes上。疾病治療方面,相對于來源細胞,exosomes具有更容易保存和運輸,本身無細胞毒性，應用時生物安全問題較少等優(yōu)點；并且exosomes表面的復合分子為其靶向特定組織及微環(huán)境提供潛在的歸巢機制(田新瑞，徐文蜻，牛勃，等.神經(jīng)干細胞來源Exosomes制備及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用:中國，CN103740645 A[P].2014-04-23.);exosomes對治療性的蛋白質(zhì)和核酸還具有保護作用，減少降解(Marcus ME, Leonard JN.FedExosomes:Engineering Therapeutic B1logical Nanoparticles that Truly Deliver [J].Pharmaceuticals (Basel)，2013，6(5):659-680.)D G-MDSC exo 在疾病治療中的應用尚未見報道。我們實驗發(fā)現(xiàn)G-MDSC exo在低溫條件下能長期保持，并且生物學活性不受影響；
G-MDSC exo既具有與G-MDSC類似的抑制⑶4+ T細胞增殖的作用，又能促進TGF- β誘導的⑶4+ T細胞向Treg細胞擴增。G-MDSC exo是一種天然免疫調(diào)節(jié)劑，對自身免疫性疾病的治療具有重要意義，在臨床上具有較好的應用價值。
[0007]依據(jù)G-MDSC exo的結構和功能特性，將其應用于自身免疫性疾病的治療，可達到“低投入、高產(chǎn)出”的目的，具有良好的臨床應用前景，有望在維持機體免疫平衡方面發(fā)揮積極作用，為自身免疫性疾病的治療提供一種全新的治療途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種G-MDSCs來源的exosomes,該exosomes具有G-MDSCs的非特異性成分和G-MDSCs內(nèi)特殊的蛋白質(zhì)和核酸等活性物質(zhì),是一種亞細胞結構的復合信息體；其既具有G-MDSCs所具備的免疫抑制特性又包含有自身表面分子CD63 ;并觀察其在自身免疫性疾病治療中的作用，以期尋求從根本上治療疾病的方法。
[0009]本發(fā)明中的G-MDSC exo是含有來源細胞胞膜脂質(zhì)成分的膜性囊泡，對其攜帶的生物活性成分具有保護作用；G-MDSC exo可發(fā)揮類似G-MDSCs的免疫抑制功能，并且具有細胞本身所不具備的眾多優(yōu)點，是細胞間信息傳遞的亞細胞結構信息復合體。
[0010]本發(fā)明公開了一種簡便的制備來源于腫瘤個體或自身免疫性疾病個體G-MDSCexo的方法，整個過程耗時短，產(chǎn)量高，并且證實其易于保存且生物活性不受影響，為進行治療目的規(guī)模生產(chǎn)化生產(chǎn)G-MDSC exo奠定基礎。即構建荷瘤小鼠模型或者自身免疫性疾病(如CIA)模型，分離脾臟G-MDSCs，收集培養(yǎng)上清；聯(lián)合使用超速離心與微孔濾膜法，分離提取 G-MDSC exoο
[0011]其具體步驟如下:
將收集的G-MDSCs培養(yǎng)懸液于4°C離心后收集上清，重復三次，將收集到的上清轉(zhuǎn)移