基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及腫瘤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑與小分子化合物聯(lián)用引起細(xì)胞死亡來篩選候選聯(lián)用分子的篩選方法，所篩選到的化合物分子本身不一定具有抗腫瘤活性，但和細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，如HDAC抑制劑聯(lián)用則顯示抗腫瘤活性，由此也可以確定藥物聯(lián)用的方案。本發(fā)明中，以腫瘤細(xì)胞為對象，用細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑分別與各單一化合物一起處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，測定所述的化合物與細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑引起培養(yǎng)的細(xì)胞死亡的程度，篩選基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物。本發(fā)明經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了上述方法可以用于聯(lián)用藥物的篩選，進(jìn)一步制備HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物，所述的藥物組合物適于所有劑型。
【專利說明】基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物篩選方法；具體涉及一種增加癌細(xì)胞對HDAC抑制劑敏感的小分子化合物及其篩選方法，以及HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著溶酶體研究的深入,專注于包含細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器囊泡研究的Christian deDuve開啟了細(xì)胞自曬新領(lǐng)域,這些和溶酶體相關(guān)的囊泡，也即自卩遼體(Autophagosome),在生物體內(nèi)廣泛存在，Christian de Duve也因?yàn)槿苊阁w的研究而獲得1974年度的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。近十年來，研究發(fā)現(xiàn)有大自卩遼(Macroautophagy)、小自卩遼(Microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自曬(Chaperone-MediatedAutophagy, CMA)三種細(xì)胞自曬形式。研究顯示，在細(xì)胞自噬發(fā)生過程中，有許多蛋白直接或間接參與了細(xì)胞自噬發(fā)生過程的不同階段，如Beclin I, Vps34對細(xì)胞自噬的產(chǎn)生至關(guān)重要，通過特定自噬基因的RNA干擾或化合物，如 3—MA (3-methyladenine)、hydroxychloroquine、bafilomycin Al 5? monensin 抑制自噬發(fā)生的不同途徑來抑制自噬的發(fā)生，但自噬的抑制不一定能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已引起研究者越來越廣泛的關(guān)注，許多抗腫瘤藥物都可以誘發(fā)自噬的產(chǎn)生，自噬能賦予癌細(xì)胞耐受化療和放療療法，因此針對細(xì)胞自噬來控制腫瘤的發(fā)生，甚至相應(yīng)的治療策略已成為腫瘤防治的手段之一。
[0003]目前已有許多關(guān)于細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑和細(xì)胞自噬抑制劑的篩選方法，這些方法都集中于以細(xì)胞自噬過程中的某個分子為靶標(biāo)，如熒光標(biāo)記的LC3強(qiáng)弱變化等來篩選細(xì)胞自噬相關(guān)化合物，這些化合物不一定有殺死癌細(xì)胞的能力。眾所周知，細(xì)胞自噬是細(xì)胞自我調(diào)節(jié)的正常生理過程，一般細(xì)胞自噬可以保護(hù)細(xì)胞免受死亡威脅，但過度活躍的自噬同樣可以引起細(xì)胞的死亡，這種雙刃劍式的影響使細(xì)胞自噬難以成為發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑的工具。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)公開了 HDAC (組蛋白去乙?；?和組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶是一對調(diào)控組蛋白及非組蛋白乙?；癄顟B(tài)的酶，在正常生理?xiàng)l件下，它們的調(diào)控作用處于相對平衡的狀態(tài)，細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)化時，增強(qiáng)的HDAC活性使原有的基因表達(dá)失去平衡，與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化惡變，目前HDAC已成為腫瘤領(lǐng)域一個研究熱點(diǎn)，其中有些已用作腫瘤防治的靶標(biāo)，HDAC抑制劑在體內(nèi)和體外都能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或凋亡，多個HDAC抑制劑如LBH589已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，SAHA已于2012年獲美國FDA批準(zhǔn)上市。
[0005]另有研究顯示，抗腫瘤藥物的聯(lián)用往往表現(xiàn)出較原藥更強(qiáng)的抗腫瘤效果，細(xì)胞自曬抑制劑氯喹(Chloroquine, CQ)、氫化氯喹(hydroxychloroquine, HCQ)和一些細(xì)胞毒藥物聯(lián)用已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，和SAHA的聯(lián)用在體外實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出較好的效果，但目前還沒有藥物聯(lián)用方案的篩選方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是，涉及基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物及其篩選方法；具體涉及一種增加癌細(xì)胞對HDAC抑制劑敏感的小分子化合物及其篩選方法，以及HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物。
[0007]本申請基于LBH589和SAHA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)hsp90的乙?；?，hsp90的乙?；梢园l(fā)生在多個位點(diǎn)的研究，研究發(fā)現(xiàn)了 7個乙?；稽c(diǎn)，其中顯示，在LBH589的作用下，細(xì)胞內(nèi)hsp70和hsp90的乙?；?，也促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生，自噬抑制劑3-MA及CQ都能抑制LBH589誘導(dǎo)的自噬活性而引起癌癥細(xì)胞的死亡；本發(fā)明利用HDAC抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬為靶標(biāo)，篩選出能抑制這種自噬的、引起癌癥細(xì)胞死亡的化合物，從而確定HDAC抑制劑和哪種化合物聯(lián)用能刺激癌癥細(xì)胞的死亡，且用該方法發(fā)現(xiàn)使癌癥細(xì)胞對HDAC抑制劑敏感的小分子化合物。
[0008]本發(fā)明所涉及HDAC抑制劑包含所有能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白hsp90乙?；?、并發(fā)生細(xì)胞自噬的化合物，本發(fā)明的實(shí)施例中選用了 HDAC抑制劑LBH589和SAHA。細(xì)胞自噬對細(xì)胞的影響依細(xì)胞所處環(huán)境有關(guān)，細(xì)胞自噬的抑制并不一定導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，但HDAC抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生以保護(hù)細(xì)胞免受死亡威脅，在此情形下抑制細(xì)胞的自噬，如，具有抑制細(xì)胞自噬功能的氯喹將促使細(xì)胞死亡。本發(fā)明以比較細(xì)胞死亡程度，以細(xì)胞死亡所釋放的寡核小體和單核小體的量衡量細(xì)胞死亡的多少為測試的指標(biāo)；進(jìn)一步建立與細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑聯(lián)用的小分子化合物篩選方法，更進(jìn)一步的確定藥物聯(lián)用的方案。
[0009]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案進(jìn)行:
以腫瘤細(xì)胞為對象，用細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑分別與各單一化合物一起處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，測定所述的化合物與細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑引起培養(yǎng)的細(xì)胞死亡的程度，篩選基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物。
[0010]更具體的，本發(fā)明以腫瘤細(xì)胞為對象、用HDAC抑制劑分別與各單一化合物一起處理96孔板中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，HDAC抑制劑用于誘導(dǎo)96孔板中的細(xì)胞發(fā)生自噬，測定這些小分子化合物和HDAC抑制劑聯(lián)用引起細(xì)胞死亡的程度，由此篩選出可以和HDAC抑制劑聯(lián)用而有效地殺死癌細(xì)胞的小分子化合物。本發(fā)明的一個實(shí)施例中，進(jìn)行了 HDAC抑制劑LBH589和氯喹聯(lián)用的抗腫瘤活性測定，結(jié)果顯示100 nM的LBH589和20μΜ氯喹聯(lián)用時可以提高LBH589殺死MCF-7細(xì)胞的能力，但20μΜ氯喹本身對MCF-7的死亡影響不大；另一個實(shí)施例中，顯示HDAC抑制劑LBH589增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對氯喹的敏感性；另一個實(shí)施例中，進(jìn)行了與HDAC抑制劑LBH589聯(lián)用小分子化合物的篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，OD平均值越高聯(lián)用效果越好；以及manzamine A與LBH589聯(lián)用能更有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的生長；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了上述方法可以用于聯(lián)用藥物的篩選。進(jìn)一步制備HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物，所述的藥物組合物適于所有劑型。
[0011]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1.氯喹增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞對LBH589的敏感性，
I:對照組；2:5μΜ喜樹堿，陽性對照；3:含DMSO的對照組；4: 25nM LBH589; 5:50ηΜ;
6:1OOnM; 7: 100ηΜ+20μΜ 氯喹；8: 20μΜ。
[0012]圖2.LBH589增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞對氯喹的敏感性。
[0013]I:DMS0 對照組；2:100μΜ 氯喹；3:25nM LBH589 ；4: 25ηΜ ?ΒΗ589+20μΜ 氯喹；
5:25ηΜ ?ΒΗ589+50μΜ 氯喹；6:25ηΜ ?ΒΗ589+100μΜ 氯喹。
[0014]圖 3.LBH589 聯(lián)用 Manzamine A 對 MDA-MB-231 細(xì)胞生長的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不限制本發(fā)明。
[0016]實(shí)施例1.HDAC抑制劑LBH589和氯喹聯(lián)用測定抗腫瘤活性
用10%的FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜的乳腺癌細(xì)胞MCF-7經(jīng)消化后稀釋成含20000個/ml的細(xì)胞懸浮液，每孔加入200μ1細(xì)胞懸浮液，于37°C和5%的CO2條件下培養(yǎng)24小時后，吸掉培養(yǎng)基，加入含不同濃度的LBH589及/或20μΜ氯喹的培養(yǎng)基，含5μΜ喜樹堿和20μΜ氯喹培養(yǎng)基的細(xì)胞分別用作陽性和陰性對照。共同培養(yǎng)24小時后，200g離心10分鐘，用Roche公司的Cell Death Detect1n ELISAplus測定細(xì)胞死亡程度。結(jié)果顯示，隨著LBH589濃度的增加，MCF-7細(xì)胞的死亡越多；100 nM的LBH589和20μΜ氯喹聯(lián)用時可以提高LBH589殺死MCF-7細(xì)胞的能力，但20μΜ氯喹本身對MCF-7的死亡影響不大(如圖1所示)。本發(fā)明將該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步延伸應(yīng)用于篩選聯(lián)用藥物。
[0017]實(shí)施例2.HDAC抑制劑LBH589增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對氯喹的敏感性
10%的FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)消化后稀釋成含20000個/ml的細(xì)胞懸浮液，每孔加入 200μ1細(xì)胞懸浮液，于37°C和5%的CO2條件下培養(yǎng)24小時后，吸掉培養(yǎng)基，加入含25nM的LBH589及不同濃度氯喹的培養(yǎng)基，24小時后采用同實(shí)施例1的方法檢測細(xì)胞死亡程度。結(jié)果顯示，隨著氯喹濃度的增加，MDA-MB-231細(xì)胞對LBH589的敏感性增強(qiáng)，細(xì)胞死亡增加，而沒有LBH589存在下的氯喹，即使?jié)舛雀哌_(dá)100μΜ對MDA-MB-231細(xì)胞的死亡也無明顯影響(如圖2所示)。
[0018]實(shí)施例3.篩選與HDAC抑制劑LBH589聯(lián)用的小分子化合物
10%的FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)消化后稀釋成含20000個/ml的細(xì)胞懸浮液，每孔加入200μ1細(xì)胞懸浮液，于37°C和5%的CO2條件下培養(yǎng)24小時后，吸掉培養(yǎng)基，加入含25nM的LBH589及不同濃度氯喹的培養(yǎng)基或含100μΜ CQ的培養(yǎng)基作為參照，測定含25nM LBH589及10μΜ各化合物的培養(yǎng)條件下，采用同實(shí)施例1的方法檢測乳腺癌細(xì)胞經(jīng)24小時培養(yǎng)后的細(xì)胞死亡程度。表1-1和表1-2顯示了 62個單體化合物分別與25nM LBH 589聯(lián)用的三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，其中，OD平均值越高代表聯(lián)用效果越好。
[0019]1-1.與LBH589聯(lián)用化合物的篩選 ___

【權(quán)利要求】
1.基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法，其特征在于，以腫瘤細(xì)胞為對象，用細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑分別與各單一化合物一起處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，測定所述的化合物與細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑引起培養(yǎng)的細(xì)胞死亡的程度，篩選基于細(xì)胞自噬的抗腫瘤藥物。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑是誘導(dǎo)熱休克蛋白hsp90乙酰化的自噬誘導(dǎo)劑。
3.按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑是HDAC抑制劑。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的HDAC抑制劑選自LBH589或SAHA。
5.一種抗腫瘤藥物組合物，其特征在于，由細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑與氯喹組成，其中所述的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑為LBH589或SAHA。
6.一種抗腫瘤藥物組合物，其特征在于，由細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑與manzamine A組成，其中所述的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑為LBH589或SAHA。
7.按權(quán)利要求1所述 的方法，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞。
【文檔編號】A61K31/4706GK104164471SQ201410150221
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】楊永華, 姜曉筱, 包勇, 劉慧娟, 寇鑫輝 申請人:復(fù)旦大學(xué)