專利名稱：：細胞死亡誘導劑的制作方法細胞死亡誘導劑
技術領域：
死亡誘導劑，
背景技術：
HLA在將外源性抗原、細菌、病毒感染細胞等作為異物識別并將它們除去的免疫反應中是重要的分子。HLA分子的主要作用是向CD8+T細胞提呈細胞中產(chǎn)生的、由約810個M酸構(gòu)成的抗原肽，在由此誘導的免疫應答和免疫耐受中擔負非常重要的作用。HLA分為classI(I類)和classII(II類)，上述classI基于由ala3三個結(jié)構(gòu)i或組成的45KD的a鏈和12KD的p2微球蛋白(P2M)的異源二聚體而形成；上述classII基于由al、a2兩個結(jié)構(gòu)域組成的3(K34KD的a鏈和由pi、P2兩個結(jié)構(gòu)域組成的2629KD的卩鏈的異源二聚體而形成。并且，已知HLAclassI(HLA-I)中還存在HLA-A、B、C等(以下，將HLA-A也稱為"HLAclassIA(HLA-IA)")。迄今為止，有人報道了淋巴細胞通過與抗HLAclassIA抗體連接而具有細胞增殖抑制效果和細胞死亡誘導效果，表明HLA分子可能是信號傳遞分子。例如有才艮道稱抗人HLAclassIA的al結(jié)構(gòu)域的抗體B9.12.1、抗a2結(jié)構(gòu)域的抗體W6/32、抗a3結(jié)構(gòu)域的抗體TP25.99和抗體A1.4抑制活化淋巴細胞的細胞增殖(非專利文獻l、2)。另外，有報道稱抗al結(jié)構(gòu)域的兩種抗體MoAb90、YTH862誘導活化淋巴細胞的凋亡(非專利文獻2、3、4)。已經(jīng)明確由這兩種抗體誘導的凋亡是胱天蛋白酶介導的反應(非專利文獻4),由此推測在淋巴細胞中表達的HLAclassIA還參與凋亡的信號傳遞。并且，有報道稱抗人HLAclassIA的o3結(jié)構(gòu)域的抗體5H7(非專利文獻5)、抗小鼠MHCclassI的a2結(jié)構(gòu)域的抗體RE2(非專利文獻6)也在活化淋巴細胞等中i秀導細胞死亡。有人報道了對人骨髓瘤細胞進行免疫而得到的單克隆抗體2D7(非專利文獻9)也是識別HLAclassIA的抗體，通過將該2D7小分子化(雙抗體化)，可以在人骨髓瘤細胞中快速誘導嚴重的細胞死亡。2D7雙抗體對各種人骨髓瘤細胞抹和活化淋巴細胞顯示出強的細胞死亡誘導活性，在將人骨髓瘤細胞移植到小鼠中得到的多發(fā)性骨髓瘤模型小鼠中也顯示出顯著的延壽效果，所以其作為骨髓瘤治療藥正在開發(fā)之中(專利文獻1、2、3、4和非專利文獻7、8)。如果這種利用HLAclassI參與的細胞死亡誘導進行的治療得到進一步發(fā)展，則期待著開發(fā)對骨髓瘤等的有效性高的藥品。與本申請的發(fā)明有關的現(xiàn)有技術文獻信息如下所示。WO2004/033499[專利文獻2]WO2005/056603[專利文獻3]WO2005/100560[專利文獻4]PCT/JP2006/309890Fayen等人，Int.Immunol.10:1347-1358(1998)[非專利文獻2]Genestier等人，Blood90:3629-3639(1997)[非專利文獻3]Genestier等人,Blood卯726-735(1997)[非專利文獻4]Genestier等人，J.Biol.Chem.273:5060-5066(1998)[非專利文獻5]Woodle等人，J.Immunol.158:2156-2164(1997)[非專利文獻6]Matsuoka等人,J.Exp.Med,181:2007-2015(1995)[非專利文獻7]Goto等人.Blood84:1922-30(1994)[非專利文獻8]Kimura等人.BiochemBiophysResCommun.，325:1201-1209(2004)岡達三，三共生命科學財団研究報告集12:46-56(1998)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明鑒于上述狀況而設，其目的在于提供包括重鏈可變區(qū)的抗體，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的^J^酸序列組成的CDR1、2、3。本發(fā)明的目的還在于提供包括輕鏈可變區(qū)的抗體，上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記載的M酸序列組成的CDR1、2、3。詳細而言，本發(fā)明的目的在于提供識別HLAclassIA且具有較以往更高的細胞死亡誘導活性的抗體。解決課題的方法
技術領域：
：本發(fā)明人等為了解決上述課題進行了深入研究。首先，使用共表i^AHLAclassIA和人P2M的細胞對小鼠進行免疫，得到單克隆抗體。再篩選所得的抗體，得到具有細胞死亡誘導活性的10個克隆的新型單克隆抗體。解析這些克隆時發(fā)現(xiàn)表位中具有HLAclassI抗原的a2結(jié)構(gòu)域的3個克隆(C3B3、C11B9、C17D11抗體)通過與抗小鼠IgG抗體交聯(lián)，顯示出強的細胞毒活性。并且，通過將所得C3B3抗體修飾成低分子抗體(C3B3雙抗體)，成功創(chuàng)制了細胞死亡誘導激動性抗體，該抗體腫瘤活性。更具體而言，本發(fā)明提供以下[1][25]?？贵w，該抗體包括重鏈可變區(qū)，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3?？贵w，該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3;上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記載的M酸序列組成的CDR1、2、3。抗體，該抗體包括以下(e)-(h)中任一項所述的輕鏈可變區(qū)(e)輕鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:4記載的氨基,列；(f)輕鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:4記載的M酸序列中有一個或多個M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該輕鏈可變區(qū)與(e)所述的輕鏈可變區(qū)功能相同；(g)輕鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA所編碼的M酸序列；(h)輕鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列；抗體，該抗體包括以下(a;n:d)中任一項所述的重鏈可變區(qū)和(e卜(h)中任一項所述的輕鏈可變區(qū)(a)重鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:2記載的氨基斷列；(b)重鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:2記載的氨基酸序列中有一個或多個M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該重鏈可變區(qū)與(a)所述的重鏈可變區(qū)功能相同；(c)重鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:1記載的核苷酸序列的DNA所編碼的M酸序列；(d)重鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:1記載的核苦酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列；(e)輕鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:4記栽的M酸序列；(f)輕鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:4記載的M酸序列中有一個或多個氣基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該輕鏈可變區(qū)與(e)所述的輕鏈可變區(qū)功能相同；(g)輕鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA所編碼的氨基酸序列；(h)輕鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列；抗體，該抗體具有以下(aHd)中任一項所述的M酸序列(a)SEQIDNO:6記載的氨基酸序列；(b)在SEQIDNO:6記載的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列；(c)包含SEQIDNO:5記載的核苷蔣列的DNA所編碼的M齡列；(d)在嚴格條件下與包含SEQIDNO:5記載的核苷酸序列的DNA進《亍雜交的DNA所編碼的氨基酸序列；抗體，該抗體與表位結(jié)合，該表位與[1][7]中任一項所述的抗體所結(jié)合的人白細胞抗原(HLA)蛋白的表位相同；[l卜[8]中任一項所述的抗體，該抗體為單克隆抗體。[1][9]中任一項所述的抗體，該抗體識別人白細胞抗原(HLA);[10]所述的抗體，其中HLA為HLAclassI;[12][11]所述的抗體，其中HLAclassI為HLA-A;[13][1卜[12]中任一項所述的抗體，該抗體為低分子抗體；[14][13]所述的抗體，其中低分子抗體為雙抗體；[15]以下(a)或(b)所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其包含SEQIDNO:1、3或5記載的核苷齡列；(b)多核苷酸，其在嚴格條件下與(a)所述的多核苷酸進行雜交，并且編碼與[1][14]中任一項所述的抗體具有相同活性的抗體。載體，該載體包括[15]所述的多核苷酸。宿主細胞，該宿主細胞包括[15]所述的多核香酸或[16]所述的載體。[1][14]中任一項所述的抗體的制作方法，該方法包括以下步驟(a)制作[15]所述的多核苷酸的步驟；(b)制作載體的步驟，所述載體包4舌(a)所述的多核苷酸；(c)將(b)所述的載體導入宿主細胞中的步驟；(d)培養(yǎng)(c)所述的宿主細胞的步驟。細胞死亡誘導劑，其含有[1][14]中任一項所述的抗體作為有效成分。[19]所述的細胞死亡誘導劑，其特征在于該誘導劑誘導B細月包或T細力包的細胞死亡。[20]所述的細胞死亡誘導劑，其中B細胞或T細胞為活化B細胞或活4bT細月包。細胞增殖抑制劑，其含有[1][14]中任一項所述的抗體作為有效成分?？鼓[瘤藥，其含有[1][14]中任一項所述的抗體作為有效成分。[23]所述的抗腫瘤藥，其中胂瘤為血液腫瘤。[25]自身免疫疾病治療藥，其含有[1][14]中任一項所述的抗體作為有效成分。附圖簡述圖1是顯示利用FACS確認HLA表達Ba/F3細胞抹和ARH77細胞的HLAclassIA的表達量的結(jié)果的圖。圖2是顯示表iiA/小鼠嵌合HLAclassIA的細胞昧的模式圖，所述人/小鼠嵌合HLAclassIA是將HLAclassIA結(jié)構(gòu)域(ala3結(jié)構(gòu)域)中的一個結(jié)構(gòu)域置換成小鼠MHCclassIA所對應的結(jié)構(gòu)域而得到的。圖3以表的形式表示使用HLA-A/p2微球蛋白((32M)共表達Ba/F3細胞對小鼠進行免疫而得到的抗體10個克隆的表位解^f的結(jié)果。利用FACS解析與各種人/小鼠嵌合HLAclassIA表達Ba/F3細胞(MHH、HMH、HHM)的結(jié)合活性，確認到結(jié)合的表位用(+)表示，未確認到結(jié)合的表位用(-)表示。由各自的染色圖案確定各克隆的表位。圖4是顯示在二次抗體的存在或不存在下，研究用HLA-A/(32微球蛋白((52M)共表達Ba/F3細胞對小鼠進行免疫而得到的抗體10個克隆對ARH77的細胞死亡誘導活性的結(jié)果的圖。圖5-l是顯示2D7和新得到的C3B3、C17D11、C11B9的重鏈可變區(qū)的氛基^列的圖。圖5-2是顯示2D7和新得到的C3B3、C17D11、C11B9的輕鏈可變區(qū)的g^列的圖。圖6是顯示C3B3小抗體經(jīng)凝膠過濾層析法純化的分離圖語的圖。圖7是顯示經(jīng)凝膠過濾層析法分離的C3B3小抗體的各峰(1)(3)對ARH77的體外細胞毒活性的圖。圖8是顯示C3B3雙抗體(C3B3DB)和2D7雙抗體(2D7DB)各自對ARH77的體外細胞增殖抑制活性的曲線圖。圖9是顯示C3B3雙抗體(C3B3DB)和2D7雙抗體(2D7DB)各自對來自人骨髓瘤細胞(ARH77、IM-9、HS-Sultan、MC/CAR)的體外細胞增殖抑制活性的曲線圖。圖10是顯示IM-9移植小鼠中給予了PBS/吐溫20(對照)、2D7雙抗體(2D7DB)或C3B3雙抗體(C3B3DB)的小鼠的存活期間的圖。圖11是顯示IM-9移植小鼠中給予了PBS/吐溫20(對照)、2D7雙抗體(2D7DB)或C3B3雙抗體(C3B3DB)的小鼠在移植后第14天血清中人IgG量的圖。圖12是顯示C3B3雙抗體和2D7雙抗體各自對人末梢血單核細胞(PBMC)的體外細胞毒活性的圖。圖13是顯示C3B3雙抗體和2D7雙抗體對人T細胞系腫瘤細胞^的增殖抑制效果的圖。各抗體對培養(yǎng)了3天的Jurkat細胞顯示增殖抑制效果。實施發(fā)明的方式本發(fā)明涉及包括重鏈可變區(qū)的抗體，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3。本發(fā)明還涉及包括輕鏈可變區(qū)的抗體，上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記載的M酸序列組成的CDR1、2、3。本發(fā)明人等以HLAclassI作為抗原，得到了具有細胞死亡誘導活性的新型抗體。在這些抗體中，發(fā)現(xiàn)表位具有HLAclassI的a2結(jié)構(gòu)域的3個克隆(C3B3、C11B9、C17D11抗體)通過與抗小鼠IgG抗體交聯(lián)，顯示出強的細胞毒活性。并且，通過利用抗體工程技術將C3B3抗體修飾成低分子抗體(雙抗體)，成功提供了激動劑抗體(C3B3雙抗體)，該抗體自身發(fā)揮出較以往的2D7抗體的雙抗體強的抗腫瘤效果。本發(fā)明正是基于上述發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供包括重鏈可變區(qū)的抗體，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3。本發(fā)明還提供包括輕鏈可變區(qū)的抗體，上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記栽的^J^酸序列組成的CDR1、2、3。對本發(fā)明的抗體沒有特別限定，只要具有重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)即可，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基^列組成的CDR1、2、3,上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3。本發(fā)明抗體的優(yōu)選例子有包括以下(a卜(d)中任一項所述的重鏈可變區(qū)的抗體。(a)重鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:2記載的氨基酸序列；(b)重鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:2記載的M酸序列中有一個或多個M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的^J-酸序列，該重鏈可變區(qū)與(a)所述的重鏈可變區(qū)功能相同；(c)重鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:1記載的核苷酸序列的DNA所編碼的M酸序列；(d)重鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:l記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列?；蛘?，本發(fā)明抗體的例子有包括以下(e卜(h)中任一項所述的輕鏈可變區(qū)的抗體。(e)輕鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:4記載的M酸序列；(f)輕鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:4記載的M酸序列中有一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該輕鏈可變區(qū)與(e)所述的輕鏈可變區(qū)功能相同；(g)輕鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA所編碼的氨基酸序列；(h)輕鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的氨基酸序列。并且，具有上述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體的例子有具有以下(a)(d)中任一項所述的氨基酸序列的抗體。(a)SEQIDNO:6記載的M酸序列；(b)在SEQIDNO:6記載的絲齡列中有一個或多個4J^酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列；(c)包含SEQIDNO:5記載的核苷,列的DNA所編碼的絲餅列；(d)在嚴格條件下與包含SEQIDNO:5記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列。重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的M酸序列可以被取代、缺失、附加和/或插入。并且，使重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)締合時，只要具有抗原結(jié)合活性即可，可以缺失一部分，也可以附加其它多肽。另外，還可以將可變區(qū)嵌合或人源化。其中"功能相同，，是指，作為對象的抗體與具有重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的抗體具有相同的活性(例如HLA-A結(jié)合活性、細胞死亡誘導活性等)，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3,上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記栽的#^酸序列組成的CDR1、2、3。作為用于制備與某一多肽功能相同的多肽的、本領域技術人員所熟知的方法，已知有向多肽中導入突變的方法。例如，本領域技術人員通過利用位點特異性誘變法(Hashimoto-Gotoh,T.等人.(1995)Gene152，271-275;Zoller，MJ和Smith,M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500;Kramer,W.等人.(1984)NucleicAcidsRes.12,9441-9456;KramerW和FritzHJ(1987)Methods.Enzymol.154,350-367;Kunkel，TA(1985)ProcNatl.Acad.Sci.USA.82，488-492;Kunkel(1988)MethodsEnzymol.85，2763-2766)等，向本發(fā)明抗體中導入適當?shù)耐蛔?，可以制備與該抗體功能相同的抗體。另外，氨基酸的突變也可以在自然界中發(fā)生。因此，具有本發(fā)明抗體的M酸序列中有一個或多個氨基貌t生突變而得到的M酸序列、且與該抗體功能相同的抗體也包含在本發(fā)明的抗體中。對發(fā)生突變的M酸數(shù)沒有特別限定，通常為30個氨基酸以內(nèi)、優(yōu)選為15個M酸以內(nèi)、進一步優(yōu)選為5個M酸以內(nèi)(例如3個氨基酸以內(nèi))。在發(fā)生突變的氨基酸殘基中，優(yōu)選突變成保存有氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的另一種氨基酸。例如，氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的例子有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性M酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羥基的側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子的側(cè)鏈的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和酰胺的側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含堿基的側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)和具有含芳族的側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括弧內(nèi)均表示氨基酸的一文字標記)。已知具有對某M酸序列通過一個或多個氛基酸殘基的缺失、附加和/或用其它M酸取代而被修飾的氨基酸序列的多肽可維持其生物學活性(Mark,D.F.等人，Proc.Natl.Acad,Sci.USA(1984)81,5662-5666;Zoller，M.J.&Smith,M.NucleicAcidsResearch(1982)10,6487-6500;Wang,A.等人，Science224，1431-1433;Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)USA79，6409-6413)。本發(fā)明的抗體還包括在本發(fā)明抗體的氨基酸序列中附加了多個氨基酸殘基的抗體。另外，還包括上述抗體與其它肽或蛋白融合的融合蛋白。制作融合蛋白的方法可以采用本領域技術人員所公知的方法，即連接編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸與編碼其它肽或多肽的多核苷酸使構(gòu)架一致，將其導入表達載體中，使之在宿主中表達即可。作為與本發(fā)明抗體融合的其它肽或多肽，例如可以使用FLAG(Hopp，T.P.等人,BioTechnology(1988)6，1204-1210)、包含6個His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片4更、VSV-GP片段、pi8HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E畫tag、SV40T抗原片段、lcktag、a-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C片段等公知的肽。另外，與本發(fā)明抗體融合的其它多肽例如有GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、HA(流感血凝素)、免疫球蛋白恒定區(qū)、P-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)等。使市售的編碼這些肽或多肽的多核苷酸與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸融合，使由此制備的融合多核苷酸表達，從而可以制備融合多肽。另外，本發(fā)明還提供結(jié)合在與本發(fā)明所公開的抗體所結(jié)合的表位相同的表位上的抗體。即，本發(fā)明涉及識別與本發(fā)明抗體所識別的表位相同的表位的抗體及其用途。上述抗體例如可以利用以下方法得到。受試抗體結(jié)合在與某抗體所結(jié)合的表位相同的表位上、即與某抗體共有表位，這可以通過兩者對同一表位的竟爭來確認。本發(fā)明中，抗體間的竟爭可以通過FACS或交叉阻斷分析來檢測。在FACS中，首先使本發(fā)明的單克隆抗體與使HLA-IA在細胞表面表達的細胞結(jié)合，測定熒光信號。接下來，使候選竟爭抗體與細胞反應，之后使本發(fā)明的抗體與相同的細胞反應，同樣利用FACS進行解析?；蛘?，還可以使本發(fā)明的單克隆抗體與受試竟爭抗體同時與相同的細胞反應。使竟爭抗體反應時，如杲本發(fā)明抗體的FACS解析圖案發(fā)生變化，則可以確認竟爭抗體與本發(fā)明抗體識別相同的表位。此外，例如竟爭ELISA分析為優(yōu)選的交叉阻斷分析。具體而言，在交叉阻斷(cross-blocking)分析中，將表達HLA-IA的細胞固定在微量滴定板的孔上。在候選竟爭抗體的存在下或不存在下進行預溫育，之后添加本發(fā)明的單克隆抗體。與孔中的HLA-IA表達細胞結(jié)合的本發(fā)明的抗體量，與竟爭結(jié)合在相同表位上的候選竟爭抗體(受試抗體)的結(jié)合能反相關。即，受試抗體與同一表位的親和性越大，本發(fā)明抗體與固定有HLA-IA蛋白表達細胞的孔的結(jié)合量越低。或者，反之，受試抗體與同一表位的親和性越大，受試抗體與固定有HLA-IA蛋白表達細胞的孔的結(jié)合量越增加。通過預先標記抗體，可以容易地測定與孔結(jié)合的抗體量。例如，生物素標記的抗體可以通過4吏用抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物和適當?shù)牡孜飦頊y定。利用了過氧化物酶等酶標記的交叉阻斷分析特別稱為競爭ELISA分析?？贵w可以用可^^測或可測定的其它標記物標記。具體公知的有放射標記或焚光標記等。并且，當受試抗體具有來自不同于本發(fā)明抗體的種的恒定區(qū)時，還可以使用特異性識別來源于任意的種的恒定區(qū)的識別抗體，測定與孔結(jié)合的任一種抗體。或者，即使是來源于相同種的抗體，當類型不同時，可以使用特異性識別各類型的抗體測定與孔結(jié)合的抗體。與不存在候選竟爭抗體時實施的對照試驗中得到的結(jié)合活性相比，候選抗體可以阻斷至少20%、優(yōu)選至少20-50%、進一步優(yōu)選至少50%的本發(fā)明的單克隆抗體的結(jié)合時，該候選竟爭抗體是與本發(fā)明抗體實質(zhì)上結(jié)合在相同表位上、或竟爭結(jié)合在相同表位上的抗體。作為結(jié)合在與本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位相同的表位上的抗體，例如有上述[8]或[9]所述的抗體。如上所述，上述[8]或[9]所述的抗體中，不僅包括單價抗體，還包括多價抗體。本發(fā)明的多價抗體中，包括具有完全相同的抗原結(jié)合部位的多價抗體、或者具有一部分不同或完全不同的抗原結(jié)合部位的多價抗體。本發(fā)明的抗體根據(jù)后述的產(chǎn)生該抗體的細胞或宿主或純化方法，而在氨基酸序列、分子量、等電點或是否具有糖鏈或構(gòu)象等方面有所不同。但所得抗體只要具有與本發(fā)明抗體相同的功能，就包括在本發(fā)明中。例如，使本發(fā)明抗體在原核細胞例如大腸桿菌中表達時，在原始抗體的氨基酸序列的N末端附加曱硫氨酸殘基。本發(fā)明的抗體也包括這樣的抗體。本發(fā)明的抗體還可以是與聚乙二醇(PEG)、放射性物質(zhì)、毒素等各種分子結(jié)合的綴合抗體。上述綴合抗體可以通過對所得抗體實施化學修飾而得到。需要說明的是，抗體的修飾方法已在本領域中確立(例如US5057313、US5156840)。本發(fā)明中的"抗體"還包括上述綴合抗體。作為本發(fā)明的抗體，可以適當使用小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、綿羊抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體等。并且，本發(fā)明的抗體可以使用低分子抗體等。作為本發(fā)明的抗體，可以使用以下抗體將抗體基因插入適當?shù)妮d體中，將該栽體導入宿主中，利用基因重組技術產(chǎn)生的基因重組型凈元體(例長口參'照Carl,A.K.Borrebaeck,James,W.Larrick,THERAPEUTICMONOCLONALANTIBODIES,PublishedintheUnitedKingdombyMACMILLANPUBLISHERSLTD,1990)。具體而言，當?shù)玫骄幋a具有由SEQIDNO:7、8、9記載的^J^酸序列組成的CDR1、2、3的重鏈可變區(qū)或具有由SEQIDNO:10、11、12記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3的輕鏈可變區(qū)的DNA時，將其與編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，將其插入表達載體中?；蛘?，體中。為了在表達調(diào)節(jié)區(qū)例如增強子、啟動子的調(diào)節(jié)下進行表達，將DNA插入表達載體中。接下來，可以利用該表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，使抗體表達。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸、或者在嚴格條件下與核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸只要編碼本發(fā)明的抗體即可，沒有特別限定，是包含多個脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的堿基或堿基對的聚合物。本發(fā)明的多核苷酸可以包含非天然的堿基。本發(fā)明的多核香酸可以在利用基因工程方法表達抗體時使用。另外，本發(fā)明的多核苷酸還可以在篩選與本發(fā)明的抗體具有相同功能的抗體時用作探針。即，使用編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸或其一部分作為探針，利用雜交、基因擴增技術(例如PCR)等技術，可以得到在嚴*件下與該多核苷酸雜交、且編碼與本發(fā)明的抗體具有相同活性的抗體的DNA。這種DNA也包含在本發(fā)明的多核苷酸中。雜交技術(Sambrook，J.等人，MolecularCloning第2版，9.47-9,58，ColdSpringHarborLab.press,1989)為本領域技術人員所熟知的技術。作為雜交條件，例如有嚴格性差的雜交條件。嚴格性差的雜交條件是指，在雜交后的清洗中例如42。C、0.1xSSC、0.1。/。SDS的條件，優(yōu)選為50°C、0.1xSSC、0.1%SDS的條件。更優(yōu)選的雜交條件例如有嚴格性強的雜交務降。嚴4各性強的雜交條件是指例如65""C、5xSSC和0.1。/。SDS的條件。在這些條件中，溫度越高越可以期待高效率地得到具有高同源性的多核苷酸。但是，作為影響雜交嚴格性的要素，要考慮溫度或鹽濃度等多個要素，本領域技術人員通過適當選擇這些要素，可以實現(xiàn)相同的嚴格性。利用上述雜交技術或基因擴增技術而得到的多核苷酸所編碼的、與本發(fā)明抗體功能相同的抗體，通常與上述抗體在M酸序列方面具有高同源性。本發(fā)明的抗體中還包含與本發(fā)明抗體功能相同、且與該抗體的M酸序列具有高同源性的抗體。高同源性是指，在氛基酸水平上通常具有至少50%以上的同源性、優(yōu)選75%以上的同源性、進一步優(yōu)選85%以上的同源性、更進一步優(yōu)選95%以上的同源性。確定多肽的同源性時，可以按照文獻(Wilbur，W.J.和Lipman,D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730)中記載的公式來確定。編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸的優(yōu)選例子有以下(a)或(b)記載的多核香酸。(a)包含SEQIDNO:l、3或5記載的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴格條件下與(a)所述的多核苷酸雜交、且編碼與本發(fā)明的抗體具有相同活性的抗體的多核苷酸。暫且分離抗體基因，將其導入適當?shù)乃拗髦兄谱骺贵w時，可以使用適當?shù)乃拗髋c表達載體的組合。本發(fā)明提供包括上述多核苷酸的載體。載體的例子有M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。為了亞克隆、切除cDNA時，除上述載體外，例如還有pGEM-T、pDIRECT、pT7等載體。為了產(chǎn)生本發(fā)明的抗體而使用載體時，表達載體特別有用。作為表達載體，例如為了在大腸桿菌中表達時，載體除了具有在大腸桿菌中擴增的上述特征外，當以JM109、DH5a、HBIOI、XL1-Blue等大腸桿菌作為宿主時，還必須持有可以在這些大腸桿菌中高效率地表達的啟動子、例如lacZ啟動子(Ward等人，Nature(1989)341,544-546;FASEBJ.(1992)6，2422-2427)、araB啟動子(Better等人,Science(1988)240,1041-1043)或T7啟動子等。作為這樣的載體，除上述載體外，還包括pGEX-5X-l(Pharmacia社制)、"QIAexpresssystem，，(Quiagen社制)、pEGFP、或者pET(此時宿主優(yōu)選表達T7RNA聚合酶的BL21)等。載體中還可以包括用于多肽分泌的信號序列。作為用于多肽分泌的信號序列，當向大腸桿菌的周質(zhì)中分泌蛋白時，可以使用pelB信號序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169,4379)。例如可以利用氯化鈣法、電穿孔法將載體導入宿主細胞中。除大腸桿菌外，用于制備本發(fā)明的多肽的載體例如還有來源于哺乳動物的表達載體(例如pcDNA3(Invitrogen社制)或pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990，18(17)，第5322頁)、pEF、pCDM8)、來源于昆蟲細胞的表達載體(例如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)，，(Gibco-BRL社制)、pBacPAK8)、來源于植物的表達載體(例如pMHl、pMH2)、來源于動物病毒的表達載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、來源于反轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體(例如pZIPneo)、來源于酵母的表達載體(例如"PichiaExpressionKit，，(Invitrogen社制)、pNVl1、SP-QOl)、來源于枯草菌的表達載體(例如pPL608、pKTH50)。為了在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中表達，載體必須具有在細胞內(nèi)表達所必需的啟動子、例如SV40啟動子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR啟動子、EFla啟動子(Mizushima等人，NucleicAcidsRes.(19卯)18,5322)、CMV啟動子等，進一步優(yōu)選具有用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的基因(例如可用藥物(新霉素、G418等)判別的耐藥性基因)。具有上述特性的載體的例子有pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。并且，為了穩(wěn)定表達基因且擴增細胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)時，可以列舉以下方法向缺失核酸合成路徑的CHO細胞中導入填補該路徑的具有DHFR基因的載體(例如pCHOI等)，再用曱氨蝶呤(MTX)擴增該載體的方法。另外，為了瞬時表達基因，可以列舉以下方法使用染色體上具有表達SV40T抗原的基因的COS細胞，用持有SV40的復制起點的載體(pcD等)進行轉(zhuǎn)化的方法。復制起點可以使用來源于多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的起點。為了在宿主細胞系中擴增基因拷貝數(shù)，表達載體可以進一步含有氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TX)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。另一方面，作為在動物體內(nèi)表達本發(fā)明的多核苷酸的方法，可以列舉將本發(fā)明的多核苷酸插入適當?shù)妮d體中，再利用例如反轉(zhuǎn)錄病毒法、脂質(zhì)體法、陽離子脂質(zhì)體法、腺病毒法等將其導入機體內(nèi)的方法等。所用載體例如有腺病毒載體(例如pAdexlcw)或反轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如pZIPneo)等，但并不限于這些。將本發(fā)明的多核苷酸插入載體中等的一般基因操作可以按照常規(guī)方法進行(MolecularCloning,5.61-5.63)。對機體內(nèi)給藥可以按照先體外后體內(nèi)(exvivo)法進行，也可以按照體內(nèi)(invivo)法進行。本發(fā)明還提供導入有本發(fā)明的載體的宿主細胞。對導入有本發(fā)明的載體的宿主細胞沒有特別限定，例如可以使用大腸桿菌或各種動物細胞等。本發(fā)明的宿主細胞可以用作例如用于制備或表達本發(fā)明抗體的產(chǎn)生系統(tǒng)。用于制備多肽的產(chǎn)生系統(tǒng)包括體外(invitro)和體內(nèi)(invivo)產(chǎn)生系統(tǒng)。體外產(chǎn)生系統(tǒng)例如有使用真核細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用原核細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。使用真核細胞時，例如可以將動物細胞、才直物細胞、真菌細胞用于宿主。動物細胞包括哺乳動物細胞例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、NIH3T3、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎(babyhamsterkidney))、HeLa、Vero;兩棲動物細胞例如非洲爪蟾卵母細胞(Xewo/^/aev^ooc聲es)(Valle等人，Nature(1981)291:358-340);或者昆蟲細胞例如Sf9、Sf21、Tn5。作為CHO細胞，特別適合使用缺失了DHFR基因的CHO細胞"-dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)或CHOK-l(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60,1275)。動物細胞中，以大量表達為目的時，特別優(yōu)選CHO細胞。關于向宿主細胞內(nèi)導入載體，例如可以通過以下方法來進行磷酸4丐法、DEAE-葡聚糖法、<吏用陽離子核糖體DOTAP(Boehringer-Mannheim社制)的方法、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等方法。植物細胞例如有來源于煙草(iWcof/amjrto6acww)的細胞，其作為多肽產(chǎn)生系統(tǒng)而眾所周知，可以對其進行愈傷組織培養(yǎng)。真菌細胞例如有酵母、例如酵母菌(Sacc/wrrawyces)屬(例如啤酒酵母CS(3cc^arawycascerev&z'ae));絲狀菌、侈'j^口曲審(^s;7erg77/w5)屬(，j^口,累、曲審(/^;7erg"/1^使用原核細胞時，有使用細菌細胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。細菌細胞包括大腸桿菌(￡.//)例如迴109、DH5a、HB101等，此外還已知枯草桿菌。利用目標多核苷酸轉(zhuǎn)化上述細胞，并在體外培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的細胞而得到抗體?？梢园凑展椒ㄟM行培養(yǎng)。例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為動物細胞的培養(yǎng)液。此時，還可以結(jié)合使用胎牛血清(FCS)等血清補充液，也可以進行無血清培養(yǎng)。培養(yǎng)時的pH優(yōu)選為約6~8。通常是在約3040。C下培養(yǎng)約15200小時，根據(jù)需要可以交換培養(yǎng)基或進行通氣、攪拌。另一方面，作為在體內(nèi)產(chǎn)生多肽的系統(tǒng)例如有使用動物的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用植物的產(chǎn)生系統(tǒng)。向這些動物或植物中導入目標多核苷酸，使在動物或植物體內(nèi)產(chǎn)生多肽并回收。本發(fā)明的"宿主"包括上述動物和植物。使用動物時，有使用哺乳動物和昆蟲的產(chǎn)生系統(tǒng)。哺乳動物可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛(VickiGlaser,SPECTRUMBiotechnologyApplications,1993)。另外，使用哺乳動物時，可以使用轉(zhuǎn)基因動物。例如，制備目標多核苷酸，將其作為和山羊P-酪素等乳汁中固有產(chǎn)生的編碼多肽的基因的融合基因。然后，將包括該融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中，將該胚胎移植到雌山羊體內(nèi)。接受了胚胎的山羊生出轉(zhuǎn)基因山羊，從該轉(zhuǎn)基因山羊或其后代所產(chǎn)生的乳汁中可以得到目標抗體。為了使由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有多肽的乳汁量增加，可以給予上述轉(zhuǎn)基因山羊適當?shù)募に?Ebert,K.M.等人，Bio/Technology(1994)12,699-702)。作為昆蟲，例如可以使用蠶。使用蠶時，通過使蠶感染插入有目標多核苷酸的桿狀病毒，可以從該蠶的體液中得到目標多肽(Susumu，M.等人，Nature(1985)315，592-594)。并且，使用植物時，例如可以使用煙草(to^c00)。使用煙草時，將目標多核苷酸插入植物表達用栽體例如pMON530中，將該載體導入根瘤土壤桿菌(v4gro6a"en'wmfwwe/ac!'era)等細菌中。用該細菌感染煙草例如煙草(Mc加'a脂to&cww)，可以從該煙草的葉中得到所需的多肽(JuIianK,C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24,131-138)。由此得到的本發(fā)明的抗體，可以將其從宿主細胞內(nèi)或細胞外(培養(yǎng)基等)分離，并純化成實質(zhì)上純粹且均勻的抗體?？贵w的分離、純化可以采用通?？贵w的純化中所使用的分離、純化方法，但沒有任何限制。例如，可以適當選擇、組合層析柱、過濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、重結(jié)晶等來分離、純化抗體。層析例如有親合層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization(蛋白質(zhì)純化與鑒定實-瞼指南)ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshark等人，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1996)。上述層析可以使用液相層析例如HPLC、FPLC等來進行。親合層析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有HyperD、POROS、SepharoseF.F.(Pharmacia)等。本發(fā)明還包含利用上述純化方法進行高度純化的抗體。本發(fā)明中，測定所制備的抗體的抗原結(jié)合活性(AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow，DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)時，可以使用/〉知的方法。例如可以采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(it射免疫測定法)或熒光免疫法等。本發(fā)明還提供抗體的制作方法，該方法包括制作上述多核苷酸的步驟；制作包括上述多核苷酸的載體的步驟；將上述載體導入宿主細胞中的步驟；以及培養(yǎng)上述宿主細胞的步驟。另外，在本發(fā)明中，為了降低對人的異種抗原性等，可以使用人工修飾的基因重組型抗體、例如嵌合抗體、人源化抗體等。上述修飾抗體可以采用已知的方法來制備。嵌合抗體是指包含人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體，將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其插入表達載體中，再將該表達載體導入宿主中，即可得到嵌合抗體。人源化抗體也稱重構(gòu)(reshaped)人抗體，是指將人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的互補性決定區(qū)(CDR;complementaritydeterminingregion)移植到人抗體的互補性決定區(qū)而得到的抗體，其通常的基因重組方法也是已知的。具體而言，利用PCR法由制作成末端部具有重疊部分的多個寡核苷酸合成DNA序列，上述DNA序列設計成連接小鼠抗體的CDR與人抗體的構(gòu)架區(qū)(frameworkregion;FR)。人源化抗體可如下得到連接所得DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA,然后插入表達載體中，再將該表達載體導入宿主中，4吏之產(chǎn)生抗體(參照歐洲專利申請公開號EP239400、國際專利申請公開號WO96/02576)。經(jīng)由CDR連接的人抗體的FR中，選擇互補性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。根據(jù)需要，可以取代抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補性決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K.等人,CancerRes.(1993)53,851-856)。另外，獲得人抗體的方法也是已知的。例如，在體外用所需抗原或表達所需抗原的細胞致敏人淋巴細胞，使致敏淋巴細胞與人骨髓瘤細胞例如U266融合，也可以得到具有抗原結(jié)合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878)。另外，可以通過用所需抗原對具有全套人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物進行免疫而獲得所需人抗體(參照國際專利申請公開號W093/12227、WO92/03918、WO94/02602、W094/25585、WO96/34096、W096/33735)。并且，還已知使用人抗體文庫，通過淘選來獲得人抗體的技術。例如，可以利用噬菌體展示法使人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)在噬菌體表面表達，選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。通過解析所選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果清楚了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，就可以制作具有該序列的適當?shù)谋磉_栽體，獲得人抗體。上述方法廣為人知，可以參考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、W093/11236、W093/19172、W095脇38、W095/15388。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為識別人白細胞抗原(HLA)的抗體。本發(fā)明中識別人白細胞抗原(HLA)的抗體在提高活性方面有用。其中，活性是指抗體通過與抗原結(jié)合而產(chǎn)生的生物學作用。其具體例子有細胞死亡誘導作用、凋亡誘導作用、細胞增殖抑制作用、細胞分化抑制作用、細胞分裂抑制作用、細胞增殖誘導作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作用、細胞周期調(diào)節(jié)作用等。優(yōu)選為細胞死亡誘導作用、細胞增殖抑制作用。對作為細胞死亡誘導作用、細胞增殖抑制作用等上述作用的對象的細胞沒有特別限定，但優(yōu)選造血細胞和非粘附細胞。造血細胞的具體例子有淋巴細胞(B細胞、T細胞)、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞(優(yōu)選活化的末梢血單核細胞(PBMC))、血液腫瘤細胞(骨髓瘤細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞)等，優(yōu)選淋巴細胞(B細胞、T細胞、活化B細胞、活化T細胞)，特別是活化B細胞或活化T細胞以及血液腫瘤細胞最優(yōu)選。非粘附細胞是指，培養(yǎng)細胞時細胞不附著在玻璃或塑料等培養(yǎng)器的表面、而以非粘附狀態(tài)進行增殖的細胞。本發(fā)明中，非粘附細胞的優(yōu)選例子有Jurkat細胞或ARH77細胞。相對于此，粘附細胞(附著細胞)是指，培養(yǎng)細胞時附著在玻璃或塑料等培養(yǎng)器表面的細胞。通常，為了增強細胞死亡誘導活性，可以將全長抗HLA抗體與抗IgG抗體等交聯(lián)，交聯(lián)可以利用本領域技術人員所公知的方法進行。本發(fā)明的抗體是否在非粘附細胞中誘導細胞死亡，這可以通過本發(fā)明的抗體是否在Jurkat細胞或ARH77細胞中誘導細胞死亡來判定。抗體是否在粘附細胞中誘導細胞死亡，這可以通過本發(fā)明的抗體是否在HeLa細胞中箭導細胞死亡來判定(W02004/033499)。本發(fā)明中，通過給予上述識別HLA的抗體，可以治療或預防下述疾病例如血液腫瘤(造血系統(tǒng)肺瘤)等腫瘤(具體例子有白血病、骨髓增生異常綜合征、惡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、漿細胞異常癥(骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥)、骨髓增殖性疾病(真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、特發(fā)性骨髓纖維化癥)等)或自身免疫疾病(具體例子有風濕病、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性水皰癥、自身免疫性腎上腺皮質(zhì)炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性嗜中性粒細胞減少癥、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性受體病、自身免疫性不孕癥、克羅恩氏(Crohn，s)病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、巴塞多氏(Basedow，s)病、少年糖尿病、阿狄森氏(Addison，s)病、重癥肌無力、晶狀體性葡萄膜炎、干褲、白塞氏(Behchet，s)病等)等疾病。另外，考慮到本發(fā)明的抗體在才幾體內(nèi)的穩(wěn)定性優(yōu)異，所以認為對機體給藥時將特別有效。本發(fā)明中，HLA是指人白細胞抗原。HLA分子分為classI和classII，classl的例子已知有HLA-A、B、C、E、F、G、H、J等，classII的例子已知有HLA-DR、DQ、DP等。本發(fā)明的抗體所識別的抗原只要是HLA分子即可，沒有特別限定，但優(yōu)選分類為classI的分子，更優(yōu)選為HLA-IA。本發(fā)明的抗體可以是低分子抗體。在本發(fā)明中，低分子抗體包括全長抗體(例如全長IgG等)的一部分缺失的抗體片段，只要具有抗原結(jié)合能即可，沒有特別限定。本發(fā)明的抗體片段只要是全長抗體的一部分即可，沒有特別限定，但優(yōu)選包括重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL),特別優(yōu)選為包括VH和VL兩方的片段。抗體片段的具體例子有Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv(單鏈Fv)、sc(Fv》等，但優(yōu)選為雙抗體(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883;Plickthun"ThePharmacologyofMonoclonalAntibody(單克隆抗體藥理學)"第113巻，Resenburg和Moore編，SpringerVerlag，NewYork，第269-315頁，(1994))。為了得到這樣的抗體片段，可以用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等處理抗體使生成抗體片段，或者構(gòu)建編碼上述抗體片段的基因，將其導入表達載體中，之后使之在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_即可(例如參照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976;Better,M.和Horwitz，A.H.，MethodsEnzymol.(1989)178,476-496;Pluckthun，A.和Skerra，A.,MethodsEnzymol.(1989)178，497-515;Lamoyi,E.，MethodsEnzymol.(1986)121，652-663;Rousseaux，J.等人，MethodsEnzymol.(1986)121，663-669;Bird,R.E.和Walker，B.W.,TrendsBiotechnol.(1991)9，132-137)。本發(fā)明中的低分子抗體優(yōu)選較全長抗體的分子量小，但有時也會形成例如二聚體、三聚體、四聚體等多聚體，有時還會較全長抗體的分子量大。本發(fā)明中，優(yōu)選的低分子抗體為包括抗體的兩個以上的VH和兩個以上的VL、且上述各可變區(qū)直接或經(jīng)由接頭等間接結(jié)合的抗體。結(jié)合可以是共價結(jié)合也可以是非共價結(jié)合，還可以是共價結(jié)合和非共價結(jié)合兩方。進一步優(yōu)選的低分子抗體為包括兩個以上的VH和VL通過非共價鍵結(jié)合而成的VH-VL對的抗體。此時，優(yōu)選低分子抗體中一方的VH-VL對與另一方的VH-VL對之間的距離較全長抗體中的距離短的抗體。本發(fā)明中，scFv是通過連接抗體的H鏈V區(qū)與L鏈V區(qū)而得到的。在該scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)經(jīng)由接頭、優(yōu)選肽接頭進行連接(Huston,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以是上述作為抗體記載的任一種來源。作為連接V區(qū)的肽接頭，例如4吏用由12~19個氨基酸殘基組成的任意的單鏈肽。編碼scFv的DNA可如下得到以編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA和編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA作為沖莫板，利用PCR法，將這些序列中的編碼所需M酸序列的DNA部分用規(guī)定其兩端的引物對進行擴增，然后再使編碼肽接頭部分的DNA和其兩端分別少見定為與H鏈、L鏈連接的引物對組合，進行擴增而得到。一旦制作了編碼scFv的DNA，就可以按照常規(guī)方法得到含有上述DNA的表達栽體和經(jīng)該表達載體轉(zhuǎn)化的宿主。另外，使用該宿主，按照常規(guī)方法可以得到scFv。關于上述抗體片段，可以如上操作獲得其基因并使之表達，在宿主中產(chǎn)生。本發(fā)明中所說的"抗體"也包括這些抗體片段。本發(fā)明中，特別優(yōu)選的低分子抗體為雙抗體(diabody)。雙抗體是指，使兩個由可變區(qū)與可變區(qū)經(jīng)接頭等連接而形成的片段(例如scFv等)(以下稱為構(gòu)成雙抗體的片段)結(jié)合而形成的二聚體，通常包括兩個VL和兩個VH(P,Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA90，6444-6448(1993);EP404097號；W093/11161號；Johnson等人，MethodinEnzymology，203,88-98，(1991);Holliger等人，ProteinEngineering,9，299-305(1996);Perisic等人，Structure,2，1217-26(1994);John等人,ProteinEngineering,12(7)，597-604，(1999);Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90，6444-6448，(1993);Atwell等人，Mol.Immunol,33,130卜1312，(1996))。構(gòu)成雙抗體的片段間的鍵可以是非共價鍵也可以是共價鍵，但優(yōu)選為非共價鍵。另外，還可以將構(gòu)成雙抗體的片段彼此用接頭等連接，形成單鏈雙抗體(sc雙抗體)。此時，若將構(gòu)成雙抗體的片段彼此用約20個氨基酸長的接頭連接，則存在于同一鏈上的構(gòu)成雙抗體的片段之間可以形成非共價鍵，從而形成二聚體。構(gòu)成雙抗體的片段包括VL與VH連接而成的片段、VL與VL連接而成的片段、VH與VH連接而成的片段等，優(yōu)選為VH與VL連接而成的片段。在構(gòu)成雙抗體的片段中，對連接可變區(qū)與可變區(qū)的接頭沒有特別限定，優(yōu)選使用短至在同一片段中的可變區(qū)之間無法形成非共價鍵的接頭。上述接頭的長度可以由本領域技術人員適當決定，但通常為2~14個氨基酸、優(yōu)選39個氨基酸、特別優(yōu)選為4~6個"tj^酸。此時，編碼在同一片段上的VL和VH由于其間的接頭短，而無法在同一鏈上的VL和VH之間形成非共價鍵，無法形成單鏈V區(qū)片段，從而利用與其它片段的非共價鍵形成二聚體。并且，還可以按照與制作雙抗體相同的原理，使三個以上的構(gòu)成雙抗體的片段結(jié)合，制作三聚體、四聚體等多聚體抗體。作為本發(fā)明中的雙抗體，可以例示具有SEQIDNO:6記載的氨基酸序列的雙抗體；或具有SEQIDNO:6記栽的M酸序列中有一個或多個M酸發(fā)生突變(取代、缺失、插入和/或附加)而得到的氨基酸序列、且與具有SEQIDNO:6記載的M酸序列的雙抗體功能相同的雙抗體；或者具有SEQIDNO:2的CDR(或可變區(qū))和SEQIDNO:4的CDR(或可變區(qū))的氨基酸序列的雙抗體；或具有SEQIDNO:2的CDR(或可變區(qū))和SEQIDNO:4的CDR(或可變區(qū))的^J^酸序列中有一個或多個M酸發(fā)生突變(取代、缺失、插入和/或附加)而得到的^tJ^蔣列、且與具有SEQIDNO:2的CDR(或可變區(qū))和SEQIDNO:4的CDR(或可變區(qū))的序列的雙抗體功能相同的雙抗體，但并不限于這些。其中，"功能相同"是指，作為對象的雙抗體與具有SEQIDNO:6記載的M酸序列的雙抗體或具有SEQIDNO:2的CDR(或可變區(qū))和SEQIDNO:4的CDR(或可變區(qū))的序列的雙抗體具有相同的活性(例如與HLA-A的結(jié)合活性、細^JL亡誘導活性等)。對發(fā)生突變的氨基酸數(shù)目沒有特別限定，但通常為30個氨基酸以內(nèi)，優(yōu)選為15個M酸以內(nèi)，進一步優(yōu)選為5個M酸以內(nèi)(例如3個氨基酸以內(nèi))。另外，為了降低對人的異種抗原性等，可以將具有SEQIDNO:6記載的M酸序列的雙抗體或具有SEQIDNO:2的CDR(或可變區(qū))和SEQIDNO:4的CDR(或可變區(qū))的序列的雙抗體進4亍人源化或嵌合化。在SEQIDNO:2記載的絲齡列中，第1號第125號相當于可變區(qū)，第31號第35號相當于CDR1(SEQIDNO:7),第50號~第66號相當于CDR2(SEQIDNO:8)，第99號~第114號相當于CDR3(SEQIDNO:9)。在SEQIDNO:4記載的^J^酸序列中，第1號~第107號相當于可變區(qū)，第24號第34號相當于CDR1(SEQIDNO:10),第50號第56號相當于CDR2(SEQIDNO:11)，第89號~第97號相當于CDR3(SEQIDNO:12)。本發(fā)明中，識別HLA的低分子抗體只要與HLA進行特異性結(jié)合、并具有生物學作用即可，沒有特別限定。本發(fā)明的低分子抗體可以利用本領域技術人員所公知的方法進行制作。例如，可以如實施例所述，根據(jù)識別HLA的抗體的序歹ij(特別是可變區(qū)的序列和互補性決定區(qū)(CDR)的序列)，采用本領域技術人員所公知的基因重組技術來制作。識別HLA的抗體的序列可以使用已公知的抗體的序列，或者以HLA作為抗原，利用本領域技術人員所公知的方法制作抗HLA抗體，取得該抗體序列并加以使用。具體而言，例如可如下進行。使用HLA蛋白或其片段作為致敏抗原，按照通常的免疫方法對其進行免疫，再按照通常的細胞融合法使所得免疫細胞與公知的親本細胞融合，利用通常的篩選法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細胞(雜交瘤)?？乖闹苽淇梢园凑展姆椒?、例如使用桿狀病毒的方法(W098/46777等)等進行。雜交瘤的制作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73:3-46)等來進行。當抗原的免疫原性4氐時，可以使抗原與白蛋白等具有免疫原性的巨大分子結(jié)合進行免疫。之后，使用逆轉(zhuǎn)錄酶，由雜交瘤的mRNA合成抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA，所得cDNA的序列可以用公知的方法進行解讀。識別HLA的抗體只要與HLA結(jié)合即可，沒有特別限定，可適當使用小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、綿羊抗體、人抗體等。另外，為了降低對人的異種抗原性等，還可以使用人工修飾的基因重組型抗體、例如嵌合抗體、人源化抗體等。上述^"飾抗體可以采用已知的方法來制備。嵌合抗體是指包含人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體等，所述嵌合抗體可通過下述方法得到將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其插入表達載體中，再將該表達載體導入宿主中，使之產(chǎn)生嵌合抗體。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體誘導細胞死亡?；谶@一發(fā)現(xiàn)，胞增殖抑制劑。另外，本發(fā)明人等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將抗HLA抗體小分子化而得到的雙抗體對人骨髓瘤模型動物具有抗腫瘤效果(WO2004/033499)。并且，認為本發(fā)明抗體的細胞死亡誘導活性在活化T細胞或B細胞中效果特別大。因此，認為本發(fā)明的抗體對癌癥等腫瘤(特別是血液胂瘤)或自身免疫疾病的治療或預防特別有效。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的抗體作為有效成分的抗腫瘤藥或自身免疫疾病治療藥。另外，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的抗體作為有效成分的細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑?？紤]到本發(fā)明抗體的細胞死亡誘導活性在活化T細胞或B細胞中效果特別大，因此認為其對癌癥等腫瘤(特別是血液腫瘤)或自身免疫疾病的治療或預防特別有效。如上所述，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明抗體的癌癥等腫瘤(特別是血液腫瘤)或自身免疫疾病的治療方法或預防方法。使用未進行小分子化的抗體作為有效成分時，優(yōu)選與抗IgG抗體等交聯(lián)。本發(fā)明的藥物還可以和干擾素結(jié)合使用。通過將抗HLAclassI抗體和干擾素結(jié)合使用，可以大大增強細胞死亡誘導等抗HLAclassI抗體的作用(W02006/123724)。通常，干擾素是指利用病毒、雙鏈RNA、凝集素等從動物細胞中誘發(fā)的、具有抗病毒作用的蛋白或糖蛋白的總稱。干擾素除具有抗病毒作用外，還具有細胞增殖抑制作用、免疫調(diào)節(jié)作用。根據(jù)產(chǎn)生細胞、與特異性受體的結(jié)合能、生物和物理化學性質(zhì)，干擾素被分為數(shù)種類型，主要有a、P、y,此外還存在IFNco、IFNt。并且，已知干擾素a中還存在20種以上的亞型?，F(xiàn)在不僅有天然型干擾素制劑，就連PEG-干擾素、復合干擾素等各種基因重組型制劑也已開發(fā)、上市。本發(fā)明中的干擾素可以是上述任一種類型，但優(yōu)選為a或Y。本發(fā)明中的干擾素只要增強由抗HLAclassI抗體誘導的細胞死亡即可，可以是天然型、人工修飾的基因重組型、天然存在的突變體、融合蛋白或它們的片段等任一種。對本發(fā)明中的干擾素的來源沒有特別限定，例如可以來源于人、黑猩猩、猩猩(馬來西亞產(chǎn))、狗、馬、綿羊、山羊、驢、豬、貓、小鼠、豚鼠、大鼠、兔等，但并不限于這些，可以來源于其它哺乳動物。優(yōu)選為來源于人的干擾素。在本發(fā)明中，本發(fā)明的抗體與干擾素的結(jié)合使用是指，將本發(fā)明的抗體與干擾素一同給藥或使用(以下，僅記作"給藥")，對給藥順序或給藥間隔等沒有限定。本發(fā)明的抗體與干擾素的給藥順序可以是下述任一順序給予干擾素后再給予本發(fā)明的抗體、同時給予干擾素和本發(fā)明的抗體、或者給予本發(fā)明的抗體后再給予干擾素，但優(yōu)選為給予干擾素后再給予本發(fā)明的抗體、或同時給予干擾素和本發(fā)明的抗體，進一步優(yōu)選為給予干擾素后再給予本發(fā)明的抗體。在給予干擾素后再給予本發(fā)明抗體的情況下，對干擾素和本發(fā)明抗體的給藥間隔沒有特別限定，可以考慮給藥途徑和劑型等要因后再設定。給藥間隔的一個例子為通常為0小時72小時，優(yōu)選為0小時~24小時，進一步優(yōu)選為0小時~12小時。本發(fā)明的抗體可以和干擾素一起制成一種醫(yī)藥組合物。另外，本發(fā)明的抗體可以制成以與干擾素結(jié)合使用為特征的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的藥物可以以藥品形式進行給藥，可以經(jīng)口服或胃腸外進行全身或局部給藥。例如，可以選擇點滴等靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，可以根據(jù)患者的年齡、癥狀選擇適宜的給藥方法。有效給藥量在每次、每lkg體重為0.01mg100mg的范圍內(nèi)選擇。或者可以選擇每名患者為1~1000mg、優(yōu)選550mg的給藥量。關于優(yōu)選的給藥量、給藥方法，例如當為識別HLA的抗體時，血中存在游離抗體的程度的量為有效給藥量，具體例子有每個月(4周)每1kg體重1次或分為數(shù)次給予0.5mg~40mg、優(yōu)選lmg20mg,例如按照2次/周、l次/周、l次/2周、1次/4周等給藥時間表，通過點滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法進行給藥的方法等。還可以邊觀察給藥后的狀態(tài)和血液檢查值的動向，邊調(diào)整給藥時間表，例如將給藥間隔由2次/周或1次/周延長至1次/2周、1次/3周、1次/4周等。本發(fā)明的藥物中可以添加保存劑或穩(wěn)定劑等制劑上可接受的載體。制劑上可接受的載體是指其本身具有或不具有上述活性、可與上述藥物一同給藥的制劑上可接受的材料。還可以是即使不具有上述活性、但通過與抗HLA抗體結(jié)合使用而具有協(xié)同或相加效果的材料。制劑上可接受的材料例如包括滅菌水或生理鹽水、穩(wěn)定劑、賦形劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑(EDTA等)、粘合劑等。本發(fā)明中，作為穩(wěn)定劑，可以使用0.2%左右的明膠或葡聚糖、0.1-1.0%的谷氨酸鈉、或者約5%的乳糖或約2%的山梨醇等，但并不限于這些。保存劑的典型例子有0.01%左右的疏柳汞或0.1%左右的p-丙內(nèi)酯等。本發(fā)明中，表面活性劑的例子有非離子表面活性劑，典型例子有脫水山梨糖醇單辛酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯等脫水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；單硬脂酸十聚甘油酯、二硬脂酸十聚甘油酯、單亞油酸十聚甘油酯等脂肪酸聚甘油酯；聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟等聚氧乙烯蠟衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB6-18的非離子表面活性劑等。另外，表面活性劑還包括陰離子表面活性劑，典型例子有十六烷基硫酸鈉、十二烷基疏酸鈉、油烯基硫酸鈉等具有碳原子數(shù)為10~18的烷基的烷基碌L酸鹽；聚氧乙烯十二烷基碌u酸鈉等環(huán)氧乙烷的平均加成摩爾數(shù)為2~4、烷基的碳原子數(shù)為10~18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基磺基琥珀酸酯鈉等烷基的碳原子數(shù)為8~18的烷基磺基琥珀酸酯鹽；天然系的表面活性劑例如有卯磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂等鞘磷脂類；碳原子數(shù)為1218的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。在本發(fā)明的藥物中，可以添加上述表面活性劑中的一種或?qū)煞N以上組合添加。本發(fā)明的制劑中使用的優(yōu)選的表面活性劑為聚山梨酸酯20、40、60或80等聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，特別優(yōu)選聚山梨酸酯20和80。另外，還優(yōu)選泊洛沙姆(PluronicF-68(注冊商標)等)所代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。表面活性劑的添加量根據(jù)使用的表面活性劑的種類而不同，使用聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80時，其添加量通常為0.001100mg/mL,優(yōu)選為0.003~50mg/mL，進一步優(yōu)選為0,0052mg/mL。本發(fā)明中，緩沖劑的例子有磷酸、枸櫞酸緩沖液、乙酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、葡萄糖酸、辛酸、去氧膽酸、水楊酸、三乙醇胺、富馬酸、其它有機酸等、或碳酸緩沖液、Tris緩沖液、組氨酸緩沖液、咪唑緩沖液等。另外，可以將本發(fā)明的藥物溶解于溶液制劑領域中公知的水性緩沖液中，制成溶液制劑。緩沖液的濃度通常為1500mM，優(yōu)選為5~100mM,進一步優(yōu)選為1020mM。另外，本發(fā)明的藥物可以含有其它小分子多肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)、M酸、多糖和單糖等糖類或碳水化合物、糖醇。本發(fā)明中，氨基酸的例子有堿性氨基酸、例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、烏氨酸等，或這些氨基酸的無機鹽(優(yōu)選鹽酸鹽、磷酸鹽的形式、即磷酸氨基酸)。使用游離氨基酸時，通過添加適當?shù)纳砩峡山邮艿木彌_物質(zhì)、例如無機酸、特別是鹽酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它們的鹽，而調(diào)節(jié)至優(yōu)選的pH值。此時，使用磷酸鹽在得到特別穩(wěn)定的冷凍干燥物方面特別有利。在制備物實質(zhì)上不含有機酸、例如蘋果酸、酒石酸、枸櫞酸、琥珀酸、富馬酸等的情況下或者不存在對應的陰離子(蘋果酸離子、酒石酸離子、枸櫞酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等)的情況下特別有利。優(yōu)選的氨基酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸。并且，還可以使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸及其鹽的形式(優(yōu)選鈉鹽)；或中性氨基酸、例如異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、曱硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；或芳族氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或其衍生物N-乙?；彼?。本發(fā)明中，多糖和單糖等糖類和碳水化合物的例子有葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖和蜜三糖等。本發(fā)明中，糖醇的例子有甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。制成注射用水溶液時，例如有生理鹽水、含葡萄糖或其它佐劑的等滲溶液、例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉，可以與適當?shù)闹軇?、例如?乙醇等)、聚醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑(聚山梨酸酯80、HCO-50)等結(jié)合使用。根據(jù)需要，可以進一步含有稀釋劑、助溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、安慰劑(soothingagent)、含碌逸原劑、抗氧化劑等。本發(fā)明中，含硫還原劑的例子有N-乙?；腚装彼帷-乙?；桶腚装彼帷⒘蛐了?、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、以及碳原子數(shù)為1~7的硫代烷酸等具有硫氫基的還原劑等。本發(fā)明中，抗氧化劑的例子有異抗壞血酸、二丁基羥基曱苯、丁基羥基茴香醚、a-生育酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞碌b酸氫鈉、亞石危酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等螯合劑。根據(jù)需要，還可以將藥物裝入微嚢(羥甲基纖維素、明膠、聚[曱基丙烯酸甲酯]等的微嚢)中，或者制成膠體藥物傳遞系統(tǒng)(脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳、納米粒子和納米嚢等)(參照"Remington'sPharmaceuticalScience第16版，，，Oslo編,1980等)。并且，將藥物制成緩釋制劑的方法也已公知，可適用于本發(fā)明(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.1981，15:167-277;Langer，Chem.Tech.1982,12:98-105;美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman等人，Biopolymers1983,22:547-556;EP第133,988號)。所使用的制劑上可接受的載體，根據(jù)劑型從上述載體中適當或組合進行選擇，但并不限于這些。制備注射劑時，根據(jù)需要添加pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定化劑、保存劑等，利用常規(guī)方法制成皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)注射劑。關于注射劑，可以將溶液收納在容器中，之后通過冷凍干燥等制成固體制劑，作為臨用前調(diào)制的制劑。另外，可以將單劑量收納在容器中，也可以將多劑量收納在同一容器中。本發(fā)明藥物的給藥方法可以采用公知的各種方法。本發(fā)明中，"給藥，，包括口服給藥或胃腸外給藥?？诜o藥的例子有以口服制劑的形式進行的給藥。作為口服制劑，可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠嚢劑、溶液劑、乳劑或懸浮劑等劑型。胃腸外給藥的例子有以注射劑形式進行的給藥，注射劑的例子有點滴等靜脈注射劑、皮下注射劑、肌肉注射劑或皿內(nèi)注射劑等。另外，可以采用基因療法，向機體內(nèi)導入含有應該給予的寡核苷酸的基因，從而達到本發(fā)明方法的效果。還可以將本發(fā)明的藥物在欲實施處置的區(qū)域進行局部給藥。例如，還可以通過手術中的局部注入、導管的使用、或通過編碼本發(fā)明抑制劑的DNA的耙基因傳遞進行給藥。對患者給藥時，除了采用例如動脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射等以外，還可以利用本領域技術人員所公知的方法進行經(jīng)鼻、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮或口服給藥。給藥量根據(jù)患者的體重、年齡、給藥方法等而變動，但本領域技術人員可以適當選擇適當?shù)慕o藥量。另外，當該化合物可通過DNA進行編碼時，還可以考慮將該DNA插入基因治療用載體中進行基因治療。給藥量、給藥方法根據(jù)患者的體重、年齡、癥狀等而變動，但本領域技術人員可適當選擇。本發(fā)明藥物的一次給藥量還根據(jù)給藥對象、對象臟器、癥狀、給藥方法而不同，例如以注射劑的形式進行給藥時，通常成人(體重60kg)每天約0.1~1000mg、優(yōu)選約1.0-50mg、更優(yōu)選約1.020mg。胃腸外給藥時，其一次給藥量還根據(jù)給藥對象、對象臟器、癥狀、給藥方法而不同，例如以注射劑的形式進行給藥時，認為成人(體重60kg)通常按照每天約0.01~30mg、優(yōu)選約1,0~20mg、更優(yōu)選約0.1-10mg左右，通過靜脈注射進行給藥比較適合。對其它動物給藥時，也可以給予每60kg體重的換算量或每體表面積的換算量。接種方法適當與否，這要考慮藥物種類、接種對象的種類等來確定。容器可以是小瓶(vial)、預充式注射器制品(pre-filledsyringe)。根據(jù)需要，可以是溶液狀也可以是通過冷凍干燥等得到的粉末制品?？梢允且淮谓臃N用也可以是多次接種用。給藥量才艮據(jù)接種對象的種類、體重、年齡、給藥方法等而變動，但本領域技術人員可W適當選擇適當?shù)慕o藥量。需要說明的是，本說明書中引用的所有專利、公開專利公報和公開文獻，均以參照的形式納入本說明書中。實施例以下，通過實施例來進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受限于這些實施例。建立表達HLAclassIA/卩2M的Ba/F3細胞株建立表達人HLAclassIA和人卩2M的Ba/F3細胞。首先，如下制作全長HLAclassIA(HLA-fUll)表達載體。以編碼全長HLAclassIA的cDNA為模板，使用以下引物(sHLA-l、fHLA-3，)進行PCR,擴增編碼全長HLAclassIA的基因片段。sHLA-1:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(SEQIDNO:13)fHLA-3，TTGCGGCCGCTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGACA(SEQIDNO:14)用EcoRI/Notl切斷所得DNA片段，并插入動物細胞表達載體pCXND3的EcoRI/Notl間，構(gòu)建全長HLAclassIA(fHLA-A)表達栽體(pCXND3-HLA掘)。接下來，如下制作全長P2-微球蛋白(p2M)表達載體。以來源于人脾臟的cDNA(人脾臟cDNA，Clontech弁S1206)為模板，使用以下引物(卩2M-1、卩2M-2)進行PCR，擴增編碼全長J32M的基因片段。J32M-1:AAGCGGCCGCCACCATGTCTCGCTCCGTGGC(SEQIDNO:15),-2:TTTCTAGATTACATGTCTCGATCCCACTTAACT(SEQIDNO:16)用Notl/Xbal切斷所得DNA片段，并插入pCOS2-ZEO的Notl/Xbal間，構(gòu)建全長p2M表達載體(pCOS2zeo-p2M)。然后，如下建立表達HLA-A/p2M的Ba/F3細胞抹。用Pvul切斷各20,g的pCXND3-HLA-fUll和pCOS2zeo-p2M，之后利用電穿孔法(BIO-RAD社GenePulser,0.33kV，950^F，timeconst.27.0)將其導入到懸浮于PBS(-)中的Ba/F3細胞(lxl07細胞/mL，800;/L)中。用生長培養(yǎng)基(RPMI1640+10%FCS+P/S+1ng/mLIL-3)稀釋至適當?shù)募毎麛?shù)后，接種在96孔板中，第二天添加G418和Zeocin,使分別達到400^g/mL和800//g/mL。之后每隔34天交換一半的培養(yǎng)基，IO天后選擇單一克隆。通過2D7IgG(10//g/mL)染色來測定所得表達HLA-A/卩2M的Ba/F3細胞林(弁9、#10、#22)、和ARH77細胞中HLAclassIA的表達量，利用FACS(COULTER,EUTE)解析各抗原在細胞膜上的表達(圖1)。其結(jié)果,確認到在細胞林約中具有與ARH77細胞相同水平的HLAclassIA的表達。于是，將該細胞林用含有1ng/mLIL-3、500〃g/mLG418、800//g/mLZeocin(Invitrogen#46-0072)和10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基大量培養(yǎng)，用于細胞免疫。細胞免疫將表達HLA-A/P2M的Ba/F3細胞抹(BaF-HLA#9)用PBS(-)清洗兩次，之后懸浮于PBS(-)中使達到1.52.0xl()7細胞/200〃L,將200戶L該懸浮液注入小鼠(MRL/lpr,雄性，4周齡，日本CharlesRiver)腹腔內(nèi)進行免疫(lmLTerumo注射器，針26G)。1周免疫1次，共免疫8次，第9周用200/^L2.5xl(f細胞/200;uL的懸浮液進行最終免疫，4天后進行細胞融合。雜交瘤的制作經(jīng)無菌操作從小鼠體內(nèi)摘出脾臟，在培養(yǎng)基l[RPMI1640(+P/S)]中攪勻，制成單一細胞懸浮液。將該懸浮液通過70/mi的尼龍篩(Falcon),除去脂肪組織等，計算細胞數(shù)。將所得B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(P3U1細胞)以約2:1的細胞數(shù)比進行混合，加入1mL50%的PEG(Roche,cat#:783641，lot#:14982000)，進行細胞融合。將已融合的細胞懸浮于培養(yǎng)基2[RPMI1640(+P/S,10%FCS)]中，按100^L/孔分注到適當板數(shù)(10板)的96孔板中，在37。C下培養(yǎng)。第二天，按IOO;/L/孔加入培養(yǎng)基3[RPMI1640(+P/S,10%FCS,HAT(Sigma,H0262)，5%BMCondimedHI(Roche,cat#:1088947,lot#:14994800))],以后每天從每孔中除去100pL培養(yǎng)基、并按100//L/孔加入新的培養(yǎng)基3，重復操作4天。細胞死亡誘導抗體的篩選自細胞融合起約1周后篩選具有細胞死亡誘導活性的雜交瘤。細胞死亡誘導抗體的篩選以細胞聚集誘導能為指標如下進行。將表達HLA-A/卩2M的Ba/F3細胞按2.5x104細胞/孔接種在96孔板中，加入80/zL各雜交瘤的培養(yǎng)上清，在37。C下培養(yǎng)1小時。之后，加入抗小鼠IgG抗體(Cappel#55482,#55459),使達到6//g/mL。再培養(yǎng)4小時以進行交聯(lián)反應，之后用顯微鏡觀察細胞，選擇觀察到細胞聚集的孔。篩選1000個克隆份的培養(yǎng)上清，結(jié)果最終得到10個陽性雜交瘤。重新向96孔板中接種上述陽性孔的細胞使達到2.5細胞/孔，培養(yǎng)約10天，再次解析細胞聚集誘導活性。通過該操作得到IO種單一克隆?？贵w組(panel)的制作5-1.抗體的純化使用1mLHiTrap蛋白GHP柱(AmershamBiosciences#17-0404-01)，從所得克隆的雜交瘤的80mL培養(yǎng)上清中純化抗體。以1mL/分鐘的流速吸附雜交瘤上清，用20mL20mM的磷酸緩沖液(pH7.0)清洗后，用3.5mL0.1M的甘氨酸-HCl(pH2.7)進行洗脫。將洗脫組分按每0.5mL回收在事先加入了50//L1M的Tris-HCl(pH9.0)的微量離心管(Eppendorftube)中。測定OD加nm，合并含有抗體的組分，加入PBS(-)使總量達到2.5mL，之后使用PD-10柱(AmershamBiosciences#17-0851-01)將緩沖液置換成PBS(-)。使已純化的抗體通過0.22,m的濾器(MILLIPORE#SLGV033RS),以下詳細研究各純化抗體的性質(zhì)。5-2.亞型的確定抗體的亞型確定使用IsoStrip(Roche#1493027)來進行。確定亞型時使用經(jīng)PBS(-)稀釋了IO倍的雜交瘤的培養(yǎng)上清。5-3.表位解析5-3-1.小鼠MHCclassIA基因的克隆為了解析所得抗體識別HLAclassIA分子上的哪一個結(jié)構(gòu)域，如下建立表達嵌合HLAclassIA的細胞林(圖2)，上述嵌合HLAclassIA是將HLAclassIA的各種結(jié)構(gòu)域(al結(jié)構(gòu)域、a2結(jié)構(gòu)域、a3結(jié)構(gòu)域)分別置換成小鼠MHCclassI對應的結(jié)構(gòu)域而得到的。首先，以小鼠MHCclassIA基因作為模板，按以下方法進行克隆。利用以下引物(mHLA-l和mHLA-2)，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA弁R005)對小鼠脾臟cDNA(MTC組，Clontech)進行PCR，擴增小鼠HLAclassIA的基因片段。mHLA-1:CTGCTCCTGCTGTTGGCGGC(SEQIDNO:17)mHLA-2:CAGGGTGAGGGGCTCAGGCAG(SEQIDNO:18)將所得基因片段TA克隆(TA-cloning)到pCRII-TOPO(InvitrogenTOPOTA-cloningkit，#45-0640)中，來確認核香^f列。5-3-2.構(gòu)建用于表位解析的嵌合HLA-A表達載體然后，如下實施構(gòu)建用于表位解析的嵌合HLA-A表達載體。HLA-A的al結(jié)構(gòu)域為小鼠(MHH)的MHH表達載體(pCOS2-chHLA-MHHflag)按以下方法進行構(gòu)建。以具有全長HLA-A的表達載體(pCXND3-HLAftill)為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005),利用以下引物(sHLA-A和chHLA-Hl)將HLA-A的信號序列(片段A)進行PCR擴增。sHLA-A:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(包括EcoRI位點)(SEQIDNO:19)chHLA-Hl:AATCTAGACTGGGTCAGGGCCAGGGCCCC(包括Xbal位點)(SEQIDNO:20)另外，利用以下引物(chHLA-H2和chHLA-H3)，將HLA-A的從a2結(jié)構(gòu)域到終止密碼子的序列(片段B)進行PCR擴增。chHLA-H2:TTTCTAGAGCCGGTTCTCACACCATCCAGAGG(包括Xbal位點)(SEQIDNO:21)chHLA-H3:AAGGATCCCACTTTACAAGCTGTGAGAGACACAT(包括BamHI位點)(SEQIDNO:22)用Eco-RI-XbaI切斷片段A、用Xbal-BamHI切斷片段B,將這些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI間。確認所得質(zhì)粒的核苷酸序列，作為pCOS2-(M)HH。同時，以小鼠MHCclassIA基因為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA弁R005),利用以下引物(chHLA-Ml和chHLA-M2)，將小鼠MHCclassIA的al結(jié)構(gòu)域(片段C)進行PCR擴增。chHLA-Ml:TTTCTAGAGCGGGCCCACATTCGCTGAGG(包括Xbal位點)(SEQIDNO:23)chHLA-M2:TTTCTAGACTGGTTGTAGTATCTCTGTGCGGTCC(包括Xbal位點)(SEQIDNO:24)用Xbal切斷所得片段C,并插入用Xbal切開的pCOS2-(M)HH中。確認核苷酸序列，完成將al結(jié)構(gòu)域置換成小鼠MHC-A的表達載體pCOS2-chHLA-MHH-flag的構(gòu)建。a2結(jié)構(gòu)域為小鼠(HMH)的HMH表達栽體(pCOS2-chHLA-HMHflag)按以下方法進行構(gòu)建。以具有全長HLA-A的表達載體(pCXND3-HLAfUll)為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005),利用以下引物(sHLA-A和chHLA-H4),將HLA-A的信號序列-al結(jié)構(gòu)域(片段D)進行PCR擴增。sHLA-A:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(包括EcoRI位點)(SEQIDNO:19)chHLA-H4:TTGTCGACCCGGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAG(包括Sail位點)(SEQIDNO:25)另外，使用以下引物(chHLA-H5和chHLA-H3)，將HLA-A的從a3結(jié)構(gòu)域到終止密碼子(片,殳E)進行PCR擴增。chHLA-H5:AAGTCGACGCCCCCAAAACGCATATGACT(包括Sail位點)(SEQIDNO:26)chHLA-H3:AAGGATCCCACTTTACAAGCTGTGAGAGACACAT(包括BamHI位點)(SEQIDNO:22)用EcoRI-SalI切斷片段D、用Sall-Bamffl切斷片段E,將這些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI間。確認所得質(zhì)粒的核苷斷列，作為pCOS2-H(M)H。同時，以小鼠MHCclassIA基因為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA存R005)，利用以下引物(chHLA-M3和chHLA-M4)，將小鼠MHCclassIA的a2結(jié)構(gòu)域(片段F)進行PCR擴增。chHLA-M3:TTGTCGACCACGTTCCAGCGGATGTTCGGC(包括Sail位點)(SEQIDNO:27)chHLA掘GAGTCGACGCGCAGCAGCGTCTCATTCCCG(包括Sail位點)(SEQIDNO:28)用Sail切斷所得片段F，將其插入用Sail切開的pCOS2-H(M)H中。確認核香酸序列，完成將a2結(jié)構(gòu)域置換成小鼠MHC-A的表達載體pCOS2-chHLA-HMH-flag的構(gòu)建。a3結(jié)構(gòu)域為小鼠(HHM)的HHM表達載體(pCOS2-chHLA-HHMflag)按以下方法進行構(gòu)建。以具有全長HLA-A的表達載體(pCXND3-HLAfiill)為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，利用以下引物(sHLA-A和chHLA-H6),將HLA-A的信號序列-a2結(jié)構(gòu)域(片段G)進行PCR擴增。sHLA-A:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(包括EcoRI位點)(SEQIDNO:19)chHLA-H6:TTTCTAGAGTCCGTGCGCTGCAGCGTCTCCT(包括Xbal位點)(SEQIDNO:29)另外，使用以下引物(chHLA-H7和chHLA-H3)，將HLA-A的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(片段H)進行PCR擴增。chHLA-H7:TTTCTAGAATGGGAGCCGTCTTCCCAGCCCA(包括Xbal位點)(SEQIDNO:30)chHLA-H3:AAGGATCCCACTTTACAAGCTGTGAGAGACACAT(包括BamHI位點)(SEQIDNO:22)用EcoRI-XbaI切斷片段G、用Xbal-BamHI切斷片段H,將這些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI間。確認所得質(zhì)粒的核普酸序列，作為pCOS2-HH(M)。同時，以小鼠MHCclassIA基因為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，利用以下引物(chHLA-M5和chHLA-M6),將小鼠畫CclassIA的a3結(jié)構(gòu)域(片段I)進行PCR擴增。chHLA-M5:AATCTAGAAAGGCCCATGTGACCTATCACCCC(包括Xbal位點)(SEQIDNO:31)chHLA掘TATCTAGAGTGAGGGGCTCAGGCAGCCCC(包括Xbal位點)(SEQIDNO:32)用Xbal切斷所得片段I,將其插入用Xbal切開的pCOS2-HH(M)中。確認核苷酸序列，完成將a3結(jié)構(gòu)域置換成小鼠MHC-A的表達載體pCOS2-chHLA-HHM-flag的構(gòu)建。ala3結(jié)構(gòu)域為小鼠(MMM)的MMM表達載體(pCOS2-chHLA-MMMflag辨以下方法進行構(gòu)建。用EcoRI-XbaI切斷片段A、用Xbal-BamHI切斷片段H，將這些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI間。確i人所得質(zhì)粒的核苷酸序列，作為pCOS2-(MMM)。以小鼠MHCclassIA基因為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，利用以下引物(chHLA-Ml和chHLA-M6)，將小鼠MHCclassIA的ala3結(jié)構(gòu)域(片段J)進行PCR擴增。chHLA-Ml:TTTCTAGAGCGGGCCCACATTCGCTGAGG(包括Xbal位點)(SEQIDNO:23)chHLA德TATCTAGAGTGAGGGGCTCAGGCAGCCCC(包括Xbal位點)(SEQIDNO:32)用Xbal切斷所得片段J,將其插入用Xbal切開的pCOS2-(MMM)中確認核苷酸序列，完成將cxla3結(jié)構(gòu)域置換成小鼠MHC-A的表達栽體pCOS2-chHLA-MMM-flag的構(gòu)建。5-3-3.建立用于表位解析的表達嵌合HLA-A/卩2M的Ba/F3細月沐用Pvul切斷各20pg的pCOS2-chHLA-MHH-flag、pCOS2-chHLA-HMH-flag、pCOS2-chHLA-HHM-flag和pCOS2-chHLA-MMM-flag,再利用電穿孔法(BIO-RAD社GenePulser,0.33kV，950〃F,timeconst.27.0)導入到懸浮于PBS(-)中的Ba/F3細胞(lx107細胞/mL,800//L)中。用生長培養(yǎng)基(RPMI1640+l()o/oFCS+P/S+1ng/mLIL-3)稀釋至適當?shù)募毎麛?shù)后，接種在96孔板中，第二天添加G418使達到500pg/mL。10天后在顯微鏡下選擇單一克隆。關于上述克隆，將lxl()S個細胞溶解于50//L0.5%的NP40lysis緩沖液(含有0.5%NP40、150mMNaCl和5mMEDTA的10mMTris-HCl(pH7.5))中，使用12;uL上清液進行SDS-PAGE。印跡到PVDF膜上后，使用抗FlagM2抗體(SIGMA弁F3165)和HRP-抗小鼠抗體(AmershamBiosciences弁NAW10)進行蛋白質(zhì)印跡，篩選產(chǎn)生chHLA的細胞林。選擇chHLA的表達最高的chHLA-MHH弁8、chHLA-HMH#6、chHLA-HHM弁2和chHLA-MMM弁4，用含有1ng/mLIL-3、500yWg/mLG418和10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基大量培養(yǎng)。并且，利用電穿孔法向這些chHLA表達細胞林中導入各15的被PvuI切斷的pCOS2zeo-卩2M。第二天添加G418和Zeocin(Invitrogen#46-0072),使分別達到500〃g/mL和800pg/mL。12天后在顯微鏡下選擇單一克隆。將這些細胞用抗人P2M抗體(SIGMA^M7398)和抗小鼠IgG-FITC抗體(BeckmanCoulter弁IM0819)染色，通過FACS(BeckmanCoulter，ELITE)分析p2M在細胞膜上的表達。將(32M的表達最高的c孤A-MHH/(32M#1-3、chHLA曙HMH/卩2M#2-1、c孤A-HHM/卩2M弁3-4和chHLA-MMM/J32M存4-6在含有1ng/mLIL-3、500^g/mLG418、800〃g/mLZeocin和10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，用于表位解析。5-3-4.利用FACS進行的表位分析為了確定所得抗體(IO個克隆)的表位,解析它們與上述嵌合HLA/|32M表達細胞的結(jié)合能。將嵌合HLA/|32M表達細胞按8xl05細胞/孔接種在96孔板中，添加各抗體使達到10〃g/mL。在冰上孵育1小時后，用150FACS緩沖液清洗細胞，再用抗小鼠IgG-FITC抗體(BeckmanCoulter釘M0819)染色，之后用FACS(BeckmanCoulter,ELITE)進行解析(圖3)。其結(jié)果，C3B3、C11B9、C17D11并沒有與HMH/Ba/F3(a2結(jié)構(gòu)域為小鼠HLA)結(jié)合，由此可知表位為a2結(jié)構(gòu)域。另一方面，盡管C17A4、C17E9、C23H12、C26D8沒有與小鼠MHCclassI交叉(結(jié)杲未顯示)，但均與嵌合HLA結(jié)合，其FACS染色圖案與抗I32M抗體產(chǎn)生的染色圖案一致，由此判斷這些克隆不與HLA反應，而與(32M反應。C7C5、C20D4并沒有與HMH(具有小鼠HLAa2結(jié)構(gòu)域)或HHM(具有小鼠HLAa3結(jié)構(gòu)域)的HLA結(jié)合，由此推測這些克隆識別a2a3之間的區(qū)域。5-4.細胞死亡誘導活性所得抗體對ARH77細胞的細胞死亡誘導活性的評價如下進行。向ARH77細胞中添加各純化抗體(5//g/mL)，之后在二次抗體(抗小鼠IgG抗體，Cappel#55482，存55459)的存在下(120/zg/mL)或不存在下，在37。C下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后回收細胞，進行碘化丙錠(PI)染色，使用FACS(BeckmanCoulter，ELITE)測定PI陽性細胞(死細月包)的比例(圖4)。其結(jié)果，在交聯(lián)存在下，在C3B3、C17D11、C11B9抗體中確認到較強的細胞死亡誘導活性。5-5.可變區(qū)的克隆使用RNeasyMiniKit(QIAGEN#74104)和QIAshredder(QIAGEN#79654)，從約5乂106個雜交瘤中純化總RNA。使用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(CLONTECH弁PT3269-1)由1的總RNA合成cDNA。此時使用試劑盒中所含的5，-CDS引物。以所得cDNA為模板，按以下條件進行PCR，擴增重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(Vt)。引物UPM<~~^G2a(VH;IgG2a)，UPM<~~^k(VL;k)94。C下5秒鐘、72。C下2分鐘，5循環(huán)94。C下5秒鐘、70。C下10秒鐘、72。C下2分鐘，5循環(huán)94。C下5秒鐘、68。C下10秒鐘、72。C下2分鐘，27循環(huán)將所得基因片段TA克隆到pCRII-TOPO(InvitrogenTOPOTA-cloningkit，#45-0640)中，來確認核苷*列。對于每個基因解析最少2個以上的質(zhì)粒，確認序列。包括本實施例中確認的前導序列的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQIDNO:46,該核苷酸序列所編碼的重鏈可變區(qū)的#^酸序列見SEQIDNO:47。SEQIDNO:46的第58號-第432號的核苷酸序列(SEQIDNO:l)和SEQIDNO:47的第20號第144號的M齡列(SEQIDNO:2)相當于重鏈可變區(qū)。另外，包括本實施例中確認的前導序列的輕鏈可變區(qū)的核苷,列見SEQIDNO:48，該核苷酸序列所編碼的輕鏈可變區(qū)的M^列見SEQIDNO:49。SEQIDNO:48的第61號~第381號的核苷,列(SEQIDNO:3)和SEQIDNO:49的第21號第127號的絲,列(SEQIDNO:4)相當于輕鏈可變區(qū)。5-6.抗體組的制作將以上所得抗體的相關信息分組概括如表1所示，所述信息包括:抗體的同工型分類、編碼抗體可變區(qū)的基因序列、表位、與ARH77細胞的結(jié)合活性以及細胞死亡誘導活性等。分析編碼可變區(qū)的M酸序列的結(jié)果在表位具有(x2結(jié)構(gòu)域的3個克隆(C3B3、C17D11、Cl1B9)的重鏈可變區(qū)中，雖然C3B3和C17D11具有相同的氨基酸，但C11B9與C3B3/C17D11相比，有一個氨基酸不同(圖5-l)。另外，輕鏈可變區(qū)中3個克隆的序列完全相同(圖5-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>雙抗體的制作6-1.雙抗體載體的制作盡管在二次抗體(GAM)存在下確認所得C3B3抗體對ARH77細胞具有細胞死亡誘導活性，但抗體單獨存在時并未確認到強的細胞死亡誘導活性。因此，制作C3B3抗體的可變區(qū)經(jīng)5mer肽(GGGGS)(SEQIDNO:33)連接而成的雙抗體。以TA克隆到pCRII-TOPO中的Vn為模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA弁R005)進行PCR,擴增H鏈可變區(qū)的從信號序列到FR4部分。使用5，側(cè)的引物中附加有EcoRI位點、3'側(cè)的引物中附加有接頭序列(氨基酸GGGGS)的引物。同樣，以TA克隆到pCRII-TOPO中的Vt為模板進行PCR，擴增L鏈可變區(qū)的從FR1到FR4序列。使用5'側(cè)的引物中附加有接頭序列(^j^酸GGGGS)、3，側(cè)的引物中附加有Flagtag和NotI位點的引物。使已擴增的VH、V^彼此退火，之后使用兩端的引物進行PCR，擴增雙抗體的基因。用EcoRI/Notl切斷所得片段，將其插入pCXND3的EcoRI/Notl間，確認核苷酸序列，完成表達載體的構(gòu)建。以下給出制作C3B3雙抗體(接頭5個^j^酸)時的引物和PCR反應條件。引物C3B3DB-H1:cctgaattcCACCATGTACTTCAGGCTCAGCTCAG(SEQIDNO:34)C3B3DB-H2:GGATATCgctaccgcetccaccTGAGGAGACGGTGACTGAAATTCCTT(SEQIDNO:35)C3B3DB-L1:CAggtggaggcggtagcGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCC(SEQIDNO:36)C3B3DB-L2:attgcggecgettatcacttategtegteatecttgtagtcTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCGATCCG(SEQIDNO:37)PCR反應條件94。C下1分鐘94。C下30分鐘、72。C下30分鐘、25循環(huán)接下來，使用S-300HR柱(AmershamBiosciences#27-5130-0l)純化所得PCR產(chǎn)物，使用pyrobestDNA聚合酶，按以下條件使各1的Vh和Vi^退火。94°。下1分鐘94。C下30分鐘、72。C下30分鐘，5循環(huán)使用較C3B3DB-H1、C3B3DB-L2短的引物C3B3DB-5，、C3B3DB-3，，按以下條件對退火后的1反應液進行PCR。C3B3DB-5，cctgaattcCACCATGTACTTCAGGC(SEQIDNO:38)C3B3DB-3，attgcggecgettatcacttateg(SEQIDNO:39)94。C下1分鐘94。C下30分鐘、72。C下l分鐘，25循環(huán)使用S-400HR柱(AmershamBiosciences#27-5140-0l)純化已擴增的片段，用EcoRI/Notl切斷該片段，并插入pCXND3的EcoRI/Notl間，確認核苷酸序列，完成pCXND3-C3B3DB-Flag的構(gòu)建。包括本實施例中確認的前導序列和Flag-tag序列的雙抗體的核普酸序列見SEQIDNO:50，該核苷酸序列所編碼的雙抗體的M酸序列見SEQIDNO:51。在SEQIDNO:50中，第58號第432號的核苷酸序列相當于重鏈可變區(qū)，第433號~第447號的核苷,列相當于接頭序列，第448號~第768號的核苷酸序列相當于輕鏈可變區(qū)。在SEQIDNO:51中，第20號第144號的M,列相當于重鏈可變區(qū)，第145號第149號的M酸序列相當于接頭序列，第150號第256號的M酸序列相當于輕鏈可變區(qū)。6-2.建立雙抗體表達細胞株將上述載體導入DG44細胞中，建立C3B3雙抗體產(chǎn)生細胞林。社GenePulser，1,5kV，25^F)導入到懸浮于PBS(-)中的DG44細胞(1x107細胞/mL，800yuL)中。用生長培養(yǎng)基(CHO-S-SFMII/PS)稀釋至適當?shù)募毎麛?shù)后，接種在96孔板中。第二天添加G418使達到500^g/mL。約2周后在顯微鏡下選擇含有單一克隆的孔，使用10//L的各培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE。印跡到PVDF膜上后，使用抗FlagM2抗體(SIGMA#F3165)、HRP-抗小鼠抗體(AmershamBiosciences#NA9310)進行蛋白質(zhì)印跡，篩選產(chǎn)生雙抗體的細胞林。大量培養(yǎng)產(chǎn)量最高的細胞株。6-3.雙抗體的純化使表達C3B3雙抗體的DG44細胞抹的100mL培養(yǎng)上清通過0.22;mi的濾器(MILLIPORE弁SL(JV033RS),之后使用Pl泵使上述培養(yǎng)上清以1mL/分鐘的流速吸附在填充有1mLANTI-FLAGM2瓊脂糖親和^J^(SIGMA弁A-2220)的K9柱(AmershamBiosciences#19-0870-01)上。用6mL50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、0.01%的Tween20清洗柱，之后用7mL0.1M的甘氨酸-HCl(pH3.5)、0.01%的Tween20洗脫。使用AKTAexplorer10S以1mL/分鐘的流速進行清洗和洗脫。監(jiān)測280nm的吸光度，同時將洗脫組分以每0.5mL回收在事先加入了50〃L1M的Tris-HCl(pH8.0)的5mL管中。合并回收的組分，使用CentriconYM-10(amicon弁4205)濃縮至300/^L，之后立即進行凝膠過濾層析。凝膠過濾層析使用Superdex200HR柱(Amersham#17-1088-01)和AKTAexplorerIOS，以0.4mL/分鐘的流速進行。用0.01%Tween20、PBS(-)平衡后，手動注入上述M2純化樣品。監(jiān)測280nm的吸光度，同時將組分按每0.5mL分取到5mL的管中。合并、回收每個峰的組分，使之通過0.22/mi的濾器(MLLIPORE#SLGV033RS或SLGV004SL)后，在4。C下保存。6-4.雙抗體的細胞死亡誘導活性的分析如圖6所示，C3B3小抗體經(jīng)凝膠過濾層析，結(jié)果根據(jù)分子量(立體結(jié)構(gòu))的不同分離成3個主要組分(峰(l)、峰(2)、峰(3))。測定各組分的細力包死亡誘導活性。與2D7雙抗體的細胞死亡i秀導活性進4亍比較。其結(jié)果，在分子量大的組分(峰(l)、(2):C3B3多聚體)中僅確認到弱的細胞死亡誘導活性，而在二聚體組分(峰(3):C3B3雙抗體)中確認到勝過2D7雙抗體的強的細胞死亡誘導活性(圖7)。6-5.比較純化C3B3雙抗體與2D7雙抗體的增殖抑制效果比較已純化的C3B3雙抗體(圖6、峰(3))和已知的2D7雙抗體的增殖抑制能力。將ARH77細胞以12xl0"田胞/孔的細胞濃度接種在96孔板中，向其中添加所得各抗體使達到適當濃度，培養(yǎng)3天后測定細胞數(shù)。測定活細胞數(shù)時使用WST-8(活細胞數(shù)測定試劑SF;NacalaiTesque)。即，將該試劑按10;/L/孔添加到細胞中，在37。C下培養(yǎng)1.5小時后，用分光光度計測定450nm的吸光度，將該數(shù)值作為相對活細胞數(shù)(圖8)。其結(jié)果，與2D7雙抗體相比，C3B3雙抗體以更低的濃度顯示出強的增殖抑制能力。由此證明C3B3雙抗體是具有較2D7雙抗體強的抗腫瘤效果的〗氐分子抗體。C3B3雙抗體的大量制備7-1.培養(yǎng)上清的制備將lxl()7個表達C3B3雙抗體-Flag的DG44細胞懸浮于2LCHO-S腸SFMII(Invitrogen,c/n:12052-098)/PS(Invitrogen，c/n:15140-122)培養(yǎng)基中，接種在cellSTACK(Coming,c/n:3271)中。在5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)于37。C下培養(yǎng)，存活率達到不足60%時回收培養(yǎng)上清(培養(yǎng)約7天)?；厥盏呐囵B(yǎng)上清以3000rpm的轉(zhuǎn)速在4。C下離心20分鐘，使上清液通過0.22;mi的濾器(Coming，c/n:430513)，在4。C下保存。7-2.利用色譜法進行的純化(l)7-2-1，利用陰離子柱進行的粗純化向XK50柱中填充QSepharoseFastFlow(AmershamBiosciences,c/n:17-0510-01)(床體積為100mL)。將該柱用500mLmilliQ7JC、500mL含1MNaCl和0.01%Tween20的20mM的Tris-HCl(pH7.5)(QB)依次清洗，之后用500mL含0.01%Tween20的20mM的Tris-HCl(pH7.5)(QA)平衡。向2L培養(yǎng)上清中加入2LmilliQ水以稀釋2倍，再加入約20mL1M的Tris調(diào)節(jié)至pH7.8,將所得溶液吸附在已平衡的柱上。吸附時使用Pl泵，以10mL/分鐘的最大流速在4。C下進行約15小時。接下來，使用AKTAprime以10mL/分鐘的流速進行清洗和洗脫。用300mL16%的QB清洗柱后，用400mL25%的QB和100mL30%的QB進行洗脫。將組分按每12mL分取在15mL的管中。監(jiān)測280nm的吸光度，同時回收從變換成25%QB后的最初峰到流過100mL30%的QB時的組分。合并回收的組分，使之通過0.22/nn濾器(Coming，c/n:430626)，加入0.6當量的QA,使鹽濃度達到約150mM，之后在4。C下保存。柱經(jīng)400mLQB、200mL0.1M的NaOH、200mLQB依次清洗后，用500mLQA平衡后再生。7-2-2.使用ANTI-FLAGM2親和柱(M2柱)進行的純化向XK26柱中填充ANTI-FLAGM2AffinityGelFreezer-Safe(SIGMA，c/n:A2220)(床體積為10mL)。將該柱用50mL含150mMNaCl和0.01%Tween20的50mMTris-HCl(pH7.4)(MA)、30mL含0.01%Tween20的0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)(MB)清洗后，用50mLMA平衡。然后，將540mL經(jīng)陰離子柱粗純化的樣品(相當于約2L的培養(yǎng)上清)吸附在兩根串聯(lián)的M2柱上。吸附時使用PI泵，以1mL/分鐘的最大流速在4。C下進行約15小時。之后，使用AKTAexplorer10S以4mL/分鐘的流速進行清洗和洗脫。用50mLMA清洗柱后，用30mL100。/。的MB洗脫。洗脫時，監(jiān)測280nm的吸光度，同時將組分按每2mL回收在事先加入了2001M的Tris-HCl(pH8.0)的5mL管中。合并回收的組分，使用CentriprepYM-10(amicon，c/n:4304)濃縮至5mL，之后立即進行凝膠過濾，置換緩沖液。當目視確認到不溶物時，將溶液通過0.22/mi的濾器(MIIXIPORE，c/n:SLGV013SL)，之后再進行凝膠過濾。洗脫樣品后，將柱用50mLMA平衡，之后在4'C下保存。當1周以上都不使用柱時，用30mL以上含150mMNaCl和0.02。/。NaN3的50mMTris-HCl(pH7.4)沖洗柱，之后在4。C下保存。7-2-3.利用凝膠過濾層析進行的純化以使用HiLoad26/60Superdex200pg(Amersham,c/n:17-1071-01)的凝膠過濾分離雙抗體，同時置換緩沖液。操作中使用AKTAexplorer10S,流速為2mL/分鐘。用含0.0P/。Tween20的PBS(-)平衡后，手動注入上述M2純化樣品。監(jiān)測280nm的吸光度，同時將保留體積為約200mL時的洗脫峰的組分^^2.5mL回收在5mL管中。合并回收的組分，使之通過0.22//m的濾器(MILLIPORE,c/n:SLGV033RS)后在4'C下保存。研究每一批已純化的雙抗體的活性后合并，用CentriprepYM-10(amicon，c/n:4304)濃縮至約1mg/mL,使之通過0.22/rni的濾器(MILLIPORE,c/n:SLGV033RS)后保存。7-3.利用色譜法進行的純化(2)通過離子交換色語法、羥基磷灰石層析、凝膠過濾層析法這3個步驟，從上述(7-l)得到的培養(yǎng)上清中純化C3B3雙抗體。培養(yǎng)上清經(jīng)超純水稀釋至3倍后，用1MTris調(diào)節(jié)至pH8.0。之后將培養(yǎng)上清加入到經(jīng)含0.02%Tween20的20mMTri-HCl(pH8.0)平衡的QSepharoseFastFlow柱(GEHealthcare)上，用相同的緩沖液清洗該柱后，使用相同的緩沖液，以0M(X5M的NaCl的直線濃度梯度洗脫吸附在該柱上的多肽。用SDS-PAGE分析所得組分，收集所有含C3B3小抗體(C3B3多聚體和C3B3雙抗體)的組分。將步驟一得到的C3B3組分添加到經(jīng)含0.02%Tween20的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石柱(BIO-RAD，typeI,20〃m)上，用相同緩沖液清洗該柱后，使磷酸緩沖液濃度直線上升至250mM,洗脫吸附在該柱上的多肽。洗脫峰用SDS-PAGE和使用了Superdex200PC3.2/30柱(GEHealthcare)的凝膠過濾進行分析。僅收集顯示目標C3B3雙抗體的分子量的峰。步驟二得到的C3B3雙抗體的峰組分用amiconultra10kDacut(MILLIPORE)進行濃縮，再用含0.01。/oTween20的PBS(-)平衡，之后添加到HiLoad26/60Superdex200pg柱(GEHealthcare)上。用SDS-PAGE分析所得組分，將含有目標C3B3雙抗體的主峰作為純化組分。使用Superdex200PC3.2/30柱，對已純化的C3B3雙抗體進行分析凝膠過濾時出現(xiàn)單峰，表觀分子量為約52kDa。C3B3雙抗體的SDS-PAGE分析結(jié)果為在還原和非還原條件下，在單體的分子量位置(約27kDa)均顯示出單譜帶。由以上可知C3B3雙抗體是兩分子單鏈Fv進行非共價結(jié)合的二聚體。C3B3雙抗體的藥效評價8-1.C3B3雙抗體對體外細胞增殖的抑制效果為了詳細解析C3B3雙抗體的抗肺瘤效果，首先，如下研究該雙抗體對各種人血液腫瘤細胞株的增殖抑制效杲。細胞使用人EBV-轉(zhuǎn)化B細胞林ARH-77、IM-9、MC/CAR和人Burkitt，s淋巴瘤細胞抹HS-Sultan。培養(yǎng)ARH-77、IM-9和HS-Sultan時使用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)MC/CAR時使用含20%FCS的Iscove，smodifiedDulbecco，s培養(yǎng)基。ARH-77和IM-9以3xl03細胞/孔的濃度接種在96孔板中、MC/CAR以5xl03細胞/孔的濃度接種在96孔板中，而HS-Sultanand以lx104細胞/孔的濃度接種在96孔板中，在C3B3雙抗體或2D7雙抗體的存在下，在5%032培養(yǎng)箱中于37。C下培養(yǎng)3天。然后向各孔中添加WST-8(Cat.No.07553-15,NakalaiTesque林式會社)，再培養(yǎng)4小時，之后用酶標儀測定450nm(參比波長為655nm)的吸光度。以未添加抗體的孔的吸光度為100%、以未添加細胞的孔的吸光度為0%,測定細胞增殖。用三份樣品進行試驗，算出平均值和標準偏差(圖9)。用于實驗的所有細胞^f朱中，C3B3雙抗體和2D7雙抗體均顯示出濃度依賴性的細胞增殖抑制。但兩者相比，C3B3雙抗體以較2D7雙抗體低的低濃度下，也顯示出遠遠超過2D7雙抗體的最大活性的增殖抑制效果。8-2.C3B3雙抗體的體內(nèi)抗腫瘤效果8-2-1.小鼠血清人IgG定量法使用下述ELISA定量小鼠血清中所含的人IgG。將100/^L經(jīng)0.1mol/L碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)稀釋至1pg/mL的山羊抗人IgG(BIOSOURCE社制)加入到96孔板(Nunc社制)上，在4。C下孵育一夜，使抗體固定。封閉后，添加100//L梯式稀釋的小鼠血清或100//L作為標準品的人IgG(CAPPEL社制)，在室溫下溫浴2小時。清洗后，加入100//L稀釋了5000倍的堿性磷酸酶標記抗人IgG(BIOSOURCE社制)，在室溫下溫浴2小時。清洗后加入底物溶液，溫浴后用酶標儀(BIO-RAD社)測定405nm的吸光度。8-2-2.C3B3雙抗體對人EBV轉(zhuǎn)化B細胞(IM-9)移植小鼠的抗腫瘤效果8-2-2-1.IM-9移植小鼠的制作IM-9移植小鼠如下制作。將在含有10%FCS(Hyclone社制)的RPMI1640培養(yǎng)基(SIGMA-ALDRICH社制)中進行體外繼代培養(yǎng)的IM-9細胞用上述培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至5xl()S細胞/mL。對前一天事先腹腔內(nèi)給予了100pL抗asialo-GMl(和光純藥社制)的Scid小鼠(雌性、6周齡、日本Clea)/A^靜脈注入200戶L上述IM-9細胞調(diào)整液。8-2-2-2.抗體的給予對上述IM-9移植小鼠，在IM-9移植后第1、2、3天，按10mg/kg尾靜脈給予抗體(2D7雙抗體或C3B3雙抗體)，每天2次，共計6次。對照組按10mL/kg尾靜脈給予含Tween20的PBS。8-2-2-3.C3B3雙抗體對IM-9移植小鼠的抗腫瘤效果的評價關于C3B3雙抗體的抗腫瘤效果，以小鼠的存活期間和血清中的人IgG量進行評價。如圖IO所示，給予了C3B3雙抗體的小鼠與對照組的小鼠相比，確認其存活期間明顯延長。即使與給予了2D7雙抗體的小鼠相比，其存活期間也有所延長。另外，在IM-9移植后第14天從小鼠體內(nèi)采取血清，使用上述8-2-1的ELISA進行測定(圖11)。其結(jié)果，如圖ll所示，給予了C3B3雙抗體的小鼠與對照組的小鼠相比，血清中人IgG量明顯降低。即使與給予了2D7雙抗體的小鼠相比，確認其血清中人IgG量也有下降的趨勢。由此表明C3B3雙抗體對人EBV轉(zhuǎn)化B細胞移植小鼠具有較2D7雙抗體強的抗腫瘤效果。[實施例9]研究C3B3雙抗體對人PBMC的細胞死亡誘導作用研究C3B3雙抗體和2D7雙抗體對人末梢血單核細胞(PBMC)的細胞死亡誘導效果。利用比重離心法從健康成人志愿者的末梢血中分離PBMC。將該PBMC以5xl04細胞/孔(用伴刀豆球蛋白A進行刺激時)或1.5xl()S細胞/孔(用SAC進行刺激時)的濃度接種在96孔板中。伴刀豆球蛋白A(以下記作ConA,和光純藥工業(yè))以最終濃度10yUg/mL進行添加，SAC(PansorbinCell,Carbiochem)以最終濃度0.01%進行添加。并且，C3B3雙抗體或2D7雙抗體分別以最終濃度10/^g/mL進行添加。將該細胞在5。/。C02培養(yǎng)箱中于37。C下培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)的第3天向每孔添加10//LCellCountingKit-8(Dojindo社制),在5%C02培養(yǎng)箱中于37°C下反應7小時，之后用酶標儀(BIO-RAD社)測定450nm(參比波長為630nm)的吸光度。其結(jié)果，如圖12所示，用ConA刺激時和SAC剌激時，C3B3雙抗體均顯示出較2D7雙抗體強的細胞死亡誘導活性。C3B3雙抗體對體外細胞增殖的抑制效果如下研究C3B3雙抗體對人T細胞系腫瘤細胞的增殖抑制效果。細胞使用Jurkat(E6-l)抹(從ATCC購入)。培養(yǎng)Jurkat(E6-l)細胞時使用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基。將Jurkat細胞以2xl04細胞/孔的濃度接種在96孔板中，在C3B3雙抗體或2D7雙抗體的存在下，在5%C02培養(yǎng)箱中于37。C下培養(yǎng)3天。然后，向各孔中添加CellCountingKit-8(Code.No.CK04，DojindoLaboratories,Japan),再培養(yǎng)2小時，之后用酶標儀測定450nm(參比波長為630nm)的吸光度。以未添加抗體的孔的吸光度為100%、以未添加細胞的孔的吸光度為0%，測定細胞增殖。用三份樣品進行試驗，算出平均值和標準偏差(SE)(圖13)。C3B3雙抗體和2D7雙抗體在Jurkat細胞中均顯示出濃度依賴性的細胞增殖抑制。但兩者相比，C3B3雙抗體在較2D7雙抗體低的低濃度下也顯示出強的增殖抑制效果。在迄今為止的研究中已經(jīng)明確HLA抗體對所有淋巴細胞均顯示出效果(W02004/033499、WO2005/100560)，根據(jù)以上結(jié)果，認為本果'產(chǎn)業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，提供通過與抗小鼠IgG抗體交聯(lián)而具有細胞死亡誘導活性的新型抗HLA-A抗體和C3B3抗體。另夕卜，將C3B3抗體低分子化(雙抗體化)而得到的抗體，即使不添加抗小鼠IgG抗體，也顯示出強效的細胞死亡誘導活性，其活性在體外腫瘤細胞分析系統(tǒng)中遠遠超過以往的低分子抗體的活性。并且，該低分子抗體在體內(nèi)胂瘤移植模型小鼠中也顯示出較以往的低分子抗體高的抗腫瘤效果。即，C3B3低分子抗體與以往的低分子抗體相比，在對血液腫瘤細胞顯示出高的殺細胞活性、同時以更低的濃度顯示出細胞死亡誘導活性方面優(yōu)異。因此，可以期待該低分子抗體作為血液腫瘤、骨髓免疫性疾病和自身免疫疾病等的治療藥，發(fā)揮比以往的低分子抗體更優(yōu)異的藥效。權(quán)利要求1.抗體，該抗體包括重鏈可變區(qū)，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3。2.抗體，該抗體包括輕鏈可變區(qū)，上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3。3.抗體，該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，上述重鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:7、8、9記載的氨基酸序列組成的CDR1、2、3;上述輕鏈可變區(qū)具有由SEQIDNO:10、11、12記載的M酸序列組成的CDRl、2、3。4.抗體，該抗體包括以下(a)(d)中任一項所述的重鏈可變區(qū)(a)重鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:2記載的絲瞎列；(b)重鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:2記載的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸#1取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該重鏈可變區(qū)與(a)所述的重鏈可變區(qū)功能相同；(c)重鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:1記載的核苷酸序列的DNA所編碼的M酸序列；(d)重鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:1記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列。5.抗體，該抗體包括以下(e卜(h)中任一項所述的輕鏈可變區(qū)(e)輕鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:4記載的M酸序列；(f)輕鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:4記載的^J^酸序列中有一個或多個氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的氨基酸序列，該輕鏈可變區(qū)與(e)所述的輕鏈可變區(qū)功能相同；(g)輕鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA所編碼的皿酸序列；(h)輕鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的氨基酸序列。6.抗體，該抗體包括以下(a卜(d)中任一項所述的重鏈可變區(qū)和(e)(h)中任一項所述的輕鏈可變區(qū)(a)重鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:2記載的M酸序列；(b)重鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:2記載的M酸序列中有一個或多個M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該重鏈可變區(qū)與(a)所述的重鏈可變區(qū)功能相同；(c)重鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:1記載的核苷酸序列的DNA所編碼的氨基^列；(d)重鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包含SEQIDNO:1記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列；(e)輕鏈可變區(qū)，其具有SEQIDNO:4記載的氨基酸序列；(f)輕鏈可變區(qū)，其具有在SEQIDNO:4記載的氨基酸序列中有一個或多個氛基酸^皮取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，該輕鏈可變區(qū)與(e)所述的輕鏈可變區(qū)功能相同；(g)輕鏈可變區(qū)，其具有包含SEQIDNO:3記載的核苷酸序列的DNA所編碼的M酸序列；(h)輕鏈可變區(qū)，其具有在嚴格條件下與包舍SEQIDNO:3記載的核普酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的M酸序列。7.抗體，該抗體具有以下(a卜(d)中任一項所述的M酸序列(a)SEQIDNO:6記載的^J^酸序列；(b)在SEQIDNO:6記載的氨基酸序列中有一個或多個M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列；(c)包含SEQIDNO:5記載的核苷酸序列的DNA所編碼的氨基,列；(d)在嚴格條件下與包含SEQIDNO:5記載的核苷酸序列的DNA進行雜交的DNA所編碼的^J^酸序列。8.抗體，該抗體與表位結(jié)合，該表位與權(quán)利要求1~7中任一項所述的抗體所結(jié)合的人白細胞抗原蛋白的表位相同，該人白細胞抗原簡稱為HLA。9.權(quán)利要求18中任一項所述的抗體，該抗體為單克隆抗體。10.權(quán)利要求1~9中任一項所述的抗體，該抗體識別人白細胞抗原，該人白細胞抗原簡稱為HLA。11.權(quán)利要求10所述的抗體，其中HLA為HLAclassI。12.權(quán)利要求11所述的抗體，其中HLAclassI為HLA-A。13.權(quán)利要求1~12中任一項所述的抗體，該抗體為低分子抗體。14.權(quán)利要求13所述的抗體，其中低分子抗體為雙抗體。15.以下(a)或(b)所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其包含SEQIDNO:1、3或5記載的核苷酸序列；(b)多核苷酸，其在嚴格條件下與(a)所述的多核苷酸進行雜交，并且編碼與權(quán)利要求114中任一項所述的抗體具有相同活性的抗體。16.載體，該載體包括權(quán)利要求15所述的多核苷酸。17.宿主細胞，該宿主細胞包括權(quán)利要求15所述的多核苷酸或權(quán)利要求16所述的載體。18.權(quán)利要求114中任一項所述的抗體的制作方法，該方法包括以下步驟(a)制作權(quán)利要求15所述的多核苷酸的步驟；(b)制作載體的步驟，所述載體包括(a)所述的多核苷酸；(c)將(b)所述的栽體導入宿主細胞中的步驟；(d)培養(yǎng)(c)所述的宿主細胞的步驟。19.細胞死亡誘導劑，其含有權(quán)利要求1~14中任一項所述的抗體作為有效成分。20.權(quán)利要求19所述的細胞死亡誘導劑，其特征在于該誘導劑i秀導B細力包或T細胞的細胞死亡。21.權(quán)利要求20所述的細胞死亡誘導劑，其中B細胞或T細胞為活化B細胞或活化T細胞。22.細胞增殖抑制劑，其含有權(quán)利要求1~14中任一項所述的抗體作為有效成分。23.抗腫瘤藥，其含有權(quán)利要求1~14中任一項所述的抗體作為有效成分。24.權(quán)利要求23所述的抗腫瘤藥，其中腫瘤為血液腫瘤。25.自身免疫疾病治療藥，其含有權(quán)利要求114中任一項所述的抗體作為有效成分。全文摘要本發(fā)明以提供具有高細胞死亡誘導活性的抗體為課題。本發(fā)明人等為了解決上述課題，首先用表達人HLAclassIA和人β2微球蛋白(β2M)的細胞對小鼠進行免疫，得到單克隆抗體。在所得抗體中篩選具有細胞死亡誘導活性的抗體，得到10個克隆。解析這些克隆時發(fā)現(xiàn)表位上具有HLAclassI抗原的α2結(jié)構(gòu)域的3個克隆(C3B3、C11B9、C17D11抗體)能夠與抗小鼠IgG抗體交聯(lián)，從而顯示出強細胞毒活性。進一步在制作C3B3抗體的雙抗體時，發(fā)現(xiàn)該雙抗體與以往的HLAclassIA抗體-2D7抗體的雙抗體相比，顯示出更強的抗腫瘤效果。文檔編號A61K39/395GK101517075SQ20078003410公開日2009年8月26日申請日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日發(fā)明者川合重人,木村直紀申請人:中外制藥株式會社