專利名稱：漢防己甲素在制備癌細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及漢防己甲素在制備誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤與心血管疾病是導(dǎo)致人類疾病和死亡的兩個(gè)最大頑疾。惡性腫瘤中肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、惡性淋巴瘤、鼻咽癌等在我國是常發(fā)性腫瘤，且以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌最為多見，約占全部惡性腫瘤的70% — 80% ο癌癥治療的傳統(tǒng)方法中有放療、化療、手術(shù)；然而放療、化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也對(duì)人體正常細(xì)胞有損傷，毒副作用大且造成患者生活質(zhì)量差、生存率低。因此，篩選高效低毒的抗癌藥物一直是癌癥治療的重要研究課題，特別是設(shè)計(jì)專門針對(duì)腫瘤細(xì)胞特定信號(hào)途徑或特定癌細(xì)胞靶位點(diǎn)的藥物。隨著研究者對(duì)細(xì)胞死亡現(xiàn)象本質(zhì)的探究，尤其是對(duì)細(xì)胞凋亡分子機(jī)理的闡明，使人們對(duì)抗癌藥物的篩選及其作用機(jī)理有了全新的認(rèn)識(shí)。有目的地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡已成為一種治療腫瘤的有效手段。漢防己甲素(Tetrandrine，分子式C38H42N2O6,分子量 622.75，CAS 號(hào) 518-34-3，以下簡寫為Tet)，又稱粉防己堿，是從中草藥粉防己的根塊中提取的雙芐基異喹啉類生物堿。臨床上常用于治療高血壓，肝纖維化和矽肺等疾病。近年來，一些研究表明較高濃度的漢防己甲素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，顯示其具有潛在的抗腫瘤活性，如對(duì)人白血病細(xì)胞株HL-60、人白血病U937細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞Mahlavu、人惡性淋巴瘤BM13674細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U138MG、鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neuro 2a有抑制腫瘤細(xì)胞增生和誘導(dǎo)凋亡的作用；研究結(jié)果還表明，漢防己甲素可以通過提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平抑制鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤株生長，誘導(dǎo)其凋亡；在HT-29細(xì)胞中漢防己甲素通過PI3K/AKT/GSK3beta途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。Tet不僅能直接抑制腫瘤生長，并且具有放療增敏、逆轉(zhuǎn)耐藥、減輕放化療毒副反應(yīng)的作用，表明Tet在抗腫瘤治療中有著良好的臨床應(yīng)用前景。與以往報(bào)道不同，在本發(fā)明中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)漢防己甲素能在較低濃度下誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，且有顯著的劑量效應(yīng)和時(shí)間依賴關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了漢防己甲素在制備誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑上的應(yīng)用。所述的癌細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的(彡5 μ M)漢防己甲素可有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，且有顯著的劑量效應(yīng)和時(shí)間依賴關(guān)系。
本發(fā)明可用于誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞，不僅限于實(shí)例中所列舉的腫瘤類型。本發(fā)明通過漢防己甲素在低濃度下(彡5μΜ)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7402、HepG2和Huh7自噬，研究漢防己甲素對(duì)肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)自噬的能力。本發(fā)明采用不同濃度漢防己甲素對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402、HepG2和Huh7處理，通過蛋白質(zhì)雜交和吖啶橙染色，觀察不同濃度漢防己甲素對(duì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞形成自噬的能力。結(jié)果表明，不同濃度的漢防己甲素都能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞形成自噬，且呈濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。


圖I不同濃度的Tet處理肝癌細(xì)胞，Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白。肝癌細(xì)胞Bel7402、Hep G2和Huh7經(jīng)不同濃度的Tet處理24小時(shí)后，Westernblot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) PARP、Caspase-8、Caspase_3、LC3 蛋白。GAPDH 作為內(nèi)參。圖2三種肝癌細(xì)胞經(jīng)5 μ M Tet處理不同時(shí)間后，吖啶橙染色并在熒光顯微鏡下觀察。圖3統(tǒng)計(jì)分析Tet處理不同時(shí)間后Bel7402肝癌細(xì)胞自噬比例。圖4統(tǒng)計(jì)分析Tet處理不同時(shí)間后!tepG2肝癌細(xì)胞自噬比例。圖5統(tǒng)計(jì)分析Tet處理不同時(shí)間后Huh7肝癌細(xì)胞自噬比例。圖6 Tet處理Bel7402肝癌細(xì)胞引起細(xì)胞自噬的腫瘤組織電鏡照片(標(biāo)尺為800nm ;處理組箭頭自噬溶酶體)。
圖7 Tet處理H印G2肝癌細(xì)胞引起細(xì)胞自噬的腫瘤組織電鏡照片(標(biāo)尺為1300nm;處理組箭頭自噬溶酶體)。
圖8 Tet處理Huh7肝癌細(xì)胞引起細(xì)胞自噬的腫瘤組織電鏡照片(標(biāo)尺為800nm;處理組箭頭自噬溶酶體)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。所有實(shí)施例所用細(xì)胞的培養(yǎng)、藥品的添加以及癌細(xì)胞自噬均按以下方法進(jìn)行。一、材料
I.細(xì)胞株肝癌細(xì)胞BEL-7402、HepG2和Huh7等細(xì)胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type CultureCollection, CCTCC)。2.試劑DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶、乙二胺四乙酸等藥品來自GIBCO公司；漢防己甲素、青霉素、鏈霉素、DMSO、、Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。LC3抗體購自sigma公司；細(xì)胞色素C, Atg5, Atg7, caspase-3, caspase-8,caspase-9, PARP, phospho-Akt, phospho-ERK, p38 MAPK 和 JNK 等抗體均為 CellSignaling公司產(chǎn)品；吖啶橙、GAPDH抗體為碧云天公司產(chǎn)品；二抗羊抗兔IgG-HRP為Beyotime公司產(chǎn)品；二抗羊抗鼠IgG-HRP為Beyotime公司產(chǎn)品；
3.儀器5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，低溫超速離心機(jī)(Haraeus公司，德國),倒置突光顯微鏡(Olympus,日本),透射電子顯微鏡(日立一H 600型)。二、主要試劑配制I)將漢防己甲素用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)配制成1(Γ2Μ儲(chǔ)備液,小量分裝，一 20 1貯存?zhèn)溆?，臨用時(shí)用相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需終濃度。2) 一抗/ 二抗工作液一抗/ 二抗均用封閉液以1:1000比例稀釋，4°C保存。3)PBS溶液將購買的PBS粉劑溶于5L三蒸水中，磁力攪拌器混勻，高壓蒸汽鍋滅菌，4°C保存。4)青霉素/鏈霉素溶液用PBS將青霉素和鏈霉素配制成10，000U/mL,用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，_20°C保存。
5) DMEM-高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM粉劑溶于10L三蒸水中，磁力攪拌器中攪拌0. 5小時(shí)后，加入37g NaHCO3，繼續(xù)攪拌0. 5小時(shí)，用稀鹽酸將pH值調(diào)到7. 04-7. 05，真空泵抽濾除菌。培養(yǎng)細(xì)胞DMEM含10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素。6) 5%牛奶封閉液稱取5g的脫脂牛奶溶于IOOmL雙蒸水中，磁力攪拌器混勻，分裝后-20°C保存。7) TBS 緩沖液(10X) Tris. Base 150g, KCl 10g，NaCl 400g，加雙蒸水至 5L，磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，用HCl調(diào)pH調(diào)至7. 4，室溫保存。8) TBST緩沖液TBS緩沖液(10X) IOOmL,加雙蒸水至1L，再加lmLTween-20，搖勻。9) Tris-甘氨酸電泳緩沖液(5X) :75. 5g Tris. Base，360g 甘氨酸，5g SDS，加雙蒸水至5L，磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，過夜，調(diào)pH調(diào)至8. 3-8. 8，4°C保存。使用時(shí)，取IOOmL加雙蒸水至1L，搖勻。10)Western blot 轉(zhuǎn)移緩沖液(10X) Tris. Base 151. 5g，甘氨酸 720g,加雙蒸水至5L，磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，室溫存放。使用時(shí)，取IOOmL加雙蒸水至1L，搖勻。11) Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液
①0. 5的PIPES (pH 6. 7)溶液的配置
將15. Ig PIPES溶于80mL三蒸水中。用5M KOH調(diào)pH值至6. 7，最后加純水，定容至100mL。用0. 2 μ m濾膜過濾除菌。分成小份于_20°C保存。② Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液的配置
將下列組分溶于800mL純水中，然后加20mL0. 5M的PIPES (pH 6. 7)，加純水定容于1L。
表I Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液各組分含量
試劑I需要量幾I終濃度
MnCla. 4Ha0_10. 88g 55mM
CaCla. 2Ha0~20g 15mM
Fe I18.65g 250mM
FlPES(0. 5M, pH6. 7) 20mL IOmM H^0~I補(bǔ)至 IL
二、實(shí)驗(yàn)方法
I.細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含10 %小牛血清的RPMI-1640或DEME培養(yǎng)基(青霉素100 u/ mL，鏈霉素100 u/ mL)中，置CO2培養(yǎng)箱(37 °C，5 % CO2)中培養(yǎng)。2.選用對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成1-5X IO4個(gè)/ mL的細(xì)胞懸液，接種在24孔培養(yǎng)板中，每孔接種lmL，37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
3.實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測(cè)藥品的培養(yǎng)基，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)5平行孔，每孔中藥物溶劑(DMS0或水)的體積不超過1%總體積。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37°C，5% CO2培養(yǎng)3 5天。
4.細(xì)胞總蛋白的提取及定量 I)提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白
①收集細(xì)胞將細(xì)胞進(jìn)行消化，加到I.5mL離心管中，1600rpm離心4分鐘，棄上清；
②冰冷PBS重懸細(xì)胞；
③1600rpm離心4分鐘,棄上清；
④根據(jù)收集細(xì)胞量加入一定量1%SDS，沸水浴20分鐘；
⑤12000rpm離心10分鐘,取上清至新EP管。2)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度(采用BCA測(cè)定)
①在酶標(biāo)板上每孔加入23μ L的滅菌ddH20,然后再加入2 μ L的蛋白樣品；同時(shí)另取兩個(gè)孔，加入25 μ L的滅菌ddH20,作為對(duì)照；
②配制BCA工作液根據(jù)蛋白樣品數(shù)量，按A液B液=50:1的比例進(jìn)行配置并充分混
勻；
③每孔加入200μ L配制的BCA工作液，于37°C放置30分鐘；
④在酶標(biāo)儀上，利用570nm的波長測(cè)定蛋白樣品的OD值；
⑤根據(jù)已有的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)蛋白樣品的濃度；
⑥根據(jù)目標(biāo)濃度進(jìn)行取樣。5. Western blot (蛋白雜交實(shí)驗(yàn))
SDS-PAGE 電泳
1)①配分離膠根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量配置相應(yīng)濃度的分離膠，加入兩玻璃板間。再加入醫(yī)用酒精至玻璃板頂部。待其凝固后，倒出醫(yī)用酒精，用濾紙吸干多余酒精；
2)②配濃縮膠按照各成分的量依次加入，混勻，加到玻璃板間，插入梳子，凝固后，移走梳子；
3)③將玻璃板安裝到電泳槽中，倒入RunningBuffer ；
4)④上樣按照樣品的順序依次加樣，蛋白上樣量為20μ g，加入3μ L LoadingBuffer ；
5)⑤140V進(jìn)行電泳；
6)⑥電泳完畢后，關(guān)閉電源，將玻璃板上取出，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。7)蛋白轉(zhuǎn)膜(用半干轉(zhuǎn)膜器進(jìn)行)
8)①活化PVDF膜將PVDF膜在甲醇中浸泡3分鐘；
9)②轉(zhuǎn)膜按從下到上濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序放置；
10)③開啟電源，電壓18V，轉(zhuǎn)膜30分鐘。11) 封閉，雜交
12)①將PVDF膜放入5%的牛奶封閉液中，室溫，搖床上緩慢搖動(dòng)1-2小時(shí)；
13)②切PVDF膜根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量切PVDF膜；
14)③將切好的PVDF膜放入相應(yīng)的一抗中，4°C孵育過夜；
15)④回收一抗，用TBST漂洗膜3次，每次10分鐘；16)⑤將漂洗后的膜放入二抗中，室溫孵育1-2小時(shí)；
17)⑥回收二抗，再用TBST漂洗膜3次，每次10分鐘。18)顯影
19)①將顯色A液、B液等量均勻混合；
20)②把膜放入顯色液中，在暗室內(nèi)使用X膠片感光、顯影。6.細(xì)胞吖啶橙染色
用無菌鑷子將滅菌好的蓋玻片加入十二孔板中，加入ImL的培養(yǎng)基，接種適量的細(xì)胞，搖勻，待細(xì)胞貼壁后，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。把滅菌的蓋玻片放入12孔板孔中，接種上適量的細(xì)胞，24小時(shí)貼壁后，用藥物處理。處理完后，吸走上清，用PBS清洗兩遍，加入吖啶橙(終濃度為I μ g/mL)，室溫避光孵育20分鐘；用PBS清洗兩遍，倒扣在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。7.電鏡觀察自噬泡
1)樣品的制備
①組織取材一2. 5%戊二醛前固定一O. IM磷酸緩沖液漂洗三次一鋨酸(1%)后固定一
O.IM磷酸緩沖液漂洗三次，梯度酒精脫水(50%，70%, 80%, 95%，100% 二次)每次15分鐘。②環(huán)氧樹脂包埋
純丙酮脫水二次(15分鐘)一 EP0N812 :丙酮(I :1)浸透30分鐘一純包埋液浸透I小時(shí)一純包埋液固化37°C 24小時(shí)后60°C 48小時(shí)。③瑞典BROMMA公司產(chǎn)LKB — V型超薄切片機(jī)切片一鈾、鉛染色(醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛)
2)觀察
在放大倍數(shù)為6000X時(shí)，觀察細(xì)胞全貌；放大倍數(shù)為25000X時(shí)，觀察自噬泡。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(control)、漢防己甲素組(Tetrandrine),采用不同濃度漢防己甲素作用于肝癌細(xì)胞株，通過蛋白質(zhì)雜交試驗(yàn)和吖啶橙染色試驗(yàn)和投射電鏡試驗(yàn)檢測(cè)漢防己甲素誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬作用。實(shí)驗(yàn)例l:Western blot檢測(cè)低濃度漢防己甲素(彡5 μ Μ)處理肝癌細(xì)胞Bel7402、HepG2和Huh7引起細(xì)胞自噬的影響。較低濃度的漢防己甲素(彡5μΜ)處理肝癌細(xì)胞Bel7402、！fepG2和Huh7 24小時(shí)后可以顯者引起細(xì)胞自卩遼。如圖I所不，Western blot檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞自卩遼的標(biāo)志性蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0_5μΜ的漢防己甲素處理細(xì)胞后，與凋亡相關(guān)的蛋白PARP、Caspase-8、Caspase-3蛋白都未發(fā)生剪切，而與細(xì)胞自噬相關(guān)的蛋白LC3_ II表達(dá)量明顯上調(diào)，并且表現(xiàn)出較好的濃度依賴關(guān)系。這些結(jié)果表明漢防己甲素在較低濃度下可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，而不引發(fā)肝癌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)例2 :吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低濃度漢防己甲素(彡5μΜ)處理肝癌細(xì)胞Be 17402、HepG2和Huh7引起細(xì)胞自噬的影響。為了進(jìn)一步證實(shí)漢防己甲素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，我們進(jìn)行了檢測(cè)細(xì)胞自噬的吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)。該染料具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色。它與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；在自噬后期，在自噬溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶活性增強(qiáng)下，吖啶橙使酸性囊泡顯著著色。在熒光顯微鏡下觀察可以看到明亮的紅色熒光。用5μΜ的漢防己甲素處理Bel7402、HepG2和Huh7細(xì)胞8小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí)，吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，對(duì)照組只有極少數(shù)著色的自噬細(xì)胞，而處理組隨著處理時(shí)間的延長，三種肝癌細(xì)胞內(nèi)紅色熒光點(diǎn)的強(qiáng)度和數(shù)量明顯增多(圖2)，這說明漢防己甲素可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。統(tǒng)計(jì)分析表明，隨時(shí)間推移，細(xì)胞自噬比例逐漸升高，24小時(shí)后三種細(xì)胞系的自噬比例都達(dá)到90%以上(圖 3，4，5)。實(shí)驗(yàn)例3 :電鏡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低濃度漢防己甲素(彡5μΜ)處理肝癌細(xì)胞Bel7402、HepG2和Huh7引起細(xì)胞自 噬的影響。電鏡觀察顯示對(duì)照組有極少的自噬泡，處理組則出現(xiàn)大量的自噬泡(圖6，7，8)。
權(quán)利要求
1.漢防己甲素在制備癌細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑上的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了漢防己甲素在制備誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑上的應(yīng)用。本發(fā)明采用不同濃度漢防己甲素對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402、HepG2和Huh7處理，通過蛋白質(zhì)雜交和吖啶橙染色，觀察不同濃度漢防己甲素對(duì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞形成自噬的能力。結(jié)果表明，不同濃度的漢防己甲素都能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞形成自噬，且呈濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K31/4748GK102631346SQ20121010524
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者劉鑫, 李文化, 梅運(yùn)軍, 陳超, 龔克 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)