專利名稱：穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體及其建立和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體及其 建立和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
自噬是一種細(xì)胞自我降解消化的過(guò)程，是細(xì)胞的一種重要生命活動(dòng)。在正常生理 情況下，細(xì)胞依靠自噬清除衰老或受損的細(xì)胞器、更新某些重要蛋白；在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài) 時(shí)，自噬激活增強(qiáng)，通過(guò)循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)成份，維持能量和代謝穩(wěn)態(tài)，清除受損蛋白質(zhì)和細(xì) 胞器，限制氧化損傷等，是維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)和生存的重要機(jī)制。因其與人類許多疾病關(guān)系 密切，特別是在腫瘤等重大疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)，相關(guān)研究 與日俱增。自噬研究需要良好的自噬觀察方法，理想的自噬觀察方法應(yīng)能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)觀察自 噬變化，并能夠快速定量分析自噬改變，使用應(yīng)簡(jiǎn)單便捷、觀察穩(wěn)定可靠，可重復(fù)性良好。傳 統(tǒng)的自噬觀察方法是使用透射電鏡直接觀察或通過(guò)吖啶橙染色熒光顯微鏡間接觀察自噬 體，以及通過(guò)Western blot檢測(cè)自噬關(guān)鍵分子LC3的改變，推測(cè)自噬之改變。由于這些觀 察方法是對(duì)某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)的自噬體或相關(guān)關(guān)鍵蛋白分子進(jìn)行觀察分析，因此無(wú)法 實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，此外，這些方法還存在其它不足①透射電鏡法為最早應(yīng)用的經(jīng)典方 法，觀察結(jié)果可靠，但是需要依賴透射電鏡和精通自噬的技術(shù)人員完成圖像觀察分析和結(jié) 果判定，而透射電鏡和技術(shù)人員在國(guó)內(nèi)配置稀缺，實(shí)驗(yàn)室通常不具備，觀察往往需要預(yù)約等 待，加上其觀察樣本制作過(guò)程繁瑣，造成觀察十分不便。同時(shí)由于電鏡下觀察視野有限和自 噬體判斷分析不易，在進(jìn)行定量分析(所需細(xì)胞數(shù)量級(jí)至少103)時(shí)往往由于工作量極大而 無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因此該方法目前僅用于進(jìn)行定性觀察，輔助分析自噬改變；②吖啶橙染色熒光顯 微鏡法利用自噬體對(duì)吖啶橙染料的染色差異實(shí)現(xiàn)自噬的檢測(cè)(吖啶橙將自噬體染成亮紅 色，同時(shí)將細(xì)胞核和胞漿染成亮綠色)。但是吖啶橙對(duì)細(xì)胞外環(huán)境(如PH值)十分敏感，染 色特異性差，易于出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或假陰性結(jié)果，可重復(fù)性差，穩(wěn)定性不足，兼之操作要求 高，應(yīng)用已日益減少；③Western blot檢測(cè)為目前普遍運(yùn)用的方法。該方法利用自噬的 關(guān)鍵分子LC3在自噬發(fā)生過(guò)程中由LC3I變?yōu)長(zhǎng)C3II，通過(guò)對(duì)LC3的改變檢測(cè)自噬。這種方 法雖然相對(duì)有效可靠，但是使用十分不便，操作繁瑣，檢測(cè)步驟多、時(shí)程長(zhǎng)，對(duì)技術(shù)及設(shè)備要 求較高，并只能進(jìn)行半定量分析，此外，檢測(cè)用抗體等試劑依賴進(jìn)口、價(jià)格昂貴，以上種種因 素，使其難以成為一種簡(jiǎn)便易用的觀察手段，在需要進(jìn)行大量自噬觀察分析(如進(jìn)行多作 用因素、多作用水平對(duì)自噬影響的研究)時(shí)往往工作量極大，這在很大程度限制了其實(shí)際 使用。使用GFP熒光蛋白標(biāo)記LC3形成GFP-LC3自噬報(bào)告基因標(biāo)記細(xì)胞使細(xì)胞指示自 噬，借助熒光顯微鏡觀察自噬活動(dòng)，是近年來(lái)出現(xiàn)的一項(xiàng)新技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)使得實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、 迅速便捷地觀察自噬成為可能。該方法利用自噬發(fā)生過(guò)程中自噬關(guān)鍵分子LC3由LC3I變 為L(zhǎng)C3II，LC3在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生改變(由LC3I的細(xì)胞胞漿內(nèi)彌散分布變?yōu)長(zhǎng)C3II的富集于自噬體上)，以GFP (綠色熒光蛋白)標(biāo)記LC3分子，通過(guò)熒光分布的改變(由GFP-LC3I 彌散分布于細(xì)胞質(zhì)之彌散綠色熒光變?yōu)镚FP-LC3II富集于自噬體上形成綠色熒光亮點(diǎn)) 及變化程度來(lái)觀察分析自噬的發(fā)生和發(fā)生強(qiáng)度。理論上，該方法具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察、簡(jiǎn)便 快捷等諸多優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際工作中卻不易實(shí)現(xiàn)。其主要問(wèn)題在于缺乏能夠高效穩(wěn)定地將 GFP-LC3自噬報(bào)告基因?qū)爰?xì)胞并使之穩(wěn)定表達(dá)的表達(dá)載體，以及快速可靠的自噬定量分 析等應(yīng)用方法。表達(dá)載體是將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞并使之表達(dá)的關(guān)鍵。目前廣泛應(yīng)用的 表達(dá)載體是攜帶GFP-LC3基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法(瞬間轉(zhuǎn)染)轉(zhuǎn)入細(xì) 胞內(nèi)并使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。這一方法存在諸多不足(特別是對(duì)于自噬研究尤為顯著)① 轉(zhuǎn)染效率低下對(duì)于自噬研究的對(duì)象細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元、心肌細(xì)胞等)，大多數(shù)轉(zhuǎn)染效 率低下(轉(zhuǎn)染率一般不超過(guò)30%)；②不能穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3基因瞬間轉(zhuǎn)染通常不能將 目的基因整合入基因組，目的基因通常在細(xì)胞傳代后表達(dá)即喪失，即使在瞬轉(zhuǎn)后使用抗性 進(jìn)行篩選純化后也不能獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，多次傳代后即喪失表達(dá)。以上兩點(diǎn)使穩(wěn)定 表達(dá)GFP-LC3，能夠擴(kuò)增傳代的細(xì)胞難以建立。穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3基因的自噬指示細(xì)胞難 以建立將導(dǎo)致研究所需的足夠數(shù)量級(jí)的細(xì)胞難以獲得，將由于分析細(xì)胞數(shù)量不足等原因?qū)?致自噬定量分析無(wú)法實(shí)現(xiàn)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)將需要不斷重復(fù)轉(zhuǎn)染工作以獲得研究所需細(xì)胞；③ 作用細(xì)胞類型有限對(duì)于一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如干細(xì)胞等、某些腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等，幾乎 無(wú)法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。這使得表達(dá)質(zhì)粒的應(yīng)用范圍非常有限，很多細(xì)胞無(wú)法應(yīng)用該方法進(jìn)行自噬 研究；④轉(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性和自噬誘導(dǎo)作用轉(zhuǎn)染試劑的毒性對(duì)細(xì)胞活力有很大影響 (如細(xì)胞活力下降等)，并可誘發(fā)自噬發(fā)生，這對(duì)于自噬研究至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染試劑的毒性作 用本身會(huì)誘發(fā)自噬，造成本底背景自噬很高，并在轉(zhuǎn)染試劑去除后仍維持較長(zhǎng)時(shí)間，在背景 自噬高的情況下，將難以準(zhǔn)確判斷自噬的發(fā)生及改變，轉(zhuǎn)染試劑的毒性和自噬誘導(dǎo)往往使 該方法之應(yīng)用陷入兩難境地因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率低下，為獲得高轉(zhuǎn)染效率和高表達(dá)， 需要增加劑量，而劑量增加又導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用和自噬誘導(dǎo)顯著增加；⑤目前廣泛應(yīng)用的 GFP-LC3質(zhì)粒的LC3是采用大鼠源性LC3序列，盡管大鼠LC3與人LC3有很高的同源性，但 是兩者仍存在較大差別。目前絕大多數(shù)自噬研究在人源性細(xì)胞進(jìn)行，繼續(xù)沿用大鼠LC3將 影響研究的可信性。傳統(tǒng)表達(dá)載體及相應(yīng)方法的種種不足促使新表達(dá)載體及方法的出現(xiàn)。 慢病毒表達(dá)載體是近年來(lái)逐漸發(fā)展起來(lái)的一種新型表達(dá)載體，具有轉(zhuǎn)染效率高(幾乎所有 的晡乳動(dòng)物細(xì)胞，接近100%的轉(zhuǎn)染效率)，高效穩(wěn)定持久的目的基因表達(dá)(目的基因經(jīng)逆 轉(zhuǎn)錄后整合入宿主基因組)等優(yōu)點(diǎn)，可克服傳統(tǒng)表達(dá)載體及相應(yīng)轉(zhuǎn)染方法的諸多不足。但 是，盡管慢病毒載體系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)載體及轉(zhuǎn)染方法的很多不足，但是目前研究報(bào)道采用 的慢病毒表達(dá)載體相對(duì)于自噬研究這一特殊領(lǐng)域仍然存在不足。其不足主要表現(xiàn)在表達(dá)載 體的表達(dá)質(zhì)粒功能欠缺以及快捷有效的定量分析等應(yīng)用方法缺乏①表達(dá)載體的表達(dá)質(zhì)粒 采用CMV啟動(dòng)子實(shí)際應(yīng)用顯示CMV啟動(dòng)子活性對(duì)于GFP-LC3表達(dá)過(guò)高，易于表達(dá)過(guò)量，過(guò) 量表達(dá)GFP-LC3 —方面對(duì)于自噬研究，由于形成過(guò)強(qiáng)熒光背景，導(dǎo)致熒光斑點(diǎn)觀察失真，影 響自噬指示和定量分析，另一方面對(duì)于細(xì)胞，持續(xù)過(guò)高表達(dá)GFP-LC3基因形成高細(xì)胞內(nèi)壓 力(stress)，導(dǎo)致較高程度的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞在傳代后易于死亡，篩選穩(wěn)定 株及擴(kuò)增不易；此外，CMV啟動(dòng)子可能增加被轉(zhuǎn)染細(xì)胞與母細(xì)胞的生物學(xué)特性差異。CMV的 這些不足需要相對(duì)溫和的啟動(dòng)子；②標(biāo)記蛋白常采用GFP :GFP熒光相對(duì)弱，為獲得清晰的 圖像和良好的觀察，通常需要加大病毒/細(xì)胞比，加大的病毒量導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，未死亡的細(xì)胞則因?yàn)樵馐苓^(guò)多病毒攻擊而細(xì)胞活力受到較大影響，背景自噬水平增高，影響自噬 判斷；③缺乏相應(yīng)的穩(wěn)定指示指示細(xì)胞系的建立方法不同的細(xì)胞類型對(duì)于慢病毒表達(dá)載 體的反應(yīng)差異很大，而不同的慢病毒表達(dá)載體有其應(yīng)用的特殊性，特別地對(duì)于建立自噬研 究使用的細(xì)胞系，需要在建立細(xì)胞系時(shí)需要將對(duì)細(xì)胞自噬指示的影響降至最低，這些需要 提供與表達(dá)載體對(duì)應(yīng)的細(xì)胞系建立方法；④缺乏快速有效的自噬定量分析方法傳統(tǒng)的自 噬定量方法為人工肉眼計(jì)數(shù)GFP-LC3自噬熒光亮點(diǎn)，再人工計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算獲得平均熒光 亮點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞。人工計(jì)數(shù)工作量很大(每一個(gè)處理組總計(jì)數(shù)細(xì)胞量通常在200以上，總熒 光亮點(diǎn)計(jì)數(shù)量通常在1000以上)，尤其是在多因素、大樣本量實(shí)驗(yàn)時(shí)工作非常繁重，計(jì)數(shù)者 易于視疲勞計(jì)數(shù)出錯(cuò)，可靠性較差，同時(shí)人工計(jì)數(shù)主觀隨意性大，定量分析結(jié)果因缺乏足夠 客觀性而可信度有限?？傊?，目前的表達(dá)載體及相關(guān)應(yīng)用方法不能滿足自噬研究所需，迫切需要能夠克 服當(dāng)前表達(dá)載體及方法不足的新型表達(dá)載體及其應(yīng)用方法，該表達(dá)載體應(yīng)能穩(wěn)定高效指示 細(xì)胞自噬活動(dòng)，能以之建立穩(wěn)定可靠的自噬指示細(xì)胞系并能夠快速便捷地定量分析自噬變 化，從而能夠?qū)?xì)胞自噬活性進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察分析，使研究工作能夠快速、順利進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體，同時(shí)提供表達(dá) 載體的建立方法及其應(yīng)用方法(包括應(yīng)用該表達(dá)載體建立能夠穩(wěn)定指示自噬的自噬指示 細(xì)胞的方法和定量分析細(xì)胞自噬的方法)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體，其方案是所述的表達(dá)載體采用慢病 毒表達(dá)載體，由慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV-UbC-EGFP-LC3和包裝質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE， pMD2G四質(zhì)粒組成，其中慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV-UbC-EGFP-LC3含有EGFP-LC3自噬報(bào)告基 因。所述EGFP-LC3自噬報(bào)告基因?yàn)槿诤匣?，由EGFP標(biāo)記蛋白和人的LC3序列組成，采用 Ubiquitin作為EGFP-LC3的啟動(dòng)子。EGFP標(biāo)記蛋白是傳統(tǒng)GFP標(biāo)記蛋白的熒光增強(qiáng)改進(jìn) 產(chǎn)物(亮度35倍于傳統(tǒng)野生型GFP)，克服了傳統(tǒng)GFP的不足，擁有更佳的熒光觀察效果和 更小的表達(dá)載體(慢病毒)需求量。以人的LC3序列替代了目前廣泛應(yīng)用的大鼠源性LC3 序列，避免了種屬差異。Ubiquitin啟動(dòng)子較之傳統(tǒng)的CMV啟動(dòng)子，啟動(dòng)作用溫和，表達(dá)目 的蛋白不易過(guò)量，對(duì)細(xì)胞影響小，避免了傳統(tǒng)CMV啟動(dòng)子的不足。應(yīng)用所述的表達(dá)載體感染 宿主細(xì)胞后可將EGFP-LC3基因整合至其基因組，使宿主細(xì)胞穩(wěn)定持久表達(dá)EGFP-LC3，利用 EGFP-LC3自噬指示功能，穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬改變。一種建立穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體的方法，其方案是采用慢病毒表達(dá) 載體構(gòu)建方法構(gòu)建，步驟如下(1)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建①NCBI獲得LC3基因序列信息，人工合 成人LC3基因；②EcoR V酶切pUC57質(zhì)粒及合成LC3基因，將LC3基因片段插入pUC57載 體，構(gòu)建成PUC57-LC3 ；③轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選克隆，提取質(zhì)粒電泳及Kpnl、HindHI雙酶 切鑒定，并測(cè)序確認(rèn)插入產(chǎn)物；測(cè)序無(wú)誤的克隆再接種擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒抽提；④用Nhe I和 Age I對(duì)pUC57-LC3進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后再做膠回收384bp的LC3基因片段；用 Nhe I和Age I對(duì)pLV_UbC-EGFP_3FLAG表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后做膠回收；⑤ 將LC3基因連接入表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成pLV-UbC-EGFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒；⑥轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽(yáng)性克隆，接種陽(yáng)性克隆，保種并分裝送測(cè)序；測(cè)序無(wú)誤的克隆再接種擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒抽提； (2)表達(dá)載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測(cè)定①選擇生長(zhǎng)旺盛期293T細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密 度為3X 106細(xì)胞/皿；②將無(wú)內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G和CaCl2溶液 混合后逐滴加入等體積的2XHBS中，加入混合溶液輕輕加入培養(yǎng)皿中并混勻后常規(guī)培養(yǎng)； ③轉(zhuǎn)染約8小時(shí)后用完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液；換液后24小時(shí)，在生物安全柜中收取上清病毒 液，并加入含2% FBS的低血清培養(yǎng)基，24h后第二次收毒后，丟掉細(xì)胞；④振蕩混勻后4°C 以10，000g高速離心30min，吸干上清后加入適量0MEM溶解沉淀；⑤濃縮病毒后以PCR法檢 測(cè)每基因組整合的病毒拷貝數(shù)，于293T細(xì)胞測(cè)定滴度；慢病毒感染性滴度達(dá)1. OX 108TU/ ml者凍存于-80度冰箱。 一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體的方法，其方 案是應(yīng)用表達(dá)載體建立穩(wěn)定指示自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì)胞，并采用基于Top-hat算子和 形態(tài)濾波的圖像分析方法定量分析自噬改變，其方法步驟如下(1)應(yīng)用表達(dá)載體建立穩(wěn) 定指示自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì)胞①確定表達(dá)載體感染細(xì)胞最佳感染復(fù)數(shù)(M0I)感染復(fù) 數(shù)(Multiplicityof Infection, M0I)是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常M0I值越高，病毒 整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高，但是病毒對(duì)于細(xì)胞有一定的毒性，病毒 量增加細(xì)胞毒性增加。不同細(xì)胞的差異很大，對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞(如Hela、293T細(xì)胞)， M0I = 2-5已經(jīng)足夠，而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如干細(xì)胞，則需要很高的M0I值。因此對(duì)于每一 株細(xì)胞，需要從感染率、表達(dá)率、自噬指示功能及細(xì)胞毒性等幾個(gè)方面綜合考量，選擇確定 最佳M0I值。取被測(cè)細(xì)胞以24板均勻鋪板X2，培養(yǎng)至30%融合，然后加入病毒培養(yǎng)液混 合物，病毒的濃度按照梯度加入，感染復(fù)數(shù)分別取2. 5，5，10，20，40，80，160，320，每個(gè)感染 復(fù)數(shù)設(shè)三個(gè)復(fù)孔，感染后36-48h換液，感染后72h熒光顯微鏡觀察拍照，統(tǒng)計(jì)感染率和表達(dá) 率，繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合，其中一塊24孔板的細(xì)胞以EBSS或Rapamycin誘導(dǎo)自噬發(fā)生，觀 察EGFP-LC3熒光亮點(diǎn)形成，統(tǒng)計(jì)亮點(diǎn)數(shù)，計(jì)算平均亮點(diǎn)/細(xì)胞值，另外一塊24孔板的細(xì)胞 以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及增殖力；按照感染率和表達(dá)率>95%、表達(dá)強(qiáng)度高(l_2s曝光清 晰成像)，自噬指示靈敏(熒光亮點(diǎn)成像清晰，與背景熒光分界清晰)，以及細(xì)胞活力及增殖 良好的原則，取符合以上要求之最小M0I值為最佳感染M0I值；②表達(dá)載體(慢病毒)感染 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30%融合，根據(jù)細(xì)胞量及最佳M0I值計(jì)算所需病毒，病 毒稀釋于培養(yǎng)液內(nèi)，加入polybrene，混勻后作用對(duì)象細(xì)胞，感染后36_48h換液，72h熒光顯 微鏡下觀察確認(rèn)后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增；③分選篩選以488nm光激發(fā)，使用配有高級(jí)熒光活性細(xì) 胞分選器的流式細(xì)胞儀(如BD公司的FACSaria II)，根據(jù)熒光有無(wú)和熒光強(qiáng)弱，在無(wú)菌條 件下分選出表達(dá)熒光強(qiáng)度在熒光強(qiáng)度均值以上的細(xì)胞；④培養(yǎng)擴(kuò)增分選純化后的細(xì)胞常 規(guī)培養(yǎng)，擴(kuò)增，獲得穩(wěn)定指示自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì)胞，備研究使用。所建立的自噬指示細(xì) 胞具有如下特性穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3，表達(dá)率100%，自噬活動(dòng)指示靈敏，可在激發(fā)波長(zhǎng)為 488nm、發(fā)射波長(zhǎng)為510nm的條件下用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，熒光穩(wěn)定不淬滅；EGFP-LC3基 因整合入染色體基因組，傳代不丟失，表達(dá)穩(wěn)定，重復(fù)性好，其熒光強(qiáng)度不隨肝癌細(xì)胞的連 續(xù)傳代而丟失；無(wú)自噬或低自噬活動(dòng)時(shí)候本底背景自噬低；細(xì)胞活力良好，穩(wěn)定傳代，死亡 率低，受病毒影響小，各細(xì)胞均可在常規(guī)條件下進(jìn)行細(xì)胞傳代；生物學(xué)特性與其母細(xì)胞基本 一致，熒光基因的整合和表達(dá)基本不影響母細(xì)胞的主要生物學(xué)行為；(2)應(yīng)用基于Top-hat 算子和形態(tài)濾波的圖像分析方法定量分析自噬改變細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)目代表細(xì)胞自噬活
7性程度，自噬體經(jīng)表達(dá)載體指示為熒光亮點(diǎn)后，熒光亮點(diǎn)數(shù)等于自噬體數(shù)目，計(jì)數(shù)熒光亮點(diǎn) 數(shù)目即可明確細(xì)胞自噬活性程度。自噬熒光亮點(diǎn)具有顯著的圖形特征(孤立于彌散分布的 綠色熒光背景中的圓形亮點(diǎn)，具有相對(duì)高的亮度，較周圍的組織密度大，與周圍組織的灰度 對(duì)比度大，輪廓明顯等)，根據(jù)自噬熒光亮點(diǎn)的這些特征，以Top-hat算子結(jié)合disk型結(jié)構(gòu) 元素對(duì)圖像處理，提取熒光亮點(diǎn)。再進(jìn)一步利用自噬熒光亮點(diǎn)固有的形態(tài)特征(一定的面 積大小的圓形，不同細(xì)胞類型大小不同)，設(shè)置形狀及大小參數(shù)過(guò)濾，進(jìn)行形態(tài)濾波處理進(jìn) 一步去除殘留的混雜少量干擾目標(biāo)，最終完成自噬熒光亮點(diǎn)的提取。熒光亮點(diǎn)提取后，以 點(diǎn)計(jì)數(shù)計(jì)算或人工計(jì)數(shù)熒光亮點(diǎn)數(shù)。如果在Top-hat運(yùn)算處理之前對(duì)圖像進(jìn)行對(duì)比增強(qiáng) 等處理，則可以獲得更好的提取和計(jì)數(shù)效果。以上圖像運(yùn)算處理通過(guò)專業(yè)生物圖像分析軟 件的計(jì)算模塊實(shí)現(xiàn)，可執(zhí)行分析的專業(yè)生物圖像分析軟件包括MetaMorph、Image-Pro Plus 等。Top-hat 運(yùn)算通過(guò) Top-hat 濾器(filter)實(shí)現(xiàn)，如 Image-Pro Plus 的 filters 中的 Top-hat濾器，MetaMorph的Top Hat algorithm等；形態(tài)濾波計(jì)算通過(guò)軟件的形態(tài)濾器實(shí) 現(xiàn)，如Image-Pro Plus的計(jì)數(shù)功能中的measurements模塊設(shè)置形態(tài)參數(shù)過(guò)濾；點(diǎn)計(jì)數(shù)計(jì) 算通過(guò)點(diǎn)計(jì)數(shù)模塊實(shí)現(xiàn)，如Image-Pro Plus的計(jì)數(shù)模塊；圖像對(duì)比增強(qiáng)可通過(guò)對(duì)比增強(qiáng)模 塊或銳化 filter 等實(shí)現(xiàn)，如 Image-Pro Plus 的 filters 的 Sharpen EnhancementFilter。 自噬定量分析的具體步驟如下①以自噬研究相關(guān)細(xì)胞處理因素處理前述已建立的自噬指 示細(xì)胞；②采用熒光顯微鏡于同一條件(相同曝光時(shí)間，背景灰度，放大倍數(shù)、視野數(shù)等)下 攝片獲得熒光圖像，每個(gè)處理組隨機(jī)取至少五個(gè)視野，使受分析細(xì)胞總數(shù)> 500 ；③以專業(yè) 生物圖像分析軟件之Top-hat模塊、形態(tài)濾波模塊實(shí)現(xiàn)以下圖像運(yùn)算分析，提取EGFP-LC3 自噬熒光亮點(diǎn)以Top-hat算子結(jié)合disk結(jié)構(gòu)元素運(yùn)算抑制去除熒光背景，進(jìn)一步根據(jù)被 研究細(xì)胞的大小不同，測(cè)量自噬熒光亮點(diǎn)之最大徑和最小徑，以大小一定的圓形設(shè)置形態(tài) 濾波過(guò)濾去除假陽(yáng)性干擾目標(biāo)，提取出EGFP-LC3自噬熒光亮點(diǎn)；④以專業(yè)生物圖像分析軟 件之點(diǎn)自動(dòng)計(jì)數(shù)模塊計(jì)數(shù)提取出的EGFP-LC3自噬熒光亮點(diǎn)獲得總熒光亮點(diǎn)數(shù)；⑤以專業(yè) 生物圖像分析軟件之細(xì)胞計(jì)數(shù)模塊或人工計(jì)數(shù)受分析細(xì)胞數(shù)；⑥計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的熒光亮點(diǎn) 數(shù)，獲得平均熒光亮點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞，重復(fù)以上步驟，數(shù)據(jù)輸入SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，通過(guò)SPSS以“平 均熒光亮點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞”為變量，對(duì)比各組差異，分析細(xì)胞自噬改變。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所述的表達(dá)載體克服了傳統(tǒng)質(zhì)粒及相應(yīng)轉(zhuǎn)染方法的不足， 具有轉(zhuǎn)染效率高、作用細(xì)胞類型廣泛、表達(dá)穩(wěn)定高效、能夠整合入基因組實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)傳 代、熒光亮度高、自噬指示靈敏可靠、細(xì)胞毒性小，使用安全、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)；使用該表達(dá) 載體感染宿主細(xì)胞可建立能夠穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì)胞，所建立的細(xì)胞穩(wěn)定 表達(dá)EGFP-LC3自噬報(bào)告基因，自噬指示靈敏，熒光穩(wěn)定不淬滅，細(xì)胞活力良好，本底背景自 噬低(指示真實(shí)可靠)，EGFP-LC3基因染色體整合度高、遺傳性狀穩(wěn)定，傳代后表達(dá)不減弱 丟失，細(xì)胞生物學(xué)行為與其相應(yīng)的母細(xì)胞一致；本發(fā)明給出的基于Top-hat算子和形態(tài)濾 波圖像分析方法的自噬定量分析方法，消除了人工計(jì)數(shù)分析的弊端，實(shí)現(xiàn)了自噬的半自動(dòng) 化定量分析，大大減輕了自噬分析的工作量，實(shí)現(xiàn)了自噬的快速可靠定量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述的穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體及應(yīng)用表達(dá) 載體感染宿主細(xì)胞建立的自噬指示高效、穩(wěn)定、靈敏迅捷、真實(shí)可靠、操作簡(jiǎn)便易用、對(duì)研究 條件設(shè)備、人員技術(shù)要求低(具備普通熒光顯微鏡即可開(kāi)展工作)，相應(yīng)的自噬定量分析方 法簡(jiǎn)單易用、快速準(zhǔn)確、可靠便捷。這些可極大地方便自噬的相關(guān)研究(尤其在工作量大的自噬研究中具有重要意義)，縮短研究所需時(shí)間，節(jié)省研究者的精力，加速自噬研究的進(jìn)程。本發(fā)明的應(yīng)用價(jià)值本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于自噬的相關(guān)研究，具有廣闊的應(yīng)用前景 和潛在的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如①自噬分子機(jī)制研究的有力工具自噬的分子機(jī)制如上 游調(diào)節(jié)機(jī)制等目前并未完全明了，本發(fā)明是自噬分子生物學(xué)研究的有力工具，可方便自噬 的分子機(jī)制等研究，有助于對(duì)自噬的深入了解和其分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明。特別地，因本發(fā) 明建立的自噬指示靈敏、迅速、并可快速定量分析，可以快速觀察分析上游調(diào)節(jié)系統(tǒng)改變對(duì) 下游的調(diào)節(jié)作用，特別有利于分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究；②自噬在腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展中的作 用的相關(guān)研究自噬與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，疾病的形成和進(jìn)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的 過(guò)程，本發(fā)明能夠?qū)崟r(shí)穩(wěn)定指示自噬，是實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察自噬在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中改變的 有力工具，對(duì)觀察了解自噬在疾病形成進(jìn)展過(guò)程中的作用具有重要應(yīng)用價(jià)值。如自噬在惡 性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，可以通過(guò)本發(fā)明建立穩(wěn)定指示自噬的自噬指示細(xì)胞系，再以自 噬指示細(xì)胞建立體外及體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移模型，觀察自噬在侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用；③自噬誘 導(dǎo)劑及抑制劑的選擇和工作濃度的快速確定自噬誘導(dǎo)及抑制(藥物及RNAi)在自噬研究 中具有非常重要的作用。自噬相關(guān)研究結(jié)論需要通過(guò)自噬誘導(dǎo)/抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，而自噬 誘導(dǎo)/抑制劑對(duì)于不同的研究對(duì)象細(xì)胞其作用濃度(工作濃度)差別很大，因此進(jìn)行自噬 研究必須先行針對(duì)性地確定被研究細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)/抑制劑的藥物種類和藥物工作濃度。 應(yīng)用本發(fā)明表達(dá)載體建立之自噬指示細(xì)胞系，通過(guò)設(shè)置對(duì)照，橫向比較不同藥物和不同工 作濃度的誘導(dǎo)/抑制效果，可以快速選擇合適的自噬誘導(dǎo)/抑制劑并確定其工作濃度；④自 噬相關(guān)藥物研發(fā)由于自噬在疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用，自噬已經(jīng)成為疾病治療的一個(gè) 重要靶點(diǎn)。自噬相關(guān)藥物作為潛在的治療藥物開(kāi)發(fā)正成為研究熱點(diǎn)。藥物的研發(fā)，無(wú)論是 新藥還是經(jīng)典藥物的改進(jìn)，都涉及到大量的藥物誘導(dǎo)或抑制自噬作用效果觀察，本發(fā)明建 立的自噬指示簡(jiǎn)捷迅速、穩(wěn)定可靠，可勝任該工作。例如，腫瘤化療耐藥與自噬高度相關(guān)，抑 制自噬可以減弱腫瘤耐藥，尋找高效安全的自噬抑制劑是相關(guān)研究的關(guān)鍵，本發(fā)明可應(yīng)用 于自噬抑制劑之快速篩選(可建立穩(wěn)定自噬指示細(xì)胞系，再建立體外及體內(nèi)模型，實(shí)時(shí)觀 察并定量分析不同自噬抑制劑對(duì)化療藥物耐藥性之影響，完成藥物的快速篩選)；⑤應(yīng)用 于傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的研究本發(fā)明采用的是慢病毒表載體，具有轉(zhuǎn)染效率高，作用 細(xì)胞范圍廣泛特點(diǎn)，對(duì)于傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞，干細(xì)胞等都可以建立穩(wěn)定 指示自噬的的相應(yīng)細(xì)胞系，從而使得這類細(xì)胞能夠得以研究并可能籍此產(chǎn)生新的發(fā)現(xiàn)；⑥ 用于模式生物等特別應(yīng)用由于利用本發(fā)明之表達(dá)載體建立的細(xì)胞能夠發(fā)出綠色熒光，可 以在自噬指示同時(shí)于體外和體內(nèi)示蹤所研究細(xì)胞，結(jié)合模式生物等可為研究提供極大的便 利。例如在斑馬魚(yú)體內(nèi)，可方便地跟蹤研究對(duì)象細(xì)胞并同時(shí)觀察細(xì)胞自噬之改變；在腫瘤 細(xì)胞裸鼠種植瘤體內(nèi)，可示蹤腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，應(yīng)用冰凍切片共聚焦掃描原位熒光觀察技術(shù)， 可同時(shí)觀察細(xì)胞的自噬改變，使得體內(nèi)原位研究成為可能。


圖1組成本發(fā)明所述的表達(dá)載體的慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)(表達(dá)質(zhì)粒 pLV-UbC-EGFP-LC3，包裝質(zhì)粒 pRsv-REV，pMDlg-pRRE, pMD2G)的結(jié)構(gòu)示意2表達(dá)載體自噬指示功能檢測(cè)圖3定量分析細(xì)胞自噬
圖4表達(dá)載體感染難轉(zhuǎn)染細(xì)胞(HCCLM3肝癌細(xì)胞，Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞及NIH3T3成 纖維細(xì)胞)建立相應(yīng)的穩(wěn)定自噬指示細(xì)胞系圖5應(yīng)用本發(fā)明快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血藥濃度的不同化療藥物對(duì)HCCLM3肝癌細(xì)胞自噬 的影響圖6應(yīng)用表達(dá)載體建立的自噬指示細(xì)胞系快速篩選確定自噬抑制劑的工作濃度圖7應(yīng)用本發(fā)明之表達(dá)載體建立HCCLM3肝癌自噬指示細(xì)胞觀察細(xì)胞在脫離ECM 狀態(tài)下自噬改變
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本實(shí)施例用以說(shuō)明穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程，以 及應(yīng)用表達(dá)載體建立自噬指示細(xì)胞和定量分析應(yīng)用；(1)表達(dá)載體構(gòu)建①表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建NCBI獲得LC3基因序列信息，人工合成LC3 基因。EcoR V酶切pUC57質(zhì)粒及合成LC3基因，將LC3基因片段插入pUC57載體，構(gòu)建成 PUC57-LC3。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選克隆，提取質(zhì)粒電泳及Kpnl、HindHI雙酶切鑒定，并 測(cè)序確認(rèn)插入產(chǎn)物。測(cè)序無(wú)誤的克隆再接種擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒抽提。用Nhe I和Age I對(duì) PUC57-LC3進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后再做膠回收384bp的LC3基因片段。用Nhe I和 Age I對(duì)pLV-UbC-EGFP-3FLAG表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后做膠回收。將LC3基因 連接入表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成pLV-UbC-EGFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒(圖1)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽(yáng)性 克隆(用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子)，接種陽(yáng)性克隆，保種并分裝送測(cè)序。測(cè)序無(wú)誤的克隆再 接種擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒抽提；②表達(dá)載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測(cè)定選擇生長(zhǎng)旺盛期 293T細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密度為3 X 106細(xì)胞/皿。將無(wú)內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE， pMD2G(圖1)和CaCl2溶液混合后逐滴加入等體積的2XHBS中，加入混合溶液輕輕加入培 養(yǎng)皿中并混勻后常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染約8小時(shí)后用完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液。換液后24小時(shí)，在生 物安全柜中收取上清，并加入含2% FBS的低血清培養(yǎng)基，24h后第二次收毒后，丟掉細(xì)胞。 振蕩混勻后高速離心(10，000g, 30min,4°C )，吸干上清后加入適量0MEM溶解沉淀，濃縮病 毒后以PCR法檢測(cè)每基因組整合的病毒拷貝數(shù)，于293T細(xì)胞測(cè)定滴度。慢病毒感染性滴度 達(dá)1. OX 108TU/ml者凍存于-80度冰箱；(2)應(yīng)用表達(dá)載體建立肝癌細(xì)胞SMMC7721自噬指示細(xì)胞①確定表達(dá)載體感染 細(xì)胞最佳感染復(fù)數(shù)(M0I)取肝癌細(xì)胞SMMC7721以24板均勻鋪板X2，培養(yǎng)至30%融合， 然后加入病毒培養(yǎng)液混合物，病毒的濃度按照梯度加入，感染復(fù)數(shù)分別取2. 5，5，10，20， 40，80，160, 320，每個(gè)感染復(fù)數(shù)設(shè)三個(gè)復(fù)孔，感染后36_48h換液，感染后72h熒光顯微鏡 觀察拍照(圖2-1，2)，統(tǒng)計(jì)感染率和表達(dá)率，繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合，其中一塊24孔板的 細(xì)胞以RapamycinQOOnM作用6h)誘導(dǎo)自噬發(fā)生，觀察EGFP-LC3熒光亮點(diǎn)形成(圖2_3， 4)，統(tǒng)計(jì)亮點(diǎn)數(shù)，計(jì)算平均亮點(diǎn)/細(xì)胞值，另外一塊24孔板的細(xì)胞以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 及增殖力；按照感染率和表達(dá)率> 95%、l-2s曝光清晰成像，自噬熒光亮點(diǎn)與背景熒光分 界清晰，以及細(xì)胞活力及增殖力良好，取符合以上要求之最小感染復(fù)數(shù)，確定M0I = 40為 最佳感染感染復(fù)數(shù)；②表達(dá)載體感染細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)SMMC7721細(xì)胞于六孔板，取對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期，30 %融合，以M0I = 40根據(jù)細(xì)胞量計(jì)算所需病毒，病毒稀釋于2ml培養(yǎng)液內(nèi)，加入 polybrene (lul/2ml)，混勻后作用對(duì)象細(xì)胞，感染后36_48h換液，72h熒光顯微鏡下觀察確認(rèn)后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，部分細(xì)胞設(shè)置自噬誘導(dǎo)復(fù)行檢測(cè)自噬指示功能。圖2-1和圖2-2低倍鏡 圖像示高效轉(zhuǎn)染和表達(dá)(轉(zhuǎn)染效率> 99% )，圖2-3和圖2-4高倍鏡圖像示自噬誘導(dǎo)試驗(yàn) 證實(shí)自噬指示功能良好(圖2-3為誘導(dǎo)前熒光呈彌散分布，圖2-4為誘導(dǎo)自噬后細(xì)胞的胞 漿內(nèi)出現(xiàn)熒光亮點(diǎn))；③分選篩選以488nm光激發(fā)，使用配有高級(jí)熒光活性細(xì)胞分選器的 流式細(xì)胞儀(BD公司的FACSaria II)，在無(wú)菌條件下分選出表達(dá)熒光強(qiáng)度在熒光強(qiáng)度均值 以上的細(xì)胞；④培養(yǎng)擴(kuò)增分選純化后的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，擴(kuò)增，一部分細(xì)胞持續(xù)傳代，25代 后重復(fù)以上功能檢測(cè)(圖2-5，6，7，8)，可見(jiàn)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率，表達(dá)強(qiáng)度，自噬指示功能等方 面保持穩(wěn)定，無(wú)明顯衰減；⑤實(shí)驗(yàn)應(yīng)用或凍存保種獲得的SMMC7721自噬指示細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng) 用或凍存保種；(3)應(yīng)用基于Top-hat算子和形態(tài)濾波的自噬定量分析方法分析細(xì)胞自噬改變 SMMC7721自噬指示細(xì)胞以Rapamycin (200nM作用6h)誘導(dǎo)自噬，設(shè)置空白對(duì)照，采用最常 見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室配置(普通熒光顯微鏡和Image-Pro Plus圖像分析軟件)定量分析自噬改變。 首先以同一條件參數(shù)拍攝不同處理的細(xì)胞圖片(曝光時(shí)間為1.5s)(圖3-1)，隨機(jī)選取拍攝 至少五個(gè)觀察視野。細(xì)胞圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus圖像分析軟件，以Top hat濾鏡過(guò)濾圖 像除去背景熒光獲得EGFP-LC3自噬熒光亮點(diǎn)(圖3-2)，以計(jì)數(shù)模塊中的形態(tài)濾波進(jìn)一步標(biāo) 記過(guò)濾去除干擾點(diǎn)(圖3-3)，然后對(duì)自噬熒光亮點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)(圖3-3，4)獲得總的熒光 亮點(diǎn)數(shù)，以計(jì)數(shù)模塊再計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，總的熒光亮點(diǎn)數(shù)除以細(xì)胞數(shù)獲得每個(gè)觀察視野的平 均熒光亮點(diǎn)數(shù)(熒光亮點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞)，每組至少計(jì)數(shù)五個(gè)視野圖片，各圖片獲得之平均熒光 亮點(diǎn)數(shù)導(dǎo)入SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例2至5用以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的具體應(yīng)用實(shí)施例2應(yīng)用本發(fā)明所述的表達(dá)載體感染難轉(zhuǎn)染細(xì)胞建立相應(yīng)的自噬指示細(xì)胞系某些細(xì)胞株是普通轉(zhuǎn)染方法(如脂質(zhì)體法)難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染率通常僅 有不到10%，如果細(xì)胞株同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的毒性敏感則轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞量更少，難以進(jìn)行后 繼實(shí)驗(yàn)。同時(shí)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法的背景自噬程度高(圖4-左側(cè))。本例以HCCLM3肝癌細(xì)胞， Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞及NIH3T3成纖維細(xì)胞三株難轉(zhuǎn)染細(xì)胞為代表，使用本發(fā)明的表達(dá)載體 建立對(duì)應(yīng)的自噬指示細(xì)胞(同時(shí)設(shè)置傳統(tǒng)的質(zhì)粒脂質(zhì)體瞬間轉(zhuǎn)染為對(duì)照)。首先以發(fā)明內(nèi) 容中所述的確定表達(dá)載體感染宿主細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)的方法步驟確定HCCLM3，Caco-2 及NIH3T3各細(xì)胞株的最佳感染復(fù)數(shù)為20，40和160，然后分別使用表達(dá)載體以各自最佳感 染復(fù)數(shù)感染各細(xì)胞，36-48h后更換培養(yǎng)液，72h后熒光顯微鏡下觀察。繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增至IO7 數(shù)量級(jí)，以BD公司FACSariaII流式細(xì)胞分選儀于無(wú)菌條件下按照熒光強(qiáng)度在細(xì)胞群熒 光強(qiáng)度均值以上分選細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，建立各自穩(wěn)定指示自噬的自噬指示細(xì)胞系(圖 4-右側(cè))，所獲得的細(xì)胞100 %表達(dá)，熒光表達(dá)強(qiáng)度高(Is曝光清晰成像)，細(xì)胞毒性小，背 景自噬低(幾乎不誘發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)生)。取部分細(xì)胞以梯度濃度的Rapamycin (50，100，200， 400，800，1600nM)作用6h行自噬誘導(dǎo)，驗(yàn)證自噬指示功能靈敏有效。取新建自噬指示細(xì)胞 的各自母細(xì)胞為對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，設(shè)置移動(dòng)侵襲試驗(yàn)檢測(cè)兩組腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)侵 襲能力，比較兩組的生物學(xué)行為(生長(zhǎng)、增殖，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等)，表明兩種細(xì)胞生物 學(xué)行為一致無(wú)顯著差別。繼續(xù)培養(yǎng)，傳代至25代，重復(fù)檢測(cè)熒光表達(dá)強(qiáng)度，重復(fù)誘導(dǎo)自噬驗(yàn) 證自噬功能，證實(shí)細(xì)胞在感染率、表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度，自噬指示靈敏度，以及細(xì)胞活力等各方面均無(wú)明顯減弱。實(shí)施例3應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行肝癌細(xì)胞化療耐藥性與自噬相關(guān)研究腫瘤對(duì)化療藥物的耐受是腫瘤治療的重要障礙，其相關(guān)研究一直是熱點(diǎn)。近年來(lái) 的研究顯示自噬是腫瘤細(xì)胞化療耐藥的重要機(jī)制，抑制自噬化療敏感性增加。腫瘤耐藥的 體外研究需要對(duì)不同細(xì)胞株在不同化療藥物及不同藥物劑量作用下自噬的改變分別進(jìn)行 檢測(cè)，以常規(guī)的Western blot、透射電鏡等方法等進(jìn)行檢測(cè)工作量非常龐大，應(yīng)用本發(fā)明 可使工作量大大減少，完成快速篩選。本例檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血藥濃度水平的8種不同化療藥物對(duì) HCCLM3肝癌細(xì)胞自噬的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的自噬指示HCCLM3肝癌細(xì)胞鋪24孔板，設(shè)3 復(fù)孔，細(xì)胞長(zhǎng)至60%融合，設(shè)置空白對(duì)照，化療藥物處理組加入含有標(biāo)準(zhǔn)血藥濃度的化療 藥物的培養(yǎng)液，6h后，熒光顯微鏡下觀察自噬改變并定量分析，可見(jiàn)各化療藥物誘導(dǎo)肝癌 細(xì)胞的能力不同(圖 5-1，2，3，4，5，6，7，8 分別為 Sorafenib，Doxorubicin, Paclitaxel, Rapamycin, Cisplatin, Velcade, Oxaliplatin 及 5-FU)。較之傳統(tǒng)的 western blot 方法， 本方法工作量大大降低，同時(shí)無(wú)論是細(xì)胞還是其他研究因素的齊性均得到良好保證，增加 研究結(jié)果的可靠性。實(shí)施例4應(yīng)用本發(fā)明快速篩選確定自噬抑制劑工作濃度自噬抑制劑是自噬研究之必不可少的研究工具。絕大多數(shù)自噬相關(guān)研究需要通過(guò) 自噬抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，而自噬抑制劑對(duì)于不同的細(xì)胞其有效作用濃度(工作濃度)差別很 大，因此進(jìn)行自噬研究前必須先行針對(duì)性地確定被研究細(xì)胞的自噬抑制劑的工作濃度。傳 統(tǒng)的方法是通過(guò)Western blot、透射電鏡等完成，工作量大，步驟繁多，耗時(shí)長(zhǎng)，應(yīng)用本表達(dá) 載體建立之細(xì)胞系可以快速確定自噬抑制劑工作濃度。方法如下(以HCCLM3肝癌細(xì)胞及 自噬抑制劑3-MA為例)以表達(dá)載體感染并建立HCCLM3自噬指示細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鋪于24 孔板，取3復(fù)孔，細(xì)胞長(zhǎng)至40-60%融合，以梯度濃度(0,10, 20,40,60,120, 240,480 μ mol/ L)加入自噬抑制劑3-MA，然后以自噬誘導(dǎo)劑(Rapamycin)誘導(dǎo)自噬，顯微鏡下觀察自噬， 定量分析平均熒光亮點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞，作自噬抑制曲線，統(tǒng)計(jì)分析被抑制程度，計(jì)算確定工作濃 度。圖6示應(yīng)用表達(dá)載體建立HCCLM3自噬指示細(xì)胞快速篩選確定自噬抑制劑3-MA的工 作濃度。圖6-1為自噬誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照(Rapamycin 200nM濃度誘導(dǎo)自噬，3-MA濃度為0)，圖 6-2至圖6-6為細(xì)胞與濃度逐漸增高的自噬抑制劑3-MA共培養(yǎng)，然后進(jìn)行自噬誘導(dǎo)，分析自 噬抑制程度，圖6-6對(duì)應(yīng)濃度為所需工作濃度。實(shí)施例5應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行肝癌細(xì)胞失巢凋亡與自噬相關(guān)研究自噬與肝癌細(xì)胞的失巢凋亡耐受關(guān)系密切。失巢凋亡(anoikis)的體外研究需要 使用poly-ΗΕΜΑ覆蓋的培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞以模擬細(xì)胞脫離基底膜的生長(zhǎng)狀態(tài)(失巢狀態(tài))。常 規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，在自行鋪設(shè)poly-HEMA時(shí)，由于要盡量做到poly-HEMA面水平，防止培養(yǎng)皿 面積小的情況下膠面因分子張力形成弧形面而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生接觸團(tuán)集(細(xì)胞在poly-HEMA 上生長(zhǎng)為非貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，如果呈弧面，細(xì)胞將聚集于皿中央，導(dǎo)致細(xì)胞間接觸團(tuán)集，影響 研究結(jié)果)，通常需要大或較大面積的培養(yǎng)皿(如IOcm直徑)。使用大面積的培養(yǎng)皿決定 了研究細(xì)胞的需求量很大。這種情況下通過(guò)使用傳統(tǒng)的脂質(zhì)體瞬間轉(zhuǎn)染和抗性篩選方法難
12以獲取大量目的細(xì)胞(瞬轉(zhuǎn)穩(wěn)篩獲得的細(xì)胞量有限，并且在擴(kuò)增傳代過(guò)程中EGFP-LC3表達(dá) 減弱或喪失)。使用本發(fā)明之表達(dá)載體構(gòu)建的自噬指示細(xì)胞系可以克服該問(wèn)題而獲得大量 穩(wěn)定高效表達(dá)EGFP-LC3的細(xì)胞，使該研究得以開(kāi)展。本實(shí)例顯示應(yīng)用本發(fā)明建立自噬指示 肝癌細(xì)胞觀察細(xì)胞在失巢狀態(tài)下細(xì)胞的自噬改變以實(shí)施例1所述方法感染HCCLM3肝癌細(xì) 胞建立自噬指示細(xì)胞HCCLM3-ATG，常規(guī)培養(yǎng)擴(kuò)增至所需數(shù)量級(jí)(2 X IO6/皿)。取常規(guī)IOcm 直徑培養(yǎng)皿及poly-HEMA覆蓋的IOcm直徑培養(yǎng)皿，以2 X IO6/皿密度鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，常規(guī)培 養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在貼壁和脫壁生長(zhǎng)0h，24及48小時(shí)后細(xì)胞自噬的改變(圖 7)，使用Volocity圖像分析軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。
權(quán)利要求
穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體，其特征是所述的表達(dá)載體采用慢病毒表達(dá)載體，由慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV UbC EGFP LC3和包裝質(zhì)粒pRsv REV，pMD1g pRRE，pMD2G四質(zhì)粒組成，其中慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV UbC EGFP LC3含有EGFP LC3自噬報(bào)告基因；所述EGFP LC3自噬報(bào)告基因?yàn)槿诤匣颍蒃GFP標(biāo)記蛋白和人的LC3序列組成，采用Ubiquitin作為EGFP LC3的啟動(dòng)子；應(yīng)用表達(dá)載體感染宿主細(xì)胞后將EGFP LC3基因整合至其基因組，使宿主細(xì)胞穩(wěn)定持久表達(dá)EGFP LC3，利用EGFP LC3自噬指示功能，穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬改變。
2.一種建立權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體的方法，其特征是 采用慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建方法構(gòu)建，步驟如下(1)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建①NCBI獲得LC3基因序列信息，人工合成人LC3基因；②EcoRV酶切pUC57質(zhì)粒及合成LC3基因，將LC3基因片段插入pUC57載體，構(gòu)建成 PUC57-LC3 ；③轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選克隆，提取質(zhì)粒電泳及Kpnl、Hindlll雙酶切鑒定，并測(cè)序確 認(rèn)插入產(chǎn)物；測(cè)序無(wú)誤的克隆再接種擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒抽提；④用NheI和Age I對(duì)pUC57_LC3進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后再做膠回收384bp的 LC3基因片段；用Nhe I和Age I對(duì)pLV_UbC-EGFP_3FLAG表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電 泳后做膠回收；⑤將LC3基因連接入表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成pLV-UbC-EGFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒；⑥轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽(yáng)性克隆，接種陽(yáng)性克隆，保種并分裝送測(cè)序；測(cè)序無(wú)誤的克 隆再接種擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒抽提；(2)表達(dá)載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測(cè)定①選擇生長(zhǎng)旺盛期293T細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密度為3X 106細(xì)胞/皿；②將無(wú)內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G和CaCl2溶液混合后逐滴加入等 體積的2XHBS中，加入混合溶液輕輕加入培養(yǎng)皿中并混勻后常規(guī)培養(yǎng)；③轉(zhuǎn)染約8小時(shí)后用完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液；換液后24小時(shí)，在生物安全柜中收取上清 病毒液，并加入含2% FBS的低血清培養(yǎng)基，24h后第二次收毒后，丟掉細(xì)胞；④振蕩混勻后4°C以10，000g高速離心30min，吸干上清后加入適量0MEM溶解沉淀；⑤濃縮病毒后以PCR法檢測(cè)每基因組整合的病毒拷貝數(shù)，于293T細(xì)胞測(cè)定滴度；慢病 毒感染性滴度達(dá)1. OX 108TU/ml者凍存于-80度冰箱。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體的方法，其特征是 應(yīng)用表達(dá)載體建立穩(wěn)定指示自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì)胞，并采用基于Top-hat算子和形態(tài)濾 波的圖像分析方法定量分析自噬改變，其具體步驟如下(1)應(yīng)用表達(dá)載體建立穩(wěn)定指示自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì)胞①確定表達(dá)載體感染細(xì)胞最佳感染復(fù)數(shù)取被測(cè)細(xì)胞以24板均勻鋪板X2，培養(yǎng)至 30%融合，然后加入病毒培養(yǎng)液混合物，病毒的濃度按照梯度加入，感染復(fù)數(shù)分別取2. 5， 5，10，20，40，80，160，320，每個(gè)感染復(fù)數(shù)設(shè)三個(gè)復(fù)孔，感染后36_48h換液，感染后72h熒光 顯微鏡觀察拍照，統(tǒng)計(jì)感染率和表達(dá)率，繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合，其中一塊24孔板的細(xì)胞以 EBSS或Rapamycin誘導(dǎo)自噬發(fā)生，觀察EGFP-LC3熒光亮點(diǎn)形成，統(tǒng)計(jì)亮點(diǎn)數(shù)，計(jì)算平均亮點(diǎn)/細(xì)胞值，另外一塊24孔板的細(xì)胞以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及增殖力；按照感染率和表達(dá) 率> 95%、l-2s曝光清晰成像，自噬熒光亮點(diǎn)與背景熒光分界清晰，以及細(xì)胞活力及增殖 力良好，取符合以上要求之最小感染復(fù)數(shù)為最佳感染感染復(fù)數(shù)；②表達(dá)載體感染細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30%融合，根據(jù)細(xì)胞量及最佳 M0I值計(jì)算所需病毒，病毒稀釋于培養(yǎng)液內(nèi)，加入polybrene，混勻后作用對(duì)象細(xì)胞，感染后 36-48h換液，72h熒光顯微鏡下觀察確認(rèn)后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增；③分選篩選以488nm光激發(fā)，使用配有高級(jí)熒光活性細(xì)胞分選器的流式細(xì)胞儀，根據(jù) 熒光有無(wú)和熒光強(qiáng)弱，在無(wú)菌條件下分選出表達(dá)熒光強(qiáng)度在熒光強(qiáng)度均值以上的細(xì)胞；④培養(yǎng)擴(kuò)增分選純化后的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，擴(kuò)增，獲得穩(wěn)定指示自噬活動(dòng)的自噬指示細(xì) 胞，備研究使用；(2)應(yīng)用基于Top-hat算子和形態(tài)濾波的圖像分析方法定量分析自噬改變①以自噬研究相關(guān)細(xì)胞處理因素處理上述自噬指示細(xì)胞；②采用熒光顯微鏡于同一條件下攝片獲得熒光圖像，每個(gè)處理組隨機(jī)取至少五個(gè)視 野，使受分析細(xì)胞總數(shù)> 500;③以專業(yè)生物圖像分析軟件之Top-hat模塊、形態(tài)濾波模塊實(shí)現(xiàn)以下圖像運(yùn)算分析， 提取EGFP-LC3自噬熒光亮點(diǎn)以Top-hat算子結(jié)合disk結(jié)構(gòu)元素運(yùn)算抑制去除熒光背景， 進(jìn)一步以大小一定的圓形設(shè)置形態(tài)濾波過(guò)濾去除假陽(yáng)性干擾目標(biāo)，提取出EGFP-LC3自噬 熒光亮點(diǎn)；④以專業(yè)生物圖像分析軟件之點(diǎn)自動(dòng)計(jì)數(shù)模塊計(jì)數(shù)提取出的EGFP-LC3自噬熒光亮點(diǎn) 獲得總熒光亮點(diǎn)數(shù)；⑤以專業(yè)生物圖像分析軟件之細(xì)胞計(jì)數(shù)模塊或人工計(jì)數(shù)受分析細(xì)胞數(shù)；⑥計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的熒光亮點(diǎn)數(shù)，獲得平均熒光亮點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞，重復(fù)以上步驟，數(shù)據(jù)輸入 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)分析。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，旨在提供一種穩(wěn)定指示細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)載體及其建立和應(yīng)用方法。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建含有EGFP-LC3自噬報(bào)告基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，采用四質(zhì)粒系統(tǒng)，建立能夠使細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3基因的慢病毒表達(dá)載體。使用該表達(dá)載體感染宿主細(xì)胞，可將EGFP-LC3基因穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組，使宿主細(xì)胞穩(wěn)定高效表達(dá)EGFP-LC3，指示細(xì)胞自噬變化。應(yīng)用該表達(dá)載體可建立穩(wěn)定的自噬指示細(xì)胞，并采用基于Top-hat算子和形態(tài)濾波的圖像分析方法快速定量分析細(xì)胞自噬改變。本發(fā)明具有自噬指示穩(wěn)定可靠、實(shí)時(shí)靈敏、自噬定量快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，極大地方便了自噬觀察分析，可廣泛應(yīng)用于自噬相關(guān)研究。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101892265SQ20101019872
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者丁振斌, 史穎弘, 彭遠(yuǎn)飛, 樊嘉 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院