PCR ;
[0109] 圖2C :進行螢光素酶測定以鑒定miR-494啟動子；
[0110] 圖2D :ERK對miR-494表達的調(diào)控；
[0111] 圖2E :AP-1調(diào)控miR-494啟動子的推定序列（SI和S2)。
[0112] 圖2F :對Sl和S2片段的染色質(zhì)免疫沉淀分析。利用C-Jun抗體免疫沉淀染色質(zhì)； 和
[0113] 圖2G :跨越pri - miR-494的30_kb基因組區(qū)域：示意圖代表位于pri - miR-494 上游27. 8kb和18. 6kb的兩個推定的API結(jié)合序列（綠色矩形）。數(shù)據(jù)表示為土SD。
[0114] 圖 3A-3D。BIM 為 miR-494 的靶：
[0115] 圖3A 3'UTR含有一個預(yù)測的miR494結(jié)合位點；顯示了 miR-494[SEQ ID NO: 16]的種子區(qū)域與BM 3' UTR[SEQ ID NO: 7]的比對；祀誘變的位點以紅色標(biāo)示；
[0116] 圖3B :利用含有野生型（直方圖的左側(cè)）或突變型（直方圖的右側(cè)）的pGL3-BM 熒光素酶構(gòu)建體進行螢光素酶測定；將螢火蟲螢光素酶表達的相對抑制針對轉(zhuǎn)染對照進行 標(biāo)準(zhǔn)化；進行3次報告基因測定，結(jié)果基本上相同；
[0117] 圖3C:miR-494下調(diào)升高293A細胞中BM蛋白的內(nèi)源水平；和，
[0118] 圖3D :293A細胞中的顯示miR-494下調(diào)后BM表達的增加的qRT-PCR。數(shù)據(jù)表示 為土SD。
[0119] 圖 4A-4E。PED 通過 ERK1/2 調(diào)控 BIM 表達：
[0120] 圖4A :顯示PEDlP PED S1°4G轉(zhuǎn)染后BM的表達的Western印跡；
[0121] 圖4B :顯示在無規(guī)miR或miR-494轉(zhuǎn)染48小時和ERK1/2抑制劑（ERK抑制劑II FR180204)的時間過程后 BM、ERK1/2、p-ERKl/2 和 p-Elkl 的表達的 Western 印跡；
[0122] 圖4C :與圖4B相關(guān)的miR-494表達的qRT-PCR ;
[0123] 圖4D :293A細胞中的顯示在ERK1/2信號傳導(dǎo)的干擾后miR-494下調(diào)的qRT-PCR ; 和，
[0124] 圖4E :293A細胞中的顯示在APl的干擾后的BM增加的qRT-PCR。數(shù)據(jù)表示為 土SD。
[0125] 圖5A-5G。miRNA-494通過BM下調(diào)抑制NSCLC中的細胞凋亡：
[0126] 圖5A :顯示在H460細胞的miR494轉(zhuǎn)染后BM的表達的Western印跡；
[0127] 圖5B :顯示在A549細胞的抗-miR-494轉(zhuǎn)染后BM的表達的Western印跡；
[0128] 圖5C:顯示在ERK1/2沉默和miR-494 -強制表達后BM和ERK1/2的表達的 Western 印跡；
[0129] 圖 :顯示在 A549 細胞的 ERKl/2、c-Jun 和 c-Fos siRNA 的轉(zhuǎn)染后 BIM、ERKl/2、 c-Jun和c-Fos的表達的Western印跡；
[0130] 圖 5E :在 miR-494 或 BM siRNA 和 TRAIL 處理（200ng/mL)后對 H460 細胞進行的 百分比細胞增殖測定。相對于未處理的H460細胞的P〈0. 05的顯著性值；
[0131] 圖 5F :在 miR-494 或 BM siRNA 和 TRAIL 處理（200ng/mL)后的對 H460 細胞進行 的半胱天冬酶3/7活性測定。相對于未處理的H460細胞的P〈0. 05的顯著性值；和
[0132] 圖5G :顯示在用（200ng/mL) TRAIL處理40分鐘的H460細胞中在miR-無規(guī)、 miR-494、siRNA對照（Ctr)和siB頂后PARP和被切割的PARP的表達的Western印跡。數(shù) 據(jù)表不為土SD。
[0133] 圖6A-6D。miR-494在體內(nèi)對致瘤性的作用：
[0134] 圖6A和圖6B :對用對照（空）或miR-494慢病毒（miR-494)感染的H460細胞進 行的克隆生成測定。進行克隆生成測定3次。顯示了代表性板。柱表示來源于涂板的500 個細胞的克隆的數(shù)目；
[0135] 圖6C :用利用空載體或miR-494穩(wěn)定感染的H460細胞注射的裸鼠中的腫瘤植入 物尺寸的比較；和，
[0136] 圖6D :系統(tǒng)的摘要圖：阻斷ERK1/2細胞核途徑的PEDlt14下調(diào)miR-494,增強對細胞 凋亡刺激的敏感性。數(shù)據(jù)表示為土SD。
[0137] 圖7A :顯示在ERKl/2、c_Fos和c-JUN siRNA轉(zhuǎn)染后蛋白質(zhì)表達的Western印跡。
[0138] 圖7B :對MegOl和293A細胞進行的顯示miR-494內(nèi)源水平的qRT-PCR。
[0139] 圖7C :在miR-494的強制表達后對MegOl細胞進行的qRT-PCR。
[0140] 圖7D :作為圖3D的對照的在miR-494下調(diào)后對293A細胞進行的qRT-PCR。
[0141] 圖8A和圖8B :顯示這些細胞系的BM和miR-494表達的NSCLC細胞的qRT-PCR。 miR-494在不同NSCLC中與BM mRNA表達反相關(guān)。
[0142] 圖8C :顯示NSCLC細胞中的BM與miR-494之間的反相關(guān)的XY散布圖。
[0143] 圖8D :A549細胞中的顯示在miR-494過表達存在或不存在的情況下在 ERKl/2siRNA 后的 miR-494 下調(diào)的 qRT-PCR。
[0144] 圖8E :A549細胞中的顯示在miR-494過表達存在或不存在的情況下在 ERKl/2siRNA后的BIM表達的增加的qRT-PCR。
[0145] 圖8F :A549細胞中的顯示在ERKl/2siRNA后的miR-494下調(diào)的的qRT-PCR。
[0146] 圖8G和圖8H :在miR-494轉(zhuǎn)染和TRAIL處理后的對A549細胞進行的增殖和半胱 天冬酶3 - 7測定。相對于未處理的A549細胞的P〈0. 05的顯著性值。
[0147] 圖81 :對用無規(guī)miR、miR-494轉(zhuǎn)染的并用（400ng/mL)TRAIL處理40分鐘的A459 細胞進行的Western印跡。數(shù)據(jù)表示為土SD。
[0148] 圖9A :顯示在抗-mir-494轉(zhuǎn)染后A549細胞的PTEN表達的Western印跡。
[0149] 圖9B :顯示用空載體或miR-494穩(wěn)定感染的H460細胞的miR-494表達的qRT-PCR。
[0150] 圖9C :對利用對照或miR-494慢病毒感染的H460細胞進行的生長曲線分析。
[0151] 圖9D :用利用空載體或miR-494穩(wěn)定感染的H460細胞注射的裸鼠的植入腫瘤的 生長曲線。
[0152] 圖9E :對來源于用對照或或miR-494慢病毒感染的H460細胞的植入腫瘤樣品進 行免疫組織化學(xué)。相對于來源于空載體（左上）的團塊，過表達miR-494 (左下）的細胞形 成大得多的團塊。基于有活力的異種移植物（V)與壞死區(qū)域（N)之間的界面上的細胞增殖 (左柱，原始放大倍數(shù)=IOX)或細胞凋亡（中和右柱，原始放大倍數(shù)=200 X)的程度不能 分離對照和表達miR-494的樣本。免疫組織化學(xué)染色：增殖=抗-Ki67,細胞凋亡=抗-半 胱天冬酶-3,兩者使用二氨基聯(lián)苯胺作為色原體來在淡蘭色（蘇木精）背景上產(chǎn)生棕色產(chǎn) 物。
[0153] 圖IOA :顯示用空載體（ZIP)或a -miR-494穩(wěn)定感染的A549細胞的miR-494的 表達的qRT-PCR。
[0154] 圖IOB和圖IOC :對用對照（ZIP)或a -miR-494慢病毒感染的A549細胞進行的 克隆生成測定。進行克隆生成測定3次。顯示了代表性板。柱表示來源于涂板的500個細 胞的克隆的數(shù)目。
[0155] 圖IOD :對利用空載體（ZIP)或a -miR-494慢病毒穩(wěn)定感染的A549細胞進行的 生長曲線分析。
[0156] 圖IOE :用利用ZIP載體或a -miR-494穩(wěn)定感染的A549細胞注射的裸鼠的腫瘤 植入物尺寸的比較。
[0157] 圖IOF :用利用空載體（ZIP)或a -miR-494慢病毒穩(wěn)定感染的A549細胞注射的 裸鼠的植入腫瘤的生長曲線。
[0158] 優(yōu)選實施方案的詳述
[0159] 在整個本公開內(nèi)容中，各種出版物、專利和公開的專利說明書通過標(biāo)識引用進行 引用。這些出版物、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容在此處通過引用并入本公開內(nèi)容 以更全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的當(dāng)前狀態(tài)。
[0160] 定義
[0161] 應(yīng)當(dāng)理解的是，前述一般描述和以下的詳細描述都只是示例性和解釋性的，并且 無意限制本教導(dǎo)的范圍。在本申請中，除非另外特別說明，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。
[0162] 當(dāng)與權(quán)利要求和/或說明書中的術(shù)語"包含"結(jié)合使用時，單詞"一個/ 一種（a)" 或〃一個/ 一種（an) 〃的使用可表示〃一個/ 一種〃，但其還與〃一個/ 一種或多個/多種 〃、〃至少一個/ 一種〃和〃一個/ 一種或超過一個/ 一種〃的含義一致。
[0163] 此外，〃包含〃、〃含有〃和〃包括〃或這些根詞的修飾體例如但不限于〃包含 (comprises) 〃、〃含有（contained) 〃和〃包括（including) 〃的使用無意是限定性的。術(shù) 語〃和/或〃意指可一起或分開地獲取之前和之后的項。為了舉例說明，但非作為限制，"X 和/或Y〃可意指〃X〃或〃Y〃或者〃X和Y〃。
[0164] 如本文中所用，術(shù)語〃其組合〃是指術(shù)語之前所列的項的所有排列和組合。例如， ^、(：或其組合〃意欲包括4、8、(：、48、4(：、8(：或48(：的至少一項，并且如果在特定上下文 中順序是重要的話，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
[0165] 應(yīng)理解，miRNA來源于基因組序列或基因。在這方面，術(shù)語〃基因〃為方便起見用 于指編碼給定的miRNA的前體miRNA的基因組序列。然而，本發(fā)明的實施方案可包括miRNA 的牽涉其表達的基因組序列，諸如啟動子或其它調(diào)控序列。
[0166] 術(shù)語〃miR〃、〃mir〃和〃miRNA〃通常是指microRNA，一類能夠調(diào)節(jié)RNA翻譯的 小 RNA 分子（參見，Zeng 和 Cullen, RNA, 9(1) : 112-123, 2003 ;Kidner 和 Martienssen Trends Genet, 19(1):13-6, 2003 ；Dennis C, Nature,420(6917):732, 2002 ；Couzin J, Science298 (5602) :2296-7, 2002,其每一個通過引用并入本文）。
[0167] 應(yīng)理解，miRNA來源于基因組序列或基因。在這方面，術(shù)語〃基因〃為方便起見用 于指編碼給定的miRNA的前體miRNA的基因組序列。然而，本發(fā)明的實施方案可包括miRNA 的牽涉其表達的基因組序列諸如啟動子或其它調(diào)控序列。
[0168] 術(shù)語"miRNA"通常是指單鏈分子，但在特定的實施方案中，本發(fā)明中應(yīng)用的分子 還將包括區(qū)域或另外的鏈，所述區(qū)域或另外的鏈與相同單鏈分子的另一個區(qū)域或與另一個 核酸部分地（在鏈的長度上10和50%之間的互補）、大體上（在鏈的長度上大于50%但小 于100%的互補）或完全互補。因此，核酸可包括包含一個或多個互補或自身互補鏈的分 子或包含分子的特定序列的〃互補物〃。例如，前體miRNA可具有達到100 %互補的自身互 補區(qū)域，本發(fā)明的miRNA探針可與它們的靶互補或與其至少60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95或 100 %互補。
[0169] 除非另外指出，否則根據(jù)常規(guī)用法使用技術(shù)術(shù)語。分子生物學(xué)中的常用術(shù)語的 定義可見于 Benjamin Lewin, Genes V，由 Oxford University Press 出版的，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（編輯），The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版的，1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (編 輯），Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版的，1995 (ISBN1-56081-569-8) 〇
[0170] 為了有利于本公開內(nèi)容的各種實施方案的綜述，提供特定術(shù)語的下列解釋：
[0171] 輔助療法：與主要治療組合使用以改善主要治療的效應(yīng)的治療。
[0172] 臨床結(jié)果：是指在疾病或病癥的治療后或在治療不存在的情況下患者的健康狀 態(tài)。臨床結(jié)果包括但不限于直至死亡的時間長度的增加、直至死亡的時間長度的減少、存活 機會的增加、死亡風(fēng)險的增加、存活率、無疾病生存率、慢性疾病、轉(zhuǎn)移、晚期或侵襲性疾病、 疾病復(fù)發(fā)、死亡以及對療法的有利的或不良反應(yīng)。
[0173] 細胞因子：由多種造血和非造血細胞產(chǎn)生的影響其它細胞的行為的蛋白質(zhì)。細胞 因子對于先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都是非常重要的。
[0174] 存活率的降低：如本文中所用，"存活率的降低"是指患者死亡前的時間長度的減 短，或患者的死亡風(fēng)險的增加。
[0175] 檢測表達的水平：例如，"檢測miR或miRNA表達的水平"是指定量存在于樣品中 的miR或miRNA的量。檢測特定miR或任何microRNA的表達可使用本領(lǐng)域中已知的或本 文中描述的任何方法例如通過qRT-PCR來實現(xiàn)。檢測miR的表達包括檢測miRNA的成熟形 式或與miRNA表達相關(guān)的前體形式的表達。通常地，miRNA檢測法包括序列特異性檢測，例 如通過RT-PCR。miR-特異性引物和探針可使用前體和成熟miR核酸序列來設(shè)計。
[0176] MicroRNA(miRNA):調(diào)控基因表達的單鏈RNA分子。MicroRNA在長度上通常為 21-23個核苷酸。MicroRNA從稱為pri-miRNA的初級轉(zhuǎn)錄物被加工成稱為前體（pre)-miRNA 的短莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并最終被加工成功能性的成熟microRNA。成熟microRNA分子與一種或多 種信使RNA分子部分互補，并且它們的主要功能是下調(diào)基因表達。MicroRNA通過RNAi途徑 調(diào)控基因表達。
[0177] miR表達：如本文中所用，"低miR表達"和"高miR表達"是指在樣品中發(fā)現(xiàn)的 miRNA的水平的相對術(shù)語。在一些實施方案中，通過比較一組對照樣品與測試樣品的miRNA 水平來測定低和高miR表達。隨后可基于樣品中miRNA的表達是高于（高）還是低于（低） 平均或中位miR表達水平來將低和高表達賦予每一個樣品。對于單個樣品，高或低miR表 達可通過將樣品與已知具有高或低表達的對照或參照樣品相比較，或通過與標(biāo)準(zhǔn)值相比較 來測定。低和高miR表達可包括miRNA的前體或成熟形式或兩者的表達。
[0178] 受試者：如本文中所用，術(shù)語"受試者"包括人和非人動物。進行治療的優(yōu)選患者 是人。"患者"和"受試者"在本文中可互換使用。
[0179] 藥學(xué)上可接受的媒介物：用于本公開內(nèi)容的藥學(xué)上可接受的載體（媒介物）是 常規(guī)性的° Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co.，Easton，PA,第15版（1975)，描述了適合用于一種或多種治療性化合物、分子或試劑的 藥物遞送的組合物和制劑。
[0180] 預(yù)防、治療或緩解疾?。?預(yù)防"疾病是指抑制疾病的完全發(fā)展。術(shù)語"預(yù)防"、"防 止"和"防治"通常是指疾病或病癥在受試者中發(fā)生的減少。預(yù)防可以是完全的，例如疾病 或病癥在受試者中完全不存在。預(yù)防還可以是部分的，以便疾病或病癥在受試者中的發(fā)生 少于在本發(fā)明不存在的情況下會出現(xiàn)的發(fā)生。"預(yù)防"疾病通常是指抑制疾病的完全發(fā)展。 "治療"是指在其開始發(fā)展后緩解疾病或病理病況的體征或癥狀的治療性干預(yù)。"緩解"是 指疾病的體征或癥狀的數(shù)量或嚴(yán)重度的減少。
[0181] 篩選：如本文中所用，"篩選"是指用于評價和鑒定影響這樣的疾病的候選試劑的 過程。microRNA的表達可使用本領(lǐng)域已知的和本文中描述的許多技術(shù)的任一種，例如通過 微陣列分析或通過qRT-PCR來定量。
[0182] 小分子：通常具有小于約1000道爾頓或在一些實施方案中小于約500道爾頓的分 子量的分子，其中所述分子能夠在一定的可測量的程度上調(diào)節(jié)靶分子的活性。
[0183] 治療：包括診斷和治療的總稱。
[0184] 治療劑：當(dāng)對受試者正確施用時能夠誘導(dǎo)所需治療或預(yù)防作用的化學(xué)化合物、小 分子或其它組合物諸如反義化合物、抗體、蛋白酶抑制劑、激素、趨化因子或細胞因子。
[0185] 如本文中所用，"候選試劑"是被選擇用于篩選以確定其是否可用作治療劑的化合 物。"溫育"包括用于試劑與細胞或組織相互作用的充足量的時間。"接觸"包括將以固體 或液體形式存在的試劑與細胞或組織一起溫育。用試劑"治療"細胞或組織包括將所述試 劑與細胞或組織接觸或一起溫育。
[0186] 治療有效量：足以在用試劑進行治療的受試者或細胞中實現(xiàn)所需作用的指定的藥 物或治療劑的量。試劑的有效量取決于幾個因素，包括但不限于進行治療的受試者或細胞 以及治療性組合物的施用方式。
[0187] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的媒介物"通常是指如可通常使用的這樣的藥學(xué)上可接 受的載體（媒介物）。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co. ,Easton, PA,第20版，描述了適合用于一種或多種治療性化合物、分子或 試劑的藥物遞送的組合物和制劑。一般地，載體的性質(zhì)將取決于所使用的具體施用模式。例 如，胃腸外制劑通常包含可注射液，所述可注射液包括藥學(xué)上和生理上可接受的液體諸如 水、生理鹽水、平衡鹽溶液、含水葡萄糖、甘油等作為媒介物。對于固體組合物（例如，粉劑、 丸劑、片劑或膠囊劑形式），常規(guī)的無毒固體載體可包括例如制藥級的甘露醇、乳糖、淀粉或 硬脂酸鎂。除了生物學(xué)中性載體以外，待施用的藥物組合物可包含少量無毒輔助物質(zhì)，諸如 濕潤劑或乳化劑、防腐劑和PH緩沖劑等，例如醋酸鈉或脫水山梨醇單月桂酸酯。
[0188] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"通常是指在靶動物（例如，哺乳動物）中被生理耐受的 本發(fā)明的化合物的任何鹽（例如，通過與酸或堿反應(yīng)所獲得的）。本發(fā)明的化合物的鹽可從 無機或有機酸和堿衍生而來。酸的實例包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富 馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、甲苯-對-磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、 甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸，諸如草酸，盡 管本身不是藥學(xué)上可接受的，但可用于制備在獲得本發(fā)明的化合物以及它們的藥學(xué)上可接 受的酸加成鹽中用作中間體的鹽。堿的實例包括但不限于堿金屬（例如，鈉）氫氧化物、堿 土金屬（例如，鎂）氫氧化物、氨等。鹽的實例包括但不限于：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、 天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán) 戊燒丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、flucoheptanoate、甘油磷 酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、2-羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸 鹽、甲磺酸鹽（mesylate)、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、palmoate、果膠酸鹽、過 硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺 酸鹽、十一烷酸鹽等。鹽的其它實例包括與合適的陽離子如Na+、NH4+和NW4+(其中W是 C1-4烷基）等化合的本發(fā)明的化合物的陰離子。對于治療性用途，本發(fā)明化合物的鹽預(yù)期 是藥學(xué)上可接受的。然而，非藥學(xué)上可接受的酸和堿的鹽也可用于例如在藥學(xué)上可接受的 化合物的制備或純化中。
[0189] 在本方法的一些實施方案中，對照的使用是需要的。在這一點上，對照可以是從相 同患者獲得的非癌性細胞/組織樣品，或從健康受試者諸如健康組織供者獲得的細胞/組 織樣品。在另一個實例中，對照是從歷史值計算的標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤樣品和非癌性細胞/組織樣 品可按照任何方法獲得。例如，腫瘤和非癌性樣品可獲自已經(jīng)歷切除術(shù)的癌癥患者，或它們 可通過使用皮下針頭抽取，通過顯微解剖或通過激光捕獲來獲得。對照（非癌性）樣品可 以獲自例如尸體器官供者或健康供者。
[0190] 在一些實施方案中，相對于某些豐富且穩(wěn)定地表達（從而使其成為良好的內(nèi)源對 照候選物）的小的非編碼RNA (ncRNA)測量miR表達。
[0191] 在一些實施方案中，篩選包括將候選試劑與細胞接觸。細胞可以是獲自患者的原 代細胞，或細胞可以是永生化或轉(zhuǎn)化的細胞。
[0192] 候選試劑可以是任何類型的試劑諸如蛋白質(zhì)、肽、小分子、抗體或核酸。在一些實 施方案中，候選試劑是細胞因子。在一些實施方案中，候選試劑是小分子。篩選包括高通量 篩選和篩選單個或小組的候選試劑。
[0193] MicroRNA 檢測
[0194] 在本文中的一些方法中，需要鑒定存在于樣品中的miRNA。
[0195] 前體microRNA(pre-miRNA)和成熟miRNA的序列是可公共獲得的，例如通 過miRBase數(shù)據(jù)庫，可通過Sanger研宄所在線獲得（參見Griffiths