miR-494通過BIM下調(diào)來調(diào)節(jié)TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡的用圖
【專利說明】miR-494通過BIM下調(diào)來調(diào)節(jié)TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡的用 途
[0001] 發(fā)明人：Carlo M. Croce, Giulia Romano
[0002] 相關(guān)申請的交叉參考
[0003] 本申請要求2012年9月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/704, 542的權(quán)益，其完整 公開內(nèi)容出于所有目的明確地通過引用整體并入本文。
[0004] 序列表
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[0006] 背景
[0007] MicroRNA (miRNA或miR)在不同類型的癌癥中的化學(xué)敏感性或化學(xué)抗性的發(fā)生中 具有重要的作用。ERK1/2途徑的激活是多種細胞過程和癌癥發(fā)展的主要決定因素，并且負 責(zé)幾種重要miRNA的轉(zhuǎn)錄。MiRNA是有吸引力的藥物靶標，因為它們調(diào)控許多細胞蛋白質(zhì)的 表達并且常常在惡性細胞中相對于正常細胞差異表達。
[0008] TNF相關(guān)細胞凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL)是細胞凋亡誘導(dǎo)性細胞因子。TRAIL是有前 景的基于細胞凋亡的抗腫瘤劑。然而，許多人癌細胞仍然對TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡具有抗 性。
[0009] 雖然已經(jīng)提出許多治療方法來治療癌癥，但仍然存在對另外的有效的抗癌劑和載 體的需要。需要用于有效和安全的體內(nèi)抗癌治療的方法和材料。需要涉及藥物抗性的生 化途徑和發(fā)現(xiàn)藥物的方法的增進的理解。此外，仍然存在對于開發(fā)基因治療載體（其對于 治療腫瘤性病癥具有增強的治療活性，最小化的毒性和廣泛目標范圍）的未滿足的醫(yī)療需 求。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 在第一廣泛的方面，本文中描述了抗-miR-494作為治療劑誘導(dǎo)細胞凋亡的用途。 在另一廣泛的方面，本文中描述了抗-miR-494作為治療劑增強藥物敏感性的用途。
[0012] 在另一廣泛的方面，本文中描述了抗-miR-494和TRAIL作為化學(xué)治療劑的共施用 (即，抗-miR-494將減小TRAIL抗性）。
[0013] 在另一廣泛的方面，本文中描述了抗-miR-494調(diào)控BM的表達以促進腫瘤細胞 (諸如，但不限于肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃腸道腫瘤和黑色素瘤）的細胞凋亡的用途。
[0014] 在另一廣泛的方面，本文中描述了 miR-494靶向BM 3' UTR的用途。
[0015] 在另一廣泛的方面，本文中描述了在有此需要的受試者中恢復(fù)ERK1/2活性的所 需模式的方法，包括施用足以靶向一個或ERK1/2的有效量的至少一種抗-miR-494。
[0016] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于在有此需要的受試者中誘導(dǎo)腫瘤抑制基因 (TSG)的再表達的方法，包括施用足以誘導(dǎo)TSG表達的有效量的抗-miR-494。
[0017] 在某些實施方案中，所述TSG包括BM和TRAIL的一種或多種。
[0018] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于在有此需要的受試者中體外和體內(nèi)抑制致 瘤性的方法，其包括施用足以靶向一種或多種腫瘤抑制基因（TSG)的有效量的抗-miR-494 核酸構(gòu)建體。在某些實施方案中，所述受試者為癌癥患者。在某些實施方案中，所述抑制方 法包括非小細胞肺癌（NSCLC)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。
[0019] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于增加腫瘤抑制基因（TSG)的表達的方法， 所述方法包括：用抗-mir-494核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞。在某些實施方案中，所述TSG包括BM 和TRAIL的一種或多種。
[0020] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于上調(diào)細胞中BM和/或TRAIL的表達水平 的方法，包括用抗-miR-494核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞。
[0021] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于在體外和體內(nèi)抑制致瘤性的方法，包括抑 制miR-494在癌細胞中的表達。
[0022] 在另一廣泛的方面，本文中描述了通過使用單獨的或與其它治療組合的合成的 抗-miR-494以在癌細胞中再活化腫瘤抑制因子和使BM和/或TRAIL表達的異常模式正 ?；瘉黹_發(fā)表觀遺傳學(xué)療法的方法。在某些實施方案中，所述細胞是癌細胞，諸如肺癌、乳 腺癌、骨肉瘤和黑色素瘤。
[0023] 在另一廣泛的方面，本文中描述了在受試者中抑制腫瘤發(fā)生的方法，所述受試者 患有或懷疑患有其中至少m i R-494在受試者的癌細胞中相對于對照細胞被上調(diào)的癌癥相 關(guān)疾病，所述方法包括：當miR-494在癌細胞中被上調(diào)時，對受試者施用有效量的至少一種 用于抑制miR-494表達的化合物，以便在受試者中腫瘤發(fā)生被抑制。
[0024] 在某些實施方案中，所述化合物包括抗-miR-494核酸構(gòu)建體，或其分離的變體或 生物活性片段或功能等同物，或與其結(jié)合的抗體。
[0025] 在某些實施方案中，治療癌細胞或抑制BM下調(diào)的方法包括在施用TRAIL和 抗-miR-494之前測量癌細胞中的miR-494表達水平；如果miR-494水平是對照水平的2-12 倍，則將所述癌細胞歸類為過表達miR-494 ;和以足以減少miR-494水平的量施用miR-494 的抑制劑。在某些實施方案中，miR-494水平在施用miR-494抑制劑后減少至少25%。在某 些實施方案中，miR-494水平減少25% -50%。在某些實施方案中，施用治療后的miR-494 水平少于對照水平的5倍。在某些實施方案中，施用治療后的miR-494水平少于對照水平 的2倍。在某些實施方案中，在施用治療之后，被治療的細胞中的miR-494水平在非癌性對 照水平的25%之內(nèi)。
[0026] 在另一廣泛的方面，本文中描述了鑒定腫瘤發(fā)生的抑制劑的方法，包括：給細胞提 供測試試劑，和測量與癌癥相關(guān)疾病中改變的表達水平相關(guān)的至少miR-494的水平，其中 所述細胞中miR-494的水平相對于適當?shù)膶φ占毎纳呋蚪档捅硎舅鰷y試試劑為腫 瘤發(fā)生的抑制劑。在某些實施方案中，癌癥為肺癌。
[0027] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于治療癌癥相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含： 至少抗-miR-494核酸構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載體。在某些實施方案中，癌癥相關(guān)疾病為 肺癌。
[0028] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于誘導(dǎo)癌細胞的細胞凋亡的方法，所述方法 包括將癌細胞與抑制癌細胞的ERK1/2信號傳導(dǎo)途徑的試劑接觸。在某些實施方案中，所述 細胞存在于受試者中。在某些實施方案中，所述細胞不過表達miR-494。
[0029] 在某些實施方案中，所述試劑為特異性抑制ERK1/2信號傳導(dǎo)途徑和引起miR-494 的下調(diào)的有機化合物。
[0030] 在某些實施方案中，所述化合物包括：含死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的蛋白，諸如糖尿病中 富集的磷蛋白（PED)或星形細胞中富集的磷蛋白（PEA-15)。
[0031] 在某些實施方案中，所述試劑為特異性拮抗ERK1/1信號傳導(dǎo)途徑的核酸試劑。
[0032] 在某些實施方案中，所述試劑選自短的干擾RNA(siRNA)、短的發(fā)夾RNA(shRNA)、 microRNA(miRNA)、反義核酸和互補 DNA(cDNA)。
[0033] 在某些實施方案中，miRNA試劑包括抗-miR-494核酸構(gòu)建體。
[0034] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于治療或改善受試者的癌癥的方法，所述方 法包括對受試者施用包含有效量的試劑的藥物組合物，所述試劑下調(diào)ERK1/2信號傳導(dǎo)途 徑和下調(diào)miR-494的表達。
[0035] 在某些實施方案中，所述試劑是特異性抑制ERK1/2信號傳導(dǎo)途徑的有機化合物。 在某些實施方案中，所述化合物包括：含死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的蛋白，諸如糖尿病中富集的磷 蛋白（PED)或星形細胞中富集的磷蛋白（PEA-15)。
[0036] 在另一廣泛的方面，本文中描述了治療或抑制有此需要的受試者中的細胞增殖的 方法，包括對受試者施用miR-494的抑制劑。在某些實施方案中，miR-494的抑制劑為反義 寡核苷酸，所述反義寡核苷酸具有與成熟miR-494序列、pri-miR-494和/或pre-miR-494 至少部分互補的序列。在某些實施方案中，miR-494的抑制劑為反義寡核苷酸，所述反義寡 核苷酸具有為miR-494轉(zhuǎn)錄啟動子序列諸如（SI)和/或（S2)或與其至少部分互補的序列。 在某些實施方案中，所述反義寡核苷酸包含至少一個糖和/或主鏈修飾。
[0037] 在某些實施方案中，通過靜脈內(nèi)或皮下施用途徑對受試者施用所述抑制劑。
[0038] 在某些實施方案中，在施用抑制劑后相較于未治療的受試者增加了受試者的癌細 胞的細胞凋亡。
[0039] 在某些實施方案中，在施用抑制劑后相較于未治療的受試者，BIM的表達在受試者 中增加。在某些實施方案中，所述受試者是人。
[0040] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含抗-miR-494核酸和細胞凋亡的至少一種 誘導(dǎo)劑的構(gòu)建體。
[0041] 在某些實施方案中，細胞凋亡的誘導(dǎo)劑選自BM和TRAIL。
[0042] 在某些實施方案中，抗-miR-494核酸是天然miR-494、pri-miR-494和/或 pre-miR-494的變體或其同源物、類似物和/或片段。
[0043] 在某些實施方案中，抗-miR-494核酸大體上是對應(yīng)于或互補于選自如下miR-494 形式的核酸序列：miR-494的初級轉(zhuǎn)錄物（pri-miR-494)、miR-494的前體（pre-miR-494)、 miR-494的RNA雙鏈體以及成熟miR-494。
[0044] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含如本文中描述的核酸構(gòu)建體的載體。
[0045] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含如本文中描述的載體的分離的宿主細胞。
[0046] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含構(gòu)建體（作為活性成分）和至少一種藥學(xué) 上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
[0047] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于治療人受試者的癌癥的方法，包括對有此 需要的人受試者施用治療有效量的構(gòu)建體，從而治療人受試者的癌癥。
[0048] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于抑制人受試者的腫瘤進展的方法，包括對 有此需要的人受試者施用治療有效量的構(gòu)建體，從而抑制人受試者的腫瘤進展。
[0049] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于在人受試者中減輕或緩解與腫瘤性病癥相 關(guān)的癥狀的方法，包括對有此需要的人受試者施用治療有效量的構(gòu)建體，從而在人受試者 中減輕或緩解與腫瘤性病癥相關(guān)的癥狀。
[0050] 在某些實施方案中，所述受試者患有特征在于miR-494在腫瘤的至少一部分細胞 中內(nèi)源性表達的腫瘤。在某些實施方案中，所述受試者患有選自肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃腸 道腫瘤和黑色素瘤的癌癥。
[0051] 在某些實施方案中，通過選自注射、輸注和至腫瘤內(nèi)的直接注射的途徑進行施用。
[0052] 在某些實施方案中，在對受試者施用化學(xué)治療劑之外進行所述方法。
[0053] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含i) 一個或多個劑量單位的構(gòu)建體；和ii) 用于對有此需要的受試者施用構(gòu)建體的說明書的試劑盒。
[0054] 在另一廣泛的方面，本文中描述了通過抑制細胞的增殖和/或誘導(dǎo)細胞的細胞凋 亡來影響細胞的方法，所述方法包括將有效量的至少miR-494的miR特異性抑制劑引入細 胞。在某些實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，所述細胞是癌細胞。
[0055] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑選自抗-miR和祀模擬物。
[0056] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑包含與miR-494互補的至少6個連 續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且與miR-494序列的其余部分具有至少50%互補性，并且其中 miR-494的miR-特異性抑制劑誘導(dǎo)BM和TRAIL的至少一種在細胞中表達。
[0057] 在某些實施方案中，miR-494的miR-特異性抑制劑上調(diào)BM和TRAIL的一種或多 種。
[0058] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑與抗-miR-494具有至少60 %互補性。
[0059] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑與抗-miR-494具有至少70%互補性。
[0060] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑與抗-miR-494具有至少80 %互補性。
[0061] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑與抗-miR-494具有至少90 %互補性。
[0062] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑在至少一個核苷酸上被化學(xué)修飾。
[0063] 在另一廣泛的方面，本文中描述了上調(diào)哺乳動物細胞的BM和/或TRAIL的方法， 其包括將有效量的至少miR-494的miR-特異性抑制劑引入哺乳動物細胞。在某些實施方案 中，所述哺乳動物細胞是癌細胞。在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑選自抗-miR 和靶模擬物。
[0064] 在某些實施方案中，所述miR-特異性抑制劑包含與miR-494互補的至少6個連 續(xù)核苷酸的核苷酸序列，并且與miR-494序列的其余部分具有至少50%互補性，并且其中 miR-494的miR-特異性抑制劑誘導(dǎo)BM和TRAIL的至少一種在細胞中表達。
[0065] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于測定獲自受試者的細胞樣品的細胞周期 進程表型的方法，所述方法包括：a)測量細胞樣品中至少miR-494的水平；和b)將至少 miR-494的水平與細胞周期進程參考值相比較，其中高于細胞周期進程參考值的水平表明 細胞樣品中加速的細胞周期進程。
[0066] 在某些實施方案中，所述細胞周期進程表型是增殖。在某些實施方案中，所述細胞 周期進程表型是細胞凋亡。
[0067] 在另一廣泛的方面，本文中描述了測量贅生物中的增殖的方法，包括測定贅生物 中miR-494的水平。
[0068] 在另一廣泛的方面，本文中描述了測量贅生物中細胞亞群的增殖的方法，包括測 定細胞亞群中miR-494的水平。
[0069] 在另一廣泛的方面，本文中描述了診斷贅生物是否抗標準化學(xué)療法的方法，所述 方法包括：測定贅生物中miR-494和TRAIL的至少一種的水平，以及如果miR-494的水平在 贅生物中比在正常對照中更高和/或TRAIL的水平在贅生物中比在正常對照中更低，則將 贅生物鑒定為抗化學(xué)療法的。
[0070] 在另一廣泛的方面，本文中描述了確定贅生物是否包含抗標準化學(xué)療法的細胞亞 群的方法，所述方法包括：分離細胞的亞群，測定miR-494和TRAIL的至少一種在細胞亞 群中的水平，以及如果miR-494的水平在亞群中比在正常對照中更高和/或TRAIL的水平 在亞群中比在正常對照中更低，則將細胞的亞群鑒定為抗化學(xué)療法的。在某些實施方案 中，細胞的亞群為干細胞樣細胞。在某些實施方案中，正常對照為大批贅生性細胞（bulk neoplastic cells)〇
[0071] 本發(fā)明的實施方案包括基于本文中描述的診斷和預(yù)后方法的結(jié)果確定用于疾病 治療的健康保險補償和/或支付的范圍或拒絕的方法。例如，從保險范圍排除治療的方法， 所述方法包括：鑒定具有健康保險的患者；接受對患者的診斷過程的結(jié)果，其中所述診斷 過程包括確定贅生物是否抗標準化學(xué)療法；以及如果miR-494的水平相較于對照較高，則 拒絕化學(xué)療法治療的健康保險范圍。在一些實施方案中，化學(xué)療法是術(shù)前和/或術(shù)后輔助 療法。在一些實施方案中，化學(xué)療法是禁忌的。在一些情況下，禁忌的化學(xué)治療劑是抑制 EGFR酪氨酸激酶的小分子諸如吉非替尼、埃羅替尼或拉帕替尼或抑制MP激酶途徑的小分 子諸如索拉非尼。
[0072] 在另一廣泛的方面，本文中描述了減少細胞的增殖的方法，包括將細胞與以有效 地減少細胞的增殖的量存在的與miR-494互補的抑制性核酸接觸。
[0073] 在另一廣泛的方面，本文中描述了增強細胞對化學(xué)治療劑的敏感性的方法，其包 括將細胞與以有效地使細胞對化學(xué)治療劑敏感的量存在的與miR-494互補的抑制性核酸 接觸。
[0074] 在某些實施方案中，將所述抑制性核酸轉(zhuǎn)染至細胞中。
[0075] 在某些實施方案中，所述化學(xué)治療劑是細胞凋亡調(diào)節(jié)劑諸如，但不限于BIM和 TRAIL。
[0076] 在某些實施方案中，所述細胞是癌干細胞。
[0077] 在某些實施方案中，所述細胞是贅生性細胞。
[0078] 在另一廣泛的方面，本文中描述了治療受試者中的贅生物的方法，包括對受試者 施用有效量的抑制miR-494的抑制性核酸。
[0079] 在某些實施方案中，所述方法還包括施用第二療法，其中所述抑制性核酸的施用 使贅生物對第二療法敏感。在某些實施方案中，所述第二療法包括施用化學(xué)治療劑。
[0080] 在某些實施方案中，所述癌癥選自肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃腸道腫瘤和黑色素瘤。
[0081] 在另一廣泛的方面，本文中描述了用于病理樣品的分析的試劑盒，所述試劑盒在 適當?shù)娜萜髦邪糜跍y定miR-494的水平、BM和TRAIL的一種或多種的水平的RNA雜 交或擴增試劑，以及使用說明書。
[0082] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含大體上純的抗-miR-494和藥學(xué)上可接受 的載體的藥物組合物。
[0083] 在另一廣泛的方面，本文中描述了包含大體上純的抗-miR-494和TRAIL以及藥學(xué) 上可接受的載體的藥物組合物。
[0084] 在另一廣泛的方面，本文中描述了方法，所述方法還包括測量測試樣品中至少一 種另外的miR基因產(chǎn)物的水平，其中所述miR選自圖ID中顯示的組。
[0085] 在另一個方面，本文中描述了用于通過施用治療有效量的核酸構(gòu)建體從而治療人 受試者的癌癥來治療人受試者的癌癥的方法。
[0086] 在另一個方面，本文中描述了用于抑制人受試者中的腫瘤進展的方法，所述方法 包括對有此需要的人受試者施用治療有效量的核酸構(gòu)建體，從而抑制人受試者中的腫瘤進 展。
[0087] 在另一個方面，本文中描述了用于抑制人受試者中的腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法 包括對有此需要的人受試者施用治療有效量的核酸構(gòu)建體，從而抑制人受試者中的腫瘤轉(zhuǎn) 移。
[0088] 在另一個方面，本文中描述了用于減輕或緩解人受試者的與腫瘤性病癥相關(guān)的癥 狀的方法，所述方法包括對有此需要的人受試者施用治療有效量的核酸構(gòu)建體，從而減輕 或緩解人受試者的與腫瘤性病癥相關(guān)的癥狀。
[0089] 在另一個方面，在一個實施方案中，所述受試者患有癌癥、腫瘤或腫瘤性病癥，其 特征在于miR-494在其至少一部分細胞中內(nèi)源地表達。
[0090] 在具體實施方案中，通過選自注射、輸注和至腫瘤內(nèi)的直接注射的途徑進行施用。
[0091] 在具體實施方案中，施用包括施用單個劑量或多個劑量的核酸構(gòu)建體。
[0092] 在具體實施方案中，方法還包括測定來自受試者的生物樣品例如細胞或組織中的 miR-494活性的水平的步驟。
[0093] 在另一個方面，本文中描述了核酸構(gòu)建體用于制備用于治療人受試者的癌癥的藥 劑的用途。
[0094] 在另一個方面，本文中描述了本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用于制備用于抑制人受試者中 的腫瘤進展的藥劑的用途。
[0095] 在另一個方面，本文中描述了核酸構(gòu)建體用于制備用于抑制人受試者中的腫瘤轉(zhuǎn) 移的藥劑的用途。
[0096] 在另一個方面，本文中描述了本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用于制備用于減輕或緩解與腫 瘤性病癥相關(guān)的癥狀的藥劑的用途。
[0097] 在另一個方面，本文中描述了試劑盒，其含有i)足夠用于表達miR-494的癌癥、月中 瘤或贅生物的一個或多個治療過程的一個或多個劑量單位的核酸構(gòu)建體；和ii)用于對有 此需要的受試者施用核酸構(gòu)建體的說明書。所述組合物、方法和試劑盒可用于治療多種與 miR-494的表達相關(guān)的癌癥和腫瘤性病癥。在具體實施方案中，所述癌癥選自肉瘤、癌、腺 癌、淋巴瘤和白血病。在具體的實施方案中，所述癌癥是肺癌。
[0098] 當根據(jù)附圖閱讀時，根據(jù)以下優(yōu)選實施方案的詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有 利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。
[0099] 附圖概述
[0100] 專利或申請文件可包含一個或多個彩色執(zhí)行的附圖和/或一張或多張照片。具有 彩色附圖和/或照片的本專利或?qū)＠暾埞_的副本在應(yīng)要求和支付必要的費用后將由 美國專利和商標局提供。
[0101] 圖 1A-1D。ERK1/2 對 miRNA 的調(diào)控：
[0102] 圖IA :顯示PEDlP PED S1°4G細胞的表達的Western印跡；
[0103] 圖IB :顯示在空載體、PEDwt和PED S1°4G轉(zhuǎn)染后293A細胞中ERK1/2的不同亞細胞 定位的Western印跡；
[0104] 圖IC :基于293A細胞中PEDwt對PED S1°4G的miRNA表達譜的無監(jiān)督層次聚類，P值 〈0· 05 ;和，
[0105] 圖ID :顯示在PEDwSt PED S1°4G轉(zhuǎn)染后失調(diào)的microRNA的倍數(shù)變化（P彡(λ 05)。
[0106] 圖2A-2G. miR494啟動子的鑒定：
[0107] 圖2A :顯示在PEDlP PED S1°4G轉(zhuǎn)染后293A細胞中的pri - miR-494下調(diào)的 qRT-PCR ；
[0108] 圖 2B :顯示在 PEDlP PED S1°4G轉(zhuǎn)染后 293A 細胞中的 premiR-494 下調(diào)的 qRT-