本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種程序性壞死誘導系統(tǒng)的建立方法。

背景技術(shù)：

腫瘤壞死因子tnf-α，是多效性的細胞因子，它參與多個細胞響應，包括細胞存活，細胞增殖以及細胞死亡。由tnf-α誘導的細胞死亡需要tnf-α與定位于細胞膜上的tnfr1結(jié)合，tnfr1活化后在細胞內(nèi)招募一系列蛋白形成不同的復合體。當tnf-α與tnfr1結(jié)合后可誘導自身及其下游蛋白死亡結(jié)構(gòu)域和其他分子的聚集而形成包含tnf受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(tradd)、rip1、tnfr相關(guān)因子2(traf2)、胞內(nèi)凋亡蛋白抑制因子1(ciap1)、ciap2的復合體。這些蛋白質(zhì)分子會根據(jù)不同的刺激物或者微環(huán)境的改變做出相應的響應，引發(fā)不同的信號通路的激活，并最終決定細胞是存活、凋亡還是壞死性凋亡。研究表明smac/diablo是一種能誘導凋亡的線粒體蛋白，在由tnf-α誘導的凋亡信號的刺激下，smac/diablo與凋亡抑制蛋白結(jié)合解除凋亡抑制蛋白的抑制效應并促進凋亡。smacmimetics作為smac/diablo的類似物能誘導某些特定的腫瘤細胞系發(fā)生凋亡，并且這種死亡能被caspase抑制劑z-vad完全地抑制。

早期的研究中發(fā)現(xiàn)用smacmimetic和z-vad處理th-29細胞，caspase抑制劑z-vad并不能抑制細胞的死亡，反而進一步加劇了細胞的死亡，并且這種細胞死亡依賴于tnf-α的存在，具有一定的壞死樣形態(tài)學特征，它是一種不同于凋亡和壞死的新的細胞死亡方式。隨著研究的進行，這種新的細胞死亡方式被定義為程序性壞死即：一種與壞死具有相似的形態(tài)學特征，但其細胞死亡方式為可調(diào)控的非caspase依賴性的程序性細胞死亡，這一過程在生理病理過程具有重要作用。近期的研究表明，在程序性壞死信號通路中有兩種新的蛋白激酶ripk3和mlkl發(fā)揮著至關(guān)重要的的作用，在細胞程序性壞死啟動后，rip3通過磷酸化mlkl激酶結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸和絲氨酸而使其活化并形成復合體necrosome，磷酸化的mlkl由單體狀態(tài)向寡聚體狀態(tài)轉(zhuǎn)化，寡聚化的mlkl結(jié)合磷酸肌醇和心肌磷脂，使整個necrosome復合體從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜或細胞器膜上，并在這些膜結(jié)構(gòu)上形成通透性孔道，破壞膜的完整性，引發(fā)細胞壞死。

然而由于目前缺少快速特異誘導細胞發(fā)生程序性壞死的方法，對于這一死亡方式的研究的開展較為困難。通過tnf-α、smacmimetic和z-vad(t+s+z)三種藥物處理細胞誘導細胞發(fā)生程序性壞死已經(jīng)成為了一種經(jīng)典途徑。然而這種誘導方式的不利因素有很多。首先，t+s+z作用于ht-29細胞最早需要6h才能引起細胞死亡，有時需要12h甚至更長的誘導時間才能取得理想的效果。并且t+s+z誘導系統(tǒng)具有一定的局限性，這一方法僅在少數(shù)細胞中可以較高效率的誘導細胞發(fā)生程序性壞死，如ht-29細胞或者鼠的細胞，而對多數(shù)人源腫瘤細胞誘導效率很低。其次，實驗中所用的細胞不同，需要的誘導時間也不同，往往需要進一步實驗確定合適的誘導時間，不可控因素很大。再次，藥物誘導時間過長影響細胞的狀態(tài)，細胞不均一狀態(tài)下得到的實驗結(jié)果也不可靠。并且t+s+z誘導方式不能特異的引起細胞發(fā)生程序性壞死，只有caspase受到抑制或者caspase相關(guān)基因被敲除，tnf-α誘導的細胞死亡方式才能由凋亡轉(zhuǎn)向壞死。這就需要實驗者實驗前進行預實驗有針對性的選擇合適的caspase抑制劑，才能特異地誘導細胞發(fā)生程序性壞死。

為了解決t+s+z誘導體系的不足之處，我們選擇的是建立可誘導的程序性壞死體系，將程序性壞死相關(guān)基因ripk3與fk506結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域(fkbp)進行融合表達，通過“tet-on”系統(tǒng)加入多西環(huán)素人為地調(diào)控ripk3過表達，只添加二聚物就能引發(fā)ripk3活化，其效率更高、可控性更好、特異性更強，解決了t+s+z誘導方式的不利因素。首先，我們選擇的細胞是人的常見的腫瘤細胞hela細胞和a549細胞，更具創(chuàng)新之意。并且只需要向培養(yǎng)基中添加四環(huán)素類似物多西環(huán)素doxycycline和二聚物idimer就能誘導細胞發(fā)生壞死，加入藥物后最早0.5h就能引起細胞的死亡，并且在hela細胞中我們僅僅加入多西環(huán)素一種藥物就能引起細胞的敏感性反應。其次，我們構(gòu)建的是包含“tet-on”系統(tǒng)的載體，通過慢病毒包裝體系得到的穩(wěn)定的細胞系，即使細胞不同，只需要控制加入培養(yǎng)基中多西環(huán)素和二聚物的量，就可以高效地調(diào)控ripk3的表達量和二聚物的誘導時間。再次，加入的多西環(huán)素能直接誘導程序性壞死信號通路中相關(guān)蛋白ripk3過表達，加入的二聚物能使ripk3二聚化并發(fā)生寡聚化反應特異性地激活程序性壞死信號通路，這種誘導方式不需要抑制caspase的活性，更不需要考慮其上游的信號通路，比t+s+z誘導體系更加簡單高效，特異性更強。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種程序性壞死誘導系統(tǒng)的建立方法，解決了目前細胞程序性壞死誘導方法效果差的問題。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是按照以下步驟進行：

步驟1：將ripk3-2×fkbp目的基因片段連入含有“tet-on”系統(tǒng)的慢病毒載體，構(gòu)建可誘導表達的系統(tǒng)，通過四環(huán)素或其類似物能調(diào)節(jié)目的基因的表達；

步驟2：經(jīng)測序正確的載體與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染至293t細胞，生產(chǎn)病毒，收集病毒液感染hela細胞和a549細胞，通過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定的細胞系；

步驟3：通過向培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素誘導穩(wěn)定細胞表達ripk3-2×fkbp蛋白，然后再加入二聚物誘導ripk3二聚化；

步驟4：通過免疫印跡實驗以及相關(guān)的實驗技術(shù)手段分析實驗結(jié)果。

本發(fā)明的優(yōu)勢是通過dox和idimer誘導細胞發(fā)生程序性壞死，其靈敏度、效率更高，特異性更強，能夠快速誘導細胞發(fā)生壞死。

附圖說明

圖1ripk3-2×fkbp表達依賴于dox示意圖；

圖2dox誘導ripk3-2×fkbp表達的劑量依賴關(guān)系圖；

圖3dox不同時間點ripk3-2×fkbp表達量的變化；

圖4dox與idimer誘導細胞死亡示意圖；

圖5caspase8抑制劑不能抑制dox與idimer誘導的細胞死亡示意圖；

圖6dox與idimer誘導mlkl蛋白磷酸化示意圖；

圖7dox與idimer可以快速誘導mlkl蛋白磷酸化；

圖8dox和dimer誘導體系效率更高特異性更強。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。

本發(fā)明通過慢病毒包裝體系嘌呤霉素篩選的方式，我們構(gòu)建了可以誘導表達ripk3-2×fkbp的a549和hela細胞穩(wěn)定細胞系，在細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的多西環(huán)素doxycycline(以下簡稱“dox”)誘導ripk3-2×fkbp蛋白的表達，然后進行免疫印跡實驗，圖1是ripk3-2×fkbp表達依賴于dox示意圖；結(jié)果表明在a549和hela細胞中，ripk3-2×fkbp的表達量在dox的濃度為1μg/ml時就很高了，而對照中沒有加入dox的細胞中并沒有檢測到ripk3-2×fkbp的表達。同時，在hela中1μg/mldox誘導效果甚至比4μg/ml和10μg/mldox還要好。這些結(jié)果表明加入的dox濃度為1μg/ml時，就有很強的誘導效果。如圖2，dox誘導ripk3-2×fkbp表達的劑量依賴關(guān)系。

我們進一步對dox的濃度梯度進行摸索，稀釋至0.001ng/ml，結(jié)果表明當dox濃度為100ng/ml時，ripk3-2×fkbp開始有表達，與dox誘導濃度為10μg/ml時ripk3-2×fkbp的表達量相比，1μg/mldox誘導的ripk3-2×fkbp表達量更高，這也與之前的結(jié)果是一致的。如圖3所示dox不同時間點ripk3-2×fkbp表達量的變化。

接著我們又對時間梯度進行了摸索，鑒于之前dox濃度為1μg/ml時，就有很強的誘導效果。我們向能誘導表達ripk3-2×fkbp的hela細胞系中加入1μg/mldox進行誘導，并在不同的時間點檢測ripk3-2×fkbp的表達，發(fā)現(xiàn)dox誘導后4hripk3-2×fkbp開始表達，并且隨dox誘導時間的延長ripk3-2×fkbp的表達量逐漸升高。而用無四環(huán)素的血清培養(yǎng)的細胞中未檢測到ripk3-2×fkbp的表達。圖4為dox與idimer誘導細胞死亡示意圖。圖5為caspase8抑制劑不能抑制dox與idimer誘導的細胞死亡示意圖。

向hela細胞中加入dox誘導12h后，再加入idimer，并在idimer加入后的0h，1h，2h，3h觀察細胞的形態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)與對照組加了dmso的細胞相比，加了dox與idimer的細胞發(fā)生了明顯的死亡。如圖所示，idimer加入后的1h細胞開始發(fā)生死亡，2h、3h其死亡程度進一步加劇，這就表明dox與idimer能誘導細胞發(fā)生死亡。當向培養(yǎng)基中加入caspase8抑制劑時，如圖6所示，我們發(fā)現(xiàn)caspase抑制劑并不能抑制dox與idimer誘導的細胞死亡，反而進一步加劇了細胞的死亡。

dox與idimer能誘導細胞死亡，并且我們發(fā)現(xiàn)caspase抑制劑并不能抑制這種細胞死亡方式。這初步表明我們成功地誘導了細胞發(fā)生程序性壞死。為了進一步證實細胞發(fā)的是程序性壞死，我們對hela細胞進行藥物處理，分析p-mlkl的表達水平。結(jié)果顯示與對照相比，hela細胞中mlkl能被磷酸化，同時dox和idimer誘導體系能在hela細胞中高效工作。如圖7所示，dox與idimer可以快速誘導mlkl蛋白磷酸化，圖8所示dox和dimer誘導體系效率更高特異性更強。

接下來，我們用dox和idimer對細胞進行處理，并在不同的時間點檢測p-mlkl表達水平。通過免疫印跡實驗分析我們發(fā)現(xiàn)，hela細胞中只需要加入dox誘導12h，使ripk3-2×fkbp過表達就足以引起細胞發(fā)生程序性壞死，相比于對照dmso處理的細胞其p-mlkl水平明顯升高。這些結(jié)果表明dox和idimer能快速誘導mlkl蛋白磷酸化。而用t+s+z誘導hela細胞發(fā)生程序性壞死時，其效果并不理想。甚至在誘導后6h都未檢測到p-mlkl。相反，dox和dimer誘導體系則能更快的誘導hela細胞發(fā)生程序性壞死，甚至是只需要添加一種藥物dox就足以誘導細胞發(fā)生程序性壞死，這就表明dox和dimer誘導體系更加快速，其效率更高，特異性也更強。

以上所述僅是對本發(fā)明的較佳實施方式而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施方式所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。