一種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性n0釋放功能的抗凝血材料制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的抗凝血材料制備方法。其步驟包括配置堿性的Tris-buffer緩沖溶液，并向其中加入一定濃度的具有鄰酚結(jié)構(gòu)的化合物和具有二硫鍵或一■砸鍵的兩端含胺基或琉基的化合物；將基底材料置入反應(yīng)溶液中，控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)l-24h后取出基底，經(jīng)清洗后、干燥后獲得目的材料。本發(fā)明方法具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和易行的優(yōu)點(diǎn)，制備的材料中具有二硫鍵或二砸鍵的兩端含胺基或巰基的化合物組分單元含量可控，采用本發(fā)明方法制得的改性涂層具有優(yōu)異的黏附性，并通過原位催化血液中的N0供體持續(xù)釋放N0分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，保護(hù)血管內(nèi)皮層。
【專利說明】一種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放功能的抗凝血材料制備 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程功能材料，尤其是具有優(yōu)異抗凝血材料制備【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 心血管植入器械，如心血管支架、人工心臟瓣膜、下腔靜脈濾器、人工血管等，長期 面臨抗凝血的難題。具有優(yōu)異性能的抗凝血材料表面也一直是血液接觸類材料實(shí)現(xiàn)功能的 考察手段和目的。一氧化氮（N0)作為人體第一信號(hào)分子，發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能， 多年的研究表明，N0可以抑制血小板的激活和聚集，能夠極大的提升抗血栓形成的能力，并 且具有抑制平滑肌細(xì)胞的增殖能力。目前，N0供體型材料主要通過制備高分子涂層裝載可 以釋放N0分子的物質(zhì)，在血液環(huán)境中，持續(xù)釋放N0達(dá)到抗凝血的目的。然而這種N0釋放 型模式，會(huì)帶來釋放速率過快，初期釋放量過大，持續(xù)時(shí)間過短引起相應(yīng)的血液病理狀況及 抗凝血時(shí)效受限等問題，這也限制了其在抗凝血方面的應(yīng)用。人體血液中含有大量的可再 生的N0供體，人體內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx)具有能催化供體釋放N0的作用，因此， 原位催化N0再生模式的構(gòu)建成為一種新型的抗凝血方案。近年的研究表明，具有二硫鍵或 二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物具有催化N0供體釋放N0能力。研究還表明，一些多 酚類化合物（如EGCG)由于其良好的抗氧化能力可以消耗活性氧片段，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞 避免氧化應(yīng)激毒性，在一定濃度范圍可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。因此研究探討獲得一種 便利有效的工藝方法，具有鄰酚結(jié)構(gòu)的化合物和具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基 的化合物以化學(xué)交聯(lián)的模式組裝制備改性涂層得以實(shí)現(xiàn)，具有明顯的必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供是一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放的新型抗凝血材料制備方 法，以硒代胱胺化學(xué)交聯(lián)的模式組裝制備改性涂層，并使之具有操作簡單、成本較低，普適 性廣的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放的抗凝血材料制備方法，包括如下步驟：
[0005] 1、將需要改性修飾的基底材料進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0006] 2、將A步驟所得樣品放置于pH = 5-12的Tris-buffer緩沖體系，然后向體系中 加入濃度為〇· 〇lmg/ml-10mg/ml的具有鄰酚結(jié)構(gòu)的化合物和濃度為0· 01mg/ml-10mg/ml的 具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物，在10_30°C下，反應(yīng)l_24h ;
[0007] 3、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0008] 采用本發(fā)明方法，通過將具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物組裝 到血液接觸類材料表面，一方面可以控制N0的釋放速度，另一方面可以獲得長效的N0持續(xù) 釋放，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。多酚類化合物較容易被氧化脫氫，其結(jié)構(gòu)中的鄰苯二酚易轉(zhuǎn) 化成鄰苯二醌結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步與含有氨基的化合物發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)和希夫堿反 應(yīng)，因此將多酚類化合物與分子結(jié)構(gòu)中含兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的化合物反應(yīng)，能形成聚合 涂層或交聯(lián)聚合物涂層。胱胺和硒代胱胺具有兩端氨基的分子結(jié)構(gòu)，能與多酚類化合物發(fā) 生邁克爾加成反應(yīng)和希夫堿反應(yīng)，能在材料表面形成交聯(lián)聚合涂層，因此就能實(shí)現(xiàn)有機(jī)硒 化合物在金屬血液接觸材料表面的負(fù)載，獲得具有原位催化NO再生的催化活性表面。該抗 凝血涂層材料中的多酚類化合物相對(duì)胱胺和硒代胱胺是過量的，除了與胱胺或硒代胱胺形 成交聯(lián)薄膜，剩余的多酚化合物還具有優(yōu)異的抗氧化性和清除氧自由基的能力，對(duì)心腦血 管具有保護(hù)作用。多酚類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有大量的鄰位酚羥基，這些鄰位酚羥基可 與金屬形成穩(wěn)定螯合作用，因此多酚類化合物能在金屬表面形成較穩(wěn)定的固定或結(jié)合，這 樣的涂層與金屬、陶瓷基底具有優(yōu)良的結(jié)合力。此外該交聯(lián)聚合涂層還能通過分子間疏水 相互作用和氫鍵作用，與聚合物基底材料具有良好結(jié)合力。因此，該涂層可廣泛的應(yīng)用于幾 乎所有的生物材料表面。
[0009] 采用本發(fā)明方法制備的新型抗凝血材料表面，具有優(yōu)異的催化人體內(nèi)源性N0供 體釋放的能力，能有效的抑制血小板在材料表面的激活和聚集，發(fā)揮較好的抗凝血功能。 [0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：
[0011] 1)傳統(tǒng)的抗凝生物分子（如肝素、水蛭素、比伐盧定），無論是以共價(jià)接枝還是靜 電組裝到材料表面，都必須依賴分子的尺寸、構(gòu)象、活性以及其在材料表面發(fā)揮抗凝作用的 穩(wěn)定性及持久性。生物分子一旦在服役過程中失活或大量丟失，便不能有效發(fā)揮其生物學(xué) 功能。本發(fā)明利用N0信號(hào)分子的功能，其發(fā)揮功用的途徑不受上述生物分子受限條件的影 響；
[0012] 2)傳統(tǒng)的N0供體型材料表面，由于是以涂層包裹裝載的方式，需要較厚的涂層裝 載N0,在實(shí)際的器械表面涂層的厚度會(huì)受到一定的限制，這也意味著N0的持續(xù)釋放受到限 制。N0的釋放速率隨時(shí)間而變化，而且存在初期N0釋放速率過快等因素，也會(huì)引發(fā)負(fù)面的 生物學(xué)效應(yīng)。本方法通過化學(xué)交聯(lián)制備的有機(jī)催化涂層，可以原位催化血液中的N0供體持 續(xù)穩(wěn)定地釋放N0分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制內(nèi)膜增生；
[0013] 3)曾有相關(guān)表面接枝有機(jī)硒化合物，催化內(nèi)源性N0釋放的抗凝血表面的技術(shù)報(bào) 道，然而，接枝密度通常較低，難以提供足量的抑制血小板激活和內(nèi)膜增生的N0濃度。本發(fā) 明通過化學(xué)交聯(lián)，具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物--胱胺、硒代胱胺、 硒代胱氨酸、胱氨酸和小分子巰基化合物共聚在改性涂層內(nèi)，調(diào)控工藝參數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī) 催化分子量的合理摻入，確保了安全的N0的釋放效率和合理的釋放濃度，發(fā)揮其生物學(xué)功 能。
[0014] 4)本發(fā)明所需制備的涂層通常低于50nm，所得涂層較為均勻，原料投入很少，且 可以在多種材料表面進(jìn)行修飾。與傳統(tǒng)的抗凝血手段相比，操作簡單，成本較低，普適性廣。
[0015] 5)本發(fā)明材料中涉及的一些多酚類組分，均具有優(yōu)異的抗氧化性，具有清除血管 中氧自由基的能力，對(duì)血管具有保護(hù)作用，通過與催化N0釋放的組分共聚，既能獲得良好 的抗凝血性能，又能獲得良好的血管內(nèi)皮層修復(fù)性能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0017] 圖1是本發(fā)明所制備功能涂層涂覆的316L SS表面的X射線光電子能譜（XPS)結(jié) 果，圖中為工藝參數(shù)下的全譜元素及Se元素的百分比含量。
[0018] 圖2a是用本發(fā)明制備的具有原位催化N0釋放的新型抗凝血材料與新鮮人富血小 板血漿接觸培養(yǎng)120min的掃描電鏡照片。有機(jī)硒涂層制備在316L醫(yī)用不銹鋼表面（316L SS)，圖中，Co(EGCG-Se):表沒食子兒茶素沒食子酸酯與硒代胱胺共聚涂層修飾的316L SS; Donor :血楽中添加 S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine (SNAP,)，模擬人血液中的內(nèi) 源性N0供體環(huán)境；No-donor :血楽中未添加 SNAP,作為無催化底物的對(duì)照。
[0019] 圖2b是316L SS表面與新鮮人富血小板血漿接觸培養(yǎng)120min的掃描電鏡照片， 左為不添加供體組，右為添加供體組。Donor與No-Donor與圖2a中所示意義相同。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作進(jìn)一步的描述。
[0021] 在實(shí)際實(shí)施中：
[0022] 所述具有鄰酚結(jié)構(gòu)的化合物為多巴胺、沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯 EGCG、表兒茶素沒食子酸酯ECG、表兒茶素 EC、表沒食子兒茶素 EGC、鄰苯二酚的一種。
[0023] 所述具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物為胱胺、硒代胱胺、硒代 胱氨酸、胱氨酸和小分子巰基化合物的一種。
[0024] 所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放的新型抗凝血材料制備方法，其特征在于，所 述基底材料可為金屬生物材料、陶瓷生物材料、天然和合成的高分子生物材料、雜化生物材 料。所述金屬生物材料包括不銹鋼、鈷基合金、鈦及其合金、金、鎂及其合金、鋅合金、鉭及其 合金、純鐵及其合金。所述陶瓷生物材料包括醫(yī)用無機(jī)材料與薄膜_Ti02、各向同性熱解碳 LTIC、羥基磷灰石，磷酸鈣、金剛石及類金剛石。所述天然和合成的高分子生物材料包括：天 然生物材料一膠原、明膠、絲素蛋白、纖維素、殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸，人工合成高分子材 料一漆綸PET、聚四氟乙烯PTFE、聚氨酯PU、聚甲醛Ρ0Μ、硅橡膠、聚乳酸PLA、乙交酯-丙交 酯共聚物PLGA、聚三亞甲基碳酸酯PTMC、聚己內(nèi)酯PCL。所述雜化生物材料包括聚乳酸/羥 基磷灰石、殼聚糖/羥基磷灰石。
[0025] 在以下實(shí)施例中，基體以外的化學(xué)試劑除特別聲明的外均為化學(xué)純。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] -種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟 獲得：
[0028] A、將需要改性修飾的純鐵材料進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0029] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 5的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為 0. 01mg/ml的多巴胺的化合物和濃度為0. 01mg/ml的胱胺，在1(TC下，反應(yīng)lh ;
[0030] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] -種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟 獲得：
[0033] A、將需要改性修飾的鎂基材料進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0034] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 12的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為10mg/ ml的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG)和濃度為lOmg/ml的硒代胱胺，在30°C下，反應(yīng) 24h ；
[0035] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0036] 實(shí)施例3
[0037] -種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟 獲得：
[0038] A、將需要改性修飾的醫(yī)用316L不銹鋼進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0039] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 7的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為2mg/ml 的表兒茶素沒食子酸酯（ECG)和濃度為3mg/ml的硒代胱氨酸，在15°C下，反應(yīng)4h ;
[0040] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0041] 實(shí)施例4
[0042] 一種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟 獲得：
[0043] A、將需要改性修飾的鈷基合金材料進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0044] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 9的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為5mg/ml 的沒食子酸和濃度為5mg/ml的胱氨酸，在20°C下，反應(yīng)8h ;
[0045] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0046] 實(shí)施例5
[0047] -種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟 獲得：
[0048] A、將需要改性修飾的鈦進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0049] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 10的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為6mg/ ml的具有表兒茶素（EC)的化合物和濃度為7mg/ml的具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或 巰基的化合物，在25°C下，反應(yīng)10h ;
[0050] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0051] 實(shí)施例6
[0052] 具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟獲得：
[0053] A、將需要改性修飾的純鐵材料進(jìn)行拋光、清洗、干燥；
[0054] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 8的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為0. lmg/ ml的表沒食子兒茶素和濃度為0. 3mg/ml的胱胺，在12°C下，反應(yīng)16h ;
[0055] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0056] 實(shí)施例7
[0057] 具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟獲得：
[0058] A、將需要改性修飾的滌綸（PET)材料進(jìn)行清洗、干燥；
[0059] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 6的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為7mg/ml 的具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物和濃度為9mg/ml的具有二硒代胱胺，在6°C下，反應(yīng)9h ;
[0060] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
[0061] 實(shí)施例8
[0062] 一種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性N0釋放功能的新型抗凝血材料制備方法，由如下步驟 獲得：
[0063] A、將需要改性修飾的聚四氟乙烯（PTFE)材料進(jìn)行清洗、干燥；
[0064] B、將A步驟所得樣品放置于pH = 11的緩沖體系，然后向體系中加入濃度為lmg/ ml的具有表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG)和濃度為lmg/ml的硒代胱胺酸，在18°C下， 反應(yīng)4h ;
[0065] C、對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下 干燥，即得目標(biāo)材料。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放功能的抗凝血材料制備方法，由如下步驟獲得： A、 將需要改性修飾的基底材料進(jìn)行拋光、清洗、干燥； B、 將A步驟所得樣品放置于pH = 5-12的Tris-buffe緩沖體系，然后向體系中加入濃 度為0· 01mg/ml-10mg/ml的具有鄰酚結(jié)構(gòu)的化合物和濃度為0· 01mg/ml-10mg/ml的具有二 硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物，在10_30°C下，反應(yīng)l_24h ; C、 對(duì)B步驟所得樣品，去離子水浸沒，超聲清洗3次，每次5min，然后在N2條件下干燥， 即得目標(biāo)材料。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征在 于，所述具有鄰酚結(jié)構(gòu)的化合物為多巴胺、沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、表 兒茶素沒食子酸酯ECG、表兒茶素 EC、表沒食子兒茶素 EGC、鄰苯二酚的一種。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征在 于，所述Tris緩沖體系包括磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征 在于，所述具有二硫鍵或二硒鍵的兩端含胺基或巰基的化合物為胱胺、硒代胱胺、硒代胱氨 酸、胱氨酸和小分子巰基化合物的一種。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征在 于，所述基底材料可為金屬基生物材料、陶瓷基生物材料、高分子基生物材料、雜化材料等。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征在 于，所述金屬基生物材料包括：不銹鋼、鈷基合金、鈦及其合金、金、鎂及其合金、鋅合金、純 鐵及其合金。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征在 于，所述陶瓷基生物材料包括：醫(yī)用無機(jī)材料與薄膜、Ti02薄膜、各向同性熱解碳LTIC、硅 和Si0 2、羥基磷灰石、磷酸鈣、金剛石及類金剛石。
8. 如權(quán)利要求5所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征 在于，所述天然和合成的高分子生物材料包括：天然生物材料--膠原、明膠、絲素蛋白、纖 維素、殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸，人工合成高分子材料--漆綸PET、聚四氟乙烯PTFE、聚氨 酯PU、聚甲醛P0M、硅橡膠、聚乳酸PLA和乙交酯-丙交酯共聚物PLGA、聚三亞甲基碳酸酯 PTMC、聚己內(nèi)酯PCL。
9. 如權(quán)利要求5所述的一種誘導(dǎo)催化內(nèi)源性NO釋放的抗凝血材料制備方法，其特征在 于，所述雜化生物材料包括聚乳酸/羥基磷灰石、殼聚糖/羥基磷灰石。
【文檔編號(hào)】A61L33/02GK104208761SQ201410394981
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】王進(jìn), 羅日方, 楊志祿, 黃楠, 翁亞軍, 趙元聰, 冷永祥, 楊蘋 申請(qǐng)人:西南交通大學(xué)