水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)的制備方法及其在制備抗前列腺癌藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法及其新用途，尤其是水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)的制備方法 及其在制備抗前列腺癌藥品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌是指發(fā)生于前列腺體的惡性腫瘤。前列腺癌病理類型上包括腺癌、導(dǎo)管 腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌，其中前列腺癌占95%以上。
[0003] 前列腺癌是一種全身性疾病，目前治療以前列腺根治術(shù)、睪丸切除術(shù)、內(nèi)分泌治療 為主，輔以化療、放療等。
[0004] 中醫(yī)中藥中的活血化瘀藥物能有效降低血液黏度和周圍血管阻力，有利于免疫系 統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的作用。
[0005] CN1636017公開(kāi)了含有蛋白酶激活系列的氣單胞菌溶素原及其在前列腺癌治療中 的使用方法，公開(kāi)了修飾的氣單胞菌溶素原肽，該蛋白包含一個(gè)前列腺特異性蛋白酶切割 位點(diǎn)及一個(gè)前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0006] CN102946878A公開(kāi)了前列腺癌的治療方法，采用釕絡(luò)合物鹽作為治療藥物。
[0007] CN1222935公開(kāi)了用于前列腺癌的免疫治療和免疫診斷的化合物及方法，該發(fā)明 的化合物包括含有一種前列腺蛋白質(zhì)的至少一部分的多肽及多肽的核苷酸序列。
[0008] CN103347540A公開(kāi)了用于治療前列腺癌的抗-a -Y-整聯(lián)蛋白抗體，通過(guò)抗血管 生成抗體DI17E6及其結(jié)構(gòu)性突變體治療前列腺癌患者。
[0009] CN102813939A公開(kāi)了前列腺癌特異性基因-病毒藥物，本藥物是將前列腺癌特意 的抗癌基因插入到前列腺癌特異性的溶瘤病毒中而制成。
[0010] CN101949565A公開(kāi)了 T-2毒素在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用，通過(guò)瘤內(nèi)注 射T-2毒素治療實(shí)體瘤。
[0011] CN102421414A公開(kāi)了用于治療前列腺癌的組合物，主要用藥為地加瑞克及其它藥 用鹽。
[0012] CN102268436A公開(kāi)了前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體、遞釋載體、遞釋系統(tǒng) 及其制備方法。遞釋載體由聚陽(yáng)離子高分子材料、親水性聚合物和寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)， 三者以共價(jià)方式鏈接構(gòu)成，所述遞釋系統(tǒng)由遞釋載體與miRNA、SiRNA或質(zhì)粒DNA形成的基 因遞釋系統(tǒng)。
[0013] CN101928696A公開(kāi)了一種前列腺癌靶向腺病毒的制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明涉及一 種前列腺癌特異性免疫溶瘤雙功能重組腺病毒載體系統(tǒng)的建立及其在前列腺癌細(xì)胞中的 目的基因的表達(dá)，病毒特異性復(fù)制及溶瘤功能的驗(yàn)證。
[0014] CN101816685A公開(kāi)了預(yù)防和治療前列腺癌的含羥基酸提取物及提取方法與應(yīng)用， 該方法是將瘤枝藻干燥、粉碎、過(guò)篩、超聲提取、提取液減壓濃縮兩次，得到雄性激素依賴型 或非雄性激素依賴型前列腺癌細(xì)胞增殖活性的預(yù)防和治療的藥品。
[0015] CN101442995公開(kāi)了新型抗前列腺活性劑，該活性劑由含有番茄紅素和染料木黃 酮等組成。
[0016] CN103860528A公開(kāi)了一種芳基萘型木質(zhì)素在制備抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用，該發(fā) 明所述木質(zhì)素為6-羥基-4 0 -(4-羥基-3-甲氧基苯基)-3 a-羥甲基-7-甲氧基-3, 4-二 氫-2-萘醛，并提供了芳基萘型木質(zhì)素類化合物的提取方法。
[0017] CN103813788A公開(kāi)了治療前列腺癌的方法，該發(fā)明公開(kāi)了用于減少前列腺癌的方 法和組合物。治療方法包括向受試者施用有效量的抑制前列腺基底上皮細(xì)胞增殖的試劑， 施用的試劑選用氟他米特、比卡魯胺、尼魯米特和ASC-J9。
[0018] CN103897050A公開(kāi)了一種烏賊墨抗前列腺癌多肽及其制備方法，該方法所述烏賊 墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1，并提供了制備方法。
[0019] CN103204904A公開(kāi)了一種抗前列腺癌赤魟軟骨蛋白多肽及其制備方法和用途，該 抗前列腺癌多肽的氨基酸序列為Ilc-Gla-Pr 0-His (IEPH)，并提供了制備方法。
[0020] CN103897037A公開(kāi)了特異性結(jié)合前列腺癌的短肽及其應(yīng)用，該發(fā)明提供了一系列 利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。
[0021] 水蛭為醫(yī)蛭科動(dòng)物水蛭，螞蝗的全體，味咸、苦，性平，有毒，歸肝經(jīng)，功能：破血逐 瘀，通經(jīng)消瘀，但水蛭的副作用較大。
[0022] 201210315709. 1公開(kāi)了人工培育水蛭蛆蟲的工藝，該發(fā)明以水蛭等為原料，通過(guò) 人工可控的方法定向生成生物活性較高的蟲體。該發(fā)明首次提出一種水蛭基因重組的方 法，該方法可以批量工業(yè)化生產(chǎn)，生成的重組水蛭基因蛋白質(zhì)對(duì)前列腺癌有特殊藥理作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明的目的是提供一種水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)的制備方法及其在制備抗前列腺癌藥 品中的應(yīng)用，本發(fā)明工藝過(guò)程中采用適宜的方法提取分離水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)，并根據(jù)水蛭蛆 蟲蛋白質(zhì)的特性輔以相應(yīng)的材料至制備成不同劑型的藥劑。
[0024] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： (1)將1000 g水蛭蛆蟲在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化粉碎。
[0025] 本步驟中，所述膨化壓力為0? l~5MPa，時(shí)間為10~60min。
[0026] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)粗品。
[0027] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0028]本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時(shí)間為10~30min。
[0029] (3)收集含有水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)粗品的溶液并且用微孔過(guò)濾器過(guò)濾去掉雜質(zhì)。
[0030] 本步驟中，所述微孔過(guò)濾器的孔徑為0. 5~50Mffl。
[0031] (4)用超濾機(jī)超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)超濾溶液。
[0032] 本步驟中，所述超濾機(jī)的孔徑為50~100nm。
[0033](5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0034]本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0035] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0036] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0037] (7)純化后的水蛭蛆蟲蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)制備成凍干蛋白粉。
[0038] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_(kāi)30~50°C、時(shí)間為18~26h。
[0039] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑等，可用于制備抗 前列腺癌藥品。
[0040] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：通過(guò)本發(fā)明分離純化的水蛭蛆蟲蛋白質(zhì) 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法及葡聚糖凝膠G-75凝膠過(guò)濾法測(cè)得相對(duì)分子量為 10. 7~12. 2KPa ;用等電聚焦法測(cè)定其等電點(diǎn)為pH8. 9~9. 6 ;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不 含糖類和磷酸基團(tuán)；紫外分光光度法分析在260nm和280nm測(cè)定純化的水輕蛆蟲蛋白質(zhì)含 量為97. 7%;分子結(jié)構(gòu)屬非典型、非單一的昆蟲蛋白質(zhì)，鏈內(nèi)與鏈間不含二硫鍵，其三級(jí)結(jié) 構(gòu)構(gòu)象單元以無(wú)規(guī)卷曲為主，a螺旋與e折疊的含量比例基本相當(dāng)。本發(fā)明制備的水蛭 蛆蟲蛋白質(zhì)制劑質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測(cè)，劑型多樣，成本 較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限如此，凡是對(duì) 本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0042] 實(shí)施例1: (1) 將1000 g水蛭蛆蟲干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對(duì)膨化裝置內(nèi) 充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至〇. l~5MPa，時(shí)間10~60min，然后迅速釋放壓力至常壓，水蛭蛆 蟲被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的水蛭蛆蟲粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加壓至2~10MPa，形成膨 脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時(shí)間10~30min，水