前列腺癌的惡性程度判定試劑盒和其方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2007年02月06日、申請?zhí)枮?00780052524. 3、發(fā)明名稱為"前 列腺癌的惡性程度判定試劑盒和其方法"的申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于判定（診斷）前列腺癌的惡性程度從而預(yù)測患者的預(yù)后的判定試 劑盒和判定法。
【背景技術(shù)】
[0003] LAT1基因是癌胚基因，在1998年由金井等人分離（Kanai，Y.，Segawa， Η·，Miyamoto，Κ·，Uchino，Η·，Takeda，Ε·，Endou，H. Expression Cloning and Characterization of a Transporter for Large Neutral Amino Acids Activated by the Heavy Chain of 4F2Antigen.J. Biol. Chem 273(37) :23629-23632,1998)。LAT1 基 因，編碼具有L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的44KD的12次跨膜型蛋白質(zhì)，在與1次跨膜蛋白 4F2hc (也稱為⑶98)共存時(shí)，顯示Na+非依賴性地轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸等大型中性氨基酸的經(jīng)典的L轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性。LAT1 和4F2hc蛋白可以認(rèn)為是通過半光氨酸-半光氨酸鍵而結(jié)合。LAT1基因被證實(shí)在來源 于癌的培養(yǎng)細(xì)胞、胎肝中高量表達(dá)，在正常組織中僅在腦、胎盤、睪丸、骨髓等有限的部位 表達(dá)（Yanagida，0·，Kanai，Y.，Chairoungdua，A.，Kim，D，Kyung.，Segawa，H.，Nii，T.， Cha，S，Ho.，Matsuo，H.，F(xiàn)ukushima，J.，F(xiàn)ukasawa，Y.，Tani，Y.，Taketani，Y.，Uchino， H.，Kim，J，Young.，Inatomi，J.，Okayasu，I.，Miyamoto, K.，Takeda，E.，Goya，T.，Endou， H. ：Human L-type amino acid transporter 1 (LAT1) characterization of function and ezpression in tumor cell lines. Biochimica et Biophysica Acta 1514:291-302， 2001)。與此相對(duì)，4F2hc基因則在幾乎全部的正常組織和癌細(xì)胞等中廣泛地分布。
[0004] LAT1 的同系物 LAT2 (Segawa，H.，F(xiàn)ukasawa，Y.，Miyamoto, K.，Takeda，E.，Endou， H.，Kanai，Y. identification and Functional Characterization of a Na+independent Neutral Amino Acid Transporter with Broad Substrate Selectivity. J. Biol. Chem 274(28) :19745-19751,1999)與LAT1蛋白有50%氨基酸同源性，關(guān)于LAT2基因的人組織 分布，在所調(diào)查的所有組織中存在。因此，LAT1可以稱為癌胚性的各種L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體， LAT2可以稱為正常型的各種L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。作為LAT的活性化因子的4F2hc幾乎在全 部的組織中分布，癌組織與正常組織沒有區(qū)別。
[0005] 然而，前列腺癌從世界范圍看是發(fā)病頻度尚的癌癥，在美國男性的癌癥中患病率 是第1位，死亡率是第2位。即使在日本，前列腺癌患者數(shù)近年來也有增加的趨勢，在1975 年一年間的2千人左右的患者數(shù)在2000年則報(bào)告了約2萬人，預(yù)計(jì)在2020年將達(dá)到約8 萬人，在男性的癌癥中僅次于肺癌，患病率達(dá)到第2位。另外，預(yù)測由前列腺癌導(dǎo)致的死亡 數(shù)在2020年將達(dá)到現(xiàn)在的1.4倍，預(yù)計(jì)在美國死亡率變?yōu)榈?位（日本臨床增刊號(hào)60; 44-48, 2002 ;前列腺疾患的臨床）。
[0006] 作為前列腺癌的診斷法，血中PSA值的早期發(fā)現(xiàn)、篩選方法是著名的，并被廣泛使 用，但是該方法對(duì)癌癥沒有特異性，已知即使在前列腺肥大、前列腺炎時(shí)也會(huì)升高。另外，在 近年，也有報(bào)道稱血中PSA僅簡單地與前列腺的大小成比例。通常，若確認(rèn)血中PSA值為高 值，則通過直腸指診確認(rèn)前列腺的大小、硬度等。在通過上述檢查強(qiáng)烈地懷疑發(fā)生前列腺癌 時(shí)，提取活組織進(jìn)行檢查，通過蘇木素伊紅（Hematoxylin eosin)染色，進(jìn)行組織病理學(xué)的 診斷。在該診斷中，通過異形度（grade of atypism)、分化度等診斷細(xì)胞的狀態(tài)，判斷其惡 性的程度。在組織病理學(xué)的診斷中，Gleasons分類是前列腺癌特有的異形度分類，是根據(jù) 異形度的程度按評(píng)分1~5的5級(jí)進(jìn)行分級(jí)的方法，近年來，該方法正成為對(duì)決定治療方法 有著非常大的影響的診斷法。
[0007] 作為使用手術(shù)時(shí)摘出的材料進(jìn)行的診斷，基于TMN分類（T:原發(fā)腫瘤，N :淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移，Μ :遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移）的診斷被認(rèn)為是有效的。
[0008] 這些診斷法，特別是Gleasons分類，作為前列腺癌的預(yù)后判定方法被廣泛地使 用，其與預(yù)后的聯(lián)系也有報(bào)告，但是現(xiàn)狀是在相關(guān)的領(lǐng)域中，為了更加精度高的診斷和治 療，期待在Gleasons分類、TMN分期之外增加新的診斷法，特別是期待分子標(biāo)記的出現(xiàn)。另 外，如上所述，TMN分類等如上所述是使用在手術(shù)時(shí)摘出的材料的診斷法，因此難以對(duì)早期 癌癥的惡性程度進(jìn)行診斷。
[0009]【專利文獻(xiàn)1】日本特開平11-299489號(hào)公報(bào)
[0010]【專利文獻(xiàn)2】日本特開2000-157286號(hào)公報(bào)
[0011] 因此，本發(fā)明的目的在于，提供在Gleasons分類、TMN分類之外作為新的診斷法的 分子標(biāo)記的方法，同時(shí)提供通過與在手術(shù)前的早期階段使用活體檢驗(yàn)材料的Gleasons分 類組合，即使不使用手術(shù)時(shí)摘出的材料而使用細(xì)胞針檢查所提取的材料時(shí)，也能夠以更高 精度且容易地判定前列腺癌的惡性程度的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明人等首先著眼于在來源于癌的培養(yǎng)細(xì)胞、胎肝中特 異性表達(dá)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體LAT1。然后，在將該LAT1作為分子標(biāo)記，研究使該LAT1顯現(xiàn)化的 各種手法時(shí)發(fā)現(xiàn)，某種方法即使在使用基于細(xì)胞針檢查提取的試樣時(shí)，對(duì)于判定前列腺癌 細(xì)胞的惡性程度特異性地有效，從而完成了本發(fā)明。
[0013] 本發(fā)明（1)是含有抗人LAT1單克隆抗體、通過免疫組織化學(xué)染色用于判定前列腺 癌的惡性程度的試劑盒。在此，該抗人LAT1單克隆抗體只要是可以特異性地識(shí)別LAT1的 抗體就沒有特別的限制，例如，可列舉特異性地識(shí)別人LAT1的從細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的N末端部位 開始 1 ~52 位的氨基酸殘基（Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Val Thr Leu Gin Arg Asn lie Thr Leu)的 抗體（例如小鼠抗人LAT1單克隆抗體）。此外，人LAT1的氨基酸序列和堿基序列在日本特 開2000-157286號(hào)公報(bào)中記載。另外，針對(duì)本說明書中的"惡性程度"，將由于癌的原因造成 患者死亡的癌設(shè)定為惡性程度高的癌，將即使診斷為癌也不會(huì)以癌為直接原因造成死亡的 癌設(shè)定為惡性程度低的癌。
[0014] 在此，抗人LAT1單克隆抗體，只要是以LAT1為抗原與該抗原結(jié)合就沒有特別的限 制，可以適當(dāng)?shù)氖褂眯∈罂贵w、大鼠抗體、兔抗體、羊抗體等。
[0015] 另外，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，基本上可以使用公知技術(shù)，按以下所述制作。即 可以通過如下方法制作：將所需的抗原、表達(dá)所需的抗原的細(xì)胞作為致敏性抗原來使用，將 其按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，利用通常的細(xì)胞融合法使得到的免疫細(xì)胞與公知的母細(xì) 胞融合，利用通常的篩選法，篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞（雜交瘤）。雜交瘤的制作，例如 可以依照 Milstein 等的方法（Kohler. G. and Milstein，C.，Methods Enzymol. (1981)73 : 3-46)等進(jìn)行。在制作抗人LAT1單克隆抗體時(shí)，可以將LAT1或其蛋白質(zhì)的片斷作為抗原 使用，另外，可