用于檢測pcv2的融合蛋白、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及PCV2病毒防治診斷領(lǐng)域，具體涉及用于檢測PCV2的融合蛋白、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是作為一種豬腎細(xì)胞系PK-15培養(yǎng)污染物而被發(fā)現(xiàn)的，其基因組為共價閉合的單股環(huán)狀DNA分子，基因組全長約1.7kb。PCV是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒，病毒粒子表面無囊膜，呈二十面體對稱，粒子直徑在17-20nm之間。根據(jù)PCV的致病性、血清型和基因型特點，將其分為非致病性的PCVl和致病性的PCV2(豬圓環(huán)病毒2型)兩種類型。其中，PCV2是引起豬圓環(huán)病毒病(PCVD)的主要病原。PCV2主要侵害免疫系統(tǒng)，降低機體的抵抗力和免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致被感染豬產(chǎn)生免疫抑制和其他病原微生物的繼發(fā)感染，從而使死亡率明顯上升。該病除能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)之外，還是豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis nephropathy syndrome, F1DNS)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、增生性壞死性肺炎(proliferativenecrotizing pneumonia, PRDC)、新生仔豬先天性震顫、懷孕母豬繁殖障礙等疾病的重要病原。
[0003]豬圓環(huán)病毒病一年四季均可發(fā)生，無嚴(yán)格的季節(jié)性，豬是PCV2的天然宿主，各種品種的豬，不論大小均可發(fā)病，主要感染5-12周齡豬。病豬和帶毒豬是豬圓環(huán)病毒病的主要傳染源，可以水平傳播，也可通過感染的懷孕母豬通過垂直傳播的方式傳染仔豬。自1991年在加拿大首次報道豬群中存在PMWS以來，相繼在美國、歐洲、東南亞等地發(fā)現(xiàn)豬群中有PMWS存在，并分離到PCV2。我國為養(yǎng)豬大國，PCV2感染也相當(dāng)嚴(yán)重，自2000年郎洪武等報道在國內(nèi)豬群中存在PCV2感染以來，PCV2引起的疾病在我國流行一直處于上升趨勢。有研宄顯示，從2008年以來中國大部分省市PCV2抗體陽性率在25.9%到63.38%之間。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果說明PCV2在我國豬群中廣泛的流行。正因為PCV2能使感染豬機體免疫功能受到損害，機體抵抗力明顯下降，易造成并發(fā)或繼發(fā)感染而使病情加重，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2已成為嚴(yán)重威脅我國及世界其他國家和地區(qū)豬群健康的重要致病因素之一，阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，嚴(yán)重影響了世界各國的養(yǎng)豬生產(chǎn)水平。
[0004]及時、準(zhǔn)確的對PCV2進(jìn)行檢測，是診斷、預(yù)防和控制PCVD的前提。目前PCV2的檢測技術(shù)包括病毒的分離、電子顯微鏡觀察、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫過氧化物單層培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫法、間接免疫熒光法、原位雜交及核酸探針雜交實驗等方法。迄今為止，盡管有多種檢測PCV2的方法，但是這些檢測方法要求較高，需要配備專門的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，檢測成本昂貴，而且耗時相對較長，這極大地限制了其在基層單位的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供用于檢測PCV2的融合蛋白，該融合蛋白在與人O型血紅細(xì)胞和PCV2病毒同時作用時，會發(fā)生肉眼可觀察到的凝集現(xiàn)象，因此可以用于快速檢測PCV2。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供所述融合蛋白的制備方法，由于該融合蛋白分子量較小、且易于原核系統(tǒng)的表達(dá)，所以產(chǎn)量較高。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供上述融合蛋白在制備檢測PCV2試劑盒方面的應(yīng)用，操作簡單、靈敏度高且特異性強，能夠滿足基層現(xiàn)場使用快速、簡便的要求。
[0008]本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0009]一種用于檢測PCV2的融合蛋白，是將抗人紅細(xì)胞H抗原納米抗體和抗PCV2納米抗體通過Linker序列連接而成。
[0010]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0011]本發(fā)明還要求保護(hù)所述融合蛋白的編碼基因。
[0012]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。
[0013]本發(fā)明還要求保護(hù)含有所述基因的重組載體；優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述重組載體是將權(quán)利要求3或4所述基因插入表達(dá)載體所得；所述表達(dá)載體優(yōu)選為pET-His。
[0014]另外，本發(fā)明還要求保護(hù)含有所述基因的重組菌，是將含有所述基因的重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌；所述重組載體是將所述基因插入表達(dá)載體PET-His所得。
[0015]本發(fā)明還要求保護(hù)制備所述融合蛋白的方法，誘導(dǎo)所述重組菌表達(dá)融合蛋白，收集所述融合蛋白的包涵體，復(fù)性所述融合蛋白。
[0016]最后，本發(fā)明還要求保護(hù)所述融合蛋白在制備檢測PCV2試劑盒方面的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明用于檢測PCV2的融合蛋白，在與人O型血紅細(xì)胞和PCV2病毒同時作用時，會發(fā)生肉眼可觀察到的凝集現(xiàn)象，因此可以用于快速檢測PCV2。本發(fā)明用于檢測PCV2的融合蛋白可以單獨與人O型血紅細(xì)胞和PCV2病毒結(jié)合，但不會發(fā)生凝集現(xiàn)象。
[0018]在本發(fā)明所述融合蛋白的制備方法中，由于該融合蛋白分子量較小、且易于原核系統(tǒng)的表達(dá)，所以產(chǎn)量較高。
[0019]上述融合蛋白可以應(yīng)用于制備檢測PCV2的試劑盒。采用該試劑盒檢測PCV2，操作簡單、靈敏度高且特異性強，能夠滿足基層現(xiàn)場使用快速、簡便、成本低的要求。
【附圖說明】
[0020]下面結(jié)合附圖所示實施例，作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不限于此實施例。
[0021]圖1融合蛋白A的誘導(dǎo)表達(dá)驗證SDS-PAGE電泳圖，M_Mark，泳道1-未誘導(dǎo)BL21-A全菌；泳道2-誘導(dǎo)后BL21-A的全菌。
[0022]圖2重組融合蛋白A的雙功能特性驗證。
[0023]圖3重組融合蛋白A的特異性驗證。
[0024]圖4重組融合蛋白A用于檢測PCV2的靈敏性驗證，其中第一、二排中，各列孔上方數(shù)字表示該孔內(nèi)病毒的稀釋度；第三排中均為對照。
[0025]圖5重組融合蛋白B的誘導(dǎo)表達(dá)驗證SDS-PAGE電泳圖，M-Mark,泳道1-未誘導(dǎo)BL21-B全菌；泳道2-誘導(dǎo)后BL21-B的全菌。
【具體實施方式】
[0026]溶液I:IMTris-HCl (ρΗ8.5-9.0)緩沖液中含有 ImM EDTA、50mM NaCl 和0.5% (質(zhì)量百分濃度)Triton X-100。
[0027]溶液II:1M Tris-HCl (pH8.5-9.0)緩沖液中含有 ImM EDTA、50mM NaCl、3M 尿素和
0.5% (質(zhì)量百分濃度)Triton X-1OO0
[0028]溶液III:1M Tris-HCl (pH8.5-9.0)緩沖液中含有 ImM EDTA、50mM NaCl、6M鹽酸胍、5% (質(zhì)量百分濃度)甘油和5mMDTT(二硫蘇糖醇)。
[0029]TGE Buffer:50mM Tris-HCl (ρΗ7.9)緩沖液中含有 0.5mM EDTA、50mM NaCl 和 5%(質(zhì)量百分濃度)甘油。
[0030]0.1M、ρΗ7.4 的 PBS 緩沖液:稱取 11.65g Na2HPO4,1.65g KH2PO4,9g NaCl，去離子水溶解后用0.1M氫氧化鈉溶液或鹽酸調(diào)pH值到7.4，定容至1000ml。
[0031]實施例1用于檢測PCV2的融合蛋白的制備
[0032]1.融合蛋白基因的設(shè)計與合成
[0033]人工設(shè)計分子量較小的用于檢測PCV2的融合蛋白A。該融合蛋白由抗人紅細(xì)胞H抗原納米抗體和抗PCV2納米抗體通過Linker序列連接而成。融合蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。設(shè)計融合蛋白A的編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。融合蛋白A的編碼基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0034]另選抗人紅細(xì)胞H抗原抗體和抗PCV2抗體通過Linker序列連接，形成分子量較大的融合蛋白B。融合蛋白B的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，編碼基因如SEQ ID No:3所示。融合蛋白B的編碼基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0035]2.融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)
[0036]將融合蛋白A的基因片段(核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)采用Nde I和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切體系:Nde I I μ 1、Hind III I μ 1、10XK buffer 2 μ 1、融合蛋白A的基因片段6μ1、ddH20 10μ1?酶切結(jié)束后進(jìn)行核酸電泳，將大小約為790bp的目的基因膠回收，克隆至原核表達(dá)載體ρΕΤ-His中，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。