一種基于氧化硅納米顆粒構(gòu)建多功能基因治療載體及藥物載體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于非病毒基因載體及藥物載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以氧化硅納米顆粒為基質(zhì)，利用表面修飾功能化氧化硅納米顆粒，以原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)法構(gòu)建多功能基因治療載體及藥物載體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著癌癥以及其它基因類(lèi)疾病發(fā)病率的升高，基因治療在癌癥以及其它疾病治療中的應(yīng)用引起人們的廣泛關(guān)注?；蛑委?gene therapy)是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的，即將外源基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說(shuō)，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。目前基因治療在攻克人類(lèi)癌癥、遺傳疾病以及心血管等重大疾病方面起到舉足輕重的作用。選擇合適的基因載體和藥物基因復(fù)合，使目的基因能夠在靶細(xì)胞中獲得安全、高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)是基因治療的關(guān)鍵問(wèn)題之一。
[0003]基因載體作為基因?qū)爰?xì)胞的工具，功能為將目的基因送至宿主細(xì)胞，跨過(guò)細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)，將基因?qū)爰?xì)胞核內(nèi)，使之得到復(fù)制和表達(dá)。目前使用的基因載體可分為病毒性載體和非病毒性載體。病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus, RV)、腺病毒(adenovirus, AV)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AV)、痕疼病毒(herpes simplexvirus, HSV)、慢病毒(Ientivirus)等。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但改造病毒易引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，具有潛在致癌性且其價(jià)格昂貴。這些缺陷使得病毒性載體的應(yīng)用受到很大限制。常見(jiàn)的非病毒性載體包括裸DNA(naked DNA)、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物(liposanes orlipoplexes)以及陽(yáng)離子高聚物(cat1nic polymer)。裸露DNA轉(zhuǎn)染主要采用物理方法，例如針注射、基因槍、電穿孔等，將目的基因直接導(dǎo)入細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。脂質(zhì)體由磷脂雙層構(gòu)成，為兩親性結(jié)構(gòu)分子，通過(guò)自組裝可構(gòu)成水相內(nèi)核的脂質(zhì)微囊，將DNA包裹，可用作制備靶向性、無(wú)免疫原性、緩釋時(shí)間長(zhǎng)、毒副作用低及載藥率高的抗癌藥物載體。陽(yáng)離子高聚物不僅具有低毒、低免疫原性、低致癌性，易于制備和攜帶目的基因、強(qiáng)靜電作用、有效絡(luò)合DNA等特點(diǎn)，且其便于進(jìn)行靶向性和生物適用性改性，是近年來(lái)研宄最廣泛的基因載體材料。
[0004]化學(xué)療法是將藥物經(jīng)血管帶到全身，因?yàn)樗盟幬锒际怯泻Γ踔潦菐Ф拘缘?，體內(nèi)細(xì)胞，無(wú)論是否為癌細(xì)胞，都受到破壞。這極大地影響了化療的治療效果，對(duì)患者的身心造成了很大的傷害。提高化療效果的關(guān)鍵是如何提高藥物的靶向性和降低藥物的毒副作用。通過(guò)載體包裹抗腫瘤藥物，能夠減少體內(nèi)酶對(duì)抗腫瘤藥物的破壞與降解從而提高了藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性。同時(shí)包裹在載體內(nèi)的抗腫瘤藥物通過(guò)緩釋過(guò)程能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持有效的血液濃度，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，提高抗腫瘤藥物的利用率，降低藥物使用的頻率。更為重要的是可以通過(guò)在抗腫瘤藥物載體上修飾各類(lèi)靶向分子實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)輸，降低藥物的毒副作用。納米科技的發(fā)展及納米藥物輸送體系的建立使得醫(yī)藥領(lǐng)域很多傳統(tǒng)難題得以解決，納米診療體系相比于傳統(tǒng)藥物，其靶向性、生物利用度等都有很大提高，同時(shí)此類(lèi)新型體系可以改善藥物穩(wěn)定性及藥物釋放動(dòng)力學(xué)行為，從而更大程度地提高治療效果并減小副作用。因此，開(kāi)發(fā)新型、多樣化的納米藥物輸送體系是貫穿納米生物醫(yī)學(xué)的重要課題。目前，常見(jiàn)的藥物載體有脂質(zhì)體、高分子聚合物、金納米顆粒介孔二氧化硅、量子點(diǎn)等。近年來(lái)，無(wú)機(jī)納米粒子因其具有光、電、磁等獨(dú)特性質(zhì)、尺寸形貌可控性好、比表面積大等一系列優(yōu)點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注。
[0005]介孔二氧化硅納米顆粒的研宄始于20世紀(jì)90年代，研宄者們先后合成了具有六方、立方孔道，孔徑為2-10nm的MCM-41、MCM-48型介孔二氧化硅材料。介孔二氧化硅由于具有有序且連續(xù)可調(diào)的介孔結(jié)構(gòu)、大的比表面積、優(yōu)良的生物相容性及表面功能基團(tuán)易于被修飾等特性，更是成為藥物輸送體系研宄的熱點(diǎn)，尤其，介孔氧化硅材料骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、孔徑規(guī)則且在2-50nm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)、表面富含羥基易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，可以有效裝載和輸送不同大小和種類(lèi)的藥物。通過(guò)改變介孔二氧化硅的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如孔徑、比表面積和比孔容等，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放的改善。特定形貌的介孔材料的制備在工業(yè)上的應(yīng)用是非常重要的，例如氧化硅膜材料在催化，分離，光學(xué)器件上的應(yīng)用以及單分散球結(jié)構(gòu)在色譜分離等方面的應(yīng)用等等。因此介孔氧化硅材料的形貌控制生長(zhǎng)也成為一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)研宄工作。由于介孔氧化硅生長(zhǎng)過(guò)程中，中間態(tài)液晶相自組裝行為變化豐富，導(dǎo)致介孔氧化硅的形貌也豐富多變。由于其同時(shí)又兼有可控的規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)，因此能否同時(shí)實(shí)現(xiàn)介孔材料在微觀和宏觀兩個(gè)層次的可控制備。介孔氧化硅的形貌很大程度上是由其中間態(tài)液晶相結(jié)構(gòu)所決定的，因此能夠?qū)@一自組裝結(jié)構(gòu)有影響的因素也都同時(shí)是影響產(chǎn)物形貌的重要因素。例如，兩親分子可能的自組裝結(jié)構(gòu)，硅源及其水解縮聚，硅酸鹽與兩親分子頭基不同的作用方式，表面活性劑的濃度，有機(jī)分子以及無(wú)機(jī)鹽添加劑，溫度，攪拌速度以及PH值影響等等都是介孔化合物形貌的重要因素，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)這些條件進(jìn)行改變可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同形貌的介孔氧化硅的形貌控制。到目前，人們已相繼合成了多種形貌的介孔氧化硅，如球狀，囊泡狀，陀螺，多面體，納米棒，納米線，納米纖維，須狀，螺旋，納米帶，納米管，薄膜，薄片，單塊等。目前，納米技術(shù)發(fā)展雖然可以合成許多形貌的介孔氧化硅納米顆粒，但是氧化硅納米顆粒的均一性、分散性仍I日是合成一大難題。
[0006]近年來(lái)，隨著活性/可控自由聚合(living/controlled radicalpolymerizat1n, LRP)研宄的快速發(fā)展，LRP技術(shù)在制備具有新穎特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大發(fā)展。LRP集活性可控聚合與自由基聚合的優(yōu)點(diǎn)為一身，不但可得到相對(duì)分子量分布極窄、相對(duì)分子量可控、結(jié)構(gòu)明晰的高分子，而且可聚合的單體多，反應(yīng)條件溫和易控制。所以，LRP技術(shù)具有極高的實(shí)用價(jià)值，受到了高分子化學(xué)家們的重視。其中，ATRP(原子轉(zhuǎn)移自由基聚合)近幾年得到了迅速發(fā)展并有著重要應(yīng)用價(jià)值。其所用引發(fā)劑一般為鹵代烷烴，基本原理是通過(guò)一交替的“活化-去活”可逆反應(yīng)使體系中游離基濃度極低，迫使不可逆終止反應(yīng)降低到最低程度，而鏈增長(zhǎng)反應(yīng)仍可進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)“活性”聚合。ATRP反應(yīng)溫度適中，適用單體范圍廣，甚至可以在少量氧存在下進(jìn)行，對(duì)高分子材料的分子設(shè)計(jì)不需復(fù)雜的合成路線，是現(xiàn)有其它活性聚合方法無(wú)法比擬的，因此可以說(shuō)ATRP技術(shù)的出現(xiàn)開(kāi)辟了活性聚合的新領(lǐng)域。
[0007]隨著高分子科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及工程學(xué)等多門(mén)學(xué)科的相互交融、相互滲透和迅速發(fā)展，高分子基因載體材料進(jìn)入一個(gè)快速發(fā)展的時(shí)期。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道一系列非病毒陽(yáng)離子聚合物載體，包括聚-L-賴(lài)氨酸(poly (L-1ysine)，PLL)、聚乙二胺樹(shù)枝狀聚合物(poly (amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙稀酸N，N-二甲酸基乙醋(poly (2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)、聚乙稀亞胺(polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有較高的轉(zhuǎn)染效率，是陽(yáng)離子非病毒載體中公認(rèn)的“金標(biāo)”。但是上述陽(yáng)離子聚合物仍具有相當(dāng)高的毒性，大大限制了它們的應(yīng)用。這樣，開(kāi)發(fā)低毒而高效陽(yáng)離子聚合物是研宄非病毒基因載體的核心內(nèi)容。最近，我們發(fā)現(xiàn)以多糖為骨架的聚陽(yáng)離子的星狀或者梳妝的基因載體，具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性。所以我們以氧化硅納米顆粒構(gòu)建低毒高效的星狀陽(yáng)離子基因載體，并且探索不同形貌以及尺寸的載體體系在不同細(xì)胞系中的應(yīng)用效果，達(dá)到在診斷和治療中最佳的效果。
[0008]綜上所述，盡管在利用活性可控自由基聚合法制備以氧化硅納米顆粒為基質(zhì)的多功能基因載體方面已經(jīng)做了很多工作，但是在技術(shù)方面還有以下問(wèn)題需要解決:
[0009]1、在制備高性能氧化硅基因載體時(shí)，如何盡可能保證氧化硅納米顆粒的均一性、分散性以及相同的表面理化性質(zhì)是探索最優(yōu)形貌尺寸基因載體的前提。
[0010]2、如何在氧化硅納米顆粒表面引入ATRP引發(fā)點(diǎn)，保證反應(yīng)高效接入大量引發(fā)點(diǎn)，并保證引發(fā)點(diǎn)均勻分布于表面，且接入引發(fā)點(diǎn)可以在聚合反應(yīng)條件下穩(wěn)定不脫離氧化硅納米顆粒表面，高效高質(zhì)接入ATRP引發(fā)點(diǎn)是聚合反應(yīng)順利進(jìn)行的前提。
[0011]3、在制備高性能氧化娃基因載體時(shí)，隨著單體不斷的接枝到氧化娃納米顆粒表面，陽(yáng)離子基因載體的分子量隨之增大，細(xì)胞內(nèi)吞作用增大，轉(zhuǎn)染效率增加，但是細(xì)胞的毒性也隨之增大，如何最大限度的降低基因載體的毒性成為需要解決的問(wèn)題。
[0012]4、隨著聚合物分子量的增大，氧化硅納米顆粒的形貌及尺寸發(fā)生變化，探索合適的接入聚合物的含量，控制形貌、尺寸以及接入聚合物的含量三個(gè)變量尋找最佳性能的載體材料成為一大難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明以不同形貌、尺寸的氧化硅納米顆粒為基質(zhì)，利用表面修飾功能化氧化硅納米顆粒，以原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)法構(gòu)