本發(fā)明屬于制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及氫分子液體/氣體在制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

近年來，隨著研究發(fā)現(xiàn)腫瘤并不是由均一的腫瘤細(xì)胞組成的，腫瘤內(nèi)不同的細(xì)胞具有不同的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移能力，具有很強的異質(zhì)性。其中一小部分細(xì)胞具有自我更新、無限增殖和多向分化的潛能，這部分細(xì)胞被稱作腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells，csc)，其腫瘤干細(xì)胞(csc)具有自我更新和分化的能力，是形成腫瘤和啟動腫瘤快速增殖的初始細(xì)胞，還可以通過不斷分化產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞形成完整腫瘤。腫瘤干細(xì)胞也被認(rèn)為是耐藥和復(fù)發(fā)的罪魁禍?zhǔn)?，尋找有效的抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的藥物已成為研究者和臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點。

氫是世界上分子量最小、最豐富的元素，約占整個宇宙質(zhì)量的90％。氫氣是一種無色無味的雙原子氣體。目前氫氣作為清潔能源氣體被廣泛研究，直到2007年日本學(xué)者太田成男教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)現(xiàn)動物呼吸2％的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血再灌注損傷，氫氣選擇性抗氧化作用的特性使得氫分子的生物學(xué)功能逐漸受到廣泛關(guān)注，越來越多的臨床和實驗研究表明氫分子能夠治療多種由于氧化損傷引起的疾病，如帕金森癥、糖尿病、代謝綜合征、線粒體疾病等。氫氣用于抑制腫瘤的研究，其實早在1975年dole等在science上發(fā)表了利用氫氣治療惡性黑色素瘤的文章，不過是采用呼吸8個大氣壓的氫氣，由于呼吸高壓氫氣存在一定危險，難以被廣泛采用。saitoh等采用富氫電解水處理人舌癌細(xì)胞hsc-4，證明在細(xì)胞水平氫分子能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞克隆形成能力。到目前為止，氫氣或富氫水是否能夠抑制腫瘤干細(xì)胞目前仍然未見相關(guān)報道。

本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)氫氣能夠顯著抑制腦膠質(zhì)瘤及其他腫瘤干細(xì)胞球的增殖能力，呼吸氫氣和富氫水能夠顯著抑制人和大鼠來源的膠質(zhì)瘤體內(nèi)成瘤能力，并且氫氣和富氫水處理后人和大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著下降，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)氫氣和富氫水能夠顯著抑制腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記cd133的表達(dá)，而促進(jìn)分化標(biāo)記的表達(dá)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的制備能夠顯著抑制人和大鼠腫瘤干細(xì)胞球的藥物。尤其是將含有氫分子的液體/氣體用于制備抑制腦瘤腫瘤干細(xì)胞及其他腫瘤干細(xì)胞藥物，顯著抑制腫瘤體內(nèi)成瘤能力，進(jìn)一步顯著抑制腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記cd133的表達(dá)，而促進(jìn)分化標(biāo)記的表達(dá)，并且使得腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著下降。

含有氫分子的液體用于制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物的應(yīng)用。

含有氫分子的液體為富氫溶液，該富氫溶液的溶劑含有水，優(yōu)選(包括但不限于)純凈水、生理鹽水、牛奶、有機酸的酸性水溶液、飲料等可飲用的水溶液，富氫溶液中氫的濃度為氫分子飽和，為15-30℃、1個大氣壓條件下或通過加壓等其他方法制備的濃度范圍不低于100μmol/l，上限濃度為氫在水中的過飽和濃度。

一種制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物，其特征在于，藥物為富氫溶液，該富氫溶液含有水，優(yōu)選(包括但不限于)純凈水、生理鹽水或可供飲用的水溶液、牛奶、有機酸的酸性水溶液、飲料等可飲用的水溶液，富氫溶液中氫的濃度為氫分子飽和，為15-30℃、1個大氣壓條件下或通過加壓等其他方法制備的濃度范圍不低于100μmol/l，上限濃度為氫在水中的過飽和濃度。

抑制腫瘤干細(xì)胞藥物為口服藥、注射藥或洗浴用藥。

含有氫分子的氣體用于制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物的應(yīng)用。

含有氫分子的氣體為含有氧氣、空氣、水蒸氣中的一種或幾種與氫氣的混合氣體，含有氫分子的氣體中氫氣的體積百分含量為2％-80％或高壓氫，優(yōu)選體積百分含量為20-70％；

一種制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物，其特征在于，藥物為含有氫分子的氣體，為含有氧氣、空氣、水蒸氣中的一種或幾種與氫氣的混合，氫氣的體積百分含量為2％-80％或高壓氫，優(yōu)選體積百分含量為20-70％。

抑制腫瘤干細(xì)胞藥物為呼吸的氣體吸入藥物。

本發(fā)明的氫分子液體/氣體在制備抑制腫瘤干細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其中氫分子能顯著抑制腫瘤體內(nèi)成瘤能力，使得腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著下降，進(jìn)一步顯著抑制腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記cd133的表達(dá)，而促進(jìn)分化標(biāo)記的表達(dá)。

附圖說明

圖1氫氣處理組和對比組抑制體內(nèi)腫瘤體積的比較圖，氫氣處理組顯著抑制膠質(zhì)瘤體內(nèi)增殖，其中，圖a為實驗動物飲用富氫水和對照組實物結(jié)果，圖b為實驗動物呼吸氫氣組和對照組結(jié)果；

圖2氫氣處理組和對比組抑制腫瘤干細(xì)胞球的增殖的比較圖，氫氣處理組顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞球增殖；其中，圖a為大鼠和人的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞c6和u87腫瘤球形成實驗的細(xì)胞形態(tài)結(jié)果和統(tǒng)計圖，圖b為hepg2、pa-1和hs38.t細(xì)胞的腫瘤球形成結(jié)果統(tǒng)計。

圖3氫氣處理組和對比組抑制干細(xì)胞標(biāo)記cd133的表達(dá)的比較圖，氫氣處理組顯著抑制干細(xì)胞標(biāo)記cd133的表達(dá)；

圖4氫氣處理組和對比組抑制腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記cd133的表達(dá)的免疫熒光圖比較，免疫熒光顯示氫氣處理組顯著抑制腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記cd133的表達(dá)，促進(jìn)分化標(biāo)記gfap的表達(dá)；

圖5氫氣處理組和對比組抑制膠質(zhì)瘤遷移侵襲能力的比較圖，氫氣處理組顯著抑制膠質(zhì)瘤遷移侵襲能力。

具體實施方式

下面采用以下實施例即實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不僅限于此，可在不脫離本發(fā)明主題和范圍的情況下以同等方式對本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修飾。

實施例1：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)中含氫培養(yǎng)基的制備

1，將鎂棒高壓滅菌后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，兩天后培養(yǎng)基中氫濃度達(dá)到飽和，可供使用。

2，使用電解水產(chǎn)生的100％體積比純氫氣通入培養(yǎng)基中一定時間(50ml30min)，此時培養(yǎng)基中氫濃度達(dá)到飽和，可供使用。

(2)動物腦膠質(zhì)瘤模型中氫組的處理

1，呼吸氫氣組動物模型中，通過電解水產(chǎn)生氫氣，將含有60％體積比的氫氣和空氣混合氣體通入動物培養(yǎng)箱中，供動物呼吸。

2，飲用富氫水動物模型中，實驗動物飲用含有飽和濃度氫分子的富氫水。富氫水制備通過電解水產(chǎn)生氫氣高壓灌入普通飲用水中密封保存。

(3)顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤成瘤模型處理比較

八周齡雄性wistar大鼠(170-180g)正常喂養(yǎng)一周。水合氯醛麻醉后，使用立體定位儀將培養(yǎng)的c6細(xì)胞注入大鼠腦部尾狀核區(qū)，具體位置為x＝3.5mm,y＝0.5mm,z＝-5.0mm。開顱后，c6細(xì)胞懸液以1μl/min的流量注入大鼠，細(xì)胞懸液體積為10μl注入細(xì)胞數(shù)量為4.8x106個每只大鼠。實驗后，大鼠隨機分為三組包括正常培養(yǎng)組、富氫水組和呼吸氫氣組，富氫水組和呼吸氫氣組采用(2)的方法，正常培養(yǎng)組、富氫水組和呼吸氫氣組的效果圖，見附圖1。

(4)腫瘤干細(xì)胞球形成

1，腫瘤細(xì)胞消化后離心收集。

2，pbs緩沖液重懸細(xì)胞，計數(shù)后，加入1.5×10⁴個細(xì)胞至5ml腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基(分別采用含氫培養(yǎng)基和普通不含氫培養(yǎng)基進(jìn)行比較，含氫的培養(yǎng)基制備見步驟(1)，腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基使用dmem/f12，其中加入20ng/mlegf,20ng/mlbfgf和50xb27。

3，細(xì)胞培養(yǎng)14天后，形成腫瘤干細(xì)胞球，見附圖2。

(5)細(xì)胞流式檢測腫瘤細(xì)胞cd133的表達(dá)

1，取按照步驟(4)中形成的氫氣和對照組處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞球，吹散后成單細(xì)胞懸液，按4×10⁵個每管分裝。

2，pbs洗一次，300g離心10min；棄上清。

3，100μlpbs重懸細(xì)胞，加入一抗cd133-fitc(biobyt1：200)，設(shè)一管為直標(biāo)抗體pe-isotype空白對照，一管為直標(biāo)抗體fitc-isotype空白對照，4℃搖床，避光反應(yīng)40min。

4，pbs清洗3次，每次300g離心10min，1％多聚甲醛固定，4℃放置，流式細(xì)胞儀檢測，見附圖3。

(6)細(xì)胞免疫熒光檢測

1，細(xì)胞增殖至70％時，消化離心，重懸細(xì)胞計數(shù)后，取1×105個細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，正常貼壁培養(yǎng)24小時后，分別更換含氫培養(yǎng)基和普通不含氫培養(yǎng)基培養(yǎng)，含氫的培養(yǎng)基制備見步驟(1)。

2，取貼壁培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基，用pbs洗三次，洗時注意不可吹打細(xì)胞，加入4％多聚甲醛固定15min；

3，吸出固定液，用pbs洗3次，每次5min，0.1％triton室溫破膜10分鐘，pbs洗3次，每次5min；

4，10％山羊血清室溫封閉30min；

5，吸出封閉血清，不需要洗，直接加入一抗：兔抗人cd133((biobyt1：200)，gfap(sab1:200)陰性對照只加pbs，于4℃冰箱孵育過夜；

6，pbs清洗3次后加入羅丹明標(biāo)記羊抗兔二抗或fitc標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，于室溫孵育1h，pbs清洗3次；

7，最后標(biāo)記dapi，室溫孵育20min，pbs清洗后在熒光顯微鏡下觀察、拍照，見附圖4。

(7)matrigel侵襲實驗

1，制備侵襲小室：matrigel膠在常溫下很快會凝固，因此，將其從-20℃取出后置于4℃融解，且整個過程都置于冰上操作。用無血清培養(yǎng)基稀釋(1：5～1：8)后，取400μl鋪到transwell膜上，將transwell小室放在6孔板中，于37℃孵箱放置3h使其凝固。

2，接種細(xì)胞：實驗用細(xì)胞消化離心后，氫氣組和對照組分別用含氫無血清培養(yǎng)基和普通不含氫無血清培養(yǎng)基重懸，含氫的培養(yǎng)基制備見步驟(1)。在小室內(nèi)加入1ml腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為3×10^5～6×10⁵(依腫瘤細(xì)胞侵襲能力選擇合適的細(xì)胞數(shù))。小室外，氫氣組和對照組分別加入3ml含1.5％胎牛血清的含氫培養(yǎng)基和普通不含氫培養(yǎng)基。

3，培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)24～48h(依腫瘤細(xì)胞侵襲能力而定)。

4，固定及染色：取出transwell小室，pbs洗一次，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，用1％結(jié)晶紫-甲醛溶液進(jìn)行固定并染色20～30min，吸去染色液，然后用自來水緩慢洗去殘留染色液，空氣干燥。

5，鏡檢：在倒置顯微鏡下拍照，每個樣品計數(shù)5個視野，計數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，見附圖5。