【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種狗肝菜多糖制備放射性口干癥藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，放射治療仍是頭頸部惡性腫瘤的治療方法之一，但由于涎腺的位置與其對(duì)放射線的高度敏感性，使惡性腫瘤細(xì)胞在被殺傷的同時(shí)，導(dǎo)致鄰近的涎腺組織也受到損傷，引起涎腺諸多并發(fā)癥，其中放射性口干癥嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，因此，對(duì)涎腺放射性口干癥的防治措施研究一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。

狗肝菜全草(diclipterachinensisl.ness)主產(chǎn)于廣東、廣西等我國南方地區(qū)，具有清熱解毒、涼血止血、生津利尿等功能，常用于感冒發(fā)熱、暑熱煩渴、小便不利等癥。其最早見載于民國時(shí)期蕭步丹《嶺南采藥錄》:“梗青色、葉象杏仁、性寒涼、散熱。有本地羚羊之稱。凡覺熱氣盛，肝火重，服之甚有功效”，現(xiàn)代研究表明，狗肝菜多糖是狗肝菜全草中主要功效成分，具有抗氧化，保肝護(hù)肝和免疫調(diào)節(jié)等生理活性。狗肝菜多糖不僅具有十分廣泛的生物活性，而且在體內(nèi)的毒副作用極低，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

水通道蛋白家族作為細(xì)胞膜上的一種對(duì)水專一的通道蛋白，普遍存在于動(dòng)植物及微生物細(xì)胞膜上，尤其在動(dòng)物體中的功能和作用日益凸顯。日前關(guān)于涎腺放射性損傷分子機(jī)制的研究認(rèn)為放射線可抑制水通道蛋白家族功能，使其表達(dá)減少，從而可能影響水通道蛋白介導(dǎo)的水跨腺泡細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，水通道蛋白5(aqp5)作為水通道蛋白家族成員之一，是迄今為止發(fā)現(xiàn)可定位于大鼠唾液腺的少數(shù)成員之一，其減少或缺失可影響水轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，導(dǎo)致滲透壓失衡，進(jìn)而引起口干癥，此外，ma通過敲除大鼠aqp5基因證實(shí)aqp5對(duì)唾液腺分泌功能有重要作用。

到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)中僅制取狗肝菜精多糖(dcp1a)，并未分析其單糖組分及結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的在于：提供一種狗肝菜精多糖用于放射性口干癥治療的用途及制備該狗肝菜精多糖的方法。本發(fā)明先對(duì)狗肝菜全草進(jìn)行分離、提取、純化，制取狗肝菜精多糖(dcp1a)作用于放射性損傷大鼠模型，通過對(duì)具有分泌唾液功能的涎腺形態(tài)學(xué)及功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，以明確狗肝菜多糖是否對(duì)涎腺放射性口干癥具有一定的防護(hù)作用；通過從蛋白水平和分子水平兩方面對(duì)大鼠下頜下腺組織中aqp5表達(dá)變化情況的觀測，深入觀測可影響唾液腺分泌功能的aqp5的表達(dá)情況，進(jìn)而為放射性口干癥的治療提供科學(xué)依據(jù)。經(jīng)過本發(fā)明的狗肝菜精多糖在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可恢復(fù)具有唾液分泌功能的涎腺組織功能及形態(tài)，并通過蛋白及分子水平對(duì)涎線組織中aqp5進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的狗肝菜精多糖可提高其表達(dá)量，故可用于放射性口干癥的治療與預(yù)防。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

狗肝菜多糖的新用途，用于制備防治放射性口干癥藥物或者保健品，可將其制備成臨床常用制劑，例如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、散劑和注射劑等，其制法與現(xiàn)有的相應(yīng)劑型的制法通用。

一種分子量為2.40-2.48×10⁴da的狗肝菜多糖應(yīng)用于制備防治放射性口干癥的藥物或者保健品，可將其制備成臨床常用制劑，例如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、散劑和注射劑等，其制法與現(xiàn)有的相應(yīng)劑型的制法通用。

一種狗肝菜多糖在制備防治放射性口干癥藥物中的應(yīng)用的組合物，組合物加入國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)允許加入的輔料，用于制成片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、散劑和注射劑，其制法與現(xiàn)有的相應(yīng)劑型的制法通用。

一種分子量為2.40-2.48×10⁴da的狗肝菜多糖在制備防治放射性口干癥藥物中的應(yīng)用的組合物，組合物加入國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)允許加入的輔料，用于制成片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、散劑和注射劑，其制法與現(xiàn)有的相應(yīng)劑型的制法通用。

本發(fā)明狗肝菜多糖的是通過采用醇沉水提的方法先狗肝菜全草中提取植物中的粗多糖，木瓜蛋白酶解法先脫去粗多糖游離蛋白質(zhì)，然后雙氧水氧化法脫去色素，再利用透析、膜分離的技術(shù)去除小分子物質(zhì)，再分別采用陰離子交換柱層析法與凝膠柱層析法分離出均一多糖組分，得到成分相對(duì)均一的狗肝菜精多糖(dcp1a)，高效液相滲透色譜法測定精多糖的分子量及純度；

其中，所述醇沉水提的方法是將狗肝菜進(jìn)行水提取得到水提取物，水提取物醇沉后后真空真空冷凍干燥機(jī)凍干后，收集得到狗肝菜粗多糖；

所述木瓜蛋白酶解法先脫去粗多糖游離蛋白質(zhì)是，將干燥后的狗肝菜粗多糖進(jìn)行溶解，加入木瓜蛋白酶水浴接著高溫將酶滅活后離心后收集上清液，冷凍干燥得到脫蛋白后狗肝菜粗多糖；

所述陰離子交換柱層析法是將deae-纖維素填料先后經(jīng)過堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)中性后再經(jīng)過酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)為中性，接著使用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)再經(jīng)過蒸餾水調(diào)節(jié)至中性，然后填料進(jìn)入層析柱，調(diào)節(jié)層析柱可使用后，先加入粗多糖，再用蒸餾水進(jìn)行溶解，將層析柱擰開螺旋夾，依次加入蒸餾水、nacl溶液，naoh溶液進(jìn)行洗脫，每隔60min收集一管10ml以上進(jìn)行洗脫液的吸光度檢測，將490nm相同峰位的洗脫液合并，然后進(jìn)行蒸發(fā)濃縮后透析凍干，得到初步純化的多糖樣品(dcp1)；

所述凝膠柱層析法是將sephacryls-300hr填料進(jìn)行預(yù)處理后，接著裝柱，調(diào)節(jié)層析柱內(nèi)內(nèi)凝膠直至體積維持不變，關(guān)閉底部螺旋夾，精密吸取凍干后的nacl流分配制成水溶液緩慢滴加到凝膠上表面，打開底部螺旋夾平衡，待樣品完全進(jìn)入凝膠床后關(guān)閉螺旋夾，滴加洗脫劑，開始柱洗脫，洗脫流分經(jīng)減壓濃縮后進(jìn)行醇沉，離心，冷凍干燥，取洗脫圖中最大峰位的狗肝菜精多糖(dcp1a)進(jìn)行進(jìn)一步純化。經(jīng)hpgpc測定，dcp1a組分中多糖含95.22％。

綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明克服了本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有的研究思維慣性和局限性，經(jīng)過了長期大量的實(shí)驗(yàn)總結(jié)與分析，采用的狗肝菜藥材資源豐富，制備狗肝菜精多糖的方法工藝制備工藝簡單，原料易得，進(jìn)而降低了制備的成本，且得率高、含量高，無任何毒副作用，口感好，具有良好的開發(fā)價(jià)值。此外，本發(fā)明發(fā)掘了狗肝菜多糖適用于防治放射性口干癥，療效確切，在制備防治放射性口干癥藥物或保健品具有良好的藥用價(jià)值，并為狗肝菜多糖進(jìn)一步深入開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明deae-52纖維素層析柱洗脫曲線；

圖2是本發(fā)明是sephacryls-300hr層析柱洗脫曲線；

圖3是本發(fā)明dcp1a的高效凝聚滲透色譜圖；

圖4是本發(fā)明狗肝菜精多糖對(duì)放射性損傷大鼠的體重增長平均值的影響(g)；

圖5是本發(fā)明dcp1a作用于放射性損傷大鼠1周及12周后下頜下腺he染色變化情況(he，×200)(備注a-d分別為照射后1周0gy空白組、0gy低劑量組、0gy中劑量組、0gy高劑量組；e-h分別為照射后1周18gy照射組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組；i-l分別為照射后12周0gy空白組、0gy低劑量組、0gy中劑量組、0gy高劑量組；m-p分別為照射后12周18gy空白組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組)；

圖6是本發(fā)明dcp1a作用于放射性損傷大鼠1周及12周后下頜下腺pas染色變化情況(pas，×200)(a-d分別為照射后1周0gy空白組、0gy低劑量組、0gy中劑量組、0gy高劑量組；e-h分別為照射后1周18gy照射組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組；i-l分別為照射后12周0gy空白組、0gy低劑量組、0gy中劑量組、0gy高劑量組；m-p分別為照射后12周18gy空白組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組)；

圖7是本發(fā)明dcp1a作用于放射性損傷大鼠1周及12周后下頜下腺中aqp5免疫組織化學(xué)染色變化情況(免疫組織化學(xué)，×200)(a-d分別為照射后1周0gy空白組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組；e-h分別為照射后1周18gy照射組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組；i-l分別為照射后12周0gy空白組、0gy低劑量組、0gy中劑量組、0gy高劑量組；m-p分別為照射后12周18gy空白組、18gy低劑量組、18gy中劑量組、18gy高劑量組)；

圖8是本發(fā)明dcp1a作用于放射性損傷大鼠下頜下腺中aqp5mrna相對(duì)表達(dá)量注:①代表0gy給藥各組vs0gy空白各組，☆p>0.05；②代表18gy4周中、高劑量組vs18gy8周中、低劑量組vs18gy12周中、高劑量組vs18gy12周中、高劑量組，p>0.05；

圖9內(nèi)參gapdh與目的aqp5擴(kuò)增曲線與溶解曲線。

【具體實(shí)施方式】

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1狗肝菜多糖分離和提取

稱取狗肝菜全草干2.00kg截成長約2cm大小，加入8l蒸餾水，90℃下提取4h，重復(fù)3次，合并提取液，在65℃條件下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200ml后緩慢倒入無水乙醇中(v濃縮液：v無水乙醇＝1:4)，振搖充分后，靜置過夜，次日收集醇沉物，于真空冷凍干燥機(jī)凍干后，收集得到狗肝菜粗多糖待用。

1.2狗肝菜粗多糖分離和提取

1.2.1狗肝菜粗多糖脫蛋白

取凍干后狗肝菜粗多糖，加入蒸餾水使最終濃度為5.00％(g/ml)，加入木瓜蛋白酶，使其終濃度為1.00％(g/ml)，充分?jǐn)嚢韬?，?0℃水浴中3h，高溫將酶滅活后，3000r/min離心10min，收集上清液，真空冷凍干燥機(jī)濃縮凍干，即得脫蛋白后狗肝菜粗多糖。

1.2.2狗肝菜粗多糖脫色素

取脫蛋白后狗肝菜粗多糖，加入蒸餾水使最終濃度為5.00％(g/ml)，加入30％過氧化氫，使其終濃度為1.00％(g/ml)，于45℃水浴中反應(yīng)4h，每隔30min檢測ph值一次，使用0.50mol·l-1naoh溶液調(diào)節(jié)ph值為8.0，使體系ph值持續(xù)維持在ph＝8.0，結(jié)束反應(yīng)后，冷卻至室溫，用0.50mol·l^-1hcl調(diào)至中性后加入nacl使其終濃度為5.00％(g/ml)，待nacl溶解完全后，向體系緩慢加入等體積無水乙醇并搖勻充分，4度過夜，24h后離心收集醇沉物，真空冷凍干燥機(jī)凍干，即獲得脫色素后狗肝菜粗多糖。

1.2.3狗肝菜粗多糖除小分子雜質(zhì)

取經(jīng)除蛋白和除色素后的狗肝菜粗多糖，加入適量蒸餾水，待其溶解完全后裝入截留分子量為3500的透析袋中透析48h后，濃縮透析液，真空冷凍干燥機(jī)凍干，即得除小分子雜質(zhì)狗肝菜粗多糖。

1.3狗肝菜精多糖分離和提取

1.3.1deae-52纖維素柱層析純化狗肝菜粗多糖

稱取deae-纖維素填料150.00g后進(jìn)行deae-纖維素填料預(yù)處理，使其浸泡在600ml蒸餾水，攪拌，24h后加入400ml蒸餾水靜置30min，抽濾除去懸浮顆粒，加入0.50mol·l^-1的naoh溶液500ml浸泡30min，抽濾后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，再用0.50mol·l^-1hcl溶液500ml浸泡30min，抽濾后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，再將填料置于0.50mol·l^-1的naoh溶液浸泡30min，抽濾后再用蒸餾水洗滌至中性即可后便可裝入規(guī)格為2.5cm×80cm的層析柱，固定三腳架上，先往層析柱內(nèi)加入蒸餾水，使蒸餾水液面達(dá)柱子高度一半，緩慢加入預(yù)先處理的deae-纖維素混懸液，打開柱底螺旋夾，保持流速1滴/6s的流速，每當(dāng)蒸餾水液面接近纖維素液面時(shí)再次緩慢倒入預(yù)處理后的deae-纖維素混懸液，重復(fù)上述操作，直到柱中deae-纖維素液面至柱口以下5cm左右的位置維持不變，關(guān)閉螺旋夾，檢查柱面是平整，無氣泡后，以蒸餾水為流動(dòng)相，流速為1滴/10s，平衡12h后上樣精密稱取粗多糖樣品2.00g，加入20ml蒸餾水中溶解，緩慢滴加樣品溶液，擰開螺旋夾，依次用蒸餾水、0.125mol·l^-1的nacl溶液和0.30mol·l^-1的naoh溶液洗脫，控制流速為1滴/6s，每隔60min收集一管(約10ml)，于490nm處測定洗脫液的吸光度，合并具有相同峰位的洗脫液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后透析48h，凍干，即得到初步純化的多糖樣品(dcp1)。

使用不同的流動(dòng)相經(jīng)deae-52纖維素柱進(jìn)行洗脫可以分離出不同組分的多糖，本實(shí)驗(yàn)依次使用蒸餾水、0.125mol/lnacl溶液和0.30mol/lnaoh作為流動(dòng)相洗脫，洗脫曲線見圖1，根據(jù)洗脫曲線分級(jí)得到的三個(gè)組分，按照出峰時(shí)間的先后順序依次命名為dcp1、dcp2和dcp3(圖1)。

1.3.2sephacryls-300hr柱層析純化狗肝菜粗多糖

先稱取sephacryls-300hr填料5.00g進(jìn)行sephacryls-300hr填料預(yù)處理，加入50ml去離子水浸泡24h，上層液體傾去后，加入體積相同的naoh溶液，靜置1h，傾去液體，去離子水反復(fù)洗滌至中性后裝柱，固定層析柱于三腳架，預(yù)先將蒸餾水注入層析柱1/4柱高度，凝膠溶液攪勻后沿管壁倒入，直至接近柱高度處，打開底部螺旋夾，補(bǔ)充層析柱內(nèi)凝膠直至體積維持不變，且保持其上平面達(dá)到柱高以下5cm左右的位置，以流速為1滴/10s的流動(dòng)相平衡，直至凝膠柱面不再下降，關(guān)閉底部螺旋夾，精密吸取凍干后的nacl流分配制成水溶液緩慢滴加到凝膠上表面，打開底部螺旋夾平衡，待樣品完全進(jìn)入凝膠床后關(guān)閉螺旋夾，滴加洗脫劑，開始柱洗脫，本試驗(yàn)以蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速設(shè)為1滴/4s，洗脫流分經(jīng)減壓濃縮后進(jìn)行醇沉，離心，冷凍干燥，取洗脫圖中最大峰位的狗肝菜精多糖(dcp1a)進(jìn)行進(jìn)一步純化。

用sephacryls-300hr凝膠過濾層析純化dcp1a，采用nacl洗脫，收集正態(tài)洗脫峰，減壓濃縮，醇沉，冷凍干燥即得dcp1a與dcp1b，如圖2所示。

1.3.3高效凝膠滲透色譜法(hpgpc)測定dcp1a的分子量

采用高效凝膠滲透色譜法(hpgpc)測定dcp1a相對(duì)分子量，精密取凍干dcp1a多糖樣品1.00g，加入超存水溶解，使溶液終濃度為1mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)品dextran40(分子量分別為5900，11800，22800，47300，112000，212000和404000)。hplc條件如下：色譜柱：tskgelg3000pwxl(φ7.8mm×300mm)；檢測器：elsd-lhii低溫型蒸發(fā)光散射檢測器(sedex85)，增益1，漂移管溫度50℃，載氣壓力50psi；分離單元：超純水，流速0.8ml/min，柱溫40℃。

如圖3所示，可見dcp1a的高效凝聚滲透色譜(hpgpc)洗脫峰單一，對(duì)稱性良好，說明dcp1a為均一組分，可用于后實(shí)驗(yàn)研究，其分子量標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y＝-0.5493x+9.1967，r2＝0.9936。通過標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出dcp1a的分子量為2.42×10⁴da。

2.1大鼠放射性模型建立

購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心spf級(jí)sd大鼠192只，適應(yīng)性飼養(yǎng)于spf級(jí)環(huán)境中一周后，采用完全隨機(jī)數(shù)字法分為1周、4周、8周、12周0gy空白對(duì)照組、0gy給藥對(duì)照組、18gy照射實(shí)驗(yàn)組和18gy給藥實(shí)驗(yàn)組(高劑量組400mg/kg，中劑量組200mg/kg，低劑量組100mg/kg)共8組，每組24只(分為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只)。各組大鼠用2％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射，待完全麻醉后，以60coγ射線為放射源，頭頸部為放射野，大鼠呈仰臥位，放射面積為2cm×5cm，其他部位受鉛塊保護(hù)，皮源距50cm，照射中心在皮下1cm，照射速度采用81.4cgy/min分割照射，模擬人體照射的方法并加以改良，一次性給予18gy照射量[39]，照射后飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心spf級(jí)環(huán)境中以待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，自照射前1周至照射后4周于每天上午9：00-11：00期間，采用灌胃法給予給藥組大鼠相應(yīng)劑量dcp1a。

2.2放射大鼠全身情況觀察

2.2.1體重

測量照射前及照射后大鼠體重，記錄數(shù)值，每7天測量一次，持續(xù)12周。

測量照射前及照射后大鼠體重，記錄數(shù)值，每7天測量一次，持續(xù)12周，計(jì)算體重增長平均值繪制結(jié)果如圖4所示：①照射前適應(yīng)性飼養(yǎng)階段，0gy給藥對(duì)照各組增長值略高于其余各組；②照射后一周，各組增長平均值均有所下降，這可能與制造大鼠放射性損傷模型過程中大鼠生活環(huán)境改變而引起大鼠飲食及飲水量降低有關(guān)，但18gy照射實(shí)驗(yàn)組呈負(fù)增長狀態(tài)，其余各組呈正增長狀態(tài)且增長水平差異較?。虎壅丈?周后18gy照射實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)正增長狀態(tài)，但可以明顯看出增長值低于其余各組，而18gy給藥實(shí)驗(yàn)組與其余對(duì)照組差異較小，這可以間接說明狗肝菜精多糖可能通過某種形式影響放射性損傷大鼠的體重增長值。見圖4。

2.4放射大鼠下頜下腺形態(tài)學(xué)觀察

2.4.1標(biāo)本處理方法

分別于照射后1、4、8、12周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將已完成測量下頜下腺指數(shù)的頜下腺快速分為三份，一份放入多聚甲醛中固定，然后制成蠟塊，待用于he染色法和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)；一份稱量后放入冷凍管中液氮保存，待用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)；另一份稱量后放入含有rna降解的保持液中，放入-80℃冰箱凍存，待用于rt-qpcr實(shí)驗(yàn)。

2.4.2he染色

分別將照射后1、4、8、12周待測蠟塊，常規(guī)切片，厚度4μm，烤片，脫蠟，復(fù)水，常規(guī)he染色，封片。

如圖5所示，光學(xué)顯微鏡下可見0gy對(duì)照組下頜下腺的結(jié)構(gòu)清晰，腺泡飽滿，腺泡細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，排列較整齊(圖a-d，i-l)，18gy給藥組雖然均較0gy對(duì)照組腺泡細(xì)胞變小，細(xì)胞核變形、縮小、空泡樣改變增多，但比損傷程度輕于18gy照射組(圖e-h，m-p)。

2.4.3pas染色

分別將照射后1、4、8、12周待測蠟塊，常規(guī)切片，厚度4μm，烤片，脫蠟，蒸餾水沖洗，過碘酸酒清液浸泡，自來水沖洗，schiff氏液浸泡10min，蘇木精染核后常規(guī)脫水、透明、封片。

如圖6所示，從光學(xué)顯微鏡下可見0gy空白組下頜下腺的結(jié)構(gòu)清晰，腺泡飽滿，腺泡細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，排列較整齊，而18gy給藥組雖然均較0gy對(duì)照組腺泡細(xì)胞變小，細(xì)胞核變形、縮小、空泡樣改變增多，但比損傷程度輕于18gy照射組，pas染色結(jié)果顯示0gy空白組胞漿中含糖元的腺泡細(xì)胞數(shù)量多，18gy給藥各組鏡下顯示糖元的腺泡細(xì)胞數(shù)量較0gy對(duì)照組減少，但多于18gy照射組，說明狗肝菜精多糖(dcp1a)作用于放射性損傷大鼠后，其下頜下腺腺泡細(xì)胞的損傷程度減輕，可部分恢復(fù)放射性損傷大鼠下頜下腺形態(tài)學(xué)損傷情況，綜上，狗肝菜精多糖對(duì)放射性損傷大鼠及其下頜下腺具有防護(hù)作用，可為放射性涎腺損傷的治療奠定基礎(chǔ)。

2.1免疫組織化學(xué)法測大鼠放射后下頜下腺中aqp5表達(dá)變化

取照射后1、4、8、12周標(biāo)本蠟塊連續(xù)切片，厚度4um，60℃烤箱中烤3小時(shí)，切片浸泡于二甲苯i、ii、iii、iv液中各5min，梯度酒精(100％、95％、85％、75％)脫蠟，每次約10秒，清水沖洗3次，置于稀釋的edta(1:50)抗原修復(fù)液中，高溫高壓抗原修復(fù)4分鐘，自然冷卻，用蒸餾水清洗3次，每次2分鐘，3％過氧化氫液37℃孵育10分鐘以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，pbs清洗3次，每次2分鐘，滴加稀釋的aqp5多克隆抗體(1:125)孵育，4℃過夜，次日pbs清洗3次，每次2分鐘，滴加試劑盒中的聚合物輔助劑(試劑a)孵育，37℃20分鐘，pbs清洗3次，每次2分鐘，滴加試劑盒中的辣根酶標(biāo)記抗兔igg聚合物(試劑b)孵育，37℃20分鐘，pbs沖洗3次，每次2分鐘，dab顯色液顯色2分鐘，流動(dòng)清水沖洗10分鐘，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。待片干后，用image-proplus6.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)本在200倍鏡下隨機(jī)取6個(gè)不同的部位測量其平均光密度值，用平均光密度代表aqp5表達(dá)量。

表1dcp1a作用于放射性損傷大鼠其下頜下腺中aqp5各組平均光密度值(x±s，n＝6)

注：①0gy給藥各組vs0gy空白各組，^*p＞0.05：②18gy4周中、高劑量組vs18gy8周中、高劑量組vs18gy12周中、高劑量組，*p＞0.05：③其余各項(xiàng)，p＜0.05

見圖7，0gy空白組與0gy給藥組aqp5在腺泡的頂膜、側(cè)膜和導(dǎo)管等處均有較強(qiáng)表達(dá)(圖a-d，i-l)，0gy空白各組與0gy給藥各組各組間進(jìn)行單因素方差分析、lsd檢驗(yàn)，*p>0.05，尚不能認(rèn)為各對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此我們可以看出單純的給予大鼠dcp1a并不能增加其下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量，因此我們可以排除dcp1a的陽性作用率；如表1所示：照射后，18gy照射組大鼠下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖e，m)，aqp5表達(dá)量逐漸減少(p＜0.05)，同一時(shí)間點(diǎn)上，18gy給藥各組表達(dá)量均高于18gy照射組(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示我們dcp1a作用于放射性損傷大鼠可使其下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量增加；18gy4周中劑量組與18gy1周中劑量組相比、18gy4周高劑量組與18gy1周高劑量組相比較，可見大鼠下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量降低(p＜0.05)，但18gy4周中、高劑量組與18gy8周中、高劑量組與18gy12周中、高劑量組各組間進(jìn)行單因素方差分析、lsd檢驗(yàn)，尚不能認(rèn)為各對(duì)照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因而我們可以看出，雖然放射后中、高給藥劑量組4周較1周大鼠下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量降低，但隨著給藥的持續(xù)進(jìn)行，4周后大鼠下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量降低可趨于穩(wěn)定狀態(tài)，經(jīng)觀察并未出現(xiàn)藥物反跳現(xiàn)象，由此我們可以得出：dcp1a作用于放射后大鼠可使其下頜下腺組織中aqp5表達(dá)量增加，中、高劑量dcp1a更適宜作用于放射性損傷大鼠。

2.3rt-qpcr測大鼠放射后下頜下腺中aqp5表達(dá)變化

取照射后1、4、8、12周，經(jīng)上述已稱量下頜下腺組織放入預(yù)冷研缽中，倒入液氮，將組織研碎成細(xì)粉末狀，加入1mlrnaisoplus溶液，室溫靜置5分鐘，12.000g，4℃離心5min，取上清液，移入經(jīng)depc處理過的1.5ml離心管中，加入200ul氯仿，振蕩混勻，室溫下靜置5min，12.000g，4℃離心15min，取上清液移至新1.5ml離心管中，加入500ul異丙醇混均勻，室溫靜置10min，2.000g，4℃離心10min，取盡上清液留沉淀，1ml75％乙醇(depc處理水配制)漂洗沉淀，12.000g，4℃離心5min，棄上清留沉淀，自然晾干，適量無酶水溶解，紫外可見光光度計(jì)進(jìn)行純度并及濃度分析，取od260/od280值在1.8-2.0之間標(biāo)本根據(jù)primescripttmrtreagentkit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法逆轉(zhuǎn)錄為cdna，具體步驟為：①除基因組dna反應(yīng)：冰上配制5×gdnaeraserbuffer2μl與gdnaeraser1μl的混合液，根據(jù)濃度計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本1μg的總rna的體積，加入到混合液中，加入rnasefreedh2o使反應(yīng)體系達(dá)到10μl，42℃，pcr儀上反應(yīng)2分鐘；②配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液：依次加入4μlrnasefreedh2o、4μl5×primescriptbuffer2(forrealtime)、1μlprimescriptrtenzymemixi、1μlrtprimermix逆轉(zhuǎn)錄試劑于0.2ml的pcr管中；③逆轉(zhuǎn)錄為cdna：取步驟②配制的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液10μl加入到步驟①的反應(yīng)管中在pcr儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件依次為37℃15分鐘，85℃5秒，然后置于-20℃條件下保存。后期利用rt-qpcr的方法檢測aqp5mrna的表達(dá)情況，根據(jù)genbank中大鼠aqp5全基因序列設(shè)計(jì)引物，由takara生物技術(shù)有限公司合成(表2)。擴(kuò)增后采用⊿⊿ct法，利用公式：2^{-[ct(放射組-內(nèi)參)-ct(對(duì)照組-內(nèi)參)}]計(jì)算出相對(duì)對(duì)0gy空白對(duì)照組下頜下腺的aqp5表達(dá)量，并繪制繪制直方圖，以了解dcp1a作用于放射性損傷大鼠后，其下頜下腺中aqp5表達(dá)變化情況。步驟按sybrpremixextaqtmii試劑盒說明進(jìn)行，具體如下：①按10.0μlsybrpremixextaqii(tlirnasehplus)、0.8μlpcrforwardprimer(10μm)、0.8μlpcrreverseprimer(10μm)、0.4μlroxreferencedye、2.0μldna模板、6.0μldh2o(滅菌蒸餾水)冰上避光配制pcr反應(yīng)混合液，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3個(gè)管。②進(jìn)行qpcr反應(yīng)：在steponeplustmreal-timepcr儀器上樣，采用二步法進(jìn)行擴(kuò)增，具體反應(yīng)條件如下：①95℃30s，1個(gè)循環(huán)；②95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；③95℃15s，60℃1h，95℃15s，1個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后分析確認(rèn)rt-qpcr的擴(kuò)增曲線和融解曲線，并記錄每個(gè)樣本的ct值。

表2aqp5與gapdh引物步驟

待steponeplusreal-timepcrsystem儀器中設(shè)定程序結(jié)束后，選取能形成良好的擴(kuò)增曲線、溶解曲線呈單峰、特異性良好的目的基因aqp5及內(nèi)參基因gapdh(圖9)，記錄其ct值，根據(jù)公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組每個(gè)樣本相對(duì)于0gy空白組表達(dá)量(圖8)，由表3可見：①0gy給藥組各組相對(duì)于0gy空白組大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)值為1.0000左右，可以說明是否給予正常大鼠dcp1a并不影響大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)；②隨放射后觀察時(shí)間增加，18gy照射組各組相對(duì)0gy空白組大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)值分為0.6717±0.0010、0.5424±0.0013、0.4006±0.0008、0.2853±0.006，呈逐漸降低趨勢；18gy低劑量組相對(duì)0gy空白組大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)值分為0.8397±0.0002、0.7975±0.0013、0.7552±0.0004、0.7471±0.005，雖然也呈逐漸降低趨勢但明顯高于18gy照射組各組；18gy中劑量組相對(duì)0gy空白組大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)值分為0.9030±0.0012、0.8672±0.0003、0.8653±0.0010、0.8619±0.0005，18gy高劑量組相對(duì)0gy空白組大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)值分為0.9411±0.0006、0.8676±0.0012、0.8663±0.0005、0.8623±0.0004，從數(shù)值上我們可以看出18gy中、高劑量組照射后4周較1周下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)值有所降低，但從照射4周后其數(shù)值降低幅度甚?。虎弁挥^察時(shí)間點(diǎn)，18gy給藥組aqp5mrna表達(dá)相對(duì)值高于18gy照射組aqp5mrna表達(dá)相對(duì)值；18gy給藥組間aqp5mrna表達(dá)相對(duì)值由高到低為高劑量組>中劑量組>低劑量組，但從4周后高劑量組與中劑量組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(☆p>0.05)，說明中、高治療劑量在放射4周后對(duì)放射性損傷大鼠下頜下腺組織中aqp5mrna表達(dá)影響效果相同，且未發(fā)現(xiàn)藥物反跳現(xiàn)象的發(fā)生。

表3dcp1a作用于放射性損傷大鼠其下頜下腺中aqp5mrna相對(duì)表達(dá)量(x±s，n＝6)

注:①代表0gy給藥各組vs0gy空白各組，☆p>0.05；②代表18gy4周中、高劑量組vs18gy8周中、低劑量組vs18gy12周中、高劑量組vs18gy12周中、高劑量組，p>0.05

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。