本發(fā)明涉及對神經(jīng)病理性疼痛、尤其是化療誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病理性疼痛(CIPNP)的新療法。本發(fā)明提供了細(xì)胞色素P450表氧化酶(CYP)的拮抗劑，更具體地，CYP2J2的拮抗劑，作為治療劑用在諸如CIPNP的神經(jīng)病理性疼痛的治療中。CYP2J2拮抗劑已在體內(nèi)鑒定為緩解CIPNP，并由此與化療藥組合而額外提供，用于治療諸如癌癥或其它增生性病癥的疾病中。該CYP2J2拮抗劑減輕化療誘導(dǎo)的疼痛，于是在癌癥治療期間允許使用更高和更佳的化療劑量。此外，本發(fā)明涉及使用CYP2J2激動劑、或CYP2J2的代謝物，用于敏化TRPV1。這種情況下，本發(fā)明提議使用CYP2J2激動劑或代謝物與瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)激動劑的組合來治療對TRPV1激動劑有應(yīng)答的病癥，例如神經(jīng)病理性疼痛。

描述

神經(jīng)病理性疼痛為持續(xù)的或慢性疼痛綜合征，其可源自對神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)、背根、或者對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。神經(jīng)病理性疼痛綜合征包括異常性疼痛、諸如帶狀皰疹后神經(jīng)痛和三叉神經(jīng)痛的各種神經(jīng)痛、幻覺痛、以及復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征，例如反射交感性營養(yǎng)不良和灼痛。灼痛通常的特征是，伴有痛覺過敏和異常性疼痛的自發(fā)燒灼痛。不幸的是，沒有用于充分地、可預(yù)見地和特異性地治療已出現(xiàn)的神經(jīng)病理性疼痛的現(xiàn)有方法，由于用于神經(jīng)病理性疼痛的目前治療方法僅由試圖幫助患者應(yīng)對心理或作業(yè)療法組成，而不是通過減輕或消除所承受的疼痛。對于神經(jīng)病理性或者慢性疼痛的治療對于醫(yī)師和患者是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)闆]有藥物特異地靶向該狀況，以及因?yàn)槟壳笆褂玫乃幬飪H帶來微小緩解并且基于它們在急性疼痛狀況中的功效或者它們緩解副作用如焦慮和抑郁的功效。慢性疼痛的發(fā)病率在社會中是逐漸上升的，其對社會的負(fù)擔(dān)在健康護(hù)理和生產(chǎn)力損傷方面都是巨大的。當(dāng)前，沒有經(jīng)科學(xué)驗(yàn)證的緩解慢性疼痛的療法。結(jié)果，衛(wèi)生界致力于“疼痛管理”，其中同時(shí)使用多個(gè)模式療法，希望對生活質(zhì)量提供一些改善。因此，亟需可緩解慢性疼痛的藥物。

化療誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病理性疼痛(CIPNP)為嚴(yán)重的細(xì)胞抑制劑(例如紫杉烷類、鉑衍生物、長春花生物堿類等)劑量限制性副作用。癥狀通常從麻刺感開始，并且可引起燒灼痛、刺痛和酸痛以及冷觸發(fā)痛和機(jī)械性觸痛。由于CIPNP，一些患者過早地停止了細(xì)胞抑制劑抗癌療法，產(chǎn)生了更高的腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。遺憾的是，很多已批準(zhǔn)用于治療不同的神經(jīng)病理性疼痛的有前途的物質(zhì)(例如加巴噴丁或阿米替林)在CIPNP的單一療法中看起來很少或者沒有鎮(zhèn)痛作用。對細(xì)胞和分子機(jī)制的了解對于治療或甚至預(yù)防CIPNP是必要的，可以改進(jìn)細(xì)胞抑制劑療法的總成功率。

最近的研究鑒定出離子通道的瞬時(shí)受體電位家族的成員(TRPV1、TRPA1和TRPV4)在奧沙利鉑和紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理期間作為機(jī)械性觸痛和冷觸發(fā)痛的促進(jìn)者。激活或敏化TRPV1和TRPA1可導(dǎo)致CGRP和物質(zhì)P的增強(qiáng)釋放，這二者都可引起神經(jīng)源性炎癥和T細(xì)胞的募集。

但是，仍不清楚哪種內(nèi)源性介質(zhì)參與了細(xì)胞抑制劑依賴的TRP通道激活或敏化，由于沒有細(xì)胞抑制劑可直接激活TRP通道。有趣的是，紫杉醇和奧沙利鉑都為CYP表氧化酶的誘導(dǎo)劑(紫杉醇：CYP2C8、CYP2C9，奧沙利鉑：CYP2E1、CYP1B1)。細(xì)胞色素P450(CYP)-表氧化酶可代謝ω-6脂肪酸，例如花生四烯酸(AA)和亞油酸(LA)，產(chǎn)生脂環(huán)氧化物如EETs(環(huán)氧二十碳三烯酸)或ω-羥化物如20-HETE。

細(xì)胞色素P450單加氧酶花生四烯酸的代謝導(dǎo)致各種生物活性的類花生酸的形成。已知發(fā)生三種類型的氧化反應(yīng)。第一，烯烴環(huán)氧化反應(yīng)(表氧化酶催化)產(chǎn)生環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)。四種重要的EET區(qū)域異構(gòu)體為[5,6]-EET、[8,9]-EET、[11,12]-EET、和[14,15]-EET。這些EET經(jīng)環(huán)氧化物水解酶水解形成對應(yīng)的二羥基二十碳三烯酸(DHET)。第二，ω末端氧化導(dǎo)致形成ω末端羥基二十碳三烯酸(HETE)。第三，烯丙位氧化導(dǎo)致形成中鏈HETE。

已經(jīng)鑒定了幾種細(xì)胞色素P450表氧化酶，包括CYP1A、CYP2B、CYP2C、CYP2E和CYP2J亞族的成員。人們最近關(guān)注CYP2J亞族的蛋白。CYP2J的一個(gè)具體亞型CYP2J2在人心肌細(xì)胞中高度表達(dá)，在這里花生四烯酸經(jīng)代謝產(chǎn)生EET。CYP2J2蛋白也在氣管和腸道中的上皮細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。與其它P450酶比較，CYP2J2蛋白沿腸道徑向在上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞中均勻分布。在自主神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞中、上皮細(xì)胞中、以及腸平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高水平的CYP2J2蛋白。在動物中已鑒定了幾種CYP2J同源物，包括大鼠CYP2J3、大鼠CYP2J4、小鼠CYP2J5和小鼠CYP2J6。

辣椒素為瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1受體(TRPV1；之前也稱為香草酸受體1(VR1))的高度選擇性激動劑，該受體為配體門控的非選擇性陽離子通道，優(yōu)先在較小直徑的感覺神經(jīng)元上表達(dá)，特別是那些專門檢測疼痛或有害感覺的C纖維上。TRPV1應(yīng)答有害刺激，包括辣椒素、熱、以及細(xì)胞外酸化，并且將整合同時(shí)暴露于這些刺激。對表達(dá)TRPV1的(辣椒素敏感的)傷害感受器的活化的最初效果為灼燒感覺、痛覺過敏、異常性疼痛、以及紅斑。但是，在持續(xù)暴露于低濃度辣椒素或單次暴露于高濃度辣椒素或其它TRPV1激動劑后，小直徑的感覺軸突變得對各種刺激(包括辣椒素或熱刺激)較不敏感。這種持續(xù)暴露也以減弱的疼痛應(yīng)答為特征。辣椒素的這些后期階段效應(yīng)經(jīng)常被稱為“脫敏”，為開發(fā)局部辣椒素制劑來治療各種疼痛綜合征和其它情況的基本原理。

因此，辣椒素、辣椒素類物質(zhì)和TRPV1激動劑可以用于緩解多種疾病。例如，它們可以用于治療神經(jīng)病理性疼痛(包括與糖尿病性神經(jīng)病變、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、HIV/AIDS、創(chuàng)傷性損傷、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、紅斑性肢痛和幻覺痛相關(guān)的疼痛)、混合傷害性和/或神經(jīng)病理性混合病因產(chǎn)生的疼痛(例如，癌癥)、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、腰痛、炎性痛覺過敏、外陰前庭炎或外陰疼痛、竇息肉間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱或膀胱過動癥、前列腺增生、鼻炎、手術(shù)、創(chuàng)傷、直腸過敏、灼口綜合癥、口腔黏膜炎、皰疹(或其它病毒感染)、前列腺肥大、皮炎、瘙癢、癢、耳鳴、牛皮癬、疣、癌癥(特別是皮膚癌)、頭疼、以及皺紋。

因此，迄今為止，沒有可用于神經(jīng)病理性疼痛的特異療法，特別是針對化療誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病理性疼痛(CIPNP)，這限制了癌癥治療期間化療劑的最大劑量，并且給經(jīng)歷化療的患者的生活質(zhì)量的帶來嚴(yán)重?fù)p害。因此本發(fā)明的目的為提供新的治療選擇來應(yīng)對神經(jīng)病理性疼痛，特別是CIPNP。

在第一方面，通過將細(xì)胞色素P450表氧化酶(CYP)拮抗劑用于在受試者中預(yù)防或治療疼痛來解決上述問題。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該CYP拮抗劑選自CYP1A、CYP2B、CYP2C、CYP2E、以及優(yōu)選的CYP2J拮抗劑。最優(yōu)選地，該CYP拮抗劑為CYP2J2的哺乳動物同源物的拮抗劑(CYP2J2拮抗劑)，優(yōu)選人CYP2J2的拮抗劑，例如替米沙坦、阿立哌唑或最優(yōu)選特非那定。

本發(fā)明涵蓋任何CYP2J2拮抗劑(優(yōu)選選擇性CYP2J2拮抗劑)的用途。術(shù)語“選擇性CYP2J2拮抗劑”涉及選擇性抑制CYP2J2而非其它相關(guān)酶如CYP3A分子的活性、功能或表達(dá)的CYP2J2拮抗劑。為了鑒定候選拮抗劑是否為CYP2J2拮抗劑，可采用發(fā)光的細(xì)胞色素P450發(fā)光測定法。CYP蛋白催化花生四烯酸代謝物的形成。發(fā)光的CYP測定使用用于熒光素酶的生光反應(yīng)的底物前體。CYP將該底物前體轉(zhuǎn)化為熒光素或者熒光素酯，其在與稱為熒光素檢測試劑(LDR)的熒光素酶反應(yīng)混合物的第二反應(yīng)中生成光。在該第二反應(yīng)中產(chǎn)生的光的量與CYP活性成比例。

為了測試候選CY2J2拮抗劑的選擇性，可采用特異于其它CYP酶(如CYP3A4)的發(fā)光CYP測定。將候選拮抗劑針對CYP2J2與該相同拮抗劑針對另一CYP蛋白(如CYP3A4)的抑制活性進(jìn)行比較，由此提供關(guān)于候選拮抗劑的選擇性的信息。

在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選的選擇性CYP2J2拮抗劑選自本文新公開的CYP2J2拮抗劑：雌二醇、鹽酸酚芐明、氯雷他定、丙酸氯倍他索、多沙唑嗪甲磺酸鹽、非諾貝特、左炔諾孕酮、阿立哌唑、哈西奈德、替米沙坦、氯苯吩嗪、左旋甲狀腺素鈉、阿洛司瓊鹽酸鹽、醋酸氟輕松、碘塞羅寧鈉、美克洛嗪二鹽酸鹽和特非那定以及它們的衍生物。

在本文描述的發(fā)明的背景下，所述待治療的疼痛優(yōu)選神經(jīng)病理性疼痛(包括與糖尿病性神經(jīng)病變相關(guān)的疼痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、HIV/AIDS誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛、創(chuàng)傷性損傷、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、紅斑性肢痛和幻覺痛)、混合傷害性和/或神經(jīng)病理性混合病因產(chǎn)生的疼痛(例如，癌癥)、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、腰痛、炎性痛覺過敏、外陰前庭炎或外陰疼痛、竇息肉間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱或膀胱過動癥、前列腺增生、鼻炎、手術(shù)、創(chuàng)傷、直腸過敏、灼口綜合癥、口腔黏膜炎、皰疹(或其它病毒感染)、前列腺肥大、皮炎、瘙癢、癢、耳鳴、牛皮癬、疣、癌癥、頭疼、以及皺紋、由于中風(fēng)或塊狀病變、脊髓損傷、或多發(fā)性硬化導(dǎo)致的中樞疼痛。但是，最優(yōu)選的實(shí)施方案涉及化療誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病理性疼痛(CIPNP)。

本發(fā)明在此提供了疼痛療法，其包括抑制尤其是CYP2J2的活性，而CYP2J2產(chǎn)生代謝化合物9,10-EpOME—根據(jù)本發(fā)明，該化合物為離子通道介導(dǎo)的疼痛感覺的敏化劑。令人驚訝地，根據(jù)本發(fā)明，對CYP2J2的抑制證實(shí)在體內(nèi)是有效的，緩解了在小鼠模型中通過紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，表明了CYP2J2拮抗劑作為針對神經(jīng)病理性疼痛尤其是CIPNP的止痛劑的用途。

本發(fā)明的一個(gè)另外實(shí)施方案涉及以上提到的疼痛的預(yù)防或治療，其包括給患有所述疼痛的受試者施用本發(fā)明的所述CYP拮抗劑，其中所述受試者接受了、正接受或?qū)⒔邮芑?。因此，該受試者在?yōu)選的實(shí)施方案中為患有或診斷為具有癌癥疾病的受試者。

在本發(fā)明上下文中，化療優(yōu)選包括向有需要治療的受試者施用化療劑，該化療劑選自基于嘧啶酮的抗腫瘤藥，例如阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶或鉑類藥物，例如順鉑，或紫杉烷類，例如紫杉醇、多西他賽或卡巴他賽，或者它們的衍生物。這些化療劑已知誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，尤其對于紫杉烷類是已知的，因此它們在本發(fā)明上下文中是優(yōu)選的。最優(yōu)選的是紫杉醇。

此外，根據(jù)本發(fā)明，所述疼痛的預(yù)防或治療包括同時(shí)或順序施用所述CYP拮抗劑和所述化療劑。對于這個(gè)實(shí)施方案，還參見以下對本發(fā)明的組合的描述。

本發(fā)明的問題在另一方面是通過用于預(yù)防或治療受試者中的疼痛的9,10-環(huán)氧-12Z-十八碳烯酸(9,10-EpOME)拮抗劑來解決的。發(fā)現(xiàn)9.10-EpOME是通過CYP活性而產(chǎn)生的。因此，代替拮抗CYP，本發(fā)明的結(jié)果可以通過直接拮抗9,10-EpOME以避免敏化介導(dǎo)疼痛的神經(jīng)元而以另外方式實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的這些9,10-EpOME拮抗劑優(yōu)選為小分子(但也可為蛋白或肽(例如，抗體或其片段))，其結(jié)合9,10-EpOME并抑制對TRPV1的敏化。

就此而言，以上描述的CYP拮抗劑的用途的具體實(shí)施方案也適用于本發(fā)明的9,10-EpOME拮抗劑，特別是涉及所述預(yù)防或治療以及化療的實(shí)施方案。

該問題又通過一組合來實(shí)現(xiàn)，該組合包括(i)CYP拮抗劑或9,10-EpOME拮抗劑以及(ii)用于在預(yù)防或治療疾病中同時(shí)或順序使用的化療劑，其中該疾病選自增生性病癥，例如癌癥，或疼痛，例如CIPNP。

在本文中，術(shù)語“增生性病癥”在廣義上包括任何需要控制細(xì)胞周期的病癥，例如心血管病癥如再狹窄和心肌病，自身免疫病癥如腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，皮膚病癥如牛皮癬，抗炎、抗真菌、抗寄生物病癥如瘧疾、肺氣腫和脫發(fā)。在這些病癥中，本發(fā)明的化合物可以根據(jù)需要在期望的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或保持停滯。優(yōu)選地，該增生性病癥為癌癥或白血病，最優(yōu)選乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮癌、肉瘤或淋巴瘤。

本實(shí)施方案還涉及治療患有疼痛的受試者組，其中受試者在接受化療劑治療。因此，本發(fā)明的CYP拮抗劑可以在癌癥治療的同時(shí)期施用，或者在之前或之后進(jìn)行，這可為優(yōu)選的，以避免累積的不良反應(yīng)。當(dāng)本發(fā)明的CYP拮抗劑的生理效應(yīng)和化療劑的疼痛誘導(dǎo)在有需要這種治療的受試者中組合時(shí)，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的結(jié)果。在治療期間的最后一劑藥物給藥后，該藥物誘導(dǎo)的生理效應(yīng)將不會立即消失，而最可能是之后消失。因此，在順序的治療周期中使用本發(fā)明的拮抗劑，例如本發(fā)明的拮抗劑不是同時(shí)而是在化療之前給藥，則仍在患者內(nèi)導(dǎo)致兩種化合物的臨床效果的組合，因此落入本發(fā)明的組合治療的含義內(nèi)。

術(shù)語“組合”在本上下文中指制劑中的兩種或更多種活性物質(zhì)的活性物質(zhì)組合，也指治療性處理中彼此以特定間隔施用的活性物質(zhì)各個(gè)制劑意義上的組合。因此，術(shù)語“組合”應(yīng)包括兩種或多種治療上有效的化合物的共給藥，如在本發(fā)明上下文中所描述的。

共施用：在本申請上下文中，兩種或更多種化合物的共施用定義為在一年內(nèi)給患者施用兩種或更多種化合物，包括分開施用兩種或更多種藥物(每種含有化合物的一種)，以及同時(shí)施用，無論兩種或更多個(gè)化合物是組合在一種制劑中，還是它們處于兩種或更多種分開的制劑中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合包括(i)和(ii)，通過在所述預(yù)防或治療期間給受試者順序或同時(shí)施用來組合，優(yōu)選其中拮抗劑和化療劑在所述預(yù)防或治療期間同時(shí)施用。

化療劑優(yōu)選選自基于嘧啶酮的抗腫瘤藥，例如阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶，或鉑劑，例如順鉑，或紫杉烷類，例如紫杉醇或多西他賽，或它們的衍生物。最優(yōu)選的化療劑為紫杉醇或多西他賽。

本文描述的發(fā)明的拮抗劑優(yōu)選選自由抑制性RNA、抑制性抗體或其片段、和/或小分子組成的化合物組。下文提供了對優(yōu)選的CYP拮抗劑的詳細(xì)描述。

在本發(fā)明上下文中，還優(yōu)選給所述受試者施用至少一種另外的對疼痛有效的治療劑，例如嗎啡、阿片類或非阿片類鎮(zhèn)痛劑或其它鎮(zhèn)痛劑。

在本發(fā)明的另一方面，提供了在受試者中預(yù)防或治療疼痛的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的本發(fā)明的CYP拮抗劑或9,10-EpOME拮抗劑的步驟。該CYP拮抗劑優(yōu)選選自CYP1A、CYP2B、CYP2C、CYP2E和CYP2J拮抗劑。該CYP2J拮抗劑優(yōu)選為CYP2J2的哺乳動物同源物的拮抗劑(CYP2J2拮抗劑)，優(yōu)選人CYP2J2的拮抗劑，例如特非那定、替米沙坦、以及它們的生物類似物或衍生物。

其它優(yōu)選的CYP拮抗劑選自雌二醇、鹽酸酚芐明、氯雷他定、丙酸氯倍他索、多沙唑嗪甲磺酸鹽、非諾貝特、左炔諾孕酮、阿立哌唑、哈西奈德、替米沙坦、氯苯吩嗪、左旋甲狀腺素鈉、阿洛司瓊鹽酸鹽、醋酸氟輕松、碘塞羅寧鈉、美克洛嗪二鹽酸鹽和特非那定。

在前述方法背景下可治療的疾病在上文中有描述。

在治療或預(yù)防期間，優(yōu)選給所述患者施用至少一種另外的對疼痛有效的治療劑，例如其它的鎮(zhèn)痛劑，例如阿片類或非阿片類鎮(zhèn)痛劑。

接著，本發(fā)明的另外方面涉及增加受試者中瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)的敏感度的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的9,10-EpOME或CYP2J2激動劑。

在本發(fā)明背景下，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)9,10-EpOME敏化TRPV1通道蛋白，而其為疼痛感覺的主要介質(zhì)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方中，本發(fā)明提供了作為TRPV1激動劑的9,10-EpOME，這在醫(yī)藥中是尤其有用的。9,10-EpOME和TRPV1激動劑辣椒素的組合顯著增強(qiáng)辣椒素活性。一個(gè)實(shí)施方案例如涉及治療以病理性抑制的疼痛感覺或以疼痛不敏感為特征的疾病。

在另一實(shí)施方案中，9,10-EpOME可以用在增強(qiáng)TRPV1激動劑如辣椒素的活性的方法中。辣椒素作為鎮(zhèn)痛劑用在局部軟膏、鼻噴劑、以及皮膚貼劑中以緩解疼痛。其可以以乳膏形式應(yīng)用，用于暫時(shí)緩解肌肉和關(guān)節(jié)炎受累關(guān)節(jié)的小痛和疼痛、背痛、拉傷和扭傷，通常在具有其他發(fā)紅劑的化合物中。其還用于減輕外周神經(jīng)病變的癥狀，例如由帶狀皰疹引起的帶狀皰疹后神神經(jīng)痛。

辣椒素的鎮(zhèn)痛和/或抗炎效果的發(fā)生機(jī)制通過模擬燒灼感覺而得到支持；通過鈣內(nèi)流壓倒神經(jīng)，導(dǎo)致傷害感受器脫敏和/或凋亡，并由此使得神經(jīng)在增長的時(shí)間段內(nèi)不能報(bào)告疼痛。長期暴露于辣椒素下，神經(jīng)元的傷害感受器經(jīng)歷凋亡，導(dǎo)致疼痛感覺減弱并阻斷神經(jīng)源性炎癥。如果去除了辣椒素，則傷害感受性神經(jīng)元隨時(shí)間逐漸恢復(fù)。因此，本發(fā)明的9,10-EpOME的使用可以大大增強(qiáng)辣椒素和相關(guān)化合物的醫(yī)療效果，或者可以幫助減少辣椒素劑量。

因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了在受試者中治療疾病的方法，包括施用治療有效量的(i)9,10-EpOME或CYP2J2激動劑和(ii)TRPV1激動劑。至于順序或同時(shí)使用治療劑，可參照上文的說明，它們一樣地應(yīng)用于本發(fā)明的這個(gè)方面。

疾病優(yōu)選選自神經(jīng)病理性疼痛(包括與糖尿病性神經(jīng)病變、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、HIV/AIDS、創(chuàng)傷性損傷、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、紅斑性肢痛和幻覺痛相關(guān)的疼痛)、混合傷害性和/或神經(jīng)病理性混合病因產(chǎn)生的疼痛(例如，癌癥)、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、腰痛、炎性痛覺過敏、外陰前庭炎或外陰疼痛、竇息肉間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱或膀胱過動癥、前列腺增生、鼻炎、手術(shù)、創(chuàng)傷、直腸過敏、灼口綜合癥、口腔黏膜炎、皰疹(或其它病毒感染)、前列腺肥大、皮炎、瘙癢、癢、耳鳴、牛皮癬、疣、癌癥、頭疼、以及皺紋。通常，包括任何可通過TRPV1激動劑治療的疾病。

本發(fā)明的示例性和優(yōu)選的TRPV1激動劑選自辣椒素、胡椒堿、6-姜酚、6-姜烯酚、α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、δ-山椒素、羥基α-山椒素以及羥基β-山椒素。

于是，另一方面涉及9,10-EpOME或CYP2J2激動劑在上述方法中的應(yīng)用。

再一方面涉及(i)9,10-EpOME或CYP2J2激動劑和(ii)TRPV1激動劑的組合在醫(yī)藥中的應(yīng)用，優(yōu)選在治療選自神經(jīng)病理性疼痛(包括與糖尿病性神經(jīng)病變、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、HIV/AIDS、創(chuàng)傷性損傷、復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、紅斑性肢痛和幻覺痛相關(guān)的疼痛)、混合傷害性和/或神經(jīng)病理性混合病因產(chǎn)生的疼痛(例如，癌癥)、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、腰痛、炎性痛覺過敏、外陰前庭炎或外陰疼痛、竇息肉間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱或膀胱過動癥、前列腺增生、鼻炎、手術(shù)、創(chuàng)傷、直腸過敏、灼口綜合癥、口腔黏膜炎、皰疹(或其它病毒感染)、前列腺肥大、皮炎、瘙癢、癢、耳鳴、牛皮癬、疣、癌癥(特別是皮膚癌)、頭疼、以及皺紋的疾病中的應(yīng)用。

該TRPV1激動劑優(yōu)選選自辣椒素、胡椒堿、6-姜酚、6-姜烯酚、α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、δ-山椒素、羥基α-山椒素以及羥基β-山椒素。

根據(jù)本文描述的發(fā)明，受試者優(yōu)選哺乳動物，優(yōu)選人，最優(yōu)選接受化療治療的人，例如癌癥患者。

CYP-拮抗劑

在本發(fā)明上下文中，“CYP拮抗劑”優(yōu)選選自CYP1A、CYP2B、CYP2C、CYP2E、以及更優(yōu)選的CYP2J拮抗劑。最優(yōu)選地，該CYP拮抗劑為CYP2J2的哺乳動物同源物的拮抗劑(CYP2J2拮抗劑)，優(yōu)選人CYP2J2的拮抗劑。因此，在本文描述的發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方案以及方面中，術(shù)語“CYP拮抗劑”為CYP2J2拮抗劑或人CYP2J2的哺乳動物同源物的拮抗劑。

在本文中，術(shù)語“CYP拮抗劑”指引起CYP表達(dá)或活性的量或速率降低的物質(zhì)。這種物質(zhì)可直接例如通過結(jié)合CYP和降低CYP表達(dá)或活性的量或速率來起作用。CYP拮抗劑還可降低CYP表達(dá)或活性的量或速率，例如通過結(jié)合CYP以使得減弱或防止CYP與CYP受體的相互作用；通過結(jié)合并修飾CYP，例如通過去除或添加一部分；以及通過結(jié)合CYP并降低其穩(wěn)定性。CYP拮抗劑也可間接地起作用，例如通過結(jié)合調(diào)節(jié)分子或基因區(qū)域以調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白或基因區(qū)域功能，并引起CYP表達(dá)或活性的量或速率的降低。因此，CYP拮抗劑可通過任何導(dǎo)致CYP表達(dá)或活性的量或速率的降低的機(jī)制起作用。

CYP拮抗劑可例如為天然或非天然存在的大分子，例如多肽、肽、肽模擬物、核酸、碳水化合物或脂質(zhì)。CYP拮抗劑還可為抗體、或其抗原結(jié)合片段，例如單克隆抗體、人源化或人抗體、嵌合抗體、微抗體、雙功能抗體、單鏈抗體(scFv)、可變區(qū)片段(Fv或Fd)、Fab或F(ab)2。CYP拮抗劑還可為特異于CYP的多克隆抗體。CYP拮抗劑還可為天然存在的大分子的部分或完全合成的衍生物、類似物或模擬物，或小有機(jī)或無機(jī)分子。

作為抗體的CYP拮抗劑可例如為結(jié)合CYP并抑制與CYP受體結(jié)合的抗體，或者改變調(diào)節(jié)CYP表達(dá)或活性的分子的活性以使CYP表達(dá)或活性的量或速率降低的抗體。用在本發(fā)明方法中的抗體可為天然存在的抗體，包括單克隆或多克隆抗體或其片段，或者非天然存在的抗體，包括但不限于，單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能抗體、互補(bǔ)決定區(qū)移植(CDR移植)抗體和人源化抗體或它們的抗原結(jié)合片段。

作為核酸的CYP拮抗劑可例如為反義核苷酸序列、RNA分子、或適體序列。反義核酸序列可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的核苷酸序列并調(diào)控CYP的表達(dá)水平，或者調(diào)控另一控制CYP的表達(dá)或活性的基因的表達(dá)。類似地，諸如催化性核酶的RNA分子可結(jié)合并改變CYP基因或控制CYP的表達(dá)或活性的其它基因的表達(dá)。適體為具有能夠結(jié)合分子靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)的核酸序列。

作為核酸的CYP-拮抗劑還可為用在RNA干擾方法中的雙鏈RNA分子。RNA干擾(RNAi)為通過轉(zhuǎn)錄后RNA降解進(jìn)行的序列特異性基因沉默過程，其由在序列上與所沉默的基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)起始。適用于RNAi的雙鏈RNA含有對應(yīng)待靶向基因的約21個(gè)連續(xù)氨基酸的正義和反義鏈，它們形成19個(gè)RNA堿基對，在每個(gè)3'末端留下兩個(gè)核苷酸的突出端(Elbashir等,Nature 411:494-498(2001)；Bass,Nature 411:428-429(2001)；Zamore,Nat.Struct.Biol.8:746-750(2001))。約25至30個(gè)核苷酸的dsRNA也已成功的用于RNAi(Karabinos等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:7863-7868(2001)。dsRNA可在體外合成，并通過本領(lǐng)域的已知方法導(dǎo)入細(xì)胞。

優(yōu)選的CYP2J2拮抗劑選自雌二醇、鹽酸酚芐明、氯雷他定、丙酸氯倍他索、多沙唑嗪甲磺酸鹽、非諾貝特、左炔諾孕酮、阿立哌唑、哈西奈德、替米沙坦、氯苯吩嗪、左旋甲狀腺素鈉、阿洛司瓊鹽酸鹽、醋酸氟輕松、碘塞羅寧鈉、美克洛嗪二鹽酸鹽和特非那定。

治療或預(yù)防疼痛或其它神經(jīng)病癥的組合物和試劑盒。

本申請的另一方面涉及通過采用本發(fā)明的化合物或組合來治療或預(yù)防疼痛或增生性病癥的組合物和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包括上文描述的化合物，其中所述化合物優(yōu)選選自抗體、抗體片段、短干擾RNA(siRNA)、適體、合成抗體(synbody)、結(jié)合劑、肽、適體-siRNA嵌合體、單鏈反義寡核苷酸、三鏈體形成寡核苷酸、核酶、外在引導(dǎo)序列、試劑編碼表達(dá)載體(agent-encoding expression vector)、小分子以及藥學(xué)上可接受的載體。

在本文中，用語“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括與藥物施用相符的任何和所有的溶劑、增溶劑、填充劑、穩(wěn)定劑、粘結(jié)劑、吸附劑、堿、緩沖劑、潤滑劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌或抗真菌劑、等張和吸收延緩劑，等等。將這些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)上有活性的物質(zhì)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。除了任何常規(guī)媒介物或試劑與該活性化合物不相容之外，考慮將其用在該組合物中。補(bǔ)充劑也可摻入到該組合物中。在某些實(shí)施方案中，該藥學(xué)上可接受的載體包括血清白蛋白。

本發(fā)明的藥物組合物配制為與其預(yù)期的施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括胃腸外施用，例如鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下施用，口服，透皮(局部)和跨粘膜施用。

用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可包括以下組分：無菌稀釋劑如注射用水，鹽水溶液，不揮發(fā)油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖?？捎盟峄驂A調(diào)節(jié)pH，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外配制物可封在安瓿瓶、一次性注射器或多重劑量小瓶中，它們由玻璃或塑料制成。

適合于可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(當(dāng)水溶時(shí))或混懸液以及用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或混懸液的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、商品名為Cremophor EL^TM的物質(zhì)(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。所有情況下，可注射組合物應(yīng)為無菌的，并且應(yīng)為流體，其程度為易于注射。其在生產(chǎn)和保存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須對微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用防腐。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液體聚乙二醇，等)、或它們的適當(dāng)混合物。例如通過使用諸如卵磷脂的涂層、對于混懸液的情況通過維持所需的粒徑以及通過使用表面活性劑可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。預(yù)防微生物作用可通過各種抗菌和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞，等。很多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等張劑，例如，蔗糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長時(shí)間吸收可通過在組合物中包括進(jìn)延緩吸收的試劑來實(shí)現(xiàn)，例如單硬脂酸鋁和明膠。

可通過將活性化合物(例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)以所需量與以上列出的成分的一種或組合摻入適合的溶劑中，然后無菌過濾(需要的話)，來制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的來自以上列出成分的其它成分的無菌載體中來制備分散體。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分加上任何額外所需成分(來自其之前無菌過濾的溶液)的粉末。

口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可包封在明膠膠囊中或壓縮為片劑。出于口服治療施用的目的，活性化合物可與賦形劑一起摻混，并以片劑、含片、或膠囊的形式使用?？诜M合物還可采用流體載體來制備，以用作漱口水，其中流體載體中的化合物口服施用，在口中來回，并且吐出或咽下。藥學(xué)上相容的粘合劑和/或佐劑材料可作為組合的一部分包括進(jìn)來。片劑、小丸、膠囊、含片等可含有以下成分或類似性質(zhì)化合物的任何一種：粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如褐藻酸、羥基乙酸淀粉鈉(Primogel)、或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或斯泰特(Stertes)；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯、或橙香精。

對于通過吸入施用，化合物是以氣溶膠噴霧的形式從含有適合的推進(jìn)劑(例如，諸如二氧化碳的氣體)的壓力容器或分配器或噴霧器遞送。

全身施用也可通過跨粘膜或透皮手段進(jìn)行。對于跨粘膜或透皮施用，將適合于待滲透屏障的滲透劑用在制劑中。這些滲透劑通常在本領(lǐng)域是已知的，包括例如用于跨粘膜施用的洗滌劑、膽汁鹽、以及梭鏈孢酸衍生物?？缯衬な┯每赏ㄟ^使用鼻噴劑或者栓劑來完成。對于透皮施用，藥物組合物配制為軟膏、藥膏、凝膠、或乳膏，如本領(lǐng)域所公知的。

在某些實(shí)施方案中，藥物組合物配制為活性成分的持續(xù)或控制釋放?？墒褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制備這些制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些材料也可在商業(yè)上從例如從阿爾扎(Alza Corporation)和諾華制藥公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)獲得。脂質(zhì)體混懸液(包括帶有針對病毒抗原的單克隆抗體的靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備。

特別有利的是,配制單位劑量形式的口服或胃腸外組合物，以方便施用和劑量一致性。單位劑量形式用在本文時(shí)包括物理上分開的單位，適合作為單一劑量用于待治療的受試者；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算與所需的藥物載體聯(lián)合會產(chǎn)生期望的治療效果。本發(fā)明單位劑量形式的規(guī)格取決于并直接依賴于活性化合物的獨(dú)特特征和待獲得的具體治療效果，以及本領(lǐng)域中配制這種用于個(gè)體治療的活性化合物的內(nèi)在限制。

這些化合物的毒性和治療功效可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序在細(xì)胞培養(yǎng)或試驗(yàn)動物中確定，例如用于確定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體治療上有效的劑量)。毒性和治療效果的劑量比例為治療指數(shù)，其可表示為比例LD50/ED50。顯示出大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可以使用顯示出毒性副作用的化合物，但應(yīng)考慮設(shè)計(jì)將這些化合物靶向受累組織位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)，以便對非感染細(xì)胞的潛在損傷降至最小，并由此減小副作用。

從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用在制定用于人的劑量范圍中。這些化合物的劑量優(yōu)選處于包括具有微小毒性或沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)隨采用的劑型和使用的施用途徑而變化。對于用在本發(fā)明方法中的任何化合物，治療有效劑量可從細(xì)胞培養(yǎng)測定初步估計(jì)?？稍趧游锬Ｐ椭兄贫ǐ@得包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50(即，實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的測試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量。這種信息可用于更精確地確定人類可用劑量。藥物組合物可連同施用說明書包括在容器、包裝盒、或分散器中。

現(xiàn)在將參照附圖和序列在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，然而并不限于此。出于本發(fā)明的目的，本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用將它們的全文并入。在附圖中：

圖1：紫杉醇CIPNP或炎癥期間氧化的亞油酸代謝物的濃度。所顯示的為C57B16/N小鼠i.p.注射載體(黑色)或紫杉醇(灰色，6mg·kg-1)24h后，坐骨神經(jīng)、DRG和脊髓背角中9,10-EpOME(a)和12,13-EpOME(b)的濃度；n.d.：未檢測到。C57B16/N小鼠i.p.注射載體(黑色)或紫杉醇(灰色)24h后，坐骨神經(jīng)、L4-L6-DRGs和對應(yīng)的脊髓背角節(jié)段中9-HODE(c)和13-HODE(d)的濃度。(e)足底內(nèi)注射酵母聚糖(12.5mg/ml,20μl)24h后，L4-L6-DRGs和背角的相應(yīng)節(jié)段中的9,10-EpOME濃度關(guān)系。數(shù)據(jù)表示每組8至10只動物的均值±SEM；***p<0.001，學(xué)生t檢驗(yàn)。

圖2：9,10-EpOME對DRG神經(jīng)元的直接作用。9,10-EpOME[10μM,30s]的應(yīng)用在DRG神經(jīng)元上引起鈣瞬變，其應(yīng)答于高鉀(50mM KCl,30s)。顯示了代表性描記線。(b)DRG神經(jīng)元中9,10-EpOME依賴的鈣相對于應(yīng)答神經(jīng)元數(shù)量增加的劑量反應(yīng)關(guān)系。數(shù)據(jù)表示每個(gè)濃度5次測量的均值±SEM。(c)和(d)在9,10-EpOME刺激前和后2分鐘采用含有EGTA(2mM)的無鈣培養(yǎng)基洗入，可阻斷9,10-EpOME[10μM,30s]引起的鈣瞬變。數(shù)據(jù)表示24個(gè)(無鈣)或16個(gè)(對照)神經(jīng)元的均值±SEM。(e)和(f)9,10-EpOME[10μM,30s]的鈣瞬變可被選擇性TRPV1拮抗劑(AMG 9810,1μM)而不是選擇性TRPA1拮抗劑(HC-030031,20μM)阻斷，這些阻斷劑在第二次9,10-EpOME刺激前2分鐘洗入。數(shù)據(jù)表示16個(gè)(對照)、31個(gè)(AMG 9810)或18個(gè)(HC-030031)神經(jīng)元的均值±SEM；**p<0.01，學(xué)生t檢驗(yàn)。

圖3：9,10-EpOME在DRG神經(jīng)元中劑量依賴性敏化TRPV1，并在脊髓薄片的第二層神經(jīng)元中增強(qiáng)辣椒素誘導(dǎo)的自發(fā)性EPSC頻率的增加。(a)用辣椒素雙刺激DRG神經(jīng)元(200nM,每次15s)，并在第二次辣椒素刺激前用載體或9,10-EpOME[1μM]溫浴2分鐘。(b)采用與(a)中描述相同的規(guī)程，第一次和第二次辣椒素應(yīng)答之間比率的劑量依賴性差異。數(shù)據(jù)表示以下數(shù)量神經(jīng)元的均值±SEM：27個(gè)(對照)、26個(gè)(250nM 9,10-EpOME)、21個(gè)(500nM 9,10-EpOME)、19個(gè)(750nM 9,10-EpOME)、41個(gè)(1μM 9,10-EpOME)、18個(gè)(2μM 9,10-EpOME)、或28個(gè)(采用50μM AITC 20s代替辣椒素)；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001學(xué)生t檢驗(yàn)。(c)自發(fā)性EPSC(sEPSC)在第二層神經(jīng)元中的描記線。下方插圖，1、2、3和4為放大的，分別表示對基線、第一辣椒素(1mM)、9,10-EpOME(1mM)、以及第二辣椒素(1mM)加9,10-EpOME的記錄。(d)sEPSC的頻率。與基線sEPSC相比，辣椒素誘導(dǎo)了sEPSC頻率的深入增加(從6.9±0.4Hz和13.7±0.4Hz)。單獨(dú)的9,10-EpOME治療稍稍增加sEPSC頻率(8.2±0.8Hz)，并由辣椒素顯著增強(qiáng)了該sEPSC頻率增加(18.7±1.1Hz)。*P<0.05,與無治療基線相比；#P<0.05，與第一次辣椒素治療(1mM)相比。n＝5個(gè)神經(jīng)元/組。(E)sEPSC的幅度。辣椒素和9,10-EpOME對sEPSC幅度沒有顯著影響。n＝5個(gè)神經(jīng)元/組。

圖4：9,10-EpOME在DRG神經(jīng)元中對TRPV1的敏化由Gs偶聯(lián)受體和cAMP-PKA途徑所介導(dǎo)。(a)9,10-EpOME在大鼠DRGs中膜碎片中催化[y-35S]-GTP結(jié)合。在30μM GDP和載體(乙酸甲酯，0.7％(v/v))、腺苷[10μM]或9,10-EpOME[1μM]存在30分鐘下，采用大鼠DRGs的膜碎片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從來自總共15只動物的膜碎片的3次測量獲得數(shù)據(jù)。對于每次測量，將來自5只動物的DRG合并；*p<0.05,**p<0.01,使用唐恩(Dunn’s)多重比較事后檢驗(yàn)的克魯斯卡-沃利斯(Kruskal-Wallis)檢驗(yàn)。(b)在9,10-EpOME、西卡前列素或毛喉素(每種1μM)刺激15分鐘后富含神經(jīng)元的DRG培養(yǎng)物中的cAMP濃度。數(shù)據(jù)表示來自5只小鼠的DRG培養(yǎng)物的均值±SEM。(c)和(d)9,10-EpOME[1μM]對TRPV1的敏化可通過以PKA抑制劑(H89-二鹽酸鹽，10μM，1h)預(yù)溫浴而減弱。數(shù)據(jù)表示15個(gè)(載體)、19個(gè)(EpOME)或33個(gè)神經(jīng)元(EpOME和H89預(yù)溫浴)的均值±SEM。(e)和(f)9,10-EpOME[1μM]對TRPV1的敏化不受PKC抑制劑預(yù)溫浴(GF 109203X,10μM，1h)的影響。數(shù)據(jù)表示18個(gè)(載體)、23個(gè)(EpOME)或39個(gè)神經(jīng)元(EpOME和GFX預(yù)溫浴)的均值±SEM；*p<0.05,**p<0.01學(xué)生t檢驗(yàn)；n.s.非顯著的。

圖5：足底內(nèi)或鞘內(nèi)注射9,10-EpOME減弱了野生型小鼠中的疼痛閾值并敏化辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械閾值。(a)和(b)C57B1/6N小鼠接受足底內(nèi)注射9,10-EpOME(10μM)或載體(DMSO鹽水溶液，0.3％(v/v))。在注射后5h監(jiān)測熱(a)或機(jī)械(b)閾值。數(shù)據(jù)表示來自8只小鼠的均值±SEM。(c)和(d)野生型BL/6N小鼠鞘內(nèi)注射9,10-EpOME(10μM)或載體(DMSO鹽水溶液，0.3％(v/v))。在注射后監(jiān)測熱(c)或機(jī)械(d)閾值2h(熱)或3h(機(jī)械)，第一小時(shí)間隔15分鐘，第二小時(shí)間隔30分鐘。數(shù)據(jù)表示來自8只小鼠的均值±SEM。圖中未包括。

圖6：分離的坐骨神經(jīng)或富含神經(jīng)元的DRG培養(yǎng)物在9,10-EpOME刺激后釋放iCGRP。(a)從野生型BL/6N小鼠的分離的坐骨神經(jīng)釋放iCGRP，用以下溶液刺激，每種5分鐘：合成腸液(SIF)、SIF+EpOME(1μM)或載體(DMSO 0.03％(v/v))、SIF+EpOME(或載體)+辣椒素(500nM),SIF。數(shù)據(jù)表示來自6個(gè)單獨(dú)坐骨神經(jīng)的均值±SEM。在PBS、9,10-EpOME、辣椒素或9,10-EpOME+辣椒素刺激15分鐘后富含神經(jīng)元的DRG培養(yǎng)物的iCGRP釋放；a:9,10-EpOME 1μM,b:辣椒素400nM,c:9,10-EpOME 2.5μM。數(shù)據(jù)表示來自6只小鼠的DRG培養(yǎng)物的均值±SEM；#,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001學(xué)生t檢驗(yàn)。虛線表示測定靈敏度。

圖7：在紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中CYP2J6上調(diào)。(a)野生型C57Bl/6N小鼠在注射紫杉醇(6mg·kg-1i.p.)后的機(jī)械閾值時(shí)程。bl：基線，數(shù)據(jù)表示每組10只小鼠的均值±SEM。8天后，切下坐骨神經(jīng)、DRG和脊髓背角。(b)紫杉醇注射(6mg·kg-1i.p.)后8天時(shí)鼠科CYP表氧化酶轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示來自每組4只小鼠的DRG的均值±SEM；*p<0.05,**p<0.01，學(xué)生t檢驗(yàn)。(c)在C57B16/N小鼠中i.p.注射載體(黑色)或紫杉醇(灰色，6mg·kg-1)后8天時(shí)坐骨神經(jīng)、DRG、和脊髓背角中9,10-EpOME的濃度；**p<0.01,學(xué)生t檢驗(yàn)。(d)通過LC-MS/MS分析揭示的，在紫杉醇治療后8至9天，鼠科DRG中類二十烷酸和亞油酸代謝物合成的方案。結(jié)構(gòu)從網(wǎng)站(lipidmaps.org)獲得。

圖8：特非那定對CYP2J6的抑制在體內(nèi)減小了脂濃度并緩解了紫杉醇誘導(dǎo)的CIPNP。(a)在紫杉醇(6mg·kg-1i.p.和1mg·kg-1特非那定(灰色)或載體(2％DMSO v/v,黑色))治療后8天時(shí)坐骨神經(jīng)、DRG和脊髓背角中通過LC-MS/MS測定的9,10-EpOME的水平，顯示為對照的百分比。數(shù)據(jù)表示來自每組5只小鼠的DRG的均值±SEM；*p<0.05,**p<0.01，學(xué)生t檢驗(yàn)。(b)在特非那定施用(1mg·kg-1)后，所有測量的環(huán)氧化脂類和二氫代謝物(9,10-EpOME、12,13-EpOME、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME和14,15-EET)在坐骨神經(jīng)、DRGs、脊髓背角和血漿中的剩余濃度。(c)經(jīng)紫杉醇治療8天(6mg·kg-1i.p.)并接受了特非那定(1或2mgkg-1)或載體(DMSO 2.5or 5％(v/v))靜脈內(nèi)注射的小鼠的機(jī)械閾值。在注射特非那定或載體后監(jiān)測機(jī)械閾值長至5h。數(shù)據(jù)表示每組8至9只小鼠的均值±SEM；#,*p<0.05，使用邦費(fèi)羅尼(Bonferroni)事后檢驗(yàn)的雙因素ANOVA(*1mg kg-1,#2mg kg-1特非那定)。(d)在紫杉醇注射后8天(6mg·kg--1i.p.)并接受了氯雷他定(1mg kg-1)或載體(DMSO 2.5or 2.5％(v/v))靜脈內(nèi)注射的小鼠的機(jī)械閾值。數(shù)據(jù)表示每組6至9只小鼠的均值±SEM。

圖9：計(jì)算的CYP2J2和CYP3A4的抑制值的相關(guān)性。位于左上象限的拮抗劑為CYP2J2選擇性的。根據(jù)制造商的規(guī)程進(jìn)行發(fā)光CYP2J2測定(https://www.promega.de/resources/pubhub/enotes/cytochrome-p450-2j2-enzyme-assay-using-a-novel-bioluminescent-probe-substrate/)。為了測試候選CY2J2拮抗劑的選擇性，采用了特異于CYP3A4的另外的發(fā)光CYP測定，并將候選CYP2J2拮抗劑的抑制活性與該相同拮抗劑對CYP3A4的抑制活性進(jìn)行比較。

SEQ ID NO:1至14：引物序列

實(shí)施例

材料與方法

動物

所有的動物實(shí)驗(yàn)都按照國立衛(wèi)生研究院的實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南中的建議進(jìn)行，并得到當(dāng)?shù)貏游镅芯總惱砦瘑T會(Darmstadt)的批準(zhǔn)，許可號碼F95/42。對于所有的行為實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人僅使用購自商業(yè)飼養(yǎng)公司(Charles River,Sulzfeld,Germany,Janvier,Le Geneset-Saint-Isle,FR)的6至12周齡的C57BL/6N小鼠。為了比較機(jī)械閾值，發(fā)明人采用了年齡和性別匹配的同窩小鼠作為對照。

前列腺素受體缺陷小鼠(DPI-/-、IP-/-、EP2-/-和EP4-/-)飼養(yǎng)在法蘭克福的臨床藥理學(xué)研究所(Institute of Clinical Pharmocology,Frankfurt)，如之前所描述的。

化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的紫杉醇模型

將紫杉醇溶解在1:1的聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)/乙醇中，并在鹽水中稀釋。腹膜內(nèi)注射的劑量設(shè)置為6mg/kg，如之前所描述的。

行為測試

為了確定機(jī)械性觸痛或熱超敏，將小鼠保持在升高的格子上的試驗(yàn)籠中至少2h，以讓它們適應(yīng)。采用動態(tài)足底觸覺計(jì)或商品名為Hargreaves的裝置(Ugo Basile,Comerio,VA,Italy)進(jìn)行基線測量，檢測機(jī)械刺激后后爪的收縮潛伏期。對于機(jī)械閾值的評估，將鋼桿推向后爪中部足底，壓力線性增加(10秒內(nèi)0-5g，增加0.5g/s)，直至出現(xiàn)快速的收縮反應(yīng)。不對爪的緩慢移動計(jì)數(shù)。以秒±0.1確定爪收縮潛伏期(PWL)，截止時(shí)間20s。非注射和注射爪輪流測量，間隔5至10min。為了確定熱閾值，將小鼠在第一天保持在升溫的玻璃板(32℃)上的試驗(yàn)籠中至少2h，以讓它們適應(yīng)。接著，用高強(qiáng)度投射燈構(gòu)成的輻射熱設(shè)備刺激爪的中部足底區(qū)域，直至發(fā)生收縮。非注射和注射爪輪流測量，間隔5至10min。對于所有的行為測試，研究者都不知小鼠的治療或基因型。

治療：對于外周注射，將20ul的9,10-EpOME[5μM](Cayman,Ann Arbor,MI,USA)皮下(s.c.)注射進(jìn)后爪的中部足底區(qū)域。對照動物接受相應(yīng)體積的DMSO(Sigma,Deisenhofen,Germany；鹽水中1.6％(v/v))。對于鞘內(nèi)注射，通過在清醒、有意識小鼠中直接腰椎穿刺來注射3.2％DMSO/鹽水(v/v)中的5ul 9,10-EpOME[10μM]。在尾靜脈中靜脈注射特非那定或氯雷他定(二者都來自Tocris,Bristol,UK)。

原發(fā)性背根神經(jīng)節(jié)(DRG)培養(yǎng)

將鼠科DRG從脊髓節(jié)段切下并直接轉(zhuǎn)移到含有CaC1₂和MgC1₂(Invitrogen,Carsbad,CA,USA)的冰冷HBSS中。接著，在37℃將分離的DRG在含有L-谷氨酰胺[2mM]青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、B-27和慶大霉素(50μg/ml)(都來自Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的神經(jīng)基的(neurobasal)培養(yǎng)基中與膠原酶/分散酶(500U/ml膠原酶；2.5U/ml分散酶)溫浴75min。在去除膠原酶/分散酶溶液后，用含有10％FCS的神經(jīng)基的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，并以0.05％胰蛋白酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)溫浴10min。重復(fù)清洗步驟，并用1ml吉爾森吸管將細(xì)胞機(jī)械解離。最終，將神經(jīng)元置于聚L-賴氨酸(Sigma,Deisenhofen,Germany)包被的蓋玻片上，并以含有L-谷氨酰胺[2mM]青霉素(100U/ml)鏈霉素(100μg/ml)、B-27和慶大霉素(50μg/ml)的神經(jīng)基的培養(yǎng)基溫浴過夜，直至通過鈣成像評估。

鈣成像實(shí)驗(yàn)

采用兩種不同的方案來進(jìn)行鈣成像實(shí)驗(yàn)。首先，發(fā)明人采用帶有10x蔡司(Achroplan)水浸物鏡(Zeiss)的阿克斯科普2(Axio scope 2)正置顯微鏡(Zeiss,Jena,Germany)。該顯微鏡配備有伊梅戈(Imago)CCD相機(jī)和多色I(xiàn)V(Polychrome IV)單色器(都來自TILL Photonics,Grafelfmg,Germany)。在兩個(gè)波長(340nm和380nm)每2秒獲得圖像，并采用提爾維森(Tillvision)軟件23處理。隨后，采用了萊卡(Leica)鈣成像方案，其由配備了DFC360FX(CCD-)相機(jī)、芙拉2(Fura-2)濾鏡和N-普蘭(N-Plan)10x/0.25Ph1物鏡的萊卡(Leica)DMI 4000b倒置顯微鏡(都來自Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)構(gòu)成。每2秒照相，并采用LAS AF軟件處理。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人選擇具有大量細(xì)胞的區(qū)域并同時(shí)監(jiān)測40-110個(gè)細(xì)胞。采用制備后24-48小時(shí)的DRG神經(jīng)元進(jìn)行鈣成像實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞加載5μM芙蘭2(fura-2)-AM酯和0.02％普朗尼克(Pluronic)F-127(二者來自Biotium,Hayward,CA)，并在37℃溫浴30至60min。然后，以外部溶液(以mM為單位，含有:NaCl[145]、CaCl₂[1.25]、MgCl₂[1]、KCl[5]、D-葡萄糖[10]、HEPES[10]；調(diào)整至pH 7.3)洗滌細(xì)胞。在外部溶液中以1至2ml/min的流速進(jìn)行基線測量。通過去除CaC1₂并添加EGTA[2mM]來產(chǎn)生無鈣溶液，通過將NaCl濃度增加至150mM來進(jìn)行滲透壓控制。將HC-030031(Sigma,Deisenho-fen,Germany)、AMG 9810,H89-二鹽酸鹽、8-溴-cAMP、GF 109203X(都來自Tocris,Bristol,UK)和NGF(Merck Millipore,Darmstadt,GE)的儲備液在外部溶液中稀釋至它們的最終濃度。

定量實(shí)時(shí)PCR

在指出的時(shí)間點(diǎn)從小鼠切下腰部DRG，并采用商品名為mirVana^TM的miRNA分離試劑盒(Ambion,life technologies,Carlsbad,CA,USA)提取RNA。采用商品名為的系統(tǒng)(lifetechnologies,Carlsbad,CA,USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR，并按之前所描述的用AAC(T)方法評估24，25。以下的寡核苷酸用于cDNA的擴(kuò)增：

表1：用于從鼠科組織進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR的引物序列，a＝MGH引物庫，ID:160948617c2。

通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)確定EET

樣品提取和標(biāo)準(zhǔn)品：按之前所描述的方式進(jìn)行樣品提取。簡言之，在甲醇中制備含有2500ng/ml所有分析物的儲備溶液。通過進(jìn)一步稀釋獲得工作標(biāo)準(zhǔn)品，對于EET、EpOME和DiHOME以及HODE濃度范圍為0.1-250ng/ml。通過液液萃取進(jìn)行樣品提取。因此，用600ul乙酸乙酯將組織或細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基萃取兩次。在柔和的氮?dú)饬飨?，?5℃的溫度去除合并的有機(jī)相。將殘留物以50ul的甲醇/水(50:50，v/v)重建，10,000xg離心2min，然后在注入LC-MS/MS系統(tǒng)前轉(zhuǎn)移到玻璃瓶(Macherey-Nagel,Duren,Germany)中。

測量環(huán)氧脂類和HODE的儀器：該LC-MS/MS系統(tǒng)由API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)構(gòu)成，配備有負(fù)ESI模式操作的圖伯-V-源(Turbo-V-source)、安捷倫1100(Agilent 1100)雙HPLC泵和脫氣器(Agilent,Waldbronn,Germany)以及帶有25ulLEAP注射器的HTC Pal自動加樣器(Chromtech,Idstein,Germany)。用于質(zhì)譜的高純度氮通過NGM 22-LC-MS氮發(fā)生器(cmc Instruments,Eschbom,Germany)產(chǎn)生。對于色譜分離，使用了基迷你(Gemini)NX C18柱和前置柱(150mm x 2mm i.d.,5μM粒徑和孔徑，來自Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)。采用線性梯度，流動相流速0.5ml/min，總運(yùn)行時(shí)間17.5分鐘。流動相A為水/氨(100:0.05,v/v)，B為乙腈/氨(100:0.05,v/v)。在12min內(nèi)，讓梯度從85％A開始，直至10％。保持10％A 1min。在0.5min內(nèi)，讓流動相移回85％A并保持3.5min以平衡色譜柱，用于下一樣品。樣品的注射體積為20ul。以分析軟件(Analyst Software)V 1.4.2(Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)采用內(nèi)標(biāo)法(同位素稀釋質(zhì)譜法)進(jìn)行定量。將分析物峰面積和內(nèi)標(biāo)面積的比例(y軸)對濃度(x軸)作圖，通過最小二乘回歸計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1/濃度2加權(quán)。

[35S]GTPγS結(jié)合測定

為了測量對預(yù)測的G蛋白偶聯(lián)受體的激活，采用1μM 9,10-EpOME(Cayman,Ann Arbor,MI,USA)和新制的[35S]GTPγS(1250Ci/mmol,Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)對成年大鼠的DRG的膜制備物進(jìn)行了GTPγS結(jié)合測定法。

iCGRP的測量

按之前的描述32，采用CGRP-酶免疫測定試劑盒(SpiBio,Bertin pharma,France)進(jìn)行CGRP測量。對于來自DRG培養(yǎng)物的CGRP測量，將野生型BL/6N小鼠的DRG切下并按上文所述處理，并在48孔板中培養(yǎng)過夜。

數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

所有的數(shù)據(jù)都表示均值±s.e.m。為了確定所有行為實(shí)驗(yàn)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，使用用于重復(fù)測量的方差分析(ANOVA)，接著采用商品名為GraphPad Prism的軟件進(jìn)行事后邦費(fèi)羅尼校正。對于僅兩組比較的體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行學(xué)生t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。

細(xì)胞色素P450熒光素酶測定

按照制造商的說明書進(jìn)行CYP2J2和CYP3A4Glo測定(P450-Glo^TM,Promega)。

CYP2J2測定規(guī)程：

-采用商品名為MultiDrop的產(chǎn)品來制備CYP2J2-酶(2nM)/熒光素-2J2/4F12底物(2μM)混合物，5μl/孔，

-采用商品名為Echo的產(chǎn)品添加50nl/孔的化合物(10μM終濃度)/DMSO(0.5％終濃度)

-在37℃溫浴30min

-采用商品名為MultiDrop的產(chǎn)品添加NADPH再生溶液，5μl/孔

-在37℃溫浴30min

-采用商品名為MultiDrop的產(chǎn)品添加LDR-酯酶溶液，10μl/孔

-在37°溫浴30min，在讀取物(EnSpire)上讀出發(fā)光值

CYP3A4測定規(guī)程：

-采用商品名為MultiDrop的產(chǎn)品制備CYP3A4-酶(2nM)/熒光素-IPA底物(7μM)混合物，5μl/孔，

-采用商品名為Echo的產(chǎn)品添加50μl/孔的化合物(10μM終濃度/DMSO(0.5％終濃度)

-在37℃溫浴30min，

-采用商品名為MultiDrop的產(chǎn)品添加NADPH再生溶液，5ul/孔

-在37℃溫浴30min，

-采用商品名為MultiDrop的產(chǎn)品添加LDR-酯酶溶液，10μl/孔

-在37°溫浴30min，并在讀取物(EnSpire)上讀出發(fā)光值。

實(shí)施例1：化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中的CYP衍生脂質(zhì)

為了研究CYP衍生脂質(zhì)是否可以在化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中起作用，發(fā)明人將紫杉醇或載體注射進(jìn)野生型BL/6N小鼠中，并在注射后24小時(shí)切下坐骨神經(jīng)、DRG和脊髓背角。采用LC-MS/MS確定脂質(zhì)濃度。發(fā)現(xiàn)是氧化的亞油酸代謝物9,10-EpOME的濃度(圖1A)，而不是其姊妹脂質(zhì)12,13-EpOME(圖1B)或他們的二氫代謝物9,10-和12,13-DiHOME(參見補(bǔ)充圖1)在DRG中強(qiáng)烈升高(圖1A)。還定量了9-和13-HODE的水平(圖1C，1D)，它們在炎性疼痛期間產(chǎn)生，為TRPV1的內(nèi)源性激活因子33。但是，發(fā)明人不能在紫杉醇處理后檢測到它們水平的任何差異。為了研究DRG中增加的9,10-EpOME濃度是否是紫杉醇處理特異性的，將酵母聚糖注射進(jìn)野生型BL/6N小鼠的后爪，以誘導(dǎo)炎性疼痛。在注射后24h炎癥高峰時(shí)，切下L4-L6-DRG和對應(yīng)的背角節(jié)段。通過LC-MS/MS的脂質(zhì)定量未揭示炎性疼痛期間9,10-EpOME水平的任何差異(圖1E)。

接著，發(fā)明人在鈣成像實(shí)驗(yàn)中就9,10-EpOME對DRG神經(jīng)元的影響進(jìn)行了表征。發(fā)明人觀察到，用10μM 9,10-EpOME短刺激30s在DRG神經(jīng)元中引起鈣瞬變(圖2A)。發(fā)明人進(jìn)行了劑量反應(yīng)分析以研究9,10-EpOME引發(fā)鈣瞬變的效力，發(fā)現(xiàn)最多10.3％的DRG神經(jīng)元應(yīng)答25μM的9,10-EpOME，對于更高濃度，應(yīng)答神經(jīng)元百分比沒有顯著增加(圖2B)。為了分析9,10-EpOME引起的鈣瞬變是由細(xì)胞內(nèi)鈣存儲的釋放還是由細(xì)胞外鈣的內(nèi)流所導(dǎo)致的，發(fā)明人使用了含有2mM EGTA的無鈣外部溶液，并用10μM 9,10-EpOME刺激DRG神經(jīng)元兩次，每次30s。在第二次刺激之前兩分鐘，洗入無鈣外部溶液，則神經(jīng)元不再應(yīng)答9,10-EpOME，由此表明9,10-EpOME導(dǎo)致外部鈣內(nèi)流(圖2C，2D)。用于神經(jīng)元的陽性對照為50mM KCl 30s的終刺激。

為了鑒定所涉及的離子通道，使用TRPV1(AMG 9810,1μM)和TRPA1(HC-030031,20μM)的選擇性拮抗劑，以便阻斷9,10-EpOME導(dǎo)致鈣內(nèi)流。用9,10-EpOME(10μM,30s)刺激DRG神經(jīng)元兩次，并在第二次9,10-EpOME刺激之前用TRP通道拮抗劑預(yù)溫浴細(xì)胞兩分鐘。發(fā)明人觀察到，是選擇性TRPV1拮抗劑AMG 9810，而不是TRPA1拮抗劑HC-030031可阻斷第二次9,10-EpOME引起的鈣瞬變，表明TRPV1為9,10-EpOME的靶向通道(圖2E，2F)。

實(shí)施例2：9,10-EpOME敏化TRPV1

然后，發(fā)明人分析了9,10-EpOME在較低的和更生理的濃度(1μM)下是否也能夠敏化TRPV1或TRPA1。由此，發(fā)明人用辣椒素刺激DRG神經(jīng)元兩次(200nM,15s)，并在第二次辣椒素刺激前用9,10-EpOME[1μM]或載體溫浴細(xì)胞兩分鐘，觀察到經(jīng)9,10-EpOME溫浴的DRG神經(jīng)元對辣椒素的顯著強(qiáng)烈的應(yīng)答，表明9,10-EpOME敏化TRPV1(圖3A)。為了研究9,10-EpOME依賴性TRPV1敏化的效力，采用250nM至2μM的9,10-EpOME濃度進(jìn)行了劑量反應(yīng)分析。觀察到與載體相比的第二次辣椒素應(yīng)答幅度的劑量依賴性增加。這種效應(yīng)看起來特異于TRPV1，因?yàn)榻婺┯鸵蕾嚨腡RPA1應(yīng)答不被9,10-EPOME[1μM]敏化(圖2B)。

為了用電生理手段確認(rèn)9,10-EpOME對TRPV1敏化的作用，發(fā)明人采用兩次辣椒素刺激[1μM]并在第二次辣椒素刺激之前用9,10-EpOME[1μM]溫浴細(xì)胞，測量了來自脊髓切片的流明II(lumina II)神經(jīng)元的sEPSC(圖3C)。單獨(dú)的9,10-EpOME處理稍稍增加sEPSC的頻率。但是，與辣椒素組合時(shí)，sEPSC頻率強(qiáng)烈增加(圖3D)。然而，無論是9,10-EpOME、TRPV1，還是兩種物質(zhì)的組合，都沒有觀察到sEPSC的幅度差異(圖3E)。

因?yàn)橐阎|(zhì)介導(dǎo)的TRPV1敏化大多數(shù)涉及到G蛋白偶聯(lián)受體的激活，發(fā)明人進(jìn)行了GTPγS測定，以分析9,10-EpOME是否能夠在DRG中激活GPCR，并在用1μM 9,10-EpOME溫浴后觀察到顯著增加的GTPγS信號(圖4A)。為了鑒定9,10-EpOME介導(dǎo)的TRPV1敏化的機(jī)制，發(fā)明人接著測量了經(jīng)載體、9,10-EpOME、IP受體激動劑西卡前列素或毛喉素[每種1μM]刺激15分鐘的富含神經(jīng)元的DRG培養(yǎng)物中的cAMP。有趣的是，發(fā)明人觀察到，與其載體相比，9,10-EpOME引起了cAMP濃度的顯著增加(圖4B)。這些結(jié)果表明了9,10-EpOME對蓋爾菲斯(Galphas)偶聯(lián)受體的激活。

由于TRPV1可被PKA和PKC磷酸化，二者導(dǎo)致該通道增加的活性和敏化35，所以發(fā)明人在鈣成像實(shí)驗(yàn)中用培養(yǎng)的來自野生型BL/6N小鼠的DRG神經(jīng)元研究了PKA或PKC抑制劑是否可減弱9,10-EpOME引起的TRPV1敏化。發(fā)明人采用與上文提到的相同規(guī)程(兩次辣椒素刺激，之間用9,10-EpOME溫浴)可重復(fù)辣椒素依賴的TRPV1敏化。但是，發(fā)明人觀察到，用PKA-抑制劑(H89二鹽酸鹽,10μM，1h)預(yù)溫浴導(dǎo)致9,10-EpOME引起的TRPV1敏化的顯著減弱(圖4C，4D)。在相同條件下(10μM，預(yù)溫浴1h)使用PKC-抑制劑GF 109203X(GFX)對9,10-EpOME引起的TRPV1敏化無任何影響(圖4E，4F)，由此表明9,10-EpOME引起PKA-而不是PKC-介導(dǎo)的TRPV1敏化。

發(fā)明人接著在鈣成像實(shí)驗(yàn)中測試了蓋爾菲斯(Galphas)偶聯(lián)的前列腺素受體參與9,10-EpOME依賴的TRPV1敏化的可能性。前列腺素受體對它們的配體前列腺素類具有不同的特異性，也可能由其它的脂質(zhì)激活。但是，發(fā)明人未能在前列腺素E受體EP2和EP4或者前列腺素D或I受體(DP和IP受體)缺陷小鼠中觀察到9,10-EpOME引起的TRPV1敏化的任何減弱。為了表征9,10-EpOME的體內(nèi)作用，發(fā)明人將該脂質(zhì)注射進(jìn)野生型BL/6N小鼠的后爪內(nèi)，并測量熱(圖5A)和機(jī)械閾值(圖5B)，直至注射后5h。兩種情況下，9,10-EpOME引起疼痛閾值的顯著降低，在注射后持續(xù)1h(熱)或2h(機(jī)械)(圖1A，1B)。然后，發(fā)明人將9,10-EpOME鞘內(nèi)注射，并在短時(shí)間間隔內(nèi)測量熱和機(jī)械閾值。在鞘內(nèi)注射后30分鐘觀察到顯著但相當(dāng)弱的熱閾值降低(圖5C)。但是，在9,10-EpOME鞘內(nèi)注射后長至1.5h觀察到機(jī)械閾值降低(圖5D)。

由于TRPV1升高的活性導(dǎo)致促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的釋放增加37，所以發(fā)明人分析9,10-EpOME是否能夠增加TRPV1依賴的CGRP釋放。發(fā)明人從野生型BL/6N小鼠切下坐骨神經(jīng)，并將它們與單獨(dú)的9,10-EpOME[1μM]、或者連同辣椒素[500nM]一起溫浴，對于辣椒素和9,10-EpOME的共刺激觀察到CGRP釋放的強(qiáng)烈增加。CGRP釋放顯著高于僅采用辣椒素或9,10-EpOME(圖6A)。為了研究在細(xì)胞胞體中是否也可見這種作用，用9,10-EpOME、辣椒素或這兩物質(zhì)刺激富含神經(jīng)元的DRG培養(yǎng)物，采用兩種不同的EpOME濃度[1和2.5μM]。同樣，采用EpOME和辣椒素二者，與采用任一種物質(zhì)相比，iCGRP的釋放顯著增加。但是，采用2.5μM 9,10-EPOME，沒有CGRP釋放的顯著增加(圖6B)。

實(shí)施例3：CYP2J2調(diào)節(jié)9,10-EpOME

接著，研究了9,10-EpOME合成在紫杉醇CIPNP期間是如何被調(diào)節(jié)的。因?yàn)?,10-EpOME被認(rèn)為是由亞族2C和2J的CYP表氧化酶所合成的16,38,發(fā)明人考察了這些亞族的鼠科CYP表氧化酶的表達(dá)。在紫杉醇處理后第8天，發(fā)明人在紫杉醇處理小鼠的機(jī)械閾值中觀察到穩(wěn)定的平臺(圖7A)。

然后發(fā)明人切下載體和紫杉醇處理小鼠的DRG，并研究了鼠科CYP2C29、CYP2C37、CYP2C38、CYP2C39、CYP2C44、CYP2J6和CYP3A11的表達(dá)。但是，在鼠科DRG中未能檢測到CYP亞型2C29和2C44。發(fā)明人觀察到，與載體處理相比，在紫杉醇處理小鼠的DRG中CYP2J6顯示出最強(qiáng)表達(dá)(圖7B)。紫杉醇處理后第8天時(shí)，CYP2J6的這種增加的表達(dá)與9,10-EpOME的增加的水平相關(guān)，如通過LC-MS/MS測量坐骨神經(jīng)、腰DRG和脊髓所分析的。

實(shí)施例4：CYP2J2拮抗劑抑制9,10-EpOME合成并減輕CIPNP

將人CYP2J2(鼠科CYP2J6的同源蛋白)的強(qiáng)力抑制劑特非那定用作拮抗劑。因?yàn)閷μ胤悄嵌ㄅc人CYP2J2的作用位點(diǎn)已有描述，所以發(fā)明人將鼠科CYP2J6和人CYP2J2的氨基酸進(jìn)行比對，并在兩種蛋白的相同位置發(fā)現(xiàn)了所有推測的與特非那定相互作用的位點(diǎn)(Leu83、Met116、Ile127、Phe30、Thr315、Ile376、Leu378、Val380、Leu402和Thr488)，除了替換為谷氨酰胺的Arg117?；贑YP2J2和CYP2J6之間驚人的氨基酸序列相似性，特非那定也與CYP2J6相互作用，并抑制該蛋白。為了研究特非那定對脂質(zhì)水平的影響，發(fā)明人向8天前接受了紫杉醇的小鼠靜脈注射1mg·kg-1特非那定。兩小時(shí)后，發(fā)明人切下坐骨神經(jīng)、DRG和背側(cè)脊髓，并在這些組織中定量環(huán)氧化脂類。發(fā)明人可在所有研究的組織中觀察到9,10-EpOME濃度的顯著降低(圖8A)。發(fā)明人還觀察到，所有測量的環(huán)氧化脂類和它們的(9,10-EpOME、12,13-EpOME、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME和14,15-EET)的剩余濃度在DRG、脊髓背角和血漿中都有顯著降低，但在特非那定處理的動物的坐骨神經(jīng)中并非如此(圖8B)。

發(fā)明人接著在小鼠中研究了特非那定處理是否可以減輕紫杉醇誘導(dǎo)的CIPNP。因此，發(fā)明人將特非那定(1或2mg·kg^-1或載體(DMSO))靜脈注射進(jìn)8天前接受了紫杉醇的小鼠中。

發(fā)明人在特非那定注射后的第1、2、4和5h測量了機(jī)械閾值，可觀察到經(jīng)特非那定處理的小鼠的機(jī)械閾值的顯著升高，持續(xù)2h。但是，未觀察到兩劑量之間的顯著差異(圖8C)。由于特非那定為組胺-1-受體拮抗劑，發(fā)明人使用了另一種不抑制CYP2J2的H1受體拮抗劑氯雷他定來研究該抗傷害作用實(shí)際上是由CYP2J2、還是組胺-1-受體的抑制引起。但是，與載體相比，氯雷他定處理不減輕紫杉醇誘導(dǎo)的CIPNP(圖8D)。

實(shí)施例5：新的選擇性CYP2J2拮抗劑的篩選

對商品名為的物質(zhì)(FDA Approved Drug Library v2)篩選CYP2J2的新的選擇性拮抗劑，用于本文描述的發(fā)明的情形。將基于酶催化的CYP-Glo熒光素酶的反應(yīng)用于測定CYP2J2的活性，將CYP3A4作為非選擇性對照。在實(shí)驗(yàn)中將特非那定用作陽性對照。兩種篩選的結(jié)果顯示在圖9中。顯示出對CYP2J2的抑制超過60％并且對CYP3A4的抑制約為0％的拮抗劑被認(rèn)為是選擇性CYP2J2拮抗劑，可用于本文描述的方法和用途中，將它們列在以下的表2中：

表2：

討論

9,10-EpOME能夠通過cAMP-PKA依賴機(jī)制在亞微摩爾濃度敏化DRG神經(jīng)元中的TRPV1，導(dǎo)致隨后的iCGRP從DRG釋放。其它的氧化亞油酸代謝物(OLAM)，例如9和13-HODE(它們在皮膚過度加熱期間產(chǎn)生)，已證實(shí)為直接的TRPV1激動劑并促進(jìn)炎性痛覺過敏。發(fā)明人也可在鼠科組織中檢測到9-和13-HODE，最主要在外周組織中。

發(fā)明人采用CYP2J2抑制劑特非那定降低9,10-EpOME的合成，可降低環(huán)氧化脂類的水平至約50％。在紫杉醇CIPNP期間，特非那定處理導(dǎo)致小鼠中減弱的機(jī)械超敏。CYP2J2及其同源物的拮抗劑因此可用于治療或預(yù)防CIPNP，這是被證實(shí)的，因?yàn)榻?jīng)氯雷他定(選擇性H1受體拮抗劑，不影響CYP2J2)處理的動物未在紫杉醇CIPNP中顯示出改善，這表明所觀察到的特非那定作用是由于對CYP2J2而不是組胺-1-受體的抑制。

化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛和隨后的感覺障礙仍然為細(xì)胞抑制劑的最嚴(yán)重副作用。尤其是在紫杉醇處理中，可觀察到早期急性疼痛綜合征，這看起來是由對傷害感受神經(jīng)元的敏化所介導(dǎo)。但是，尚不知曉促進(jìn)這種病理學(xué)生理狀態(tài)的內(nèi)源性介導(dǎo)物。根據(jù)發(fā)明人的數(shù)據(jù)，9,10-EpOME依賴的TRPV1敏化和傷害感受神經(jīng)元的增加的活性可能由此促進(jìn)了紫杉醇急性疼痛綜合征(P-APS)。

目前，對于CIPNP治療劑有強(qiáng)烈的未滿足的醫(yī)療需求。在大型隨機(jī)和安慰劑對照臨床試驗(yàn)中，用諸如阿米福汀或谷胱甘肽的抗氧化劑或神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)治療患者未能緩解CIPNP，最近的Cochrane綜述得出結(jié)論，沒有這些物質(zhì)用于功能性CIPNP療法的證據(jù)。此外，抗氧化劑可以干擾細(xì)胞抑制劑的抗腫瘤效果。最近，有報(bào)道稱，用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和維生素E處理通過減少DNA損傷而增加小鼠中肺腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長。就這點(diǎn)而言，CYP2J2抑制劑可能優(yōu)于采用抗氧化劑，因?yàn)橐延袌?bào)道，它們通過激活半胱天冬酶-3、Bax和Bcl-2以及通過減少腫瘤細(xì)胞遷移和粘附，甚至在體外和體內(nèi)減少腫瘤生長。

序列表

<110> 弗勞恩霍夫應(yīng)用研究促進(jìn)協(xié)會

<120> 疼痛治療中的CYP2J2拮抗劑

<130> F30742WO

<150> EP14181086.1

<151> 2014-08-14

<150> EP14186624.4

<151> 2014-09-26

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

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