四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗，包括：腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物、免疫活化劑和佐劑，該免疫活性劑為寡聚脫氧核苷酸，其序列中含有兩個拷貝的5’—CGTTCGAG—3’；所述寡聚脫氧核苷酸的長度為18~38個核苷酸。本發(fā)明可以提高疫苗的免疫效果、降低疫苗抗原的用量、減少免疫針次和降低疫苗成本的腦膜炎球菌疫苗。
【專利說明】四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物接種疫苗，具體涉及到一種四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗。

【背景技術(shù)】
[0002]流行性腦脊髓膜炎，是由腦膜炎雙球菌感染腦膜或者腦脊髓膜引起的呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)主要有高燒、頭痛、噴射狀嘔吐、脖子發(fā)硬。也可引起敗血癥，皮膚出現(xiàn)紫色淤血、瘀斑，腦膜炎會引起腦部損傷而遺留聽力下降或耳聾、智力低下等后遺癥。病死率在5%?10%。流腦冬春季節(jié)病例高發(fā)，一般11?12月份病例開始增多，第二年的2?5月份為發(fā)病高峰期。該病是發(fā)病率高，危險性大，是嚴重危害兒童健康的傳染病。根據(jù)莢膜多糖的化學結(jié)構(gòu)，腦膜炎球菌可分為十幾個血清群，其中A、B、C、Y和W135是最主要的流行菌群。接種疫苗是預防流腦的主要途徑。
[0003]用腦膜炎球菌莢膜多糖制備的疫苗具有一定的預防效果，但它是一種T細胞非依賴性抗原，對2歲以下的嬰幼兒免疫效果很差，而且不能誘生免疫記憶。與載體蛋白偶聯(lián)可以將多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細胞依賴性抗原，不但對嬰幼兒有效，而且能誘生免疫記憶。但是這種多糖蛋白結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝比較復雜，產(chǎn)量較低，價格較貴，遠遠不能滿足計劃免疫的大規(guī)模需求。因此，有必要研制一種新型的腦膜炎球菌疫苗。
[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提出了一種新的解決方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗。
[0006]為達上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:提供一種四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗，包括:A群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物；C群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物；Y群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物；W135群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物；
免疫活性劑，該免疫活性劑為寡聚脫氧核苷酸，其序列中含有兩個拷貝的5’ —CGTTCGAG— 3’;所述寡聚脫氧核苷酸的長度為18?38個核苷酸；其中CpG是非甲基化的；佐齊U，該佐劑包括氫氧化鋁和乳糖。
[0007]本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種可以提高疫苗的免疫效果、降低疫苗抗原的用量、減少免疫針次和降低疫苗成本的腦膜炎球菌疫苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為實驗例I中Al疫苗和BI疫苗產(chǎn)生特異性抗體的抗體滴度；
圖2為實驗例2中A2疫苗和B2疫苗產(chǎn)生特異性抗體的抗體滴度；
圖3為實驗例I和實驗例2中疫苗產(chǎn)生的特異性抗體的特異性；
其中，帶有三角形的曲線為實驗例2中B2組疫苗產(chǎn)生的特異性抗體的特異性曲線，帶有正方形的曲線為實驗例I中BI組疫苗產(chǎn)生的特異性抗體的特異性曲線。

【具體實施方式】
[0009]本發(fā)明的一個實施方案中，A群、C群、Y群和W135群腦膜炎球菌，這四種腦膜炎球菌的莢膜多糖與載體蛋白的結(jié)合是通過以下方法來實現(xiàn)的:
步驟1:分別將四種腦膜炎球菌多糖進行活化反應與衍化反應，在反應時，首先使用溴化氰活化腦膜炎球菌多糖，然后用乙二胺衍化溴化氰活化的腦膜炎球菌多糖，最后用試劑衍化多糖。
[0010]步驟2:載體蛋白的巰基化，所用到的巰基化試劑包括但不限于2-亞氨基硫烷。
[0011]步驟3:衍化的腦膜炎球菌多糖與巰基化的載體蛋白結(jié)合。
[0012]腦膜炎球菌加膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)方法已經(jīng)被多個文獻公開，因此，該耦聯(lián)方法不僅限于本發(fā)明公開的方法，采用其他偶聯(lián)方法同樣可以達到本發(fā)明的實施目的。
[0013]在本發(fā)明的另一個實施方案中，腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物優(yōu)選是腦膜炎球菌血清群A群、C群、Y群和W135群中的一種或多種莢膜多糖與破傷風類毒素或白喉類毒素或其它任何適用于人用疫苗的載體蛋白的化學偶聯(lián)物。此處的破傷風類毒素或白喉類毒素均是示意性地說明本發(fā)明的，并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何適用于人用疫苗的載體蛋白都適用于本發(fā)明
本發(fā)明的一個實施方案中，免疫活性劑為寡聚脫氧核苷酸，其序列中含有兩個拷貝的5’ 一CGTTCGAG— 3’ ；所述寡聚脫氧核苷酸的長度為18?38個核苷酸；其中CpG是非甲基化的。優(yōu)化的，免疫活性劑的核苷酸序列為5’ -TCGC CGTTCGAG CCTA CGTTCGAGCTTG—3’。進一步優(yōu)化的，免疫活性劑的核苷酸序列為5’一TTCTGAC CGTTCGAG TGCACTACGTTCGAG CAGTTG—3’。在實施本方案時，可以按照現(xiàn)有的任一方法制備四價腦膜炎球菌加膜多糖，然后與可以接收的載體蛋白結(jié)合，結(jié)合和可以將偶聯(lián)物與免疫活性劑和佐劑簡單混合，制得疫苗。
[0014]本發(fā)明的一個實施方案中，每支疫苗中腦膜炎球菌加膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物總含量為1ug?lOOug，每支疫苗中佐劑中含量為Img?lOOmg。
[0015]本發(fā)明的一個實施方案中，每支疫苗中還包括藥學上可接受的賦形劑，比如凍干賦形劑、成型劑等。
[0016]實驗例I
結(jié)合疫苗對小鼠A群腦膜炎球菌免疫應答的增強效果研究
通過現(xiàn)有技術(shù)制備四價腦膜炎球菌多糖與破傷風內(nèi)毒素的化學偶聯(lián)物，以下簡稱該偶聯(lián)物為疫苗Al，在疫苗Al中加入佐劑氫氧化鋁和免疫活性劑，得到疫苗BI。疫苗Al中，A群、C群、Y群和W135群的多糖含量相同，且多糖總含量為80ug/ml ;疫苗BI中多糖總含量為80ug/ml，佐劑氫氧化鋁的含量為5mg/ml。疫苗BI中的免疫活性劑序列為5’ 一TCGCCGTTCGAG CCTA CGTTCGAG CTTG—3’。經(jīng)過人工合成，并進行全鏈硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，溶于生理鹽水，零下20°C的條件下保存?zhèn)溆谩?br> [0017]選取試驗小鼠，分成兩組，即疫苗Al組和疫苗BI組；分別注射SOul進行免疫應答實驗，在注射3周后，以同樣方式和同等劑量進行再免疫，此時采集小鼠采集血液分離血清，并在再免疫2周后再次采集血液分離血清。將分離的血清分別采用PBS溶液對血清進行3倍稀釋，采用ELISA方法來檢測抗體滴度。
[0018]如圖1所示，在注射疫苗3周和再免疫注射2周后，注射疫苗Al的疫苗Al組產(chǎn)生的抗多糖IgG滴度在注射3周后和2周后均較弱。相反的，注射加入疫苗活性劑和佐劑的疫苗BI組的抗多糖IgG滴度明顯增加，與疫苗Al組相比，在注射3周后的疫苗BI組的IgG滴度與同期的疫苗Al相比增加了 15.2倍；再免疫注射兩周后，疫苗BI組的IgG滴度相比同期的疫苗Al的IgG滴度增加了 10.5倍。這表明，在注射疫苗后，疫苗BI能夠快速產(chǎn)生免疫應答，并可以誘導產(chǎn)生較高的抗體滴度，免疫效果增強。
[0019]實驗例2
結(jié)合疫苗對小鼠C群腦膜炎球菌免疫應答的增強效果研究
通過現(xiàn)有技術(shù)制備四價腦膜炎球菌多糖與白喉內(nèi)毒素的化學偶聯(lián)物，以下簡稱該偶聯(lián)物為疫苗A2，在疫苗A2中加入佐劑氫氧化鋁和免疫活性劑，得到疫苗B2。疫苗A2中，A群、C群、Y群和W135群的多糖含量相同，且多糖總含量為100ug/ml ;疫苗B2中多糖總含量為100ug/ml，佐劑氫氧化鋁的含量為5mg/ml。疫苗B2中的免疫活性劑序列為5’ —TTCTGACCGTTCGAG TGCACTA CGTTCGAG CAGTTG—3’。經(jīng)過人工合成，并進行全鏈硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，溶于生理鹽水，零下20°C的條件下保存?zhèn)溆谩?br> [0020]選取試驗小鼠，分成兩組，即疫苗A2組和疫苗B2組；分別注射SOul進行免疫應答實驗，在注射3周后，以同樣方式和同等劑量進行再免疫，此時采集小鼠采集血液分離血清，并在再免疫2周后再次采集血液分離血清。將分離的血清分別采用PBS溶液對血清進行3倍稀釋，采用ELISA方法來檢測抗體滴度。
[0021]如圖2所示，在注射疫苗3周和再免疫注射2周后，注射疫苗A2的疫苗A2組產(chǎn)生的抗多糖IgG滴度在注射3周后和2周后均較弱。相反的，注射加入疫苗活性劑和佐劑的疫苗B2組的抗多糖IgG滴度明顯增加，與疫苗A2組相比，在注射3周后的疫苗B2組的IgG滴度與同期的疫苗A2相比增加了 15.2倍；再免疫注射兩周后，疫苗B2組的IgG滴度相比同期的疫苗A2的IgG滴度增加了 10.5倍。這表明，在注射疫苗后，疫苗B2能夠快速產(chǎn)生免疫應答，并可以誘導產(chǎn)生較高的抗體滴度，免疫效果增強。
[0022]實驗例3
多糖特異性抗體的特異性
將接種BI疫苗的疫苗組和B2疫苗的疫苗組的小鼠血漿稀釋200倍。向2種稀釋的小鼠血漿分別加入A群腦膜炎多糖和C群腦膜炎多糖，用ELISA方法檢測小鼠血漿中抗多糖的抗體水平。如圖3所示，隨著多糖加入量的增加，多糖特異性抗體結(jié)合96孔板中包被多糖的能力逐漸降低。當加入的多糖達到15微克時,兩組血楽;的抗體結(jié)合多糖的能力喪失。這表明小鼠產(chǎn)生的抗多糖抗體能夠特異性地結(jié)合多糖。
【權(quán)利要求】
1.一種四價腦膜炎球菌多糖載體蛋白結(jié)合疫苗，包括: A群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物； C群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物； Y群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物； W135群腦膜炎球菌莢膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物； 免疫活性劑，該免疫活性劑為寡聚脫氧核苷酸，其序列中含有兩個拷貝的5’ —CGTTCGAG— 3’ ；所述寡聚脫氧核苷酸的長度為18?38個核苷酸；其中CpG是非甲基化的； 佐劑，該佐劑包括氫氧化鋁和乳糖。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述化學偶聯(lián)物是腦膜炎球菌血清群A群、C群、Y群和W135群中的一種或多種莢膜多糖與破傷風類毒素、白喉類毒素或其它任何適用于人用疫苗的載體蛋白的化學偶聯(lián)物。
3.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述免疫活性劑的核苷酸序列為5’一TCGCCGTTCGAG CCTA CGTTCGAG CTTG—3’。
4.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述免疫活性劑的核苷酸序列為5’—TTCTGAC CGTTCGAG TGCACTA CGTTCGAG CAGTTG—3’。
5.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:每支疫苗中腦膜炎球菌加膜多糖與載體蛋白的化學偶聯(lián)物總含量為lOuglOOug，每支疫苗中佐劑中含量為lmg?100mg。
6.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:進一步包括藥學上可接受的賦形劑。
【文檔編號】A61K39/385GK104174019SQ201410324895
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】侯文禮 申請人:成都康華生物制品有限公司