A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種菌種的培養(yǎng)方法，具體涉及的是A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦，下同)是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道傳染病。一百多年來，一直在世界各地流行或散在發(fā)生，感染病原菌后可引起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童，以暴發(fā)型病死率最高，可達40%?60%。當(dāng)今世界各大洲發(fā)病率在1/10萬?10/10萬，總病死率在5%?15%，高達20%的腦膜炎患者會有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括智力受損和耳聾等。根據(jù)莢膜多糖型別進行血清學(xué)分類可分13個血清型，其中A群、B群、C群約占流行菌群的90%。A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7-14年就會出現(xiàn)一次較大流行。
[0003]我國于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾發(fā)生過5次全國性流腦流行；其中以1967年春季流行最為嚴重，發(fā)病率高達403/10萬，病死率為5.49%。我國過去90%以上的病例是A群病菌致病，現(xiàn)在B群或C群病菌有時亦引起流腦暴發(fā)。2003年開始，C群流腦的發(fā)病率明顯上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有進一步增高的趨勢。因此，目前我國預(yù)防流腦工作的重點是以預(yù)防A群和C群為主。
[0004]目前預(yù)防流行性腦脊髓膜炎最有效的方法是接種疫苗。研究表明，A群C群腦膜炎球菌的莢膜多糖具有良好的免疫原性，提取莢膜多糖可直接制備成疫苗，經(jīng)注射免疫后的人群可以獲得免疫保護。我國從2007年起已將流腦疫苗納入國家免疫規(guī)劃，在全國范圍對適齡兒童普及接種。目前納入國家免疫計劃的流腦多糖疫苗包括A群腦膜炎球菌多糖疫苗，A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中均是從A群腦膜炎球菌中提取出多糖制成多糖疫苗，進而達到預(yù)防腦膜炎的效果。因多糖是從莢膜中提取出來，如果菌種培養(yǎng)過程中死菌較多，容易導(dǎo)致直接從A群腦膜炎球菌中提取多糖的提取效率低，且提取出來的多糖不容易純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中直接從A群腦膜炎球菌中提取多糖的提取效率低，且提取出來的多糖不容易純化的問題，提供一種解決上述問題的A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法。
[0007]為解決上述缺點，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(O制備純化的工作種子批菌種；
(2)開啟工作種子批菌種，接種至半綜合培養(yǎng)基中，在溫度35?37°C條件下培養(yǎng)16?24小時，然后經(jīng)過三代擴增培養(yǎng)，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子；
(3)將生產(chǎn)用種子接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)6?12小時即可；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基為半綜合培養(yǎng)基，溫度為35?37°C，培養(yǎng)基pH為7.0?7.2，發(fā)酵罐中攪拌速度為140?150r/min，接種量為10?15萬/ml ο
[0008]優(yōu)選地，所述步驟(I)的具體過程如下:
將A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種接種到純化培養(yǎng)基上，在38°C條件下培育20h，挑選健壯且無雜菌污染的菌種再接種到純化培養(yǎng)基上進行二次培養(yǎng)，再在38°C條件下培育12h，挑選健壯且無雜菌污染的菌種加入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備即得純化的工作種子批菌種。
[0009]作為優(yōu)選的實施方式，所述純化種子的開啟過程如下:
將工作種子批菌種溶解到無菌水中，將其接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35?37°C的環(huán)境下培養(yǎng)16?20小時后，挑選出健壯且無雜菌污染的菌種即可。
[0010]進一步，所述步驟(2)的具體培育過程如下:
將開啟后的純化種子接種到半綜合液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)的條件為溫度35?37°C、pH7.0?7.2、攪拌速度140?150r/min，培養(yǎng)時間為6?8h ;最后將活化后的純化種子經(jīng)過三代擴增培養(yǎng)，即可制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子。
[0011]更進一步地，所述三代擴增培養(yǎng)的條件為:擴增培養(yǎng)用培養(yǎng)基為半綜合液體培養(yǎng)基中；培育條件為溫度35?37°C、pH7.0?7.2、攪拌速度140?150r/min。
[0012]為了達到最好的效果，所述半綜合液體培養(yǎng)基的組成配比如下:
牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化鈉5g，無菌脫纖維馬血、羊血或兔血10ml，葡萄糖3g，鹽酸酪蛋白水解物2g，pH7.0?7.2。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果:
本發(fā)明培育出的A群腦膜炎球菌的死菌較少，提取出的多糖純化更加容易；而且多糖在莢膜中的提取率更高。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步地詳細說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0015]實施例1
A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(I)制備純化的工作種子批菌種:將A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種接種到純化培養(yǎng)基上，在38°C條件下培育20h，挑選健壯且無雜菌污染的菌種再接種到純化培養(yǎng)基上進行二次培養(yǎng)，再在38°C條件下培育12h，挑選健壯且無雜菌污染的菌種加入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備即得純化的工作種子批菌種。
[0016](2)將工作種子批菌種溶解到無菌水中，將其接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35?37°C的環(huán)境下培養(yǎng)16?20小時后，挑選出健壯且無雜菌污染的菌種；
將開啟后的純化種子接種到半綜合液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)的條件為溫度35?37°C、pH7.0?7.2、攪拌速度140?150r/min，培養(yǎng)時間為6?8h ;
最后將活化后的純化種子經(jīng)過三代擴增培養(yǎng)，即可制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子；其中擴增培養(yǎng)用培養(yǎng)基為半綜合液體培養(yǎng)基中；培育條件為溫度35?37°C、pH7.0?7.2、攪拌速度 140 ?150r/min。
[0017](3)將生產(chǎn)用種子接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)6?12小時即可；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基為半綜合培養(yǎng)基，溫度為35?37°C，培養(yǎng)基pH為7.0?7.2，發(fā)酵罐中攪拌速度為140?150r/min，接種量為10?15萬/ml。
[0018]本實施例中，各步驟中的具體培育條件如下:
步驟(2)工作種子批菌種開啟的培育條件為35°C，培養(yǎng)18小時；活化培養(yǎng)的條件為溫度37°C、pH7.2、攪拌速度140r/min，培養(yǎng)時間為6?8h ;擴增培養(yǎng)的培育條件為溫度36°C、ρΗ7.0、攪拌速度 145r/min ；
步驟(3)中發(fā)酵罐培養(yǎng)的培育條件為溫度為37°C，培養(yǎng)基pH為7.0，攪拌速度為145r/min，接種量為12萬/ml。
[0019]且步驟(I)中采用的純化培養(yǎng)基為加入抗生素的巧克力培養(yǎng)基，有效達到純化的目的；步驟(2)中開啟工作種子批菌種所使用培養(yǎng)基為未加入抗生素的巧克力培養(yǎng)基，SP10%羊血瓊脂培養(yǎng)基，通過該培養(yǎng)基的培養(yǎng)后即可有效達到開啟工作種子批菌種的效果。
[0020]活化和擴增用培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基均是半綜合液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為:牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化鈉5g，無菌脫纖維馬血、羊血或兔血100ml，葡萄糖3g，鹽酸酪蛋白水解物28，？!17.0?7.2。
[0021]實施例2
本實施例與實施例1的區(qū)別僅僅在于，各步驟中的具體培育條件不同，具體設(shè)置如下:步驟(2)工作種子批菌種開啟的培育條件為36°C，培養(yǎng)16小時；活化培養(yǎng)的條件為溫度37°C、pH7.0、攪拌速度145r/min，培養(yǎng)時間為8h ;擴增培養(yǎng)的培育條件為溫度37°C、pH7.0、攪拌速度 150r/min ；
步驟(3)中發(fā)酵罐培養(yǎng)的培育條件為溫度為37°C，培養(yǎng)基pH為7.0，攪拌速度為150r/min，接種量為15萬/ml。
[0022]實施例3
本實施例與實施例1的區(qū)別僅僅在于，各步驟中的具體培育條件不同，具體設(shè)置如下:步驟(2)工作種子批菌種開啟的培育條件為37°C，培養(yǎng)18小時；活化培養(yǎng)的條件為溫度36°C、pH7.2、攪拌速度150r/min，培養(yǎng)時間為7h ;擴增培養(yǎng)的培育條件為溫度37°C、pH7.2、攪拌速度 145r/min ；
步驟(3)中發(fā)酵罐培養(yǎng)的培育條件為溫度為37°C，培養(yǎng)基pH為7.2，攪拌速度為145r/min，接種量為10萬/ml。
[0023]上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非對本發(fā)明保護范圍的限制，但凡采用本發(fā)明的設(shè)計原理，以及在此基礎(chǔ)上進行非創(chuàng)造性勞動而作出的變化，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (O制備純化的工作種子批菌種； (2)開啟工作種子批菌種，接種至半綜合培養(yǎng)基中，在溫度35?37°C條件下培養(yǎng)16?24小時，然后經(jīng)過三代擴增培養(yǎng)，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子； (3)將生產(chǎn)用種子接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)6?12小時即可；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基為半綜合培養(yǎng)基，溫度為35?37°C，培養(yǎng)基pH為7.0?7.2，發(fā)酵罐中攪拌速度為140?150r/min，接種量為10?15萬/ml ο2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(I)的具體過程如下: 將A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種接種到純化培養(yǎng)基上，在38°C條件下培育20h，挑選健壯且無雜菌污染的菌種再接種到純化培養(yǎng)基上進行二次培養(yǎng)，再在38°C條件下培育12h，挑選健壯且無雜菌污染的菌種加入無菌脫脂牛奶中，混勻凍干制備即得純化的工作種子批菌種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述純化種子的開啟過程如下: 將工作種子批菌種溶解到無菌水中，將其接種在10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，放于35?37°C的環(huán)境下培養(yǎng)16?20小時后，挑選出健壯且無雜菌污染的菌種即可。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體培育過程如下: 將開啟后的純化種子接種到半綜合液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)的條件為溫度35?37°C、pH7.0?7.2、攪拌速度140?150r/min，培養(yǎng)時間為6?8h ;最后將活化后的純化種子經(jīng)過三代擴增培養(yǎng)，即可制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三代擴增培養(yǎng)的條件為:擴增培養(yǎng)用培養(yǎng)基為半綜合液體培養(yǎng)基中；培育條件為溫度35?37°C、ρΗ7.0 ?7.2、攪拌速度 140 ?150r/min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述半綜合液體培養(yǎng)基的組成配比如下: 牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化鈉5g，無菌脫纖維馬血、羊血或兔血10ml，葡萄糖3g，鹽酸酪蛋白水解物2g，pH7.0?7.2。
【專利摘要】本發(fā)明公開的是A群腦膜炎球菌的培養(yǎng)方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中直接從A群腦膜炎球菌中提取多糖的提取效率低，且提取出來的多糖不容易純化的問題。本發(fā)明包括以下步驟：（1）制備純化的工作種子批菌種；（2）開啟工作種子批菌種，接種至半綜合培養(yǎng)基中，在溫度35～37℃條件下培養(yǎng)16～24小時，然后經(jīng)過三代擴增培養(yǎng)，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子；（3）將生產(chǎn)用種子接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)6～12小時即可；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基為半綜合培養(yǎng)基，溫度為35～37℃，培養(yǎng)基pH為7.0～7.2，發(fā)酵罐中攪拌速度為140～150r/min，接種量為10～15萬/ml。本發(fā)明具有死菌較少、多糖純化更容易、多糖提取率更高等優(yōu)點。
【IPC分類】C12R1/36, C12N1/20
【公開號】CN105039227
【申請?zhí)枴緾N201510543425
【發(fā)明人】朱沖, 米強, 陳道遠
【申請人】成都歐林生物科技股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月31日