新型acyw135群腦膜炎球菌結合疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫技術領域，具體的涉及一種多價腦膜炎球菌結合疫苗及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm)感染所致的流行性腦脊髓膜炎 (流腦），是一種世界范圍內發(fā)病的急性呼吸道傳染病，根據Nm莢膜多糖構成的不同，可將 其分成13個血清群，且所有血清群均可致病，其中尤以六4、(：、￥、1135群所致疾病為主，約 占 Nm疾病的95 %以上，且可引起爆發(fā)和流行。
[0003] 疫苗接種是預防流腦疾病既經濟又有效的途徑。世界各國根據各自流腦疾病菌 群致病特點，開發(fā)了不同種類和不同組合的腦膜炎球菌疫苗，其中包括莢膜多糖疫苗：A 群、C群、AC群、ACYW135群及由破傷風類毒素（TT)或白喉類毒素（DT)、白喉無毒變異株 (CRM197)為載體蛋白的多糖-蛋白結合疫苗有：A群、C群、AC群、ACYW135群。B群腦膜炎 球菌疫苗有：古巴Finlay研究所生產的VA-MENG0C-BC疫苗，含B群OMV，C群CPS (莢膜多 糖），AL(OH)3佐劑，及諾華4C Men B(Bexsero)疫苗，含有fHbp I型蛋白，Nad A蛋白和 NHBA蛋白，后又加入新西蘭B群OMV疫苗（MeNZB)組成。
[0004]目前，國際、國內研究及已上市的各種組合的腦膜炎球菌多糖-蛋白結合疫苗，所 用載體蛋白分別有CRM197 (無毒白喉變異株類毒素 ）、TT (破傷風類毒素 ）、DT (白喉類毒 素）。這些蛋白載體雖也能刺激機體產生相應的抗體，但這些抗體與腦膜炎球菌疾病的預防 無關，僅具有載體效應。并且，TT和DT是由各自細菌毒素經甲醛或戊二醛脫毒而來的，在 百白破三聯(lián)疫苗的應用中為規(guī)避出現(xiàn)毒性逆轉，需要加入微量甲醛或戊二醛來維持其脫毒 效果的穩(wěn)定性。但是，在以TT或DT為蛋白載體的結合疫苗中是不加甲醛或戊二醛的，因而 存在著蛋白載體"毒性逆轉"的風險。并且，破傷風毒素是高致敏原性物質，難免存在著因 脫毒不徹底而致的破傷風類毒素（TT)，白喉類毒素（DT)為載體蛋白的多糖-蛋白結合疫苗 接種的包括"過敏反應"等的安全隱患。
[0005] 當使用單一載體蛋白的多價多糖結合疫苗接種時，難免會引起接種機體抗原位點 競爭現(xiàn)象，因接種機體的同一種載體特異性T細胞數量是有限的，因此在單一載體的多種 多糖結合物間會產生競爭性抑制，而某些抗原找不到相應結合位點，使得免疫效果下降。這 種現(xiàn)象稱為"抗原位點競爭"。文獻報導，TT引起的表位抑制現(xiàn)象更明顯。
[0006] 另外，由于多價多糖一蛋白結合疫苗僅用一種載體蛋白，由于載體蛋白太單一，造 成每次接種時載體蛋白的接種劑量太大，因而導致接種機體針對載體蛋白大量及多次重復 接種后的免疫耐受，影響其結合到載體蛋白上的多糖的免疫原性，致使免疫應答下降。這種 現(xiàn)象稱為"免疫耐受"。已引起國內、外學者的高度關注和重視。
[0007] 因此，有必要開發(fā)一種有效預防A、C、Y和W135群腦膜炎球菌感染性疾病的疫苗。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的第一個目的在于規(guī)避由TT或DT為蛋白載體結合疫苗而引起的毒性逆 轉、過敏反應等不安全風險，同時克服由單一載體蛋白制備多價多糖結合疫苗所致的抗原 位點競爭、免疫耐受影響免疫效果的缺陷，提供一種有效預防A、C、Y、W135群腦膜炎球菌感 染性疾病的疫苗。本發(fā)明的第二個目的在于提供一套以二株不同血清型B群外膜蛋白為載 體的ACYW135群腦膜炎球菌結合疫苗規(guī)?；a工藝，實現(xiàn)產業(yè)化生產方案。
[0009] 為達到本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明提供了一種ACYW135群腦膜炎球菌結合疫 苗，具體的，所述疫苗為4價結合疫苗，含有A、C、Y和W135群腦膜炎球菌的莢膜多糖分別與 B群血清型4型和15型外膜囊蛋白中的一種外膜囊蛋白偶聯(lián)獲得的多糖-蛋白偶聯(lián)物。
[0010] 可選的，在所述疫苗中，A、C、Y和W135群腦膜炎球菌的莢膜多糖中的兩種莢膜多 糖分別與B群血清型4型外膜囊蛋白共價偶聯(lián)形成以B群血清型4型外膜囊蛋白為載體的 兩種多糖-蛋白偶聯(lián)物，另外兩種莢膜多糖分別與B群血清型15型外膜囊蛋白偶聯(lián)形成以 B群血清型15型外膜囊蛋白為載體的另外兩種多糖-蛋白偶聯(lián)物。
[0011] 例如，在本發(fā)明的一種實施方式中，A和C群腦膜炎球菌的莢膜多糖分別與B群血 清型4型外膜囊蛋白共價偶聯(lián)形成以B群血清型4型外膜囊蛋白為載體的兩種多糖-蛋白 偶聯(lián)物，另外兩種莢膜多糖，即Y和W135群腦膜炎球菌的莢膜多糖分別與B群血清型15型 外膜囊蛋白偶聯(lián)形成以B群血清型15型外膜囊蛋白為載體的兩種多糖-蛋白偶聯(lián)物。以 上共獲得四種多糖-蛋白偶聯(lián)物，將這四種多糖-蛋白偶聯(lián)物混合后獲得本發(fā)明所述的4 價結合疫苗。
[0012] 在本發(fā)明中，所述B群腦膜炎球菌包括按照不同分型方法劃分的不同亞型、基因 型、克隆群和來自于不同地區(qū)的優(yōu)勢致病菌株。
[0013] 在本發(fā)明中，所述疫苗的生產菌株來源于CMCC，但不限于其他來源的同一血清群 和不同血清型菌株。
[0014] 可選的，A群腦膜炎球菌的莢膜多糖來自菌株CMCC29201 ;
[0015] C群腦膜炎球菌的莢膜多糖來自菌株CMCC29205 ;
[0016] Y群腦膜炎球菌的莢膜多糖來自菌株CMCC29028 ;
[0017] W135群腦膜炎球菌的莢膜多糖來自菌株CMCC29037 ;
[0018] B群血清型4型腦膜炎球菌的外膜蛋白來自菌株CMCC29356 ;
[0019] B群血清型15型腦膜炎球菌的外膜蛋白來自菌株CMCC29361。
[0020] 在本發(fā)明的腦膜炎球菌結合疫苗中，所述疫苗中游離多糖的含量< 15,游離蛋白 的含量< 3% ;所述疫苗免疫動物后，血清抗體陽轉率多90%。
[0021] 可選的，每種莢膜多糖在所述腦膜炎球菌結合疫苗的每劑免疫劑量中各有 4-20 μ g/mL〇
[0022] 可選的，（1)所述疫苗為液體劑型時，任選含或不含鋁佐劑；不含鋁佐劑時稀釋液 為緩沖生理鹽水；含鋁佐劑時，所述鋁佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁；
[0023] (2)所述疫苗為凍干劑型時，任選含有的賦形劑包括乳糖、蔗糖、明膠、山梨醇或人 血白蛋白。
[0024] 可選的，所述疫苗為凍干劑型，用于稀釋疫苗的稀釋液是緩沖生理鹽水、生理鹽 水；或者所述稀釋液為含有鋁佐劑的緩沖液或生理鹽水，其中，每毫升稀釋液中鋁含量為 0. 2-1. Omg0
[0025] 為達到本發(fā)明的第二個目的，本發(fā)明提供了所述腦膜炎球菌結合疫苗的制備方 法，其中，A群、C群、Y群、W135群莢膜多糖的制備包括以下步驟：
[0026] (1)分別對A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌菌株進行種子擴增培養(yǎng)，并連續(xù)傳 代至第4或第5代進行發(fā)酵罐培養(yǎng)，甲醛殺菌，離心收獲培養(yǎng)上清液，加入十六烷基三甲基 溴化銨，離心收集復合多糖，以氯化鈉或氯化鈣解聚復合多糖，分步乙醇沉淀，收獲粗制多 糖；
[0027] (2)以中性醋酸鈉溶液溶解粗制多糖，再以冷酚抽提或離子交換層析和分子篩層 析，收獲精制多糖，除菌過濾，獲得符合質量標準要求的多糖原液。
[0028] 可選的，B群血清型外膜蛋白的制備包括以下步驟：
[0029] (1)分別對B群血清型4型、15型腦膜炎球菌菌株進行種子擴增培養(yǎng)，并連續(xù)傳代 至第4或第5代進行發(fā)酵罐培養(yǎng)，待細菌生長至對數生長期后期或靜止期前期，終止培養(yǎng)， 離心收獲菌體；
[0030] (2)外膜囊蛋白溶出：用生理鹽水或pH6_8. 8的磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌并離心 收獲菌體，向菌體中加入0. 5-1. 5M NaCl溶液或0. 1-0. 5M氯化鋰-醋酸鈉提取液溶出外膜 囊蛋白，離心收集上清液；
[0031] (3)外膜囊蛋白純化：將步驟（2)的上清液用冷乙醇分步沉淀，離心收集沉淀，用 注射用水復溶后，加硫酸銨分步沉淀，注射用水溶解后加脫氧膽酸鈉解聚，超濾收集濃縮 液，用三氯醋酸沉淀，離心收集沉淀，注射用水溶解后超濾濃縮，并依次進行離子交換層析， 疏水層析，分子篩層析，收集樣品，除菌過濾，取樣檢定，符合質量要求的為合格外膜囊蛋白 原液，置2-8 °C保存或冷凍干燥保存。
[0032] (4)步驟（3)的技術參數具體為：向步驟（2)的上清液中加入冷乙醇至終濃度為 55-75% ;離心收沉淀，注射用水復溶后，加硫酸銨至終濃度為15-65%進行分步沉淀，分別 收獲上清或沉淀物，沉淀物復溶后加入脫氧膽酸鈉至終濃度〇. 2-1. 0 %，振蕩后進行超濾， 收集濃縮液，加入三氯醋酸至終濃度〇. 2-3. 0 %，離心收集沉淀，注射用水溶解，超濾，然后 依次進行離子交換層析，疏水層析和分子篩層析，收集樣品。
[0033] 可選的，所述方法包括將四種多糖-蛋白偶聯(lián)原液混合獲得4價結合疫苗，其中多 糖-蛋白偶聯(lián)原液的制備包括以下步驟：
[0034] 分別量取腦膜炎球菌多糖，經CNBr活化后，再在活化糖鏈上連接ADH，形成莢膜多 糖-ADH衍生物，超濾去除游離的CNBr和ADH后，加入B群血清型0MV，混合均勻，經加入的 EDAC縮合作用，在ADH的橋聯(lián)作用下形成共價結合的多糖-蛋白偶聯(lián)物，超濾去除殘余的 EDAC等小分子物質并濃縮體積，經分子篩層析，收集高分子量多糖-蛋白偶聯(lián)物。
[0035] 本發(fā)明所提供的腦膜炎球菌結合疫苗有效規(guī)避了由單一載體蛋白制備多價疫苗 存在的免疫耐受和抗原位點競爭所致的影響疫苗免疫應答的風險，及以TT、DT為載體蛋白 制備結合疫苗存在的過敏反應和毒性逆轉等的安全性風險，并能夠增進A群免疫作用，提 供較廣泛范圍的針對B群有保護作用的殺菌抗體。同時提供了完整的ACYW135群腦膜炎球 菌結合疫苗生產工藝，并能適應規(guī)?；a。研究表明，本疫苗具有良好的免疫原性及可靠 的安全性及穩(wěn)定的免疫持久性。
[0036] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0037] 1、以二株B群不同血清型OMV為載體蛋白制備的ACYW135群腦膜炎球菌結合疫苗 顯示了良好的載體效應和更好的免疫應答。與TT、DT為載體蛋白的各血清群偶聯(lián)物的多糖 回收率比較，OMV載體偶聯(lián)物回收率更高，尤其是C群、W135群的回收率更高，具有統(tǒng)計學差 異。
[0038] 2、動物免疫原性抗體效價，OMV載體偶聯(lián)物的二針次免疫效價相等于