具有抑菌活性的螺旋藻多肽p1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型的具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。本發(fā)明首次從螺旋藻中提取出具有抑菌活性的多肽P1，實(shí)驗(yàn)證明其能夠有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，且無(wú)任何毒副作用，可作為廣譜抗菌劑或細(xì)菌防腐劑使用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說(shuō)明】具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種具有抑菌活性的螺旋藻多肽Pi 及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 螺旋藻（Spirulina)是一類單細(xì)胞生物，屬于藍(lán)藻門顫藻科。大量研究表明，螺旋 藻含有非常豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%_70%，氨基酸組成比例非常理想，是一種 極好的蛋白質(zhì)來(lái)源。但蛋白質(zhì)屬于大分子物質(zhì)，遇水膨脹后粘度較大，不利于加工，且也不 利于人體對(duì)其消化和吸收。對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)進(jìn)行水解有利于提高蛋白質(zhì)的溶解性，提高利 用率。螺旋藻蛋白水解后形成多肽及小分子肽，能被人體快速吸收。
[0003] 隨著人們的生活水平和安全意識(shí)的不斷提高，國(guó)內(nèi)外對(duì)食品的微生物污染問(wèn)題十 分關(guān)注，對(duì)食品中的防腐劑要求也越來(lái)越高。由于天然防腐劑具有抗菌性強(qiáng)，安全無(wú)毒，水 溶性好，熱穩(wěn)定性好，作用范圍廣等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)是化學(xué)合成的防腐劑無(wú)法比擬的。而近 幾十年來(lái)，肽類做為一種新型的天然防腐劑，其研究和應(yīng)用也在逐漸增多。
[0004] 以螺旋藻作為制備活性肽的來(lái)源，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。螺旋藻生長(zhǎng)迅速，生物量大， 蛋白質(zhì)含量高，篩選出的抑菌肽既有防腐作用又能提供營(yíng)養(yǎng)，對(duì)于天然防腐劑的應(yīng)用與開 發(fā)和螺旋藻的綜合利用具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供螺旋藻多肽Pl在抑菌方面的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1，其氨基酸序 列如Seq ID No. 1所示。
[0008] 本發(fā)明的螺旋藻多肽Pl是從鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis)中提取出來(lái)的 一種具有抑菌活性的多肽，多肽氨基酸數(shù)目小于20個(gè)，無(wú)需任何修飾連接，為線性多肽，且 人工合成方便。
[0009] 本發(fā)明還提供螺旋藻多肽Pl在制備廣譜抗菌劑中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供一種抗菌劑，其有效成分為所述螺旋藻多肽P1。
[0011] 本發(fā)明還提供螺旋藻多肽Pl在制備防腐劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種防腐劑，其有效成分為所述螺旋藻多肽P1。所述防腐劑為 安全無(wú)毒的細(xì)菌防腐劑。
[0013] 本發(fā)明首次從螺旋藻中提取出具有抑菌活性的多肽P1，實(shí)驗(yàn)證明其能夠有效抑制 革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，且無(wú)任何毒副作用，可作為廣譜抗菌劑或細(xì)菌防腐劑使用， 應(yīng)用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明螺旋藻多肽Pl對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（以金黃色葡萄球菌為例）的抑菌效 果。
[0015] 圖2為本發(fā)明螺旋藻多肽Pl對(duì)革蘭氏陰性菌（以大腸桿菌為例）的抑菌效果。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0017] 實(shí)施例1螺旋藻蛋白的提取
[0018] (1)將適量鈍頂螺旋藻干粉溶于蒸餾水中，制成螺旋藻懸浮液，利用超聲結(jié)合反復(fù) 凍融法進(jìn)行破壁處理。
[0019] (2)將步驟（1)得到的螺旋藻液離心（_4°C，8000r/min離心20min)收集上清液， 將上清液用50%飽和NH4S04進(jìn)行鹽析純化。
[0020] (3)將步驟（2)鹽析后得到的螺旋藻液冷凍離心（lOOOOr/min離心20min)，收集沉 淀，用濃度為〇. 〇〇5M，pH為6. 86的磷酸鹽緩沖液溶解，于4°C下透析，透析終點(diǎn)用BaC12進(jìn) 行檢測(cè)。脫鹽后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到螺旋藻蛋白。
[0021] 實(shí)施例2螺旋藻混合多肽的提取
[0022] ( 1)將實(shí)施例1中制備的螺旋藻蛋白進(jìn)行酶法水解，先使用堿性蛋白酶水解螺旋 藻蛋白，酶解條件為：加酶量4300U/g，溫度55°C，pH7. 0,酶解160min;水解完畢后在85°C 水浴中滅活酶15?20min。
[0023] (2)將步驟（1)的水解產(chǎn)物用木瓜蛋白進(jìn)行進(jìn)一步水解，酶解條件為：酶底比 4. 5%，溫度60°C，pH6. 5,酶解210min。水解結(jié)束后，于80°C水浴中滅活酶15?20min。
[0024] (3)將步驟（2)得到的水解產(chǎn)物在4°C，5000r/min離心20min，收集上清液，凍干 得到螺旋藻多肽。
[0025] 實(shí)施例3具有抑菌性的螺旋藻多肽的分離純化及人工合成
[0026] (1)將實(shí)施例2中制備的螺旋藻混合多肽進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，采用大腸桿菌和金黃色 葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)菌種，確定其具有抑菌活性。
[0027] (2)將步驟（1)的具有抑菌性的混合多肽利用分子篩進(jìn)行分離純化，采用葡聚糖 凝膠G-25柱層析，得到4個(gè)組分，分別對(duì)各組分進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明組分2具有抑菌活 性。
[0028] (3)將步驟（2)得到的組分2利用反相高效液相制備色譜（Zorbax SB-C18柱 4. 6mmX 250mm)進(jìn)行分離純化，得到4組峰，收集后分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，得到峰1具有抑菌活 性。
[0029] (4)將步驟（3)得到的峰1利用分子篩進(jìn)行分離純化，采用superdexl0/300GL柱 層析，得到2個(gè)組分，分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明組分1具有抑菌活性。
[0030] (5)將步驟（4)得到的組分1進(jìn)行測(cè)序，采用液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法(液質(zhì)聯(lián)用雙 壓線性離子阱質(zhì)譜儀LTQ-Velos)及Sequest數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到組分1的氨基酸序列為 KLVDASHRLATCDVAVRA，即螺旋藻多肽 P1。
[0031] (6)將步驟（5)得到的多肽序列進(jìn)行人工合成。HPLC檢測(cè)純度大于98%，同時(shí)通過(guò) 質(zhì)譜檢測(cè)確定多肽合成質(zhì)量。樣品以凍干狀態(tài)保存。
[0032] 其中，步驟（1)中抑菌實(shí)驗(yàn)樣品濃度為lOOmg/mL ;步驟（2)中抑菌實(shí)驗(yàn)樣品濃度 為50mg/mL ;步驟（3)、（4)中的樣品由于是直接由色譜分離濃縮得到，未確定其準(zhǔn)確濃度， 但不影響抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，估算其濃度可達(dá)到mg/mL級(jí)別；步驟（6)中合成的多肽樣品濃度為 20mg/mL〇
[0033] 實(shí)施例4多肽抑菌活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
[0034] (1)菌懸液的制備：選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌種。準(zhǔn)備2個(gè)裝 有適量0. 85%濃度生理鹽水的三角燒瓶，滅菌后用接種環(huán)挑取3-4環(huán)經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)的 活化菌接種于三角瓶中，混合均勻，600nm下測(cè)定OD值，當(dāng)OD值達(dá)到0. 1時(shí)即得到濃度為 I X IO6-I X 107cfu/ml 的菌懸液。
[0035] (2)帶菌平板的制備：將滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按照每平皿15ml-20ml的 量制成平板，凝固后，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入事先步驟（1)的菌懸液〇. Iml，均勻涂布，待用。
[0036] 其中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制方法為：稱取1.5g牛肉膏，5g蛋白胨，7. 5g瓊 月旨，2. 5g NaCl，置于IOOOmL容量瓶中，加去離子水定容至刻度，搖勻備用。
[0037] (3)樣品溶液制備：稱取一定量的螺旋藻多肽粉末，用0. 85%的生理鹽水溶解，配 成一定濃度的溶液。
[0038] (4)實(shí)驗(yàn)方法：利用無(wú)菌打孔器對(duì)帶菌平板進(jìn)行打孔，孔徑為6mm，向孔中加待測(cè) 樣品0. Iml。然后將培養(yǎng)皿置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察統(tǒng)計(jì)抑菌圈大小，抑菌圈直徑 以毫米計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，且在無(wú)菌環(huán)境下操作。溶劑對(duì)照為生理鹽水。
[0039] 結(jié)果表明，本發(fā)明的螺旋藻多肽Pl對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（以金黃色葡萄球菌為例)和革 蘭氏陰性菌（以大腸桿菌為例）均有一定抑菌效果，且對(duì)大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)金黃色 葡萄球菌的抑菌效果。其中，當(dāng)多肽Pl的濃度為20mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為 16.0mm (圖1)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為12.0mm (圖2)。
[0040] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有抑菌活性的螺旋藻多肽P1，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所 /Jn〇
2. 權(quán)利要求1所述的螺旋藻多肽Pl在制備廣譜抗菌劑中的應(yīng)用。
3. -種抗菌劑，其有效成分為權(quán)利要求1所述的螺旋藻多肽P1。
4. 權(quán)利要求1所述的螺旋藻多肽Pl在制備防腐劑中的應(yīng)用。
5. -種防腐劑，其有效成分為權(quán)利要求1所述的螺旋藻多肽P1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的防腐劑，其特征在于，其為細(xì)菌防腐劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK104311645SQ201410039710
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】李博生, 孫宜君 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)