專利名稱：一種利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及顯微檢測技術，特別涉及利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法。
背景技術：
螺旋藻(&ir"77'朋)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍藻門 (Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢 植物學研究，1997， 15(4): 369-374]，因其富含優(yōu)質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外 的極大關注，目前己在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產業(yè)，并廣泛應用于食品、生 物醫(yī)藥保健、飼料、精細化工等領域。該屬中的鈍頂螺旋藻(^A/r"h'/7aj^ate/i A)是國內 外商業(yè)化養(yǎng)殖生產與開發(fā)應用最廣泛的品種。我國是全球生產與出口螺旋藻粉的主要國家， 產量近占世界總產量的一半[/owv aJ 0//^/co7og, 2005， 41: 622-628]。
手性(chirality or handedness)系指左右對稱性的差異特征。手性在自然界普遍存在， 如一些植物的藤蔓等往往呈螺旋狀，根據(jù)其螺旋取向可區(qū)分為左手性或左旋(Left-handed)、 右手性或右旋(Right-handed)，以及無手性特征的手中性(No-chiral)。手性取向可按業(yè)內 通用的左右手定則進行判別。螺旋藻藻絲在分類學上典型的形態(tài)學特征為由多個柱狀細胞串 聯(lián)成絲狀、不分枝、有規(guī)則、疏松或緊密的螺旋形，但在某些條件下會發(fā)生多形性變異甚至 完全變直[/owv aJ 0/,力ycoJo^x. 2005, 41: 622-628]。近年來，利用激光掃描共聚焦顯微 技術等研究又發(fā)現(xiàn)螺旋藻藻絲的螺旋取向不僅具有典型的左、右對稱性差異，即具有明顯的 手性(Chirality或handedness)特征，而且在某些條件下手性取向會發(fā)生逆轉，甚至變成手 中性(即變直)LZ尸々rco丄2003， 39: 360 - 367]。
眾多實驗研究與生產實踐表明，螺旋藻藻絲的螺旋手性及其取向是其工廠化培殖生產中 重要的經濟性狀。 一方面，螺旋形態(tài)不僅有利于藻體上浮和游動，顯著提高光能和養(yǎng)分利用 率，而且可用簡便的篩絹過濾方式低成本采收。當藻絲一旦變直失去其螺旋手性特征(稱手 中性)，就難以恢復到螺旋形，并給生產帶來產量和質量急驟下降、難以采收及易受其它生物 污染等嚴重后果，生產上稱這種"不可逆"的變異為藻種退化。另一方面，在螺旋藻工廠化 培養(yǎng)生產中，當藻絲群體均為螺旋形且手性取向一致時，藻體分散性好，產量高、品質和采 收性能好；而當藻絲群體即使全為螺旋形但取向不一致時，藻絲間往往會發(fā)生相互纏繞和結塊，進而引發(fā)藻體死亡或變直。據(jù)不完全統(tǒng)計，僅我國每年因手性變異導致藻種退化等嚴重 生產問題所造成的經濟損失至少上億元，因而將藻絲螺旋手性定期觀察列入螺旋藻養(yǎng)殖生產 的日常管理內容是非常重要的，這對確保螺旋藻高產、優(yōu)質、低成本生產具有重要的現(xiàn)實意 義。但值得指出的是，目前判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法要借助激光共聚焦顯微鏡或更高 級的電子顯微鏡等精密、昂貴的科研大型儀器設備才能進行，而絕大多數(shù)螺旋藻生產基地僅 配備了普通光學顯微鏡，也未配備能從事激光共聚焦顯微鏡或電子顯微鏡等大型儀器復雜操 作的專業(yè)技術人員。因此，迫切需要建立一種能利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手 性，且操作簡便、省時省力、成本低、可靠實用的新方法，以滿足當前國內外螺旋藻產業(yè)不 斷發(fā)展的實際需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺 旋手性的方法。
本發(fā)明提供了一種利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法，包括以下步驟
(1) 將待檢測螺旋藻液與Sp-CDS檢測液按照1 : 1 2的體積比混勻得到待檢混合液；
(2) 按顯微觀察所需量取待檢混合液滴至載玻片上，置于普通光學顯微鏡下觀察，通過 調節(jié)細調焦旋鈕得到藻絲表層清晰的影像；
(3) 利用左右手定則根據(jù)藻絲表層的螺旋取向判別藻絲的螺旋手性為左旋還是右旋； 所述Sp-CDS檢測液是dH20、吐溫-20、 Triton-X100和甘油按體積比70 80: 6 10:
6~10: 8 10的比例組成的混合液。
作為一種改進，所述待檢測螺旋藻液與Sp-CDS檢測液按照1 : 1的體積比混勻。 作為一種改進，所述Sp-CDS檢測液是由dH20、吐溫-20、 Triton-X100和甘油按體積比
72: 10: 8: IO的比例組成的混合液。 本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明所建立的利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法，與目前利用激光 共聚焦顯微鏡或更高級的電子顯微鏡等精密、昂貴的科研大型儀器設備的判別方法相比，具 有操作簡便、省時省力、成本低、對操作人員的專業(yè)技術無特殊要求、生產應用性強等優(yōu)點。


圖1是利用激光共聚焦顯微鏡對螺旋藻品系Sp-11的藻絲進行的顯微照相，其螺旋手性 為左旋；
圖2是利用普通光學顯微鏡對螺旋藻品系Sp-ll的藻絲進行的顯微照相，其螺旋手性為
4左旋，圖中A為藻絲表層。
具體實施例方式
本發(fā)明的技術方案可以通過以下步驟實現(xiàn)。
選用樣本材料；為公知的鈍頂螺旋藻品系Sp-11，這株螺旋藻品系是實驗室常用的螺旋 藻，在發(fā)明人所在的浙江大學原子核農業(yè)科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存， 可隨時提供樣本。利用公知的激光共聚焦顯微鏡判別法可以確認Sp-ll藻絲的螺旋取向為左 手性。
試劑和儀器本發(fā)明中所用的吐溫-20、 Triton-X100和甘油均為美國安發(fā)碼西亞公司 產品，其它試劑均為國產分析純。激光共聚焦顯微鏡產由德國生產，型號為LSM 5 EXCITER; 普通光學顯微鏡為上海長方光學儀器有限公司生產，型號為XSP-IICE。
利用普通光學顯微鏡鑒別螺旋藻藻絲螺旋手性的主要步驟如下
(1) 將dH20、吐溫-20、 Triton-X100和甘油按體積比為72: 10: 8: 10的比例取樣并 混合均勻，配成基于普通光學顯微鏡鑒別螺旋藻藻絲螺旋手性的檢測液(Sp-CDS),并保存于 4'C冰箱待用。如要配制10 ml的Sp-CDS,則依次取7, 2 ml dH20、 1,0 ml吐溫-20、 0.8 ml Triton-X100和1 ml甘油，輕輕攪拌并充分混勻即可。
(2) 取O. 5 ml待檢測的螺旋藻液于體積為2 ml的Eppendorf管中，再加入O。 5 ml Sp-CDS 并輕輕搖晃混勻。
(3) 用玻璃吸管吸取少量步驟(2)所得混勻的藻液均勻滴至載玻片上。此時，液滴會 因受其中所含的表面活性劑吐溫-20和Triton-X100的表面張力作用而迅速展開成很薄的一 層膜，螺旋藻藻絲也隨之散布開來。同時，液滴中所含的甘油因具有保水作用能較長時間維 持載玻片上的膜層和藻絲表面不干，以便有足夠的時間觀察藻絲的螺旋手性。
(4) 將步驟(3)加好藻液的載玻片放置于普通光學顯微鏡的載物臺上，在低倍物鏡(如 4X)下通過調節(jié)焦距與載波片移位旋鈕，看到清晰的橫躺在載玻片上的螺旋藻藻絲的影像， 再將物鏡切換成更高倍數(shù)的鏡頭(若目鏡為10X，則物鏡至少為10X),并通過調節(jié)焦距得 到清晰的藻絲影像。
(5) 逆時針方向旋轉細調焦旋鈕(此時載物臺下降)，使藻絲影像隱約可見(即變得較 模糊)。
(6) 順時針方向緩慢旋轉細調焦旋鈕(此時載物臺上升)，使載玻片上藻絲的表層清晰 可見，藻絲的底層(緊貼載玻片)隱約可見。
(7) 根據(jù)左右手定則(手心朝上)，并根據(jù)藻絲表層的螺旋取向判別藻絲的螺旋手性為 左旋還是右旋。作為實例，我們選取螺旋藻Sp-ll為樣本利用本發(fā)明的方法在普通光學顯微鏡下判別其 的螺旋手性，可以確認Sp-11藻絲的螺旋取向為左手性；這一結果，與利用公知的激光共聚 焦顯微鏡判別法所得的結果一致。
權利要求
1、一種利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法，包括以下步驟(1)將待檢測螺旋藻液與Sp-CDS檢測液按照1∶1～2的體積比混勻得到待檢混合液；(2)按顯微觀察所需量取待檢混合液滴至載玻片上，置于普通光學顯微鏡下觀察，通過調節(jié)細調焦旋鈕得到藻絲表層清晰的影像；(3)利用左右手定則根據(jù)藻絲表層的螺旋取向判別藻絲的螺旋手性為左旋還是右旋；所述Sp-CDS檢測液是dH2O、吐溫-20、Triton-X100和甘油按體積比70～80∶6～10∶6～10∶8～10的比例組成的混合液。
2、 根據(jù)權利要求1所述的利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法，其特征 在于，所述待檢測螺旋藻液與Sp-CDS檢測液按照1 : 1的體積比混勻。
3、 根據(jù)權利要求1所述的利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法，其特征 在于，所述Sp-CDS檢測液是由dH20、吐溫-20、 Triton-X100和甘油按體積比72: 10: 8: 10 的比例組成的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及顯微檢測技術，旨在提供一種利用普通光學顯微鏡判別螺旋藻藻絲螺旋手性的方法。該方法包括(1)將待檢測螺旋藻液與Sp-CDS檢測液按照1∶1～2的體積比混勻得到待檢混合液；(2)按顯微觀察所需量取待檢混合液滴至載玻片上，置于普通光學顯微鏡下觀察，通過調節(jié)細調焦旋鈕得到藻絲表層清晰的影像；(3)利用左右手定則根據(jù)藻絲表層的螺旋取向判別藻絲的螺旋手性為左旋還是右旋。本發(fā)明與目前利用激光共聚焦顯微鏡或更高級的電子顯微鏡等精密、昂貴的科研大型儀器設備的判別方法相比，具有操作簡便、省時省力、成本低、對操作人員的專業(yè)技術無特殊要求、生產應用性強等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/84GK101592618SQ20091010026
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月2日 優(yōu)先權日2009年7月2日
發(fā)明者汪志平, 潘劍用, 王冬云, 董丹丹, 謝彥廣, 斌 邵 申請人:浙江大學