專利名稱：區(qū)分螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于螺旋藻開發(fā)應(yīng)用的技術(shù)，特別涉及一種區(qū)分螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣度的方法。
背景技術(shù)：
螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋的原核絲狀微藻，系藍(lán)藻門(Cyanophyta)> 顫藻目(OsciIlatoriales)> 顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學(xué)研究，1997，15(4): 369-374]。因富含優(yōu)質(zhì)蛋白和多種生物活性物質(zhì)而受到國內(nèi)外的極大關(guān)注，并已在大量研究的基礎(chǔ)上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，成為目前全球研究開發(fā)規(guī)模最大、應(yīng)用前景最廣泛的經(jīng)濟(jì)微藻。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產(chǎn)實踐表明:螺旋藻不同品種(系)，對溫度、光質(zhì)、光照強(qiáng)度以及培養(yǎng)液的鹽度、PH和營養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要求與適應(yīng)性存在顯著差異，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益也相差甚遠(yuǎn)[水生生物學(xué)報，1999，23(1): 59-64]。所以，與其它農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)一樣,選育品性兼優(yōu)的品種(系)是有效提升當(dāng)前螺旋藻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益、切實解決生產(chǎn)實際問題的最直接而重要的途徑之一 O目前國內(nèi)外篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)螺旋藻品種(系)的常規(guī)方法如下:1、對新分離到的品種(系)進(jìn)行編號；2、在實驗室條件下做多種環(huán)境因子的交叉組合培養(yǎng)試驗，并根據(jù)所測定的生長曲線、光合放氧和生化組成等指標(biāo)進(jìn)行初步篩選；3、對實驗室初篩到有生產(chǎn)養(yǎng)殖潛力的候選品種(系)在不同季節(jié)、氣候及營養(yǎng)條件下進(jìn)行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗，再篩選出目標(biāo)品種(系)。這一方法雖然實用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長，且成本高。因此，迫切需要建立一種簡單、高效、低成本的評價與篩選方法，以滿足當(dāng)前國內(nèi)外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的實際需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡單、高效、低成本的區(qū)分螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣度的方法。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:提供一種區(qū)分螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣度的方法，包括以下步驟:用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白樣品分離后,利用Quantity One分析軟件檢測蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明具體包括下述步驟:
1、選用9株螺旋藻品系作為樣本，包括4株生產(chǎn)性狀好的品系:Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17 ；5株生產(chǎn)性狀不好的品系:Sp-l、Sp-2、Sp_6、Sp-9和Sp-1O ；2、試劑和儀器蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自GE Healthcare Biosciences (美國)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等購自Amresco (美國)。所用的垂直電泳系統(tǒng)和紫外-可見掃描分光光度計等為AmershamPharmcia Biotech (美國)產(chǎn)品；冷凍干燥儀為VirTis (美國)產(chǎn)品；掃描儀GS-800和Quantity One分析軟件等為Bio-Rad (美國)產(chǎn)品；3、水溶性蛋白的制備取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，加入3ml Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI,0.9% NaCl, pH 6.8)，在_20°C冷凍1.5h后再在4°C融化2h，如此反復(fù)凍融3次直至出現(xiàn)深藍(lán)紫色熒光。4°C下12000r/min離心20min得上清液即為螺旋藻水溶性蛋白；在上述所提的上清液中加入3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后_20°C靜置2h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液；沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后，加入適量SDS上樣緩沖液使其溶解，即制得用于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的蛋白樣品。4、SDS-PAGE 和軟件分析蛋白質(zhì)濃度測定參照Bradford [Anal Biochem, 1976, 72: 248一254]的考馬斯亮藍(lán) G-250 法進(jìn)行；蛋白質(zhì) SDS-PAGE 分析參照 Laemmli [Nature, 1970, 227: 680— 685]的方法進(jìn)行，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍(lán)至膠底部。用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后凝膠成像，利用Quantity One分析軟件對蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值進(jìn)行檢測分析，并根據(jù)其值利用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖，構(gòu)建藻株間的聚類圖，通過聚類情況來鑒別該品系生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所建立的區(qū)分螺旋藻生產(chǎn)性狀優(yōu)良品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單、高效、可靠、成本低，而且不用進(jìn)行核酸測序與生物信息學(xué)比對等復(fù)雜試驗和分析，因而適合大規(guī)模、高通量篩選。


圖1為9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝膠圖；其中M:標(biāo)準(zhǔn)分子量；I 9:依次對應(yīng) Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-10、Sp-9, Sp_4、Sp_5、Sp-17 和 Sp_15。圖2為9株用于構(gòu)建生產(chǎn)性狀鑒別標(biāo)準(zhǔn)的螺旋藻品系的聚類圖。圖3為被鑒別藻株Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp_37的SDS-PAGE凝膠圖；其中M:標(biāo)準(zhǔn)分子量;1 4:依次對應(yīng) I:Sp-18 ；2:Sp-3 ；3:Sp-16 ；4:Sp_37。圖4為被鑒別藻株Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp_37在所建鑒別標(biāo)準(zhǔn)中的歸類圖。
具體實施例方式蛋白質(zhì)的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于煙草、水稻、木本植物和海藻等生物的分類和鑒定等領(lǐng)域，但有關(guān)螺旋藻蛋白質(zhì)的SDS-PAGE指紋圖譜及相關(guān)分析方法在分類和鑒定等方面的應(yīng)用，卻鮮有報道。本發(fā)明建立了一種以檢測蛋白指紋圖譜在102kD處條帶光密度值的大小，并通過聚類來鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)良及能否應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖的新方法。我們以9 株公知的螺旋藻 Sp-1、Sp-2、Sp_4、Sp_5、Sp-6, Sp_9、、Sp_10、Sp-15 和Sp-17為對照材料,經(jīng)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE及利用Quantity One軟件檢測其蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小，并根據(jù)其大小進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9株品系可分為兩大類:Sp-4、Sp-5、Sp-15 和 Sp-17 為第 I 類；Sp_l、Sp-2、Sp-6, Sp-9 和 Sp-10 為第 II類。長期的科學(xué)研究與生產(chǎn)實踐表明，上述第I類中的4株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的5株品系因適應(yīng)能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見，蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小可用于鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)良。即若候選品系的蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案可以通過以下步驟實施:1、選用材料為公知的 9 株螺旋藻品系 Sp-1、Sp-2、Sp-4、Sp-5、Sp-6、Sp-9、Sp-10、Sp-15和Sp-17，在浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存。其中，Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17因生產(chǎn)性狀好，被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)；而Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-9和Sp-10因生產(chǎn)性狀差而不適用于工廠化生產(chǎn)。2、試劑和儀器蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自GE Healthcare Biosciences (美國)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等購自Amresco (美國)。所用的垂直電泳系統(tǒng)和紫外-可見掃描分光光度計等為AmershamPharmcia Biotech (美國)產(chǎn)品；冷凍干燥儀為VirTis (美國)產(chǎn)品；掃描儀GS-800和Quantity One分析軟件等為Bio-Rad (美國)產(chǎn)品；3、水溶性蛋白的制備取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，并加入Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI,0.9% NaCl,pH 6.8) 3ml，在 _20°C冷凍 1.5h 后再在 4°C融化 2h，如此反復(fù)凍融 5次至出現(xiàn)深藍(lán)紫色熒光，并在顯微鏡下鏡檢無完整細(xì)胞。4°C下12000r/min離心20min得上清液即為螺旋藻水溶性蛋白；4、SDS-PAGE 和軟件分析蛋白質(zhì)濃度測定參照Bradford [Anal Biochem, 1976, 72: 248一254]的考馬斯亮藍(lán) G-250 法進(jìn)行；蛋白質(zhì) SDS-PAGE 分析參照 Laemmli [Nature, 1970, 227: 680— 685]的方法進(jìn)行，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍(lán)至膠底部。用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后凝膠成像，利用Quantity One分析軟件對蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值進(jìn)行檢測分析，并根據(jù)其值利用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖，通過聚類情況來鑒別該品系生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。5、結(jié)果與分析圖1為9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝膠圖；利用Quantity One軟件對蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值進(jìn)行檢測，并根據(jù)其值進(jìn)行聚類分析，如圖2所示，9株螺旋藻品系可分為兩大類:Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17為第I類；Sp_l、Sp-2、Sp-6、Sp-9 和 Sp-10 為第 II 類。長期的科學(xué)研究與生產(chǎn)實踐表明，上述第I類中的4株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的5株品系因適應(yīng)能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見，蛋白電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小可用于鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。即若候選品系的蛋白電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。進(jìn)一步利用NanoLC-MS/MS對生產(chǎn)性狀好與差兩組節(jié)旋藻品系SDS-PAGE上102kD處的蛋白帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定與生物信息學(xué)分析與比較發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)性狀好的品系具有一種特異性的蛋白——麥芽寡糖基海藻糖合成酶，而在生產(chǎn)性狀差的品系中沒有。麥芽寡糖基海藻糖合成酶能催化合成海藻糖。而海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等外界惡劣環(huán)境條件下能在生物體細(xì)胞表面形成獨特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，維持生命體正常的生命過程和生物特征，從而使生物體對外界環(huán)境有更好的適應(yīng)能力(邵引剛等.海藻糖的應(yīng)用及基因工程研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2008，36(3): 857-859)。因此，生產(chǎn)性狀好的品系中由特有的麥芽寡糖基海藻糖合成酶合成的海藻糖，能有效地抵御節(jié)旋藻培植過程中高溫和滲透壓驟變等各種不良環(huán)境，使用權(quán)其表現(xiàn)出更好的生產(chǎn)性狀；而生產(chǎn)性狀差的品系，因缺乏該合成酶而不能合成海藻糖，致使其對環(huán)境等變化更敏感而表現(xiàn)出更差的生產(chǎn)性狀?？梢姡?jié)旋藻SDS-PAGE上102kD處的蛋白帶與品系的生產(chǎn)性狀密切相關(guān)。作為實例，我們選取公知的Sp-3、Sp-16、Sp_18和Sp_37這4株品系來驗證本發(fā)明的實用性，其中，Sp-3和Sp-16品系的生產(chǎn)性狀好，被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)，而Sp-18和Sp-37因生產(chǎn)性狀差而不適用于工廠化生產(chǎn)。Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp_37這4株品系的水溶性蛋白經(jīng)SDS-PAGE獲得蛋白質(zhì)電泳圖譜(圖3 )，利用Quantity One軟件檢測蛋白質(zhì)是泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值，然后根據(jù)其值進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖4所示，Sp-3和Sp-16的蛋白指紋圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值都大于140，且都能與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，說明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；而Sp-18和Sp-37的蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值都小于40，且都能與已知生產(chǎn)性狀差的品系聚到一起，說明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。該例子進(jìn)一步說明，通過檢測蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值來鑒別該品系生產(chǎn)性狀的優(yōu)良，可作為一種簡單、高效、低成本的方法來鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。
權(quán)利要求
1.一種區(qū)分螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣度的方法，其特征在于，包括以下步驟: 用TriS-HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品分離后，利用Quantity One分析軟件檢測蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括下述步驟: 取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，加入3ml Tris-HCl提取液利用凍融破壁的方法提得水溶性蛋白； 進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5% ;先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍(lán)至膠底部。用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后凝膠成像； 利用Quantity One分析軟件檢測蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值,根據(jù)其值利用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖，并通過聚類情況鑒別該品系生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。
全文摘要
本發(fā)明涉及螺旋藻開發(fā)應(yīng)用技術(shù)，旨在提供一種區(qū)分螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣度的方法。該方法是用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品分離后，檢測蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明簡單、高效、可靠、成本低，不用進(jìn)行核酸測序與生物信息學(xué)比對等復(fù)雜試驗和分析，因而適合大規(guī)模、高通量篩選。
文檔編號G01N21/84GK103149211SQ20131006696
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月3日
發(fā)明者汪志平, 于金鑫, 劉新穎, 呂蓓芬, 馬麗芳, 陳子元 申請人:浙江大學(xué)