一種螺旋藻多糖及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到多糖及其生物活性研究，詳細研究了一種經(jīng)營養(yǎng)調(diào)控的高糖螺旋藻 中的富含葡萄糖的螺旋藻多糖的生物活性及其應(yīng)用，屬于糖工程和糖生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，植物病害也越來越嚴重，極大影響了農(nóng)業(yè)植物的產(chǎn)量。為了 控制植物病害，主要采用化學(xué)殺菌劑和培育抗性品種等，但化學(xué)殺菌劑不僅能引起環(huán)境污 染，還危機人類健康，而抗性新品種也由于選育時間長、耗資大、抗性易退化等原因而發(fā)展 緩慢，所以安全、環(huán)保、快速的控制植物病害方法迫在眉睫。
[0003] 已有研究結(jié)果表明，植物在長期進化過程中由于需要不斷抵抗微生物的侵害，逐 漸形成一系列復(fù)雜而行之有效的防御系統(tǒng)，當植物受到侵染，防御系統(tǒng)便得到啟動，達到清 除病菌保護自身目的。誘導(dǎo)機制比較復(fù)雜，主要在如下幾方面：1、寄主的木質(zhì)化反應(yīng)；2、植 保素增加；3、酚類物質(zhì)積累；4、病程相關(guān)蛋白積累，如幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶等；防御 酶系的變化，如過氧化物酶、多酚氧化酶等。相比其它病害防治方法，誘導(dǎo)抗病具有使用技 術(shù)簡單、抗病譜廣、病原菌無耐藥性且對環(huán)境無污染等優(yōu)點。
[0004] 目前已報道的具有誘導(dǎo)抗病性的寡糖類有寡聚半乳糖醛酸、殼聚糖、野菊 多糖等，還未見螺旋藻多糖作為植物誘導(dǎo)子應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植物抗病的報道。螺旋藻 (Spirulinaplatensis)是單細胞藻類，屬藍藻門，生態(tài)分布廣，易于培養(yǎng)，生長速度快，含有 大量的生物活性物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和維生素等。本發(fā)明提供一種螺旋藻多糖用于 植物抗病誘導(dǎo)劑，防治植物病害。
[0005] 腫瘤是現(xiàn)代社會人類健康面臨的重大問題，化學(xué)藥物在抑制腫瘤方面取得重要進 展，但是也有諸多不足，如耐藥性、副作用等。從天然物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)和提取具有抗腫瘤活性的 物質(zhì)，一直是抗腫瘤藥物研究的重點和熱點。另外，從食療角度和提高天然產(chǎn)物的開發(fā)深度 來說，開發(fā)螺旋藻多糖的抗腫瘤活性也具有重要的意義。所以本發(fā)明則從經(jīng)營養(yǎng)調(diào)控的高 糖螺旋藻提取到一種新型螺旋藻多糖，提供其在抗腫瘤方面的活性應(yīng)用，具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種從經(jīng)營養(yǎng)調(diào)控的高糖螺旋藻提取的新型螺旋藻多糖， 用于植物病害防控、壯苗及抗腫瘤藥物的用途。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所述螺旋藻多糖為富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所 述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、 葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸9種單糖組成；其中葡萄糖含量超過50%。
[0009] 其單糖組成摩爾比（以半乳糖醛酸的摩爾數(shù)為基數(shù)計算）為分別為鼠李糖： 巖藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2. 2~ 2. 8:1. 4 ~L 7 :1· 4 ~L 6 :1· 5 ~I. 7 :1. 1 ~L 6 :2· 6 ~2. 8 :68· 4 ~73. 3 :1. 0 ~I. 1 : 1。分子量為l〇-l〇〇KDa。
[0010] 所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖提取制備方法為：
[0011] 將經(jīng)營養(yǎng)調(diào)控得到的高糖螺旋藻進行高壓均質(zhì)破壁，并用熱水浸提法提取多糖， 絮凝劑除蛋白，再通過濃縮、沉淀和干燥，得到富含葡萄糖的螺旋藻多糖。
[0012] 所述高壓破碎工藝為：將螺旋藻粉與水按質(zhì)量體積比1:10~50(g/ml)制備成懸 浮液，經(jīng)過高壓均質(zhì)機破碎，高壓勻質(zhì)的壓力為40~120MPa，高壓勻質(zhì)次數(shù)為1~5次，得 螺旋藻破碎液；
[0013] 取上述螺旋藻破碎液，控制螺旋藻破碎液中螺旋藻與水質(zhì)量體積比為1:10~50， 在30~90°C熱水浸提法提取螺旋藻多糖，浸提時間為2~6h，提取后3000~8000rpm離 心5~20min，去除沉淀物，收集上清，得到多糖溶液；
[0014] 所述絮凝劑除蛋白的絮凝劑為聚合硫酸鐵、聚硅酸鐵、聚硅酸硫酸鐵、聚磷氯化鐵 或ZTC1+1的一種或兩種以上混合物；使用前2~24h絮凝劑分別配制成質(zhì)量濃度0. 2~ 2%溶液，絮凝1~3h，絮凝劑溶液添加量分別為多糖溶液體積的1~5% (v/v);絮凝后離 心去除沉淀物,收集上清液；
[0015] 絮凝離心后的上清液加熱濃縮；濃縮為過程為：于上述提取液在40~70°C，轉(zhuǎn)速 40~120rpm的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的1/2~1/8 ;
[0016] 沉淀過程為：于濃縮液中加入濃縮液2~8倍體積沉淀劑，沉淀劑為乙醇、丙酮、丁 醇、2-丁醇的一種或者兩種以上的混合物；然后3000~8000rpm離心5~30min，得到沉淀 部分，將沉淀部分進行干燥，得到螺旋藻多糖。
[0017] 所述絮凝劑絮凝除蛋白的過程，優(yōu)選是將聚合硫酸鐵、聚硅酸鐵、聚硅酸硫酸鐵或 聚磷氯化鐵的一種或兩種以上混合物與ZTC1+1聯(lián)合使用；使用前2~24h絮凝劑分別配制 成質(zhì)量濃度〇. 2~2%溶液，在絮凝時先添加聚合硫酸鐵、聚硅酸鐵、聚硅酸硫酸鐵、聚磷氯 化鐵中的一種或兩種以上混合物絮凝1~3h后，然后再添加 ZTC1+1，絮凝1~3h ;絮凝劑 溶液每次添加量分別為多糖溶液體積的1~5% (v/v);絮凝后離心去除沉淀物，收集上清 液。
[0018] 所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有誘導(dǎo)植物抗病活性，所述的螺旋藻多糖可作為 植物誘抗劑。
[0019] 所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有抗腫瘤活性，所述的螺旋藻多糖在制備抗腫瘤 藥物或保健食品中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0021] 1本發(fā)明表明螺旋藻多糖具有誘導(dǎo)植物抗病性，來源天然，無副作用，可開發(fā)成植 物綠色農(nóng)藥或食品添加劑。
[0022] 2螺旋藻多糖原料為經(jīng)過人工營養(yǎng)調(diào)控培養(yǎng)，其來源廣泛、價格低廉，本發(fā)明有利 于螺旋藻的綜合利用并提高其附加值。
[0023] 3該發(fā)明螺旋藻多糖具有明顯抗腫瘤活性，有效率高，可用于新型抗腫瘤藥物開 發(fā)，且無毒副作用。
【附圖說明】
[0024] 圖1.實施例1的螺旋藻多糖氣相色譜圖；
[0025] 圖2.實施例1的螺旋藻多糖紅外光譜圖；
[0026] 其中：
[0027] 圖1中，a:鼠李糖b:巖藻糖c:阿拉伯糖d:木糖e:甘露糖f:半乳糖g:葡萄 糖h:葡萄糖醛酸i:半乳糖醛酸低糖藻粉中9種單糖比例：4. I :1. 4 :1. 4 :2 :1. 3 :6 :22. 8 : 1. 4 :1 高糖藻粉中 9 種單糖比例：2. 8 :1. 7 :1. 6 :1. 7 :1. 6 :2. 8 :73. 3 :1. 1 :1。
[0028] 圖2中，a :普通螺旋藻多糖；b :制備的新型螺旋藻多糖。
【具體實施方式】
[0029] 以下通過實施例來進一步闡述【具體實施方式】，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0030] 實施例1螺旋藻多糖的提取
[0031] 1.取高糖螺旋藻藻粉10g，采用水作為提取液，攪拌溶解至螺旋藻充分溶脹（固液 比1:30)，常溫條件下高壓勻質(zhì)，壓力為80MPa，連續(xù)3次。
[0032] 2.高壓勻質(zhì)液用80°C熱水浸提法提取螺旋藻水溶性多糖，浸提時間為4h，提取后 6000rpm高速離心20min，去除沉沉物，收集上清。
[0033] 3.采用絮凝劑除蛋白，絮凝劑為聚硅酸硫酸鐵和ZTC1+1 (A組分和B組分，由北京 中科圣源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）聯(lián)用，用前24h分別配制成1 %溶液，在絮凝時先后添加， 絮凝劑添加量分別為多糖溶液體積的1 %，3. 5 % (B組分）和2 % (A組分），絮凝時間為2h。
[0034] 4.絮凝后采用高速離心去除沉淀物，收集上清后在60°C，轉(zhuǎn)速SOrpm的條件下旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的1/3,加入3倍體積95%乙醇，5000rpm離心15min，得到沉淀部分， 最后直接進行干燥，得到螺旋藻水溶性固體，采用硫酸-苯酚法分析其多糖純度為95%，多 糖收率為90%。
[0035] 5.采用高效凝膠過濾色譜法測定該多糖的相對分子質(zhì)量為12、37、64、93和 163KDa，采用氣相色譜法測定其單糖組成及摩爾比為鼠李糖：巖藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘 露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2.8 :1. 7 :1. 6 :1. 7 :1. 6 :2. 8 :73. 3 : 1. 1 :1〇
[0036] 實施例2螺旋藻多糖的提取
[0037] 1.取高糖螺旋藻藻粉10g，采用水作為提取液，攪拌溶解至螺旋藻充分溶脹（固液 比1:40)，常溫條件下高壓勻質(zhì)，壓力為80MPa，連續(xù)3次。
[0038] 2.高壓勻質(zhì)液用90°C熱水浸提法提取螺旋藻水溶性多糖，浸提時間為4h，提取后 6000rpm高速離心20min，去除沉沉物，收集上清。
[0039] 3.采用絮凝劑除蛋白，絮凝劑為聚硅酸鐵，絮凝劑添加量分別為多糖溶液體積的 2%，絮凝時間為2h。
[0040] 4.絮凝后采用高速離心去除沉淀物，收集上清后在60°C，轉(zhuǎn)速SOrpm的條件下旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的1/3,加入3倍體積95%乙醇，5000rpm離心15min，得到沉淀部分， 最后直接進行干燥，得到螺旋藻水溶性固體，采用硫酸-苯酚法分析其多糖純度為89%，多 糖收率為91%。
[0041] 5.采用高效凝膠過濾色譜法測定該多糖的相對分子質(zhì)量為12、36、63、95和 163KDa，采用氣相色譜法測定其單糖組成及摩爾比為鼠李糖：巖藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘 露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2. 2:1.4 :1. 4 :1. 5 :1. I :2. 6 :68.4 : 1.0 :1〇
[0042] 實施例3螺旋藻多糖誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒試驗
[0043] (1)噴霧處理：將實施例1制備的螺旋藻多糖分別用水稀釋得到濃度為0. 1~ 0. 5mg/mL的溶液，然后分別對六至八葉期的枯斑三生煙進行全株噴霧，設(shè)三個重復(fù)，每個重 復(fù)三株；同時以同等濃度海帶多糖作為對照，空白組用清水噴霧。
[0044] (2)病毒接種液的制備：病毒來源為本研究室保存普通株系，將感染煙草花葉病 毒的普通煙的葉片去除主脈，與PBS(pH8. 0, 0.0 lmol/L)按lg/20mL混合，每20mLPBS加 0. 015g金剛砂，充分研磨葉片，得到接種液。
[0045] (3)接種：按步驟⑴方法噴霧處理枯斑三生煙植株72h后，用步驟⑵得到的接 種液進行汁液摩擦接種（植病研究方法（第三版）