專利名稱：棉酚及其衍生物在制備治療白血病/骨髓瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，特別涉及一種棉酚及其衍生物在制備治療白血病/骨髓瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前臨床癌癥的主要治療方法是化學(xué)藥物治療，即大劑量DNA損傷劑的應(yīng)用。這種方法副作用很大，因?yàn)榛焺┰跉┌Y細(xì)胞的同時(shí)也大量破壞正常細(xì)胞。不僅如此，腫瘤細(xì)胞在治療過程中會(huì)產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致癌癥的復(fù)發(fā)。因此，尋找能選擇性殺傷癌癥細(xì)胞，特別是耐常規(guī)化療藥物的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。
癌癥抗藥性的原因較多。最新的研究表明，癌癥的抗藥性與癌癥細(xì)胞的凋亡異常有關(guān)，其中Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的精細(xì)調(diào)控中起著非常重要的作用。該家族蛋白包含兩類功能相反的蛋白一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2和Bcl-xL等十余個(gè)成員；另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bid和Bad等十余個(gè)成員?？沟蛲龅鞍兹鏐cl-2和Bcl-xL通過其BH3結(jié)構(gòu)域能與一定數(shù)目的促凋亡蛋白如Bak、Bid、Bad、Bax形成異二聚體，它們的相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的凋亡或生存。臨床研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bcl-xL蛋白表達(dá)異常與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，許多腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2/Bcl-xL蛋白，另外，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bcl-xL表達(dá)的增多也與癌細(xì)胞抵抗廣譜化療藥物以及放療相關(guān)。因此，Bcl-2/Bcl-xL已經(jīng)是目前國際上開發(fā)抗癌藥物的一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)，其研發(fā)工作集中在如何抑制Bcl-2/Bcl-xL活性或降低其表達(dá)水平，來誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到治療的目的。
棉酚及其衍生物是一種具有廣泛藥理作用的多元酚類化合物，大量的研究表明，棉酚及其衍生物具有抗生育、抗炎癥、抗病毒、抗寄生蟲的作用。另外，棉酚及其衍生物還具有殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，如中國專利ZL97105968.3、美國專利US6114397A中所述，目前國內(nèi)外對(duì)棉酚及其衍生物殺傷腫瘤細(xì)胞活性的研究主要集中在男女生殖系統(tǒng)的腫瘤，如宮頸癌、子宮肌瘤、卵巢癌、乳腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、前列腺癌，睪丸癌。但對(duì)棉酚及其衍生物在治療白血病/骨髓瘤中的應(yīng)用，特別是有效殺傷BcL-2高表達(dá)的白血病細(xì)胞的研究，尚未見報(bào)道以及專利的申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供棉酚及其衍生物在制備治療白血病/骨髓瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的棉酚的結(jié)構(gòu)式如下 其衍生物為醋酸棉酚或甲酸棉酚。
本發(fā)明是通過建立細(xì)胞凋亡的技術(shù)平臺(tái)，從中藥庫中和化學(xué)藥庫中近10000個(gè)化合物中篩選出棉酚及其衍生物，并通過一系列實(shí)驗(yàn)證明其為具有細(xì)胞通透性、非免疫原性的小分子化合物，能夠抑制腫瘤細(xì)胞Bcl-2/Bcl-xL的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到腫瘤治療的目的。
本發(fā)明的優(yōu)益之處在于棉酚及其衍生物能有效殺傷具有抗藥性的白血病/骨髓瘤癌癥細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有殺傷能力，并且特別適用于耐常規(guī)化療藥物的癌癥病人和癌癥復(fù)發(fā)病例。


圖1是腫瘤細(xì)胞的生長與棉酚濃度的關(guān)系圖；其中“-◆-”代表骨髓瘤細(xì)胞IM9/BcL-2，“-■-”代表骨髓瘤細(xì)胞U266，“-▲-”代表白血病細(xì)胞HL60。
圖2是腫瘤細(xì)胞的生長與醋酸棉酚濃度的關(guān)系圖；其中“-◆-”代表骨髓瘤細(xì)胞IM9/BcL-2，“-■-”代表骨髓瘤細(xì)胞U266，“-▲-”代表白血病細(xì)胞HL60。
圖3是凋亡細(xì)胞與棉酚濃度的關(guān)系圖；其中“-◆-”代表骨髓瘤細(xì)胞IM9/BcL-2，
“-■-”代表骨髓瘤細(xì)胞U266，“-▲-”代表白血病細(xì)胞HL60。
圖4是棉酚和醋酸棉酚處理的IM9/Bcl-2細(xì)胞線粒體膜勢(shì)能與處理時(shí)間的關(guān)系圖；其中“-◆-”代表棉酚，“-■-”代表醋酸棉酚。
圖5是棉酚引起的鼠肝臟線粒體細(xì)胞色素C的釋放與棉酚濃度的關(guān)系；圖6是特異性抑制劑CsA和Bcl-xL能夠完全抑制棉酚誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放；圖7是棉酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3裂解為17kD的小片斷。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、新的Bcl-2/Bcl-xL小分子抑制劑棉酚及其衍生物醋酸棉酚的鑒定建立競(jìng)爭(zhēng)性與Bcl-xL結(jié)合的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將人重組的Bcl-xL蛋白包被在96孔板上，加入FITC標(biāo)記的人Bid-BH3多肽，其氨基酸序列為Ile Ile Arg Asn Ile Ala ArgHis Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg，再加入中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心提供的10000種不同的待選小分子化合物，進(jìn)行反應(yīng)，使用熒光分光光度計(jì)POLAR STAR檢測(cè)96孔板的熒光變化，如果小分子化合物能夠抑制FITC-Bid-BH3與Bcl-xL的結(jié)合，則FITC-Bid-BH3熒光強(qiáng)度明顯減弱，經(jīng)過初步的篩選，15種小分子化合物能夠強(qiáng)有力地抑制FITC-Bid-BH3與Bcl-xL的結(jié)合，其中棉酚及醋酸棉酚的的抑制活性最強(qiáng)，IC50為7.2μM，因此篩選出做進(jìn)一步做細(xì)胞水平的研究。
將棉酚和醋酸棉酚與Bcl-2高表達(dá)的人多發(fā)性骨髓瘤IM9細(xì)胞(轉(zhuǎn)染人Bcl-2cDNA的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系IM9/BcL-2)在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)，加入MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)，ELISA讀板機(jī)在490nm波長下分析不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的生長抑制情況。結(jié)果表明，小分子化合物棉酚及其衍生物醋酸棉酚具有細(xì)胞膜通透性，能夠拮抗Bcl-2的生物學(xué)功能，有效地抑制IM9/Bcl-2細(xì)胞的增殖。這進(jìn)一步證明棉酚和醋酸棉酚就是我們要篩的新的Bcl-2/Bcl-xL小分子抑制劑。根據(jù)圖1所示的腫瘤細(xì)胞的生長與棉酚濃度的關(guān)系圖，說明棉酚能夠有效抑制Bcl-2高表達(dá)的IM9/Bcl-2細(xì)胞、人骨髓瘤細(xì)胞U266和白血病細(xì)胞HL60細(xì)胞的增殖，并呈濃度依賴性關(guān)系。根據(jù)圖2所示的腫瘤細(xì)胞的生長與醋酸棉酚濃度的關(guān)系圖，說明醋酸棉酚也能夠有效抑制Bcl-2高表達(dá)的IM9/Bcl-2細(xì)胞、人骨髓瘤細(xì)胞U266和白血病細(xì)胞HL60細(xì)胞的增殖，并呈濃度依賴性關(guān)系。上述研究表明，棉酚和醋酸棉酚能夠抑制人白血病/骨髓瘤細(xì)胞的增殖，特別是能夠特異地抑制Bcl-2/Bcl-xL高表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞生長。
實(shí)施例2、棉酚及其衍生物醋酸棉酚誘導(dǎo)Bcl-2高表達(dá)的人骨髓瘤細(xì)胞及其它白血病細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)接著我們研究了棉酚和醋酸棉酚能否誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。我們應(yīng)用目前國內(nèi)外普遍使用的AnnexinV染色這一檢測(cè)指標(biāo)，來定量檢測(cè)棉酚和醋酸棉酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。將不同種類的人骨髓瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞接種在24孔板中，加入不同濃度的棉酚或醋酸棉酚處理48小時(shí)，PBS洗兩次，加入FITC標(biāo)記的AnnexinV，利用流式細(xì)胞計(jì)(FACSCalibur)檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。由圖3凋亡細(xì)胞與棉酚濃度的關(guān)系圖所示，棉酚在48小時(shí)內(nèi)能有效地誘導(dǎo)IM9/Bcl-2骨髓瘤細(xì)胞、U266細(xì)胞和HL60細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。棉酚濃度在20μM時(shí)，80％以上的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。從表1的研究結(jié)果可以看出，棉酚的衍生物醋酸棉酚也能殺傷Bcl-2高表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞和其它白血病細(xì)胞，并呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。另外，臨床常規(guī)應(yīng)用的抗癌藥物如VP16，順鉑等不能誘導(dǎo)Bcl-2高表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡。將棉酚和醋酸棉酚與分離的正常人的外周血白細(xì)胞孵育，也未出現(xiàn)細(xì)胞毒效應(yīng)。上述研究表明，棉酚及其衍生物醋酸棉酚對(duì)白血病/骨髓瘤細(xì)胞具有特異殺傷效應(yīng)，尤其是能夠殺傷Bcl-2/Bcl-xL高表達(dá)的耐常規(guī)藥物的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常人外周血白細(xì)胞無明顯殺傷作用。
表1 醋酸棉酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與其濃度依賴關(guān)系醋酸棉酚(48h)0μM 2.5μM5μM10μM20μMIM9/Bcl-24.56±2.78* 11.25±4.23 20.98±3.44 32.56±5.89 60.35±10.62HL60 12.62±4.18 23.25±6.29 40.91±8.57 59.17±7.39 82.08±11.79U266 14.06±5.14 21.17±5.16 35.41±8.11 53.42±6.59 79.81±9.21*凋亡細(xì)胞百分率，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差實(shí)施例3、棉酚及其衍生物醋酸棉酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是經(jīng)過線粒體途徑
(1)棉酚及其衍生物醋酸棉酚能夠引起細(xì)胞線粒體膜勢(shì)能的下降將棉酚及其衍生物醋酸棉酚處理的IM9/Bcl-2細(xì)胞與熒光探針3，3’-dihexyloxacarbocynin iodide[DiOC6(3)]一起孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱，檢測(cè)線粒體膜勢(shì)能的變化，如圖3所示，棉酚及其衍生物醋酸棉酚處理的IM9/Bcl-2細(xì)胞線粒體膜勢(shì)能與處理時(shí)間的關(guān)系圖表明，兩者均能導(dǎo)致線粒體膜勢(shì)能(Δψm)的下降，且呈時(shí)間依賴性關(guān)系，處理16小時(shí)后線粒體膜勢(shì)能下降了80％。
通過差速離心法分離細(xì)胞內(nèi)線粒體，進(jìn)行的無細(xì)胞體系實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，棉酚能快速引起線粒體膜勢(shì)能的下降，而重組的人Bcl-xL蛋白能夠抑制棉酚引起的線粒體膜勢(shì)能的下降，上述研究結(jié)果表明棉酚是具有線粒體毒性的藥物，其作用的靶點(diǎn)在線粒體外膜蛋白Bcl-xL上。
(2)棉酚能夠引起線粒體細(xì)胞色素C的釋放將健康的Balb/C鼠斷頸處死，迅速取出肝臟，勻漿，應(yīng)用差速離心法提取線粒體，Western Blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素C釋放的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，棉酚引起的鼠肝臟線粒體細(xì)胞色素C的釋放與棉酚濃度的關(guān)系表明棉酚能夠引起線粒體細(xì)胞色素C的釋放，并呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。
由圖6可見，PTP孔開放的特異性抑制劑(CsA)和Bcl-xL，能夠完全阻斷棉酚引起的細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)一步說明棉酚是直接作用于線粒體的細(xì)胞毒性藥物，其作用靶點(diǎn)是線粒體外膜蛋白Bcl-xL。
實(shí)施例4、棉酚引起的細(xì)胞凋亡部分是由Caspase介導(dǎo)的將人骨髓瘤細(xì)胞系IM9-Bcl-2細(xì)胞接種在24孔板中，加入20μM棉酚處理不同時(shí)間，檢測(cè)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中Caspase的活化情況，以及Caspase抑制劑z-VAD-fmk對(duì)棉酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制情況。結(jié)果顯示棉酚處理IM9/BcL-2細(xì)胞4小時(shí)，Caspase-3的活性明顯升高，同時(shí)出現(xiàn)Caspase-3酶原的裂解，裂解為17kD的小片斷，見圖7，說明棉酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是有Caspase-3介導(dǎo)的。Caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk只能部分抑制IM9/Bcl-2細(xì)胞的凋亡，抑制率為30％～40％。研究表明，棉酚引起的Bcl-2/Bcl-xL高表達(dá)細(xì)胞的凋亡存在Caspase-依賴和Caspase-非依賴的兩種形式。
利用細(xì)胞凋亡的技術(shù)平臺(tái)和理論，采用高通量的大規(guī)模篩選檢測(cè)體系，從中藥和化學(xué)合成藥物庫中鑒定出了具有細(xì)胞通透性、非免疫原性的棉酚及其衍生物醋酸棉酚，它能特異地結(jié)合細(xì)胞線粒體外膜蛋白Bcl-xL，拮抗Bcl-2/Bcl-xL的活性，促使Bcl-2家族蛋白形成的膜孔道開放，細(xì)胞色素C釋放，隨后激活Caspase-9以及凋亡執(zhí)行分子caspase-3，最后導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。由于棉酚及其衍生物醋酸棉酚能夠有效地殺傷Bcl-2高表達(dá)的骨髓瘤/白血病細(xì)胞，而對(duì)人正常的白細(xì)胞無毒副作用。因此我們相信，棉酚和其衍生物是潛在的具有發(fā)展前景的抗白血病新藥，特別是對(duì)常規(guī)化療藥物有耐藥性的骨髓瘤和白血病細(xì)胞的治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。
甲酸棉酚殺腫瘤細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)與棉酚和醋酸棉酚一樣。
研究表明，醋酸棉酚能夠抑制白血病/骨髓瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)高表達(dá)Bcl-2分子的IM9骨髓瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常人的外周血白細(xì)胞無明顯毒副作用，甲酸棉酚的殺腫瘤細(xì)胞活性呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞方面，甲酸棉酚能夠引起線粒體膜勢(shì)能的下降，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c釋放，隨后引起caspase-9以及凋亡執(zhí)行分子caspase-3的活化，后者裂解胞漿和胞核的底物，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此棉酚及其衍生物醋酸棉酚和甲酸棉酚均是潛在的抗白血病/骨髓瘤藥物。
權(quán)利要求
1.棉酚及其衍生物在制備治療骨髓瘤/白血病藥物中的應(yīng)用，所述的棉酚的結(jié)構(gòu)式如下 所述的棉酚衍生物為醋酸棉酚或甲酸棉酚。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉酚及其衍生物在制備治療白血病/骨髓瘤藥物中的應(yīng)用。所述的棉酚的結(jié)構(gòu)式如右式,所述的棉酚衍生物為醋酸棉酚或甲酸棉酚；本發(fā)明的優(yōu)益之處在于棉酚及其衍生物能有效殺傷具有抗藥性的白血病/骨髓瘤癌癥細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有殺傷能力，并且特別適用于耐常規(guī)化療藥物的癌癥病人和癌癥復(fù)發(fā)病例。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1565432SQ0314255
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月11日
發(fā)明者陳英玉, 雷曉波, 陳佺, 王曉惠, 金海京, 杜冠華, 尚念勇 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院動(dòng)物研究所, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所