慢病毒載體介導(dǎo)pedf在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，該方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc以及將慢病毒包裝、純化，通過分子影像學(xué)技術(shù)，在體外和體內(nèi)實(shí)時、動態(tài)、定量地觀察慢病毒介導(dǎo)的PEDF基因抑制腎癌干細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡的過程，發(fā)現(xiàn)能夠明顯抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，并活體觀測PEDF基因治療腎細(xì)胞癌原位移植瘤的效果，本發(fā)明介導(dǎo)PEDF的重組慢病毒載體可能成為腎細(xì)胞癌基因治療的有力工具。
【專利說明】慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行 轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 分子影像學(xué)（molecular imaging，MI)的概念，是指活體狀態(tài)下在細(xì)胞和分子水平 上應(yīng)用影像學(xué)方法對體內(nèi)分子的生物化學(xué)過程進(jìn)行定性和定量研究可以直觀地顯示特定 分子在體內(nèi)的生物學(xué)行為。在分子影像學(xué)誕生之前，無法觀察活體內(nèi)微小腫瘤病灶和早期 的微轉(zhuǎn)移，更無法直觀、無創(chuàng)地觀察腫瘤細(xì)胞在活體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等變化。分子影 像學(xué)不僅可以可以解決以上問題，還可以在活體動物上獲取腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移 機(jī)制方面的分子生物學(xué)信息。生物發(fā)光成像儀是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)分子、基因表達(dá)的 分析檢測系統(tǒng)，可以將報告基因即熒光素酶（Luciferase，Luc)基因通過IRES和目的基因 相連，當(dāng)體內(nèi)報告基因表達(dá)后，產(chǎn)生螢火蟲素酶，同時外源注入相應(yīng)的底物后，螢火蟲素酶 與螢火蟲素酶反應(yīng)將產(chǎn)生熒光，利用生物發(fā)光成像儀就可以檢測到此熒光，從而反映目的 基因的表達(dá)。此類技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是無輻射，可以連續(xù)、實(shí)時、無創(chuàng)、定量、直觀地檢測腫瘤 細(xì)胞的生物學(xué)行為，因?yàn)橹挥袌蟾婊虻谋磉_(dá)產(chǎn)物與底物（如D-luciferin)發(fā)生反應(yīng)才能 檢測到信號，所以只對活的細(xì)胞成像，且沒有背景噪聲的影響。分子成像技術(shù)具有以上諸多 優(yōu)點(diǎn)，所以可將此技術(shù)應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究。將分子成像研究引入腎癌干細(xì)胞基因治療 具有其他方法無可比擬的優(yōu)勢，將解決在活體內(nèi)無創(chuàng)、實(shí)時、直觀、定量地檢測腎癌干細(xì)胞 的各種生物學(xué)行為的難題。
[0003] 腎癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，近年來腎癌發(fā)病率與致死率呈逐年上升。 由于對其發(fā)生、發(fā)展和惡化機(jī)理的研究一直未見明顯突破，加之腎癌對放射治療和化 學(xué)治療都不敏感，所以腎癌的基因治療顯得尤為重要。色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor, PEDF)是目前已知的人體最強(qiáng)的血管生長抑制因子，是 最有希望成為治療腫瘤和血管增生性疾病的候選基因。PEDF屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑 (Serpin)家族蛋白。PEDF對維持眼內(nèi)組織無血管狀態(tài)具有重要作，可能是維持角膜，玻璃 體等眼內(nèi)組織無血管形成的主要原因。在大鼠脈絡(luò)膜新生血管（CNV)模型中，注入編碼 PEDF基因的Adenovirus (Ad-PEDF)，能在視網(wǎng)膜表達(dá)PEDF蛋白和mRNA，使CNV受到顯著抑 制。正常視網(wǎng)膜組織中VEGF和PEDF含量保持平衡，VEGF和PEDF比值改變與新生血管形 成程度呈正相關(guān)，表明PEDF作為血管抑制劑參與了血管形成的調(diào)控。
[0004] PEDF抑制腫瘤細(xì)胞生長主要通過：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途 徑。最近研究顯示：PEDF可以調(diào)節(jié)I κ B磷酸化，或者使其降解，從而調(diào)節(jié)NF-κ B活性。 Morais等研究發(fā)現(xiàn)NF- κ B的激活可以促進(jìn)腎癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并且他們發(fā)現(xiàn)用四氫 吡咯二硫代氨基甲酸鹽（PDTC)抑制NF-κΒ的活性，具有抑制腎癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡 的作用。在基因治療過程中，基因表達(dá)的作用在很大程度上受到轉(zhuǎn)染效率的限制，提高轉(zhuǎn)染 效率是一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，不但能感染分裂期的細(xì)胞并整合 到其基因組中，而且還可以感染非分裂期的細(xì)胞。
[0005] 目前慢病毒作為載體包裝質(zhì)粒技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域?，F(xiàn)有技術(shù)中未 見報道慢病毒介導(dǎo)的靶向PEDF在在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。通過上述研究有望 為腎癌的治療提供一個新的方法，也為臨床應(yīng)用PEDF基因治療腎癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用的方 法，達(dá)到利用慢病毒作為載體包裝質(zhì)粒抑制腎癌細(xì)胞增殖的目的。
[0007] 慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，該方法主要步驟如下： [0008] (1)采用RT-PCR擴(kuò)增PEDF、IRES、Luc基因，測序并鑒定，將其導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增；
[0009] (2)采用Luciferase PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI接入pBobi載體，得到 pBobi-Luc，構(gòu)建pBobi-Luc載體，對pBobi-Luc(+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定；
[0010] (3)采用PEDF PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI接入pBobi載體，得到 pBobi-PEDF ;Luciferase PCR 產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 BamHI/XhoI 接入 pcDNA3. 1 (+)，得 至lj pN31-Luc ;IRES PCR 產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 BamHI/XhoI 接入 pN31-Luc，得到 pN31-IL ; 以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入Xhol單酶切的pBobi-PEDF，構(gòu)建 pBobi-PEDF-IRES-Luc 載體，對 pBobi-PEDF-IRES-Luc (+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定；
[0011] (4)分別對pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重組質(zhì)粒進(jìn)行包裝，得到 Lenti_Luc 病毒及 Lenti_PEDF_Luc 病毒。
[0012] (5)將Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒導(dǎo)入進(jìn)行裸鼠腎癌治療試驗(yàn)和腎癌 細(xì)胞試驗(yàn)。
[0013] 所述步驟⑴中擴(kuò)增所需引物分別為：
[0014] Lucf：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA ；
[0015] Lucr ：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC ；
[0016] IRESF ：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC ；
[0017] IRESr :TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
[0018] 步驟（5)所述的裸鼠腎癌治療試驗(yàn)，針對人PEDF基因的質(zhì)粒治療腎癌裸鼠移植瘤 模型的建立及治療的給藥方式及劑量，并利用分子影像學(xué)技術(shù)無輻射，可以連續(xù)、實(shí)時、無 倉ij、直觀地監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為及治療效果。
[0019] 步驟（5)所述的腎癌細(xì)胞試驗(yàn)，應(yīng)用慢病毒將熒光酶基因 PEDF導(dǎo)入腎癌細(xì)胞，并 整合到染色體中穩(wěn)定表達(dá)，通過精諾真生物發(fā)光分子成像儀，采集Luc基因標(biāo)記的腫瘤細(xì) 胞內(nèi)生物發(fā)光信號，使標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，可以精確定量分析腎癌細(xì)胞治 療效果。
[0020] 所述的PEDF基因的質(zhì)粒構(gòu)建，能夠有效抑制腎癌細(xì)胞的體外侵襲、遷移、增殖和 凋亡，抑制腎癌原位移植瘤的生長。
[0021] 本研究應(yīng)用分子影像學(xué)技術(shù)，分別從細(xì)胞水平和動物實(shí)驗(yàn)方面驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo) PEDF (Lent i-PEDF)誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡和抑制腎癌組織血管生成的作用，并檢測PEDF對 I κ B/NF-κ B/Telomerase信號傳導(dǎo)路徑的影響程度與誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以闡明 PEDF誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理，同時應(yīng)用AS203治療作為化療組與基因治療組作對 t匕，具有顯著療效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是利用慢病毒載體介導(dǎo)PEDF抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中作用流程圖；
[0023] 圖2是體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lenti-PEDF抑制腎癌細(xì)胞生長；
[0024] 圖3是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用腎細(xì)胞癌裸鼠模型證實(shí)Lenti-PEDF抑制腎癌細(xì)胞生長。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明；慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞 癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，該方法主要步驟如下：
[0026] (1)采用RT-PCR擴(kuò)增PEDF、IRES、Luc基因，測序并鑒定，將其導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增；
[0027] (2)采用Luciferase PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI接入pBobi載體，得到 pBobi-Luc，構(gòu)建pBobi-Luc載體，對pBobi-Luc(+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定；
[0028] (3)采用PEDF PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI接入pBobi載體，得到 pBobi-PEDF ;Luciferase PCR 產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 BamHI/XhoI 接入 pcDNA3. 1 (+)，得 至lj pN31-Luc ;IRES PCR 產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 BamHI/XhoI 接入 pN31-Luc，得到 pN31-IL ; 以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入Xhol單酶切的pBobi-PEDF，構(gòu)建 pBobi-PEDF-IRES-Luc 載體，對 pBobi-PEDF-IRES-Luc (+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定；
[0029] (4)分別對pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重組質(zhì)粒進(jìn)行包裝，得到 Lenti_Luc 病毒及 Lenti_PEDF_Luc 病毒。
[0030] (5)將Lenti-Luc病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒導(dǎo)入進(jìn)行裸鼠腎癌治療試驗(yàn)和腎癌 細(xì)胞試驗(yàn)。
[0031] 所述步驟⑴中擴(kuò)增所需引物分別為：
[0032] Lucf ：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA ；
[0033] Lucr ：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC ；
[0034] IRESF ：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC ；
[0035] IRESr :TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
[0036] 步驟（5)所述的裸鼠腎癌治療試驗(yàn)，針對人PEDF基因的質(zhì)粒治療腎癌裸鼠移植瘤 模型的建立及治療的給藥方式及劑量，并利用分子影像學(xué)技術(shù)無輻射，可以連續(xù)、實(shí)時、無 倉ij、直觀地監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為及治療效果。
[0037] 步驟（5)所述的腎癌細(xì)胞試驗(yàn)，應(yīng)用慢病毒將熒光酶基因 PEDF導(dǎo)入腎癌細(xì)胞，并 整合到染色體中穩(wěn)定表達(dá)，通過精諾真生物發(fā)光分子成像儀，采集Luc基因標(biāo)記的腫瘤細(xì) 胞內(nèi)生物發(fā)光信號，使標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，可以精確定量分析腎癌細(xì)胞治 療效果。
[0038] 所述的PEDF基因的質(zhì)粒構(gòu)建，能夠有效抑制腎癌細(xì)胞的體外侵襲、遷移、增殖和 凋亡，抑制腎癌原位移植瘤的生長。
[0039] 實(shí)施例：
[0040] 第一階段：腎癌干細(xì)胞的分離和篩選
[0041] 臨床腎癌組織標(biāo)本中分離和篩選腎癌干細(xì)胞。取臨床腎癌瘤體組織深部無囊性 變、無壞死的腫瘤組織標(biāo)本，置于腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基中。修剪去除外周壞死組織，培養(yǎng)基沖 洗，剪碎，微量加樣器反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，100微米孔徑篩網(wǎng)過濾，取單細(xì)胞以2*107接 種。飽和濕度培養(yǎng)，待培養(yǎng)基中懸浮的單克隆細(xì)胞團(tuán)形狀規(guī)則后，棄貼壁細(xì)胞，吸取培養(yǎng)基 并離心后，重懸，按比例傳代。擴(kuò)增后流式細(xì)胞術(shù)（FACS)檢測⑶133及NCAM等腎癌干細(xì)胞 表面標(biāo)志物，分選腎癌干細(xì)胞。
[0042] 第二階段：組織收集
[0043] 術(shù)中收集腎癌組織（分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組）、癌旁組織和正常腎臟組織共4組標(biāo) 本，應(yīng)用 RT_PCR、Western Blot、免疫組化等方法檢測標(biāo)本中 CD34、VEGF、PI3K、Telomerase、 NF-κ B、Fas、caspase-3家族等基因的表達(dá)。以上4組標(biāo)本中PEDF表達(dá)水平在前期工作已 經(jīng)完成，其結(jié)果為以下實(shí)驗(yàn)提供可靠的理論依據(jù)。
[0044] 第三階段：PEDF基因誘導(dǎo)腎癌干細(xì)胞的凋亡的體外實(shí)驗(yàn)
[0045] 1. Lenti-Luc 及 Lenti-PEDF-Luc 慢病毒載體的構(gòu)建：
[0046] (1)重組質(zhì)粒 pBobi-Luc 及 pBobi-PEDF-IRES-Luc 的構(gòu)建
[0047] 1)設(shè)計引物，RT-PCR擴(kuò)增PEDF、IRES、Luc基因，測序并鑒定，并將 其導(dǎo)入質(zhì)粒擴(kuò)增：引物分別為：Lucf :TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA ;Lucr : TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC ；IRESF ：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC ；IRESr ： TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
[0048] 2) pBobi-Luc 載體構(gòu)建：Luciferase PCR 產(chǎn)物以 BamHI/XhoI 接入 pBobi 載體，得 到pBobi-Luc,構(gòu)建pBobi-Luc載體。對pBobi_Luc(+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提取和純化，測定DNA 的濃度與純度。
[0049] 3)pBobi-PEDF-IRES-Luc 載體構(gòu)建：PEDF PCR 產(chǎn)物以 BamHI/XhoI 接入 pBobi 載 體，得到 pBobi-PEDF ;Luciferase PCR 產(chǎn)物以 BamHI/XhoI 接入 pcDNA3. 1+，得到 pN31-Luc ; IRES PCR 產(chǎn)物以 BamHI/XhoI 接入 pN31-Luc，得到 pN31-IL 以 BamHI/XhoI 酶切 pN31-IL，得 到 IRES-Luc 片段，接入 Xhol 單酶切的 pBobi-PEDF，構(gòu)建 pBobi-PEDF-IRES-Luc 載體。對 pBobi-PIL(+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定及病毒包裝。
[0050] (2)慢病毒包裝及低度測定
[0051] 分別對 pBobi-Luc 及 pBobi-PEDF-IRES-Luc 重組質(zhì)粒進(jìn)行包裝，得到 Lenti-Luc 病毒及Lenti-PEDF-Luc病毒，純化，滴度測定。
[0052] 2.將腎癌干細(xì)胞分為A、B、C、D四組。A :基因治療組（Lenti-PEDF-Luc轉(zhuǎn)染腎癌 干細(xì)胞）:對照組（Lenti-Luc轉(zhuǎn)染腎癌干細(xì)胞）；C :PBS空白對照組；D :化療組（As203 化療組）。
[0053] 3.觀察以上四組治療后腎癌干細(xì)胞生長、凋亡、侵襲、遷移及相關(guān)血管活性因子等 各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況：
[0054] (l)MTT法檢測腎癌干細(xì)胞增殖抑制率
[0055] (2)流式細(xì)胞儀檢測腎癌干細(xì)胞的凋亡情況
[0056] (3)ELISA檢測細(xì)胞上清液的血管活性因子VEGF
[0057] (4)腎癌干細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)：將腎癌干細(xì)胞平鋪于有明膠的Transwell小室， 培養(yǎng)后應(yīng)用精諾真可見光成像儀觀察細(xì)胞向明膠內(nèi)的侵襲情況;Western Blot法檢測 MMP-2、MMP-9 表達(dá)
[0058] (5)使用熒光定量PCR和Western Blot等方法，檢測PEDF和As203誘導(dǎo)腎癌干細(xì) 胞凋亡相關(guān)因子NF- κ B、Fas、caspase-3、Telomerase等的變化。
[0059] 第四階段：PEDF基因誘導(dǎo)腎癌干細(xì)胞凋亡的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0060] 1.建立動物模型：以1 %水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射麻醉BALC/c裸鼠，75%酒精消 毒裸鼠背部皮膚，剪開裸鼠背側(cè)皮膚，暴露腎臟，用微量加樣器將2*106 Luc標(biāo)記的腎癌干 細(xì)胞制成200 μ 1懸液注射于4周齡裸鼠的腎實(shí)質(zhì)內(nèi)，縫合皮膚后置于SPF條件下繼續(xù)飼 養(yǎng)。
[0061] 2.動物模型分組和治療方案：腎癌干細(xì)胞懸液接種2周后，應(yīng)用精諾真可見光成 像儀觀察裸鼠成瘤，通過鼠尾靜脈對腎癌干細(xì)胞原位移植瘤分別進(jìn)行治療。70只裸鼠（每 組10只）堆積分為A、B、C、D、E、F、G 7組，鼠尾靜脈給藥，連續(xù)7天，每天一次。給藥劑量 如下：
[0062] A、Lenti-PEDF載體治療組（注射含慢病毒2*107TU的PBS 200 μ 1);
[0063] B、Lenti-PEDF載體治療組（注射含慢病毒5*107TU的PBS 200 μ 1);
[0064] C、空病毒對照組（注射慢病毒2*107TU的PBS 200 μ 1);
[0065] D、空病毒對照組（注射慢病毒5*107TU的PBS 200 μ 1);
[0066] E、PBS 空白對照組（注射 PBS 200 μ 1);
[0067] F、As203 化療組（2mg/kg);
[0068] G、As203 化療組（8mg/kg)?！?br> [0069] 3.基因治療療效評估及凋亡相關(guān)因子檢測
[0070] (1)光學(xué)分子成像：應(yīng)用精諾真可見光成像儀對7組腎癌干細(xì)胞原位移植瘤模型 治療效果（腫瘤區(qū)熒光強(qiáng)度）進(jìn)行定量分析及評價
[0071] ⑵測量腫瘤體積和重量，繪制各處理組腫瘤生長曲線
[0072] (3)免疫組化法檢測各組腫瘤MVD及VEGF表達(dá)水平
[0073] (4) Western Blot 法檢測 MMP-2、MMP-9 表達(dá)
[0074] (5)使用熒光定量PCR、Western Blot檢測腎癌干細(xì)胞凋亡相關(guān)因子PI3K、 NF- κ B、Fas、caspase-3、Telomerase 等的變化。
【權(quán)利要求】
1. 慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于：該方法主要 止 少 驟如下： (1) 采用RT-PCR擴(kuò)增PEDF、IRES、Luc基因，測序并鑒定，將其導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增； (2) 采用Luciferase PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI接入pBobi載體，得到 pBobi-Luc，構(gòu)建pBobi-Luc載體，對pBobi-Luc(+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定； (3) 采用PEDF PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI接入pBobi載體，得到 pBobi-PEDF ;Luciferase PCR 產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 BamHI/XhoI 接入 pcDNA3. 1 (+)，得 到 pN31-Luc ;IRES PCR 產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 BamHI/XhoI 接入 pN31-Luc，得到 pN31-IL ; 以BamHI/XhoI酶切pN31-IL，得到IRES-Luc片段，接入Xhol單酶切的pBobi-PEDF，構(gòu)建 pBobi-PEDF-IRES-Luc 載體，對 pBobi-PEDF-IRES-Luc (+)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提純，鑒定； (4) 分別對pBobi-Luc及pBobi-PEDF-IRES-Luc重組質(zhì)粒進(jìn)行包裝，得到Lenti-Luc病 毒及 Lenti_PEDF_Luc 病毒。 (5) 將Lenti-Luc病毒及Lenti-PE：DF-Luc病毒導(dǎo)入進(jìn)行裸鼠腎癌治療試驗(yàn)和腎癌細(xì)胞 試驗(yàn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)TODF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其 特征在于：所述步驟（1)中擴(kuò)增所需引物分別為： Lucf ：TTTGGATCCCCATGGAAGACGCCAAAA ； Lucr ：TTTCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC ； IRESF ：TTTAAGCTTCCAATTCCGCCCCTC ； IRESr : TTTGGATCCGCTTATCATCGTGTTTTCAA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其 特征在于：步驟（5)所述的裸鼠腎癌治療試驗(yàn)，針對人PEDF基因的質(zhì)粒治療腎癌裸鼠移植 瘤模型的建立及治療的給藥方式及劑量，并利用分子影像學(xué)技術(shù)無輻射，可以連續(xù)、實(shí)時、 無創(chuàng)、直觀地監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為及治療效果。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其 特征在于：步驟（5)所述的腎癌細(xì)胞試驗(yàn)，應(yīng)用慢病毒將熒光酶基因 PEDF導(dǎo)入腎癌細(xì)胞，并 整合到染色體中穩(wěn)定表達(dá)，通過精諾真生物發(fā)光分子成像儀，采集Luc基因標(biāo)記的腫瘤細(xì) 胞內(nèi)生物發(fā)光信號，使標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，可以精確定量分析腎癌細(xì)胞治 療效果。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)PEDF在抑制腎細(xì)胞癌血行轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其 特征在于：所述的PEDF基因的質(zhì)粒構(gòu)建，能夠有效抑制腎癌細(xì)胞的體外侵襲、遷移、增殖和 凋亡，抑制腎癌原位移植瘤的生長。
【文檔編號】A61K49/00GK104195175SQ201410392790
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月5日
【發(fā)明者】徐萬海, 楊印輝, 劉玉偉, 孫鵬程 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院