專(zhuān)利名稱(chēng)：基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的抗乙肝病毒基因藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNAi抗乙肝病毒藥物，即以乙肝病毒表達(dá)的乙肝 表面抗原中有效的表位蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接來(lái)介導(dǎo)RNAi進(jìn) 入肝細(xì)胞內(nèi)的藥物，本發(fā)明具體涉及基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介 導(dǎo)的抗乙肝病毒基因藥物。
技術(shù)背景乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)感染是全球一個(gè)重要的健康問(wèn)題。 目前全球約有3.5億感染者，其中75%分布在亞太地區(qū)。1992-1995 年全國(guó)病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)査顯示，我國(guó)人群乙肝病毒感染率 為57. 6%，乙肝病毒攜帶率為9. 75%，據(jù)此推算全國(guó)有6. 9億人曾感 染過(guò)乙肝病毒，其中1.2億人長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒，據(jù)專(zhuān)家估計(jì)，目前 全國(guó)有現(xiàn)患慢性乙肝病人2， 000萬(wàn)人。在我國(guó)法定報(bào)告的傳染病中， 多年來(lái)乙肝的發(fā)病數(shù)和發(fā)病率一直高居前列。乙肝給病人、家庭、社 會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)不容忽視的影響，是許 多家庭因病致貧、因病返貧的重要原因，同時(shí)也引發(fā)一系列社會(huì)問(wèn)題， 是我國(guó)現(xiàn)階段最為突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此，研究出一種新型的有效的抗乙型肝炎病毒藥物將會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益?？刂艸BV感染的抗病毒治療主要采用干擾素和核苷類(lèi)似物，這二 類(lèi)藥物是目前臨床常用的治療方法，但是這些藥物對(duì)慢性乙型肝炎的 抗病毒療效都有缺陷，高劑量重組干擾素的持續(xù)應(yīng)答率僅為30%，且 臨床副作用較大；核苷類(lèi)似物雖然抗病毒活性較強(qiáng)，但停藥后病毒復(fù) 制快速反跳，以及長(zhǎng)期應(yīng)用后引起耐藥病毒株，這些都有可能誘發(fā)原 有肝炎的加重。近年來(lái)RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，為慢 性HBV感染的治療開(kāi)辟了新的途徑，其原理是通過(guò)19-24個(gè)核苷酸片 段的短雙鏈RNA，即小干擾RNA (short interference RNA， siRNA) 誘發(fā)對(duì)宿主細(xì)胞漿中內(nèi)源或外源性RNA的特異性切割或降解作用，從 而抑制目的基因的表達(dá)，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS)。 RNAi具有高效性和高特異性，己經(jīng)被廣泛 應(yīng)用于植物、真菌、蠕蟲(chóng)和低等動(dòng)物以及高等哺乳動(dòng)物的基因功能研 究，由于RNAi技術(shù)顯示出的巨大價(jià)值，被《Science》雜志評(píng)為2001 和2002年的十大科學(xué)成就之一，同時(shí)獲得2006年度的諾貝爾獎(jiǎng)。RNA 干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類(lèi)似的防御機(jī)制，初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明這種設(shè)想有可能變成現(xiàn)實(shí)。用小干擾RNA可抑制人類(lèi)免疫缺陷病 毒(HIV)的某些基因，如P24、 Vif、 nef、 tat或rev可阻礙HIV在 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。也有通過(guò)RNA干擾抑制各類(lèi)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的報(bào)道， 如脊隋灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。 大量的體外實(shí)驗(yàn)研究資料已經(jīng)顯現(xiàn)出該技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用前景和新藥開(kāi)發(fā)中得到巨大潛力。除使用人工合成的小干擾性RNA 之外，人們己經(jīng)成功地使用發(fā)夾狀RNA或以質(zhì)粒DNA或病毒為載體在 細(xì)胞內(nèi)生成小干擾性RNA樣轉(zhuǎn)錄物，來(lái)特異性地抑制外源性或內(nèi)源性 基因在哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者用RNA干擾對(duì)乙肝病毒的作用進(jìn)行了初步的研 究。且一系列研究報(bào)道了 RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)外試驗(yàn)中均顯著抑制 HBV的蛋白表達(dá)和DNA復(fù)制，顯示了該技術(shù)在治療慢性乙型肝炎中具 有巨大的應(yīng)用前景。但是RNA干擾在臨床上的廣泛使用還需要解決一 些關(guān)鍵性問(wèn)題如更有效的設(shè)計(jì)、體內(nèi)的生物穩(wěn)定性、安全性和有效 靶向傳遞等。目前多是采用直接注射或利用脂質(zhì)體包裹將合成的 siRNA或siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是以乙肝病毒表達(dá)的乙肝表 面抗原中有效的表位蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接來(lái)介導(dǎo)RNAi進(jìn)入 肝細(xì)胞內(nèi)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的 抗乙肝病毒基因藥物，該藥物的復(fù)合載體可改善siRNA的有效性、體 內(nèi)的生物穩(wěn)定性、安全性和有效靶向傳遞，實(shí)現(xiàn)siRNA的臨床應(yīng)用， 提高臨床應(yīng)用的有效性。本發(fā)明為解決上述問(wèn)題采用的技術(shù)方案是根據(jù)乙肝病毒及其表 達(dá)產(chǎn)物的特點(diǎn)，以乙肝病毒表達(dá)的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白與 陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接，借助乙肝表面抗原表位蛋白與肝細(xì)胞表面受 體發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)siRNA進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層的可融性，加大siRNA表達(dá)載體進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi) 的效率。本發(fā)明的步驟如下1、 Si腿合成；2、 針對(duì)HBV各基因區(qū)(S、 C、 P、 X) siRNA及siRNA池表達(dá)載體的 構(gòu)建；3、 以乙肝病毒表達(dá)的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì) 體生物鏈接，介導(dǎo)RNAi進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明的關(guān)鍵在于乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白介導(dǎo)的RNAi的細(xì)胞傳遞確定乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白的氨基酸序列，合成乙型肝炎表面抗原表位蛋白，將合成的乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白和陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接。乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白序列如下 cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga ate etc aca ata cca cag agt cta gac tcg 0 AGFFLLTRILTIPQSLDS 由美國(guó)ABI公司合成。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的組成如下DC-chol 〔3^-(N-(N' ，N' -二甲基氨基乙基))氨基甲酸酯膽固醇〕/DOPE(二油酰磷酸乙醇胺)=1 : l(摩爾比)，由Sigma公司提供。 合成的乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白和陽(yáng)離子脂質(zhì)體的生物鏈接由 美國(guó)ABI公司合成。siRNA序列如下 siRNA-Sl:正義鏈(5 ， - GUGGUGGACUUCUCUCAAUTT -3，)反義鏈(5， -AUUGAGAGAAGUCCACCACTT -3，) siRNA-S2:正義鏈(5 ， - AACCUCCAAUCACUCACCAACTT -3，)反義鏈(5， - GUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUTT-3，) siRNA-S3:正義鏈(5 ， - GCCUCAUCUUCUUGUUGGUTT -3，) 反義鏈(5， - ACCAACAAGAAGAUGAGGCTT-3，) siRNA-S4:正義鏈(5 ， - GGUAUGUUGCCCGUUUGUCTT _3，) 反義鏈(5， - GACAMCGGGCAACAUACCTT -3，) 本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)(1) HBsAg的有效表位蛋白可與肝細(xì)胞表面受體發(fā)生特異性結(jié)合；(2) 陽(yáng)離子脂質(zhì)體與細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層具有很好的相融性；(3) HBsAg中有效的表位蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接可增加siRNA 池表達(dá)載體細(xì)胞傳遞的靶向效應(yīng)；(4) siRNA池表達(dá)載體在體內(nèi)具有較好的生物穩(wěn)定性和安全性；(5) siRNA池表達(dá)載體在體內(nèi)對(duì)HBV具有較強(qiáng)的基因沉默效應(yīng)；(6) shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可減少細(xì)胞分泌HBsAg的水平。


圖1為針對(duì)HBV各基因區(qū)(S、 C、 P、 X) siRNA及siRNA池表達(dá) 載體的構(gòu)建；圖2為本發(fā)明的siRNA復(fù)合載體具體傳遞方式圖。 圖3化學(xué)合成的siRNAs用復(fù)合載體運(yùn)載體系轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì) 胞后對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制作用。(A)mRNA水平(B)蛋白水平。HBsAg mRNA和HBsAg蛋白水平在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后分別用實(shí)時(shí)RT-PCR和ELISA法檢測(cè)。圖4.shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞。在轉(zhuǎn)錄后72小時(shí)分 別用ELISA、實(shí)時(shí)RT-PCR和實(shí)時(shí)檢測(cè)PCRpHBV-S 1 ， pHBV-S2， pHBV-S4， pHBV-2S和pHBV-3S質(zhì)粒的HBsAg基因沉默效應(yīng)(A)蛋白, (B)RNA和(C)DNA。圖5.質(zhì)粒編碼的shRNA在HepG2.2.15細(xì)胞中對(duì)HBsAg的RNAi干 擾作用。細(xì)胞種于24孔板，用lmg/孔shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72 小時(shí)后，細(xì)胞固定，HBsAg免疫染色，顯微鏡觀(guān)察。這些結(jié)果顯示與 質(zhì)控標(biāo)本比較HBsAg的表達(dá)水平被減低到不同水平。圖6. shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞72小時(shí)后，用ELISA法 檢測(cè)培養(yǎng)基中釋放的IFN-Y。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了shRNA表達(dá)質(zhì)粒后 HepG2.2.15細(xì)胞分泌的IFN-y濃度變化不明顯，說(shuō)明沒(méi)有誘導(dǎo)IFN應(yīng) 答。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步詳細(xì)的闡述本發(fā)明，本發(fā)明的突出的 實(shí)質(zhì)性的特點(diǎn)和積極效果可從下述實(shí)例中得以體現(xiàn)，但它們并不是對(duì) 本發(fā)明作出任何限制。 材料psiSTRIKE 質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自Promega公司，抗生素G418購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司，小牛白蛋白血清(BSA)(成分V，純度〉98X) 購(gòu)自USB公司，DMEM (Dulbecco， s modified eagle， s medium)、 青霉素G ( 5000單位/ml )、Trypsin-EDTA、 Trizol、 DNase I、 HBsAg表位蛋白一陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合載體由ABI公司合成、PureLink 病 毒RNA/DNA試劑盒、鼠單克隆抗-HBsAg和Alexa Fluor 488羊抗 鼠IgG購(gòu)自Invitrogen公司，限制性?xún)?nèi)切酶(Pstl， EcoRI， Clal， BsrGI， Sgfl and BglII.)購(gòu)自New England Biolabs公司，逆轉(zhuǎn) 錄酶購(gòu)自Applied Biosystems公司，HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Abazyme公司，si腿s禾口弓l物由Integrated DNA Technologies公司 合成。siRNA設(shè)計(jì)與合成針對(duì)乙型肝炎HBsAg不同區(qū)域設(shè)計(jì)siRNA (Gene Bank Accession tt NM—U95551)，見(jiàn)表1，這些siRNA為19-21nt和2-nt脫氧核糖核 苷酸并針對(duì)ayw HBV基因組的保守S區(qū)，這些siRNA的設(shè)計(jì)參照 Ambion (http:〃www. ambion. com/techlib/misc/siRNA—finder, htm l)禾口 Invitrogen (https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexp ress/design. do)，所有siRNA序列的特異性通過(guò)BLAST search(www. ncbi. nlm. nih. gov)驗(yàn)證,所有siRNA由Integrated DNA Technologies公司合成。表lsiRNA序列和HBV的靶位點(diǎn)S臓ATarget site細(xì)麵,s羅織256^274加 4^-44!加 4歸？6加AACCUCCAAUCACUCACCAACTTAUlK惡M;AAGlKXACaVCTT 0ACAMCGOGCAACAUACC1T,531shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)識(shí)別不同siRNA序列，選擇三個(gè)有效序列轉(zhuǎn)化為針對(duì)HBsAg不 同靶區(qū)域的shRNA序列，見(jiàn)表2A，用口31311^11^1"構(gòu)建表達(dá)抗-HBsAg的pHBV-Sl， pHBV-S2， pHBV-S4和質(zhì)控的shRNA表達(dá)載體，其包含一個(gè) U6 RNA多聚酶啟動(dòng)子。為了構(gòu)建shRNA池表達(dá)質(zhì)粒pHBV-2S和pHBV-3 S，合成包含多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的序列的一個(gè)序列正義鏈(5' -ACC GGA ATT CCG GAT ATC GAT GTA CAG CGG CCG CGA TCG CGA C-3)和 反義鏈(5， -TGC AGT CGC GAT CGC GGC CGC TGT ACA TCG ATA TCC GGA ATT C-3')插入psiSTRIKETM質(zhì)粒稱(chēng)之為pEsiST載體；使用EcoRI和Clal消化pEsiST并包含大量限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，shRNA-Sl'的 正義鏈(5， -MT TCG TGG TGG ACT TCT CTC MT CTT CCT GTC MT TGA GAG MG TCC ACC ACAT-3，)和反義鏈(5， -CGAT GT GGT GGA C TT CTC TCA ATT GAC AGG MG ATT GAG AGA AGT CCA CCA CG-3，)退 火克隆入pEsiST載體的EcoRI- Clal位點(diǎn)，稱(chēng)之為pshRNA-SI' 質(zhì) 粒；使用SgfI和BglII消化pshRNA-SI'質(zhì)粒，shRNA-S4'的正義鏈(5， -CGC GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT TCC TGT CAG ACA AAC GG G CM CAT ACC TTT TTA_3，)和反義鏈(5， -GATCT AAA MG GTA TG T TGC CCG TTT GTC TGA CAG GM GGA CAA ACG GGC AAC ATACC GCGA T-3')退火克隆入pshRNA-Sl'質(zhì)粒的Sgfl-BglII位點(diǎn)，稱(chēng)之為pHBV -2S質(zhì)粒，shRNA-S4，末端包含一個(gè)TTTTT伸展產(chǎn)生pol III終止信號(hào)。 然后使用BsrGI和Sgfl消化pHBV-2S質(zhì)粒，shRNA-S2'的正義鏈(5'-GTACA AAC CTC CAA TCA CTC ACC MC CTT GCT GTC AGT TGG TGA GT G ATT GGA GGT T GCGAT-3，)和反義鏈(5， -CGC MC CTC CAA TCA CTC ACC MC TGA CAG GM GGT TGG TGA GTG ATT GGA GGT TT-3，)退 火克隆入pHBV-2S質(zhì)粒的BsrGI-Sgfl位點(diǎn)，稱(chēng)之為pHBV-3S載體質(zhì)粒；所以2-3個(gè)shRNA (見(jiàn)表2B)插入到psiSTRIKETM載體中(見(jiàn)圖l) 產(chǎn)生pHBV-2S和pHBV-3S質(zhì)粒載體。表2針對(duì)HBsAg不同耙區(qū)域的shRNA的序列shKNA Sen鍵S&^uenee Loop ,uencenCOGTaOTaGACTTCTCTCAAraTOa^徹ATTC船她錫TCCACCMmTTT仁^Cb謡"ijKNA ^ACCGCCATAATAMJTCACTOCT7CTTCCT"則MGC:ACTCACTrA'rrATOCJTTrTC'3' ，《OTArmTTCAGTCACGAAG^Ga^GrrTCCTGACTGAATAATiVCGAAAAAO^CCT^fncACCTGA40A飾rnm似G^a^rmACTcrCTTC織.rrGGTG膨w順shHN&微縱 ^G鵬鍵O:TCC顛TCACrCACCAACCnrcroitMGTTG0TC然TCATTOG^0Tta^掘'麟 ,'HH(M CCATACi\ACGGOCAAACAGO^a^/l0:rCTarTrC3CCCGTTCTATGGMAAArC M， tinker ^ACCGGAATTCCGGATWrCOATGTAC^CcK^CCOCOATCGCOACa*細(xì)胞傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建乙肝病毒表達(dá)的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白序列如下cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga ate etc aca ata cca cag agt eta gac teg 0 AGFFLLTRILTIPQSLDS陽(yáng)離子脂質(zhì)體的組成如下DC-chol 〔3 3-(N-(N' ，N' -二甲基氨基乙基))氨基甲酸酯膽固醇)/DOPE(二油酰磷酸乙醇胺)=1 : l(摩爾比)，由Sigma公司提供。 合成的HBsAg蛋白和陽(yáng)離子脂質(zhì)體的生物鏈接均由美國(guó)ABI公司合成。 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染-H印G2. 2.15細(xì)胞系在4%胎牛血清和330 pi g / ml和抗生素G418 的DMEM培養(yǎng)液中，于增濕孵化器中37° C 、 5% C02培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24 小時(shí)，在24孔培養(yǎng)板上細(xì)胞以每孔1 X 105的密度分種。siRNA質(zhì)粒載體用乙肝表面抗原中有效的表位蛋白序列與陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接所形成的復(fù)合載體以1 Pg/1 Pg的比率包裹后以40 -80 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同樣，shRNA表達(dá)載體也以復(fù)合載體包裹后 分別以0.5Pg、 Wg、 2Pg/孔的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)空白和轉(zhuǎn)染試劑對(duì) 照，各做三復(fù)孔，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收獲細(xì)胞做進(jìn)一步分析。 顆粒大小和4勢(shì)能的檢測(cè)質(zhì)粒和復(fù)合脂質(zhì)體分別以5yow/v的葡萄糖稀釋到250W，然后把DNA 加入到復(fù)合脂質(zhì)體中，于室溫作用45分鐘。改變脂質(zhì)/質(zhì)粒的混合比 率，用Malvern Zetasizer于25"C通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法分別檢測(cè)顆粒大 小和4勢(shì)能。熒光定量PCR檢測(cè)HBsAg mRNA和培養(yǎng)基中的HBV DNA分別用siRNA或shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H印G2. 2. 15細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后 72h的細(xì)胞用胰蛋白酶消化、離心收集，再用PBS重懸、離心收集， 用DNA提取試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明提取總DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)基中的HBV DNA禾卩HBsAg mRNA。針對(duì)HBV S基因的特異性引物為正義鏈5， -GAT TCC TAG GAC CCC TTC TC-3，,反義鏈:5， -GGA GGA CAG GAG GTT GGT GA-3，，實(shí)時(shí)PCR 的條件如下50° C， 2min; 95° C ， lOmin; 95° C， 15s; 54° C ， lmin， X40 cycles; 72。 C ， 5min。 免疫熒光檢測(cè)用shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H印G2. 2.15細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)后，用 3%福爾馬林固定15 min，用DPBS洗3次，用0.1% Bri ji98/PBS作用 2min，用DPBS洗2次，用20%羊血清封閉30 min，用單克隆鼠抗-HBsAg抗體作為第一抗體和Cy3-羊抗鼠IgG作為第二抗體室溫反應(yīng)lh，制片，顯微鏡觀(guān)察。結(jié)果siRNA序列的基因沉默效應(yīng)選擇HBsAg作為耙基因，檢測(cè)siRNA沉默HBV基因表達(dá)的能力。 比較耙向HBsAg四個(gè)不同基因區(qū)的4個(gè)不同19-21bp的siRNA的基因 沉默作用(見(jiàn)表1)。這些siRNA單獨(dú)或者4個(gè)混合以混合載體包裹轉(zhuǎn) 染H印G2. 2. 15細(xì)胞。如圖2所示，siRNA對(duì)HBsAg的基因沉默是序列 特異性和劑量依賴(lài)性的，3種siRNAs都引起了 HBsAg mRNA水平的大 幅度降低，而對(duì)照siRNA對(duì)HBsAg的基因表達(dá)幾乎沒(méi)有作用。用 siRNA-Sl、 siRNA-S2、 siRNA-S3和siRNA-S4以40nmol/L的劑量作用 于標(biāo)本可使HBsAg mRNA表達(dá)水平降低40. 9、 13. 41、 17. 4 and 40.16%。 當(dāng)siRNA-Sl、 siRNA-S2、 siRNA-S3和siRNA-S4劑量增加到 80nmol/L，可增加HBsAg的基因沉默效應(yīng)，分別為71. 77、58. 79、 54.49 and 84.69%，如圖3A。用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染3天后HBsAg分泌到培養(yǎng)基中的水平。在 siRNA-Sl、 siRNA-S2、 siRNA-S3和siRNA-S4以40nmol/L的劑量作 用后，分泌到培養(yǎng)基中HBsAg水平分別被降低了 39. 67、31. 79、 30. 55 和42,29%;當(dāng)作用劑量增加到80nmol/L時(shí)，培養(yǎng)基中HBsAg的濃度 大幅度降低，分別為58.72、 55.03、 46.01和 61.71%，如圖犯； siRNA-S4在這幾種siRNA中顯示了最高的基因沉默水平，當(dāng)轉(zhuǎn)染劑量 達(dá)到80nmol/L時(shí)，HBsAg的mRNA和蛋白水平分別被降低了 84. 69%和61.71%。別的siRNA對(duì)HBsAg的表達(dá)表現(xiàn)為不同水平的抑制作用。 siRNA對(duì)照組HBsAg的表達(dá)水平無(wú)變化，說(shuō)明siRNA對(duì)HBsAg的抑制 作用具有序列特異性。 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)識(shí)別不同siRNA序列，選擇三個(gè)高活性的siRNA序列轉(zhuǎn)化為 耙向HBsAg不同耙區(qū)域的shRNA序列，這些序列在5，和3，末端包 含克隆所需的唯一的限制性位點(diǎn)，并在正義鏈的有一個(gè)可產(chǎn)生pol III 終止信號(hào)的TTTTT序列(見(jiàn)表2A),然后把這些序列克隆入 psiSTRIKE ,如圖1所列。pHBV-Sl、 pHBV-S2、 pHBV-S4用限制性 內(nèi)切酶消化產(chǎn)生2個(gè)大約3047bp和1370bp的DNA片段。pHBV-2S和 p麗-3S載體用EcoRI和Bgl II酶消化鑒別。pHBV-2S和pHBV-3S 產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別為118bp和163bp， DNA序列結(jié)果顯示插入的片段有 所要的序列。shRNA表達(dá)對(duì)HBsAg分泌的作用為了評(píng)價(jià)siRNA池對(duì)HBV生活周期的影響，用口31311 11^1"載體 在H印G2. 2. 15細(xì)胞系中直接合成大量的siRNA。克隆、擴(kuò)增和純化后 的pHBV-Sl， pHBV-S2， pHBV-S4, pHBV-2S和pHBV-3S，形成質(zhì)粒復(fù) 合載體的混合物，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)檢測(cè)顆粒大小和；勢(shì)能。這 些質(zhì)粒復(fù)合載體的混合物顆粒的平均大小為200-400nm，；勢(shì)能為 20-30Mv。檢測(cè)以0.5、 l和2Pg/孔的濃度轉(zhuǎn)染進(jìn)H印G2.2. 15細(xì)胞的 shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HBsAg基因沉默的效應(yīng)，每一個(gè)序列都獲得了大量 的HBsAg基因沉默效應(yīng)(見(jiàn)圖4)。與對(duì)照shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染群比較，shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H印G2. 2.15細(xì)胞可大量的抑制培養(yǎng)基中的HBsAg 的濃度(見(jiàn)圖4A)。與編碼單一 shRNA的質(zhì)粒比較，編碼針對(duì)HBsAg 基因不同區(qū)域的3個(gè)shRNA質(zhì)粒顯示更有效的HBsAg沉默效應(yīng)。我們用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)染的H印G2.2.15細(xì)胞中提取的總 RNA，結(jié)果確證了編碼三個(gè)shRNAs(pHBV-3S)的質(zhì)粒，可使HBsAgmRNA 的濃度減少63. 2-87. 7%(見(jiàn)圖4B)。用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)了培養(yǎng)基中的HBV DNA，如圖3C所示，當(dāng) H印G2. 2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染了編碼耙向HBsAg的shRNA質(zhì)粒可大量的降低其 HBV DNA的水平。當(dāng)用編碼3個(gè)shRNAs(pHBV-3S)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)抑制 率約為85%。HBsAg表達(dá)的的免疫熒光分析在H印G2. 2. 15細(xì)胞轉(zhuǎn)染了編碼針對(duì)HBsAg的shRNA質(zhì)粒72小時(shí)后， 細(xì)胞免疫染色后用顯微鏡觀(guān)察。HBsAg染色的熒光強(qiáng)度依次為HBV-S1 >HBV-S2>HBV-S4>HBV-2S〉HBV-3S(見(jiàn)圖5)。說(shuō)明用shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞HBsAg水平被減少到不同程度。pHBV-2S和pHBV-3S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞顯示低的熒光，說(shuō)明HBsAg的低表達(dá)。 shRNA誘導(dǎo)的IFN應(yīng)答為了檢測(cè)shRNA是否誘導(dǎo)了 IFN應(yīng)答，在shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 H印G2. 2. 15細(xì)胞72小時(shí)后，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基中釋放的IFN，， 如圖6所示，用shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的后IFN-Y濃度不增加，說(shuō)明沒(méi) 有誘導(dǎo)IFN應(yīng)答。以上結(jié)果顯示乙肝病毒表達(dá)的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白序列和陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接作為siRNA表達(dá)載體的細(xì)胞傳遞體系，與 目前常用的單一的陽(yáng)離子傳遞體系統(tǒng)相比，基因傳遞效率較高，非靶 位效應(yīng)小，非特異性免疫應(yīng)答作用小，符合預(yù)期設(shè)想的抗乙型肝炎病 毒的作用，可以用于臨床。
權(quán)利要求
1、基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的抗乙肝病毒基因藥物，其特征在于該藥物根據(jù)乙肝病毒及其表達(dá)產(chǎn)物的特點(diǎn)，以乙肝病毒表達(dá)的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接，借助乙肝表面抗原表位蛋白與肝細(xì)胞表面受體發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)RNAi進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層的可融性，加大siRNA表達(dá)載體進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)的效率。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的 抗乙肝病毒基因藥物，其特征在于乙型肝炎表面抗原中有效的表位 蛋白序列如下cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga ate etc aca ata cca cag agt cta gac tcg QAGFFLLTRILTIPQSLDSc
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的抗乙肝病毒基因藥物，其特征在于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的組成如下DC-chol 〔3P-(N-(N' ，N' -二甲基氨基乙基))氨基甲酸酯膽固醇〕/DOPE(二油酰磷酸乙醇胺)=1 : i(摩爾比)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的抗乙肝病毒 基因藥物，其特征在于siRNA序列如下siRNA-Sl:正義鏈(5 ， _ GUGGUGGACUUCUCUCAAUTT -3，) 反義鏈(5， -AUUGAGAGAAGUCCACCACTT -3，)siRNA-S2:正義鏈(5 ， 反義鏈(5'siRNA-S3:正義鏈(5 ， 反義鏈(5'siRNA-S4:正義鏈(5 ， 反義鏈(5'權(quán)利要求書(shū)第2/2頁(yè)-AACCUCCAAUCACUCACCAACTT -3，) -GUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUTT-3，)- GCCUCAUCUUCUUGUUGGUTT -3，) -ACCAACAAGAAGAUGAGGCTT-3，)-GGUAUGUUGCCCGUUUGUCTT -3，) 一 GACAAACGGGCAACAUACCTT -3，)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了基于siRNA池干擾的復(fù)合載體介導(dǎo)的抗乙肝病毒基因藥物，根據(jù)乙肝病毒及其表達(dá)產(chǎn)物的特點(diǎn)，以乙肝病毒表達(dá)的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白與陽(yáng)離子脂質(zhì)體生物鏈接，借助乙肝表面抗原表位蛋白與肝細(xì)胞表面受體發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)RNAi進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層的可融性，加大siRNA表達(dá)載體進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)的效率。本發(fā)明藥物可改善siRNA的有效性、體內(nèi)的生物穩(wěn)定性、安全性和有效靶向傳遞，可以用于臨床。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101322847SQ20081012350
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者勇 陳 申請(qǐng)人:淮安市第四人民醫(yī)院