增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的方法交叉引用美國(guó)相關(guān)專利申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2011年2月16日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?1/443,569的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其整體內(nèi)容具體地并入本文。發(fā)明背景癌癥是一種嚴(yán)重的疾病和一大殺手。盡管近年來(lái)對(duì)某些癌癥的診斷和治療已經(jīng)取得了進(jìn)展，但是仍需要對(duì)其診斷和治療進(jìn)行改進(jìn)。類似地，盡管在過(guò)去的10-30年中病毒和細(xì)菌感染的治療已有所改善，但是仍需要能夠顯著提高存活率和/或縮短感染持續(xù)時(shí)間的新的方法和組合物。刺激患者自身免疫系統(tǒng)的組合物和方法可能有助于治療多種疾病，包括癌癥以及細(xì)菌和病毒感染。一些研究表明在動(dòng)物模型中IL-12可能能夠活化宿主針對(duì)多種腫瘤的免疫器官（參見(jiàn)，Trinchieri&Scott(CurrTopMicrobiolImmunol238,57-78(1999);Rook等，Blood94,902-8.(1999);Rook等，AnnNYAcadSci941,177-84.(2001))。用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的其它方法可用在多種病癥和疾病的治療方案中。發(fā)明概述本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N通過(guò)給予GOLPH2的抑制劑增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的方法。此類抑制劑能夠通過(guò)多種方式增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，包括：例如，通過(guò)增加白介素-12和/或干擾素-γ的內(nèi)源性產(chǎn)生。因此，用于抑制GOLPH2的方法和組合物可用在癌癥和病原體感染的免疫治療中，其得益于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以控制、改善和消除病癥，并且對(duì)病癥或病癥的復(fù)發(fā)進(jìn)行長(zhǎng)期保護(hù)?？梢酝ㄟ^(guò)抑制GOLPH2治療的病癥和疾病包括：例如，肝癌、前列腺癌、肺癌、睪丸癌、胰腺癌和B-細(xì)胞癌，以及多種傳染性疾病，如HIV/AIDS和肝炎。附圖說(shuō)明圖1A-B表示BDSFIL-12的活性及其同GOLPH2的關(guān)聯(lián)。圖1A表明樹(shù)突狀細(xì)胞分泌一種因子，該因子抑制活化的T細(xì)胞分泌干擾素-γ。將該因子稱為BDSFIL-12。使用CD4+T細(xì)胞MACS分離試劑盒從C57BL/6小鼠的脾臟中分離T淋巴細(xì)胞，將其在RPMI培養(yǎng)基（15%FBS，20ng/mlmIL-2）中培養(yǎng)4天。然后將T細(xì)胞鋪板，1ml，1x106個(gè)細(xì)胞/孔，在存在或不存在骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基上清（500μl）的條件下使用5μg/ml刀豆蛋白A（ConA）刺激24小時(shí)。特別地，將這些T細(xì)胞等分進(jìn)行四種處理中的一種。第1種處理方式：將樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基上清加入T細(xì)胞中，其中樹(shù)突狀細(xì)胞是靜息的，未被刺激。第2種處理方式：將樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基上清加入T細(xì)胞中，其中樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)脂多糖（LPS）刺激。第3種處理方式：將樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基上清加入T細(xì)胞中，其中樹(shù)突狀細(xì)胞使用2E2上清（含有BDSFIL-12）培養(yǎng)。第4種處理方式：將樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基上清加入T細(xì)胞中，其中樹(shù)突狀細(xì)胞使用2E2上清（含有BDSFIL-12）培養(yǎng)并且經(jīng)脂多糖（LPS）刺激。圖1B顯示了無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清的SDS-PAGE分離圖，該無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清來(lái)自靜息的和經(jīng)LPS刺激的RAMOS細(xì)胞和2E2細(xì)胞，將所檢測(cè)的主要蛋白條帶稱為BDSFIL-12（分子量>50kDa）。BDSFIL-12的初步特征表現(xiàn)出下述生化性質(zhì)：耐熱；對(duì)蛋白酶和脂肪酶不敏感；通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞生產(chǎn)；分子量分離顯示BDSFIL-12>50kDa。在進(jìn)一步鑒定時(shí)，將來(lái)自靜息和經(jīng)LPS刺激的RAMOS細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清（第1-2道）在無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，而將2E2的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清（第3道）煮沸30min，再用胰酶（50ng/ml）處理30分鐘，通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離。將來(lái)自靜息和經(jīng)LPS刺激的RAMOS細(xì)胞上清的較下方條帶，如圖1B中下面的箭頭所示，切下并進(jìn)行質(zhì)譜分析。選擇來(lái)自RAMOS的樣品而非2E2的樣品進(jìn)行最終分析的原因在于：其對(duì)具有較高BDSFIL-12活性的經(jīng)刺激樣品和具有較低或不具有活性的未經(jīng)刺激樣品之間具有可比性。在經(jīng)LPS刺激的RAMOS上清中鑒定出可能與BDSFIL-12對(duì)應(yīng)的兩種蛋白，其與對(duì)照樣品（靜息的RAMOS上清）相比具有明顯較高的評(píng)分：一種較多和一種較少，高爾基體磷蛋白2（GOLPH2；主要產(chǎn)物）和Roquin（次要產(chǎn)物）的占比分別為7%和1%。圖2A-F顯示FACS分析檢測(cè)到的在不同細(xì)胞類型中GOLPH2的細(xì)胞位置不同，并且說(shuō)明GOLPH2分泌至不同培養(yǎng)細(xì)胞系的上清中。圖2A-E表明在靜息（圖2A）和經(jīng)LPS活化（圖2B）的原代人外周血B淋巴細(xì)胞中GOLPH2在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面大量表達(dá)。但是，在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2中，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的GOLPH2比在細(xì)胞表面表達(dá)的更多（圖2C）。在RAW264.7細(xì)胞（小鼠巨噬細(xì)胞）中，GOLPH2完全在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，加入LPS，對(duì)GOLPH2表達(dá)的水平和位置即使有影響，也是非常的?。▓D2D）。圖2F顯示了源于RAMOS細(xì)胞（靜息和經(jīng)LPS活化，分別在第2-3道）、2E2細(xì)胞（第4道）、HepG2細(xì)胞（人肝細(xì)胞癌（HCC），第5道）、B16細(xì)胞（小鼠黑色素瘤，第6道）、4T1細(xì)胞（小鼠乳腺癌，第7道）和RAW264.7細(xì)胞（小鼠巨噬細(xì)胞，第8道）的細(xì)胞培養(yǎng)基上清的Western印跡。將由組氨酸標(biāo)記的表達(dá)載體表達(dá)的重組人GOLPH2作為陽(yáng)性對(duì)照（第9道）。除非另有說(shuō)明，否則分析靜息細(xì)胞。圖3A-D為用于說(shuō)明BDSFIL-12/GOLPH2某些活性的圖。圖3A是說(shuō)明由活化的T細(xì)胞分泌的干擾素-γ分泌情況的圖，該T細(xì)胞暴露于不同細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)基的上清。使用表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的人GOLPH2或無(wú)關(guān)核蛋白SREBP2的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎293（HEK293）細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，收集無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清，以與上述圖1A所述的相同方式加入到樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的共培養(yǎng)物中。柱a：源于未經(jīng)刺激的HEK細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清；柱b；源于經(jīng)LPS刺激的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清；柱c：經(jīng)SREBP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清；柱d：經(jīng)GOLPH2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清；和柱e：2E2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清。柱狀圖下面的小方框表示在使用SREBP2（柱c）或GOLPH2（柱d）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重組轉(zhuǎn)染后，使用帶有組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體檢測(cè)的HEK293細(xì)胞上清的Western印跡圖。如圖所示，GOLPH2表達(dá)并分泌至用于獲得柱d所示結(jié)果的上清中，但未進(jìn)入SREBP-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清中（用于獲得柱c所示的結(jié)果）。圖3B為顯示GOLPH2的表達(dá)增加使IL-12-p35的表達(dá)減少的圖。在RAW264.7細(xì)胞中將人IL-12p35啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告子構(gòu)建體（參見(jiàn)，Kim等，Immunity21,643-53(2004)）與表達(dá)人GOLPH2的效應(yīng)器構(gòu)建體或者對(duì)照空載體（pCDNA3）一同使用，效應(yīng)器/報(bào)告子（E:R）的摩爾比為1:1、2:1和4:1。數(shù)據(jù)以相對(duì)啟動(dòng)子活性表示，即IFN-γ與LPS刺激的高于未刺激活性部分的比值。圖3C顯示GOLPH2減少由IL-12p35啟動(dòng)子而非由IL-12p40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。使用FLAGged空表達(dá)載體（FLAG），或者表達(dá)人GOLPH2或SREBP2的FLAGged載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，收集無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清，并將0.5ml加入到1.5ml經(jīng)人IL-12p35-或IL-12p40-受體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染6小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞中。然后，再使用IFN-γ和LPS進(jìn)一步刺激RAW264.7細(xì)胞7小時(shí)，隨后收集進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，設(shè)置三復(fù)管。數(shù)據(jù)以平均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。圖3D顯示源于凋亡細(xì)胞（AC）和經(jīng)LPS刺激的RAMOS細(xì)胞的上清減少由IL-12p35啟動(dòng)子而非由IL-12p40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。除了將凋亡細(xì)胞（AC）或RAMOS培養(yǎng)基上清加入RAW264.7細(xì)胞以外，進(jìn)行與上文圖3C所述的相同類型的報(bào)告子檢測(cè)。圖4A-B顯示當(dāng)GOLPH2被抗-GOLPH2抗體抑制或因GOLPH2在氨基酸位點(diǎn)52或54突變而被抑制時(shí)，由IL-12p35啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)增加。圖4A顯示了在不存在和存在抗-GOLPH2抗體時(shí)由IL-12p35啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞中，2E2上清（含有BDSFIL-12活性）抑制由IFN-γ和LPS誘導(dǎo)的p35-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)加入抗-GOLPH2多克隆抗體（其量在0-2μg/ml間變化）強(qiáng)烈地和特異性地抑制此類表達(dá)。該抗-GOLPH2多克隆抗體為來(lái)自SantaCruzBiotechnologies（SantaCruz,CA）的GP73（N-19）。同種型匹配的對(duì)照IgG抗體不抑制IL-12p35-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。圖4B顯示了突變的GOLPH2不抑制IL-12p35-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。IL-12p35報(bào)告子構(gòu)建體與對(duì)照載體（pCR3.1），或者野生型GOLPH2（WT）-表達(dá)、分泌突變R52A-表達(dá)、分泌突變R54A-表達(dá)和Roquin-表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，效應(yīng)器與報(bào)告子的摩爾比（E:R）為0.2:1。測(cè)定經(jīng)IFN-γ和LPS刺激細(xì)胞的熒光素酶活性。使用較低的E:R比值（1:0.2）以使得能理想地檢測(cè)GOLPH2和Roquin之間的相互（協(xié)同）作用。當(dāng)使用更高量時(shí)，與WTGOLPH2相比R52A和R54A的效力弱很多（數(shù)據(jù)未列出）。圖5A-B顯示了對(duì)IL-12p35啟動(dòng)子內(nèi)BDSFIL-12-應(yīng)答元件的鑒定。圖5A顯示了不同的人IL-12p35啟動(dòng)子序列，以及當(dāng)用熒光素酶表達(dá)檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由那些啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)水平。含有野生型和跨核苷酸位置-1082至+61的突變IL-12p35啟動(dòng)子序列的核酸片段分別地與編碼熒光素酶的核酸連接。野生型IL-12p35啟動(dòng)子片段（a）包括在核苷酸位置+13至+19的TGCCGCG序列。3’缺失的IL-12p35啟動(dòng)子片段（b）僅含有跨核苷酸位置-1082至-4的區(qū)域。三個(gè)突變IL-12p35啟動(dòng)子片段（c-e）具有特異性的堿基取代突變：XXCCGCG(c)、TGXXGCG(d)和TGCCXXG(e)。將啟動(dòng)子-報(bào)告子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，在存在或不存在源于2E2細(xì)胞的上清（含有BDSFIL-12）的條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。使用LPS刺激細(xì)胞7小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性。如圖所示，上清中存在的BDSFIL-12抑制由野生型IL-12p35啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)，但是當(dāng)啟動(dòng)子片段的核苷酸位置+13至+19缺失（a與b比較），或者在位置+17和+18突變?yōu)門(mén)GCCXXG（e）（a與e比較）時(shí)這種抑制喪失。圖5B是Western印跡結(jié)果，其表明在所培養(yǎng)細(xì)胞的上清中存在的BDSFIL-12導(dǎo)致GC-結(jié)合蛋白活化（磷酸化）。將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)并暴露于培養(yǎng)基（Med），或凋亡Jurkat細(xì)胞（AC），或含有或不含IFNγ和LPS的源于2E2細(xì)胞的上清（BDSFIL-12）。將核提取物與抗-GC-結(jié)合蛋白抗體免疫共沉淀（Kim等，Immunity21,643-53(2004)），隨后用抗-磷酸-酪氨酸mAb（pY99）進(jìn)行印記。上部：磷酸化-GC-BP；下部：總GC-BP（～80kDa）。如圖所示，BDSFIL-12刺激GC-結(jié)合蛋白的酪氨酸磷酸化。圖6A-B顯示了在表達(dá)（野生型小鼠）和不表達(dá)（IgM敲除B-/-小鼠）BDSFIL-12的動(dòng)物中，B16黑色素瘤的生長(zhǎng)和免疫應(yīng)答情況。圖6A顯示了在WT和IgM敲除（B-/-）小鼠中B16黑色素瘤的生長(zhǎng)情況。對(duì)小鼠（每組五只）皮下注射106個(gè)腫瘤細(xì)胞以接種腫瘤。通過(guò)使用游標(biāo)卡尺定期測(cè)量腫瘤直徑以監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。圖6B顯示了在野生型和IgM敲除B-/-脾細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞中多種T細(xì)胞因子的表達(dá)水平。收集接種腫瘤小鼠（每組五只）的脾臟。將來(lái)自這些小鼠的脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞（8:1）培養(yǎng)7天。通過(guò)ELISA分析源于這些培養(yǎng)物的上清中的細(xì)胞因子水平。如圖所示，源于IgM敲除B-/-小鼠的細(xì)胞中IL-10、INF-γ、p40和IL-12的表達(dá)水平升高。圖7是說(shuō)明GOLPH2如何抑制IL-12產(chǎn)生和T細(xì)胞活化的示意圖。在專門(mén)的抗原呈遞細(xì)胞（樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞）中通過(guò)先天免疫途徑，如Toll樣受體（TLR）-介導(dǎo)的信號(hào)和通過(guò)獲得性免疫信號(hào)，如CD40L（#1），刺激IL-12基因的轉(zhuǎn)錄。這些活化NF-κB和IL-12p35的基因轉(zhuǎn)錄（#3）。活化的B淋巴細(xì)胞（#4）和惡性B細(xì)胞（#5）產(chǎn)生GOLPH2，其與DC（#6）上假定的受體（GOLPH2-R）結(jié)合并誘導(dǎo)GC-BP酪氨酸磷酸化（#7）。磷酸化的GC-BP轉(zhuǎn)位至核（#8）并通過(guò)在ACRE與p35啟動(dòng)子區(qū)域的近端結(jié)合從而阻斷IL-12的產(chǎn)生（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）（#9）。IL-12（#10）的缺乏導(dǎo)致阻斷天然T（Th0）細(xì)胞（#11）的TH1分化和活化，其限制了針對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體和惡性腫瘤的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在巨噬細(xì)胞中也誘導(dǎo)GC-BP磷酸化，該巨噬細(xì)胞通過(guò)磷脂酰絲氨酸受體（#12）與具有外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）的凋亡細(xì)胞（AC）相接觸。發(fā)明詳述如本申請(qǐng)所述，高爾基體磷蛋白2（GOLPH2），最初因其是抑制IL-12的B細(xì)胞來(lái)源的可溶性因子，所以被稱為BDSFIL-12，其是一種由B細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子，其令人驚訝地通過(guò)抑制IL-12來(lái)作用于樹(shù)突狀細(xì)胞并調(diào)節(jié)T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，IL-12是高效的TH1細(xì)胞激活劑。GOLPH2對(duì)T細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用具有重要的臨床意義。TH1細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞毒性T-細(xì)胞的活化是抗病毒和抗腫瘤免疫的重要組成部分。在初始和侵襲階段，病毒和腫瘤細(xì)胞常常采用復(fù)雜和精細(xì)的策略逃避免疫攻擊。在多種疾病中TH1/TH2平衡被破壞，該疾病包括HIV/AIDS、自身免疫性疾病和惡性腫瘤。B細(xì)胞在調(diào)節(jié)這種微妙平衡中發(fā)揮的作用在很大程度上未得到充分的認(rèn)識(shí)。如本申請(qǐng)所述，BDSFIL-12/GOLPH2由活化的和惡性B細(xì)胞產(chǎn)生，其提供了一種調(diào)節(jié)和刺激細(xì)胞免疫的方法，該方法用于抗腫瘤、抗病毒和抗微生物治療。在下面的敘述中，涉及的多種實(shí)施方式和附圖構(gòu)成了本發(fā)明的一部分，其以說(shuō)明方式描述和顯示。這些實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì)描述以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是可以采用其它實(shí)施方式并且在不脫離本發(fā)明范圍的前提下可以對(duì)其進(jìn)行合乎邏輯的改變。因此，下文所述的示例性實(shí)施方式不具有限制性意義。高爾基體磷蛋白2GOLPH2是此前功能未知的高爾基體磷蛋白。其也被稱為高爾基體膜蛋白1（Golm1）、GP73和BDSFIL-12。本發(fā)明人獨(dú)立地鑒定了一種由B細(xì)胞分泌的可溶性因子，并發(fā)現(xiàn)該因子通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞抑制IL-12的產(chǎn)生（圖1A）。將這種B-細(xì)胞來(lái)源的可溶性因子稱為BDSFIL-12。隨后的實(shí)驗(yàn)證明了BDSFIL-12是GOLPH2。發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)鑒定了可溶性、分泌性BDSFIL-12的若干活性：(i)BDSFIL-12對(duì)胰酶和熱（例如，煮沸）具有較高的抗性；(ii)BDSFIL-12選擇性抑制IL-12分泌，但對(duì)TNF-α、IL-10,、IL-6和TGF-β的分泌沒(méi)有影響；(iii)以不依賴于TGF-β、IL-10、TNF-α和前列腺素E2的方式，BDSFIL-12通過(guò)活化單核細(xì)胞和骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞抑制IL-12分泌；(iv)BDSFIL-12對(duì)其它樹(shù)突狀細(xì)胞的性質(zhì)，如CD11c、CD80、CD86和MHCII的表面表達(dá)幾乎沒(méi)有影響；(v)BDSFIL-12，以其可溶性、細(xì)胞外形式，活化轉(zhuǎn)錄因子與IL-12p35啟動(dòng)子結(jié)合——當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合時(shí)抑制IL-12p35的轉(zhuǎn)錄；以及(vi)即使B細(xì)胞未被HIV感染，但原代B細(xì)胞與HIV-1-感染的T細(xì)胞共培養(yǎng)也產(chǎn)生BDSFIL-12。這些結(jié)果表明在HIV-感染患者中常見(jiàn)的TH1受損至少部分是由過(guò)度活化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的BDSFIL-12所致。在本申請(qǐng)通篇描述了BDSFIL-12（GOLPH2）的其它性質(zhì)。為進(jìn)一步表征BDSFIL-12，使用胰酶處理經(jīng)LPS刺激的RAMOS（B淋巴瘤）細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，煮沸10分鐘，并使用SDS-PAGE凝膠分離含有可溶性蛋白的上清液（圖1B）。將圖1B的第1道和第2道中上方箭頭指示的條帶切下并進(jìn)行質(zhì)譜分析。經(jīng)鑒定，在經(jīng)LPS刺激的RAMOS上清中存在GOLPH2和若干其它蛋白，但其在未經(jīng)刺激的RAMOS上清中不存在，未經(jīng)刺激的RAMOS上清不具有IL-12抑制活性。隨后的功能分析排除了其它蛋白，僅有GOLPH2具有BDSF-樣活性。因而，發(fā)明人確定BDSFIL12因子是GOLPH2。BDSFIL12/GOLPH2在多種組織的正常上皮細(xì)胞中廣泛地表達(dá)，特別是在腸、前列腺、腎臟、肺和在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。在穩(wěn)態(tài)條件下，GOLPH2是明顯具有良性功能的完整的順式高爾基體膜蛋白。但是，如本文所述，其循環(huán)出順式高爾基體到達(dá)核內(nèi)體和細(xì)胞表面，成為抑制免疫功能的可溶性因子。GOLPH2的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致前蛋白轉(zhuǎn)化酶furin-介導(dǎo)的裂解，結(jié)果使其釋放至細(xì)胞間隙。其以可溶性形式存在于血清中是人干細(xì)胞癌（HCC）的生物標(biāo)志物。73kDa的GOLPH2蛋白由位于人染色體9q21.33（小鼠染色體13）上的基因GOLM1編碼，其最初通過(guò)來(lái)自患有成年巨細(xì)胞肝炎（一種推測(cè)為由病毒引起的罕見(jiàn)肝炎）的患者肝臟組織的cDNA文庫(kù)差示篩選克隆得到（Kladney等，Gene249,53-65(2000)）。在分泌蛋白發(fā)現(xiàn)創(chuàng)制（secretedproteindiscoveryinitiative）（SPDI）中獨(dú)立地鑒定出GOLPH2，SPDI是一項(xiàng)由計(jì)算機(jī)工具輔助的在酵母細(xì)胞中利用生物信號(hào)序列捕獲來(lái)鑒定新型人分泌和跨膜蛋白的大規(guī)模嘗試。GOLPH2基因在黑猩猩、犬、牛、小鼠和斑馬魚(yú)中是保守的。與GOLPH2最接近的人類同源物是癌癥敏感性候選基因4（CASC4）蛋白（Swiss-ProtQ6P4E1），其是一種單通道II型膜蛋白，其表達(dá)水平的增加與HER-2/neu原癌基因的過(guò)表達(dá)相關(guān)。已獲得多種GOLPH2蛋白和核酸的GOLPH2序列，例如在由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（見(jiàn)網(wǎng)站www.ncbi.nlm.nih.gov/）維護(hù)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)中。GOLPH2蛋白及其片段或抗原片段用于制備GOLPH2功能的抑制劑。人GOLPH2氨基酸序列的一個(gè)例子為登錄號(hào)CAG33482.1（GI:48146519），見(jiàn)下述SEQIDNO:1。1MGLGNGRRSMKSPPLVLAALVACIIVLGFNYWIASSRSVD41LQTRIMELEGRVRRAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQL81DKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVLQ121DQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCIN161QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQ201ALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSE241VVLDSKRRVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVE281DRPVGGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERD321QLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAESE361TDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTL將該400個(gè)氨基酸的GOLPH2蛋白在位置53后面的兩個(gè)精氨酸之間裂解以產(chǎn)生能夠由細(xì)胞分泌的可溶性形式的GOLPH2。因此SEQIDNO:1GOLPH2蛋白的可溶性形式具有下述序列（SEQIDNO:2）。54RAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQL81DKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVLQ121DQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCIN161QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQ201ALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSE241VVLDSKRRVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVE281DRPVGGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERD321QLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAESE361TDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTLGOLPH2蛋白具有跨膜區(qū)，該跨膜區(qū)包括跨氨基酸位置12-34的區(qū)域，并具有下述氨基酸序列（SEQIDNO:3）：SPPLVLAALVACIIVLGFNYWIA。無(wú)N-末端區(qū)域包括此跨膜區(qū)的GOLPH2蛋白具有下述序列（SEQIDNO:4）。35SSRSVD41LQTRIMELEGRVRRAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQL81DKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVLQ121DQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCIN161QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQ201ALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSE241VVLDSKRRVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVE281DRPVGGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERD321QLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAESE361TDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTLGOLPH2蛋白具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，其包括跨SEQIDNO:1序列的氨基酸位置35-203的序列。該序列如下述SEQIDNO:5所示。35SSRSVD41LQTRIMELEGRVRRAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQL81DKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVLQ121DQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCIN161QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQ201ALS在裂解和分泌后，GOLPH2卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)⒃贜-末端截短，并且將具有下述序列（SEQIDNO:6）。54RAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQL81DKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVLQ121DQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCIN161QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQ201ALS這些和其它GOLPH2蛋白片段可用于制備GOLPH2抑制劑。例如，具有氨基酸54-90的GOLPH2蛋白片段可以具有此類作用。該GOLPH2蛋白片段具有下述序列（SEQIDNO:7）。54RAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQ識(shí)別SEQIDNO:7GOLPH2蛋白片段的家兔抗-GOLPH2多克隆抗體（GP73（N-19））是GOLPH2的有效抑制劑。可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸91-130的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:8）。91LESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVLQDQLKTLQRNY可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸131-170的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:9）。131GRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCINQMKEVKEQCE可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸171-210的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:10）。171ERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQALSEPQPRLQ可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸211-250的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:11）。211AAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSEVVLDSKRRVE可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸251-290的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:12）。251KEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVEDRPVGGRGFG可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸291-330的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:13）。291GAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEE可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸331-370的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:14）。331EQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAESETDKQAALAGN可以用于制備GOLPH2抑制劑的另一種GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸371-400的GOLPH2，其具有下述序列（SEQIDNO:15）。371DRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTL編碼上述GOLPH2蛋白（SEQIDNO:1-15）的核酸序列可以是登錄號(hào)為CR457201.1（GI:48146518），如下述核酸SEQIDNO:16所示。1ATGGGCTTGGGAAACGGGCGTCGCAGCATGAAGTCGCCGC41CCCTCGTGCTGGCCGCCCTGGTGGCCTGCATCATCGTCTT81GGGCTTCAACTACTGGATTGCGAGCTCCCGGAGCGTGGAC121CTCCAGACACGGATCATGGAGCTGGAAGGCAGGGTCCGCA161GGGCGGCTGCAGAGAGAGGCGCCGTGGAGCTGAAGAAGAA201CGAGTTCCAGGGAGAGCTGGAGAAGCAGCGGGAGCAGCTT241GACAAAATCCAGTCCAGCCACAACTTCCAGCTGGAGAGCG281TCAACAAGCTGTACCAGGACGAAAAGGCGGTTTTGGTGAA321TAACATCACCACAGGTGAGAGGCTCATCCGAGTGCTGCAA361GACCAGTTAAAGACCCTGCAGAGGAATTACGGCAGGCTGC401AGCAGGATGTCCTCCAGTTTCAGAAGAACCAGACCAACCT441GGAGAGGAAGTTCTCCTACGACCTGAGCCAGTGCATCAAT481CAGATGAAGGAGGTGAAGGAACAGTGTGAGGAGCGAATAG521AAGAGGTCACCAAAAAGGGGAATGAAGCTGTAGCTTCCAG561AGACCTGAGTGAAAACAACGACCAGAGACAGCAGCTCCAA601GCCCTCAGTGAGCCTCAGCCCAGGCTGCAGGCAGCAGGCC641TGCCACACACAGAGGTGCCACAAGGGAAGGGAAACGTGCT681TGGTAACAGCAAGTCCCAGACACCAGCCCCCAGTTCCGAA721GTGGTTTTGGATTCAAAGAGACGAGTTGAGAAAGAGGAAA761CCAATGAGATCCAGGTGGTGAATGAGGAGCCTCAGAGGGA801CAGGCTGCCGCAGGAGCCAGGCCGGGAGCAGGTGGTGGAA841GACAGACCTGTAGGTGGAAGAGGCTTCGGGGGAGCCGGAG881AACTGGGCCAGACCCCACAGGTGCAGGCTGCCCTGTCAGT921GAGCCAGGAAAATCCAGAGATGGAGGGCCCTGAGCGAGAC961CAGCTTGTCATCCCCGACGGACAGGAGGAGGAGCAGGAAG1001CTGCCGGGGAAGGGAGAAACCAGCAGAAACTGAGAGGAGA1041AGATGACTACAACATGGATGAAAATGAAGCAGAATCTGAG1081ACAGACAAGCAAGCAGCCCTGGCAGGGAATGACAGAAACA1121TAGATGTTTTTAATGTTGAAGATCAGAAAAGAGACACCAT1161AAATTTACTTGATCAGCGTGAAAAGCGGAATCATACACTT1201TAA人GOLPH2氨基酸序列的另一個(gè)例子可以是登錄號(hào)CAG33482.1（GI:48146519），如下述SEQIDNO:17所示。1MMGLGNGRRSMKSPPLVLAALVACIIVLGFNYWIASSRSV41DLQTRIMELEGRVRRAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQ81LDKIQSSHNFQLESVNKLYQDEKAVLVNNITTGERLIRVL121QDQLKTLQRNYGRLQQDVLQFQKNQTNLERKFSYDLSQCI161NQMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQL201QALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSS241EVVLDSKRQVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVV281EDRPVGGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPER301DQLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAES361ETDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHT401L將該401個(gè)氨基酸的GOLPH2蛋白在位置54后面的兩個(gè)精氨酸之間裂解以產(chǎn)生與序列SEQIDNO:2相同的可溶性GOLPH2蛋白。上述GOLPH2SEQIDNO:17序列的核酸序列可以是登錄號(hào)AY358593.1（GI:37182307），如下述核酸SEQIDNO:18所示。1GCTCGAGGCCGGCGGCGGCGGGAGAGCGACCCGGGCGGCC41TCGTAGCGGGGCCCCGGATCCCCGAGTGGCGGCCGGAGCC81TCGAAAAGAGATTCTCAGCGCTGATTTTGAGATGATGGGC121TTGGGAAACGGGCGTCGCAGCATGAAGTCGCCGCCCCTCG161TGCTGGCCGCCCTGGTGGCCTGCATCATCGTCTTGGGCTT201CAACTACTGGATTGCGAGCTCCCGGAGCGTGGACCTCCAG241ACACGGATCATGGAGCTGGAAGGCAGGGTCCGCAGGGCGG281CTGCAGAGAGAGGCGCCGTGGAGCTGAAGAAGAACGAGTT321CCAGGGAGAGCTGGAGAAGCAGCGGGAGCAGCTTGACAAA361ATCCAGTCCAGCCACAACTTCCAGCTGGAGAGCGTCAACA401AGCTGTACCAGGACGAAAAGGCGGTTTTGGTGAATAACAT441CACCACAGGTGAGAGGCTCATCCGAGTGCTGCAAGACCAG481TTAAAGACCCTGCAGAGGAATTACGGCAGGCTGCAGCAGG521ATGTCCTCCAGTTTCAGAAGAACCAGACCAACCTGGAGAG561GAAGTTCTCCTACGACCTGAGCCAGTGCATCAATCAGATG601AAGGAGGTGAAGGAACAGTGTGAGGAGCGAATAGAAGAGG641TCACCAAAAAGGGGAATGAAGCTGTAGCTTCCAGAGACCT681GAGTGAAAACAACGACCAGAGACAGCAGCTCCAAGCCCTC721AGTGAGCCTCAGCCCAGGCTGCAGGCAGCAGGCCTGCCAC761ACACAGAGGTGCCACAAGGGAAGGGAAACGTGCTTGGTAA801CAGCAAGTCCCAGACACCAGCCCCCAGTTCCGAAGTGGTT841TTGGATTCAAAGAGACAAGTTGAGAAAGAGGAAACCAATG881AGATCCAGGTGGTGAATGAGGAGCCTCAGAGGGACAGGCT921GCCGCAGGAGCCAGGCCGGGAGCAGGTGGTGGAAGACAGA961CCTGTAGGTGGAAGAGGCTTCGGGGGAGCCGGAGAACTGG1001GCCAGACCCCACAGGTGCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCA1041GGAAAATCCAGAGATGGAGGGCCCTGAGCGAGACCAGCTT1081GTCATCCCCGACGGACAGGAGGAGGAGCAGGAAGCTGCCG1121GGGAAGGGAGAAACCAGCAGAAACTGAGAGGAGAAGATGA1161CTACAACATGGATGAAAATGAAGCAGAATCTGAGACAGAC1201AAGCAAGCAGCCCTGGCAGGGAATGACAGAAACATAGATG1241TTTTTAATGTTGAAGATCAGAAAAGAGACACCATAAATTT1281ACTTGATCAGCGTGAAAAGCGGAATCATACACTCTGAATT1321GAACTGGAATCACATATTTCACAACAGGGCCGAAGAGATG1361ACTATAAAATGTTCATGAGGGACTGAATACTGAAAACTGT1401GAAATGTACTAAATAAAATGTACATCTGA結(jié)構(gòu)分析揭示，GOLPH2在跨膜區(qū)后完全是螺旋的，具有兩個(gè)長(zhǎng)度為150至200個(gè)殘基的預(yù)計(jì)連續(xù)的螺旋區(qū)。這種顯著的螺旋性質(zhì)可以解釋其對(duì)蛋白酶的抗性，因?yàn)榈鞍姿庑枰煺沟慕Y(jié)構(gòu)如β-股或不規(guī)則卷曲構(gòu)象。GOLPH2極其簡(jiǎn)單的二級(jí)結(jié)構(gòu)還可以解釋其耐熱性，因?yàn)樵摰鞍卓赡芫哂蟹浅８叩淖冃詼囟然蚩赡芤子谠诶鋮s后重新折疊。研究發(fā)現(xiàn)在患有肝病，特別是肝細(xì)胞癌（HCC）的患者血清中具有高水平的GOLPH2（Li&Fan,Hepatology50,1682(2009);Marrero等，JHepatol43,1007-12(2005)）。與最常用的癌癥血清標(biāo)志物α-甲胎蛋白相比，GOLPH2的血清水平針對(duì)早期HCC似乎更加敏感（Marrero等，JHepatol43,1007-12(2005)）。在HCC中GOLPH2被巖藻糖基化，在血清中其巖藻糖基化的部分甚至是更好的疾病標(biāo)志物（Block等，ProcNatlAcadSciUSA102,779-84(2005)）。在具有HCV1b基因型感染背景發(fā)展成HCC的患者中檢測(cè)到GOLPH2的血清水平升高最為顯著（Riener等，Hepatology49,1602-9(2009)）。在肺癌患者中GOLPH2的血清水平也顯著升高（Zhang等，ClinBiochem43,983-91(2010)）。GOLPH2還被描述為用于診斷前列腺癌的非常好的輔助組織生物標(biāo)志物（Kristiansen等，Br.J.Cancer99:939-48(2008)）。表達(dá)C-末端截短GOLPH2的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出存活率降低，并具有較強(qiáng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的肝腎病變（Wright等，IntJClinExpPathol2,34-47(2009)）。這種腎臟病變與在脂蛋白簇（CLU）敲除小鼠中觀察到的情況有幾分類似（Whelchel等，InvestOphthalmolVisSci34,2603-6(1993)），其分泌形式（sCLU）表現(xiàn)為通過(guò)后面的C-末端與分泌的GOLPH2發(fā)生相互作用（Li&Fan,Hepatology50,1682(2009)）。如本申請(qǐng)所述，GOLPH2具有一個(gè)迄今為止未知的和意想不到的功能：通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)IL-12產(chǎn)生，并且調(diào)節(jié)IL-12驅(qū)動(dòng)的TH1活化。本申請(qǐng)所描述的實(shí)驗(yàn)證明了GOLPH2的細(xì)胞和分子機(jī)制，及其影響細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和免疫逃逸的抵抗。本申請(qǐng)進(jìn)一步證明了，用于抑制GOLPH2的組合物和方法增加IL-12表達(dá)，并降低GOLPH2通常表現(xiàn)出的免疫抑制活性。一種傳統(tǒng)的免疫學(xué)范式是：B細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用是T細(xì)胞輔助B細(xì)胞最終分化為免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的血漿細(xì)胞的單向現(xiàn)象。本申請(qǐng)所述的研究對(duì)這種理論發(fā)起挑戰(zhàn)，并且在這一缺失環(huán)節(jié)定義了特定的分子：GOLPH2，本申請(qǐng)中將其描述為癌癥治療的新靶點(diǎn)。圖7描述了GOLPH2誘導(dǎo)的對(duì)IL-12產(chǎn)生的抑制和T細(xì)胞活化的預(yù)計(jì)模型。在專門(mén)的抗原呈遞細(xì)胞（DCs和巨噬細(xì)胞）中通過(guò)先天免疫途徑，如TLR-介導(dǎo)的信號(hào)，和通過(guò)獲得性免疫信號(hào)，如CD40L（#1），刺激IL-12基因的轉(zhuǎn)錄。這些活化NF-κB和IL-12p35的基因轉(zhuǎn)錄（#3）?；罨腂淋巴細(xì)胞（#4）和惡性B細(xì)胞（#5）產(chǎn)生GOLPH2，其與DCs（#6）上假定的受體（GOLPH2-R）結(jié)合并誘導(dǎo)GC-BP酪氨酸磷酸化（#7）。磷酸化的GC-BP轉(zhuǎn)位至核（#8）并通過(guò)在ACRE與近端的p35啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來(lái)阻斷IL-12的產(chǎn)生（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）（#9）。IL-12（#10）的缺乏導(dǎo)致天然T（Th0）細(xì)胞（#11）的活化和TH1分化的阻斷，這限制了針對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體和惡性腫瘤的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在吞噬細(xì)胞中也誘導(dǎo)了GC-BP磷酸化，該吞噬細(xì)胞與具有外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）的凋亡細(xì)胞（AC）通過(guò)磷脂酰絲氨酸受體（#12）接觸。治療方法本發(fā)明的一個(gè)方面是一種在有需要的哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物GOLPH2抑制劑，從而在哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫是一種不涉及抗體但涉及巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）、抗原-特異性細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞的活性的免疫應(yīng)答，并且在對(duì)抗原的應(yīng)答中涉及多種細(xì)胞因子的釋放。如本申請(qǐng)所述，GOLPH2抑制劑增加哺乳動(dòng)物IL-12的內(nèi)源性產(chǎn)生。在某些實(shí)施方式中，GOLPH2抑制劑使哺乳動(dòng)物IL-12的內(nèi)源性產(chǎn)生增加10%、或20%、或50%、或70%、或100%、或150%、或200%、或300%、或400%、或500%、或700%、或1000%。GOLPH2抑制劑還能夠通過(guò)活化T淋巴細(xì)胞增加干擾素-γ（IFN-γ）的產(chǎn)生。在某些實(shí)施方式中，GOLPH2抑制劑使哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞IFN-γ的內(nèi)源性產(chǎn)生增加10%、或20%、或50%、或70%、或100%、或150%、或200%、或300%、或400%、或500%、或700%、或1000%。本申請(qǐng)所述的方法和組合物能夠用于治療多種癌癥和腫瘤，例如白血病、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、皮膚癌、睪丸癌、胃癌、胰腺癌、腎癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、頭頸部癌、腦癌、食管癌、膀胱癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肺癌、支氣管癌、子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌、宮頸癌或肝癌、以及原發(fā)灶不明的癌癥。能夠治療的肝臟疾病的例子包括：那些涉及肝炎病毒和與急性或慢性病毒性肝炎（如乙型肝炎和丙型肝炎）相關(guān)的肝臟疾病，或由丙型肝炎引起的肝硬化或肝細(xì)胞癌。將乙型肝炎定義為由HBV感染引起的肝炎，將丙型肝炎定義為由HCV感染引起的肝炎。將慢性肝炎定義為肝臟中的炎癥持續(xù)或幾乎持續(xù)6個(gè)月或以上的臨床狀況。將肝臟疾病定義為肝臟的炎性病癥，該概念可以根據(jù)癥狀的進(jìn)展情況包括脂肪肝、肝硬化和肝細(xì)胞癌。本申請(qǐng)所述的方法和組合物還能夠用于治療多種微生物感染，包括：例如，細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、霉菌、真菌和其它微生物。例如，所治療的感染可以是致病性細(xì)菌導(dǎo)致的感染，如志賀氏菌，傷寒沙門(mén)氏菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，霍亂弧菌，空腸彎曲菌，空腸螺旋桿菌，銅綠假單胞菌，流感嗜血桿菌，百日咳桿菌（百日咳），霍亂弧菌，和大腸桿菌，大腸桿菌包括致瀉性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌（EaggEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、腎盂腎炎大腸桿菌（UPEC）和新生兒腦膜炎大腸桿菌（NMEC）?？梢灾委煹钠渌虏⌒约?xì)菌感染可以由包括炭疽芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、土拉弗朗西斯菌、類鼻疽桿菌、伯氏考克斯體、布魯氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、金黃色葡萄球菌、耐藥鏈球菌、普氏立克次氏體、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌、空腸彎曲菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的感染引起。本申請(qǐng)所述的組合物可以治療或預(yù)防多種病毒感染，包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、長(zhǎng)囊水云病毒、水泡性口病毒、病毒性腦炎（如東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒和西部馬腦炎病毒）、病毒性出血熱（如埃博拉、馬爾堡、朱寧、阿根廷和拉沙病毒）、流感病毒和禽流感病毒（有時(shí)也被稱為鳥(niǎo)流感）。其它可以治療的病毒感染包括但不限于那些涉及重型天花（痘癥）和其它痘病毒、砂粒病毒（包括LCM、朱寧病毒、馬丘波病毒、瓜納里托病毒、拉沙熱病毒）、布尼亞病毒（包括漢坦、裂谷熱病毒）、黃病毒（包括登革熱病毒）、絲狀病毒（包括埃博拉病毒和馬爾堡病毒）、蜱媒出血熱病毒（包括克里米亞-剛果出血熱病毒）、蜱媒腦炎病毒、黃熱病毒、流感病毒、狂犬病毒、西尼羅河病毒、拉克羅斯病毒、加利福尼亞腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦脊髓炎病毒、日本腦炎病毒和賈薩努爾森林病毒的感染。IL-12的抗腫瘤作用IL-12能夠在動(dòng)物模型中顯著活化宿主的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗多種腫瘤。IL-12的抗腫瘤作用通過(guò)活化非抗原特異性的自然殺傷（NK）細(xì)胞，MHCI介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，以及誘導(dǎo)TH1效應(yīng)器細(xì)胞和活化用于腫瘤特異性消除和長(zhǎng)期保護(hù)性免疫的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）來(lái)介導(dǎo)的。IL-12活化五個(gè)重要的免疫效應(yīng)器細(xì)胞[NK、CTL、T輔助細(xì)胞（TH）、淋巴組織誘導(dǎo)（LTi）細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞]的能力使得腫瘤幾乎沒(méi)有機(jī)會(huì)逃逸。如上文所述，調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化（包括TH1分化）的信號(hào)從B-細(xì)胞發(fā)出。多種腫瘤在原位缺乏明顯的免疫原性可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的特殊性質(zhì)所致，例如缺乏共刺激分子、下調(diào)MHC細(xì)胞或產(chǎn)生免疫抑制性因子。這種免疫原性的缺乏還可能是由免疫系統(tǒng)固有的耐受機(jī)制所致。IL-12能夠顯著改善較弱的抗腫瘤免疫應(yīng)答并提供腫瘤特異性消除和長(zhǎng)期保護(hù)性免疫。IL-12活化五個(gè)重要的免疫效應(yīng)器細(xì)胞：自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、T輔助（TH）細(xì)胞、淋巴組織誘導(dǎo)（LTi）細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞。這些IL-12活化細(xì)胞的綜合作用使得腫瘤幾乎沒(méi)有機(jī)會(huì)逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。因而，如果IL-12的產(chǎn)生增強(qiáng)，則能夠克服腫瘤細(xì)胞的免疫原性缺乏，并且宿主自身的免疫系統(tǒng)就能夠消除癌細(xì)胞而不需要導(dǎo)致衰弱的化療。IL-12用于人T細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤和腎癌的人臨床應(yīng)用和在恒河猴SIV-感染模型中的初步結(jié)果均支持IL-12具有潛在的抗腫瘤治療作用。參見(jiàn)，Rook等，Blood94,902-8.(1999)；Rook等，AnnNYAcadSci941,177-84.(2001)；Ansell等，Blood99,67-74(2002)；Mortarini等，CancerRes60,3559-68.(2000)；Gollob等，ClinCancerRes6,1678-92.(2000)；Lee等，JClinOncol19,3836-47.(2001)；Kang等，HumGeneTher12,671-84.(2001)；Gajewski等，ClinCancerRes7,895s-901s.(2001)；Portielje等，ClinCancerRes5,3983-9.(1999)；Ansari等，JVirol76,1731-43.(2002)。在經(jīng)過(guò)不確定重組IL-12的安全性和對(duì)導(dǎo)致其不良作用的原因進(jìn)行密集調(diào)查的短暫時(shí)期后，最近重新將其用于設(shè)計(jì)更為合理的癌癥治療，如聯(lián)合治療和疫苗佐劑，例如，用于與卵巢癌或原發(fā)性腹膜癌相關(guān)的腹膜癌（Lenzi等，JTranslMed5,66(2007)）、AIDS-相關(guān)的卡波西氏肉瘤（Little等，Blood110,4165-71(2007)）、復(fù)發(fā)難治性非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏?。╕ounes等，ClinCancerRes10,5432-8(2004)）和晚期黑色素瘤（Peterson等，JClinOncol21,2342-8(2003)）。在惡性腫瘤中的TH1/TH2失衡越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在腫瘤生長(zhǎng)中或?qū)⒁L(zhǎng)時(shí)，早期和持續(xù)的炎癥型應(yīng)答調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)的多個(gè)方面（deVisser等，NatRevCancer6,24-37(2006)）?，F(xiàn)在人們認(rèn)識(shí)到持續(xù)性的體液免疫應(yīng)答加劇了腫瘤微環(huán)境中先天性免疫細(xì)胞的募集和活化，在腫瘤微環(huán)境中其調(diào)節(jié)組織重塑、促血管生成通路和促存活通路，這共同促進(jìn)了癌癥的生長(zhǎng)（Andreu等，CancerCell17,121-134(2010)）。已知前惡性和惡性組織與免疫細(xì)胞功能的改變相關(guān)，包括抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫（CMI），與排斥腫瘤失敗相關(guān)，同時(shí)伴隨著增強(qiáng)能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的體液免疫。（Dalgleish等，AdvCancerRes84,231-76(2002)）。無(wú)數(shù)人和動(dòng)物模型的研究證明了TH1和TH2細(xì)胞因子的平衡對(duì)多種癌癥的發(fā)展具有非常重要的影響（Agarwal等，CancerImmunolImmunother55,734-43(2006)；Kanazawa等，AnticancerRes25,443-9(2005)；Galon等，Science313,1960-4(2006)；Sheu等，JImmunol167,2972-8(2001)）。TH1/TH2失衡可能反映了細(xì)胞免疫的顯著變化，這在惡性血液病中、在患有急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的兒童和成人中、在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）中、在結(jié)直腸腺癌中和在卵巢癌發(fā)展過(guò)程中均是有據(jù)可查的。參見(jiàn)，Mori等，CancerImmunolImmunother50,566-8(2001)；Zhang等，CancerImmunolImmunother49,165-72(2000)；Yotnda等，ExpHematol27,1375-83(1999)；deTotero等，BrJHaematol104,589-99(1999)；Cui等，CancerImmunolImmunother56,1993-2001(2007)；Kusuda等，OncolRep13,1153-8(2005)。B細(xì)胞通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)一種傳統(tǒng)的免疫學(xué)范式是B-細(xì)胞和T-細(xì)胞之間的相互作用是T-細(xì)胞輔助B細(xì)胞最終分化為免疫球蛋白種類改變的血漿細(xì)胞的單向現(xiàn)象。然而，最近的研究表明B細(xì)胞對(duì)T-細(xì)胞的分化和效應(yīng)器功能具有反向影響。例如，B細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞的直接耐受、通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的產(chǎn)生使得T-細(xì)胞無(wú)反應(yīng)力、通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞下調(diào)IL-12的產(chǎn)生、和通過(guò)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子影響TH1/TH2的分化（Bennett等，JExpMed188,1977-83(1998)；Eynon&Parker,JExpMed175,131-8(1992)；Fuchs等，Science258,1156-9(1992)；Parekh等，JImmunol170,5897-911(2003)；Skok等，JImmunol163,4284-91(1999)；Mori等，JExpMed176,381-8(1992)；Harris等，NatImmunol1,475-82(2000)）。類似地，B細(xì)胞能夠在T細(xì)胞免疫的體內(nèi)模型中表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能，包括腫瘤排斥、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎（EAE）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）（Qin等，NatMed4,627-30(1998)；Fillatreau等，NatImmunol3,944-50(2002)；Mauri等，JExpMed197,489-501(2003)）。在小鼠中，最近鑒定出具有IL-10依賴性負(fù)向T-細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的相對(duì)罕見(jiàn)的脾臟B細(xì)胞亞型，并將其命名為B10細(xì)胞（Matsushita等，JClinInvest118,3420-30(2008)；Watanabe等，JImmunol184,4801-9(2010)；Yanaba等，Immunity28,639-50(2008)）。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，顯示出B10細(xì)胞通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞（APC）的能力，間接調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫（Matsushita等，JImmunol185,2240-52(2010)）。B細(xì)胞能夠抑制樹(shù)突狀細(xì)胞接種的能力以防止腫瘤的生長(zhǎng)（Watt等，JImmunother30,323-32(2007)）。B細(xì)胞對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫的抑制作用與同腫瘤抗原相關(guān)的I類主要組織相容性分子（MHC）的提呈無(wú)關(guān)，但與II類MHC表達(dá)的B細(xì)胞相關(guān)。給予B細(xì)胞不會(huì)改變樹(shù)突狀細(xì)胞從注射部位遷移的能力或者削弱樹(shù)突狀細(xì)胞-T細(xì)胞之間在引流淋巴結(jié)內(nèi)的相互作用。通過(guò)CD4+、CD25+調(diào)節(jié)的T細(xì)胞的耗竭，部分逆轉(zhuǎn)了B細(xì)胞的抑制性作用（Watt等，JImmunother30,323-32(2007)）。因而，B細(xì)胞是一種重要的，但是到目前為止被低估了的T細(xì)胞介導(dǎo)免疫的調(diào)節(jié)劑。針對(duì)GOLPH2的抗體本發(fā)明還提供了優(yōu)選地與GOLPH2蛋白結(jié)合的抗體和結(jié)合實(shí)體。本發(fā)明的抗-GOLPH2抗體和結(jié)合實(shí)體能夠與GOLPH2蛋白上的任意表位結(jié)合。例如，所述的抗-GOLPH2抗體和結(jié)合實(shí)體能夠與具有SEQIDNO:1-15和17中任意一個(gè)的GOLPH2多肽的任意表位結(jié)合。然而，優(yōu)選地，抗-GOLPH2抗體和結(jié)合實(shí)體特異性地與以其可溶的、胞外形式的GOLPH2結(jié)合。抗體-GOLPH2抗體/結(jié)合實(shí)體能夠結(jié)合的GOLPH2多肽序列的例子包括：具有SEQIDNO:2、4-15中任意一個(gè)的GOLPH2多肽?？贵w-GOLPH2抗體和/或結(jié)合實(shí)體能夠結(jié)合的GOLPH2表位可以包括具有片段長(zhǎng)度，例如約10-20個(gè)氨基酸，的任意GOLPH2肽序列。這樣，可以從具有SEQIDNO:1-15和17中任意一個(gè)的多肽或其任意類似物引入GOLPH2表位，以產(chǎn)生抗-GOLPH2抗體和/或結(jié)合實(shí)體。這樣，在某些實(shí)施方式中，GOLPH2表位可以是截短的多肽，例如從其N-末端和/或C-末端移除任意數(shù)量氨基酸的SEQIDNO:1-15和17中的任意一個(gè)。例如，可以使用其N-末端和/或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60個(gè)氨基酸的截短的SEQIDNO:1-15和17多肽作為產(chǎn)生抗-GOLPH2抗體和/或結(jié)合實(shí)體的表位。在其它實(shí)施方式中，所述GOLPH2表位可以是具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的多肽。例如，所述GOLPH2表位可以具有其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代的SEQIDNO:1-15和17序列中的任意一個(gè)的多肽。在某些實(shí)施方式中，取代的氨基酸具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)或類似的化學(xué)性質(zhì)。與此類GOLPH2表位特異性結(jié)合的抗-GOLPH2抗體和/或結(jié)合實(shí)體用于抑制分泌的GOLPH2。如本申請(qǐng)所述，當(dāng)GOLPH2裂解并分泌后，其通過(guò)，例如抑制IL-12產(chǎn)生，來(lái)抑制免疫應(yīng)答。然而，給予分泌的GOLPH2的抑制劑能夠減輕抑制和刺激免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了通過(guò)現(xiàn)有程序制備的抗體和結(jié)合實(shí)體，其能夠與GOLPH2，特別是可溶的、分泌的GOLPH2結(jié)合。優(yōu)選抑制GOLPH2的功能并且恢復(fù)IL-12表達(dá)的抗體。用于治療目的時(shí)，優(yōu)選人或人源化抗-GOLPH2抗體。因而，抗體或結(jié)合實(shí)體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如對(duì)GOLPH2具有特異性的抗體的CDR區(qū)，可以被轉(zhuǎn)化成或同任意適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合實(shí)體骨架，包括人抗體骨架，一起使用?？贵w分子屬于被稱為免疫球蛋白的血漿蛋白家族，其基本構(gòu)造塊，即免疫球蛋白折疊或結(jié)構(gòu)域，在免疫系統(tǒng)和其它生物識(shí)別系統(tǒng)的多種分子中以不同形式應(yīng)用。典型的抗體是由兩條相同的免疫球蛋白重鏈和兩條相同的輕鏈組成的四聚體結(jié)構(gòu)，其分子量約為150,000道爾頓?？贵w的重鏈和輕鏈由不同結(jié)構(gòu)域組成。每條輕鏈具有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（VL）和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域（CL），而每條重鏈具有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（VH）和三個(gè)或四個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域（CH）。參見(jiàn)，例如Alzari,P.N.,Lascombe,M.-B.&Poljak,R.J.(1988)Three-dimensionalstructureofantibodies.Annu.Rev.Immunol.6,555-580。各結(jié)構(gòu)域由約110個(gè)氨基酸殘基組成，折疊成由兩個(gè)β-折疊彼此擠壓形成的典型的β-三明治結(jié)構(gòu)，即免疫球蛋白折疊。VH和VL結(jié)構(gòu)域均具有三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR1-3），其為環(huán)狀或旋轉(zhuǎn)，在所述結(jié)構(gòu)域的一端與β-股連接。輕鏈和重鏈的可變區(qū)通常與抗原的特異性相關(guān)，但是各條鏈對(duì)特異性所發(fā)揮的作用不總是相同的?？贵w分子已經(jīng)進(jìn)化為通過(guò)使用六個(gè)隨機(jī)的環(huán)（CDRs）與大量分子結(jié)合。依據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列將免疫球蛋白分為不同類型。至少有五（5）種主要類型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM?？梢詫⑵渲械哪承┻M(jìn)一步分成亞型（同種型），例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。與IgA、IgD、IgE、IgG和IgM類型的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將抗體輕鏈分成兩種明顯不同的類型，稱為κ和λ。不同類型免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型均是公知的。在抗體可變結(jié)構(gòu)域的上下文中，術(shù)語(yǔ)“可變的”指不同抗體可變結(jié)構(gòu)域序列的某些部分存在極大差異的這一事實(shí)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域用于結(jié)合和確定各特定抗體針對(duì)其特定抗原的特異性。然而，所述可變性并不是在整個(gè)抗體的可變結(jié)構(gòu)域平均分布的。相反的是，所述可變性集中在被稱為互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR）的三個(gè)片段，也將其稱為輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的超變區(qū)。將可變結(jié)構(gòu)域中高保守性的部分稱為框架（FR）區(qū)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域中各包含四個(gè)FR區(qū)，其主要為β-折疊構(gòu)型，由三個(gè)CDR連接，形成環(huán)狀連接，在某些情況下形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)。各條鏈的CDRs通過(guò)FR區(qū)彼此緊鄰，并且與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出不同的效應(yīng)器功能，如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒作用。因而，本發(fā)明中考慮使用的抗體可以是多種形式中的任意一種，包括整個(gè)免疫球蛋白，抗體片段，如Fv、Fab，和類似片段，包括可變結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR）的單鏈抗體等形式，這些均落入如本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”的范圍。本發(fā)明考慮的抗體、多克隆或單克隆抗體特異性的任意用途，不限于識(shí)別并與特定GLOPH2多肽或其衍生物發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。而且，抗體的結(jié)合區(qū)或CDR可以位于任意適合的結(jié)合實(shí)體多肽的骨架內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本申請(qǐng)所述方法的上下文中，抗體、結(jié)合實(shí)體或其片段對(duì)使用其治療的哺乳動(dòng)物不具有免疫原性。而且，優(yōu)選對(duì)GOLPH2及其變體和衍生物具有免疫特異性的抗體、結(jié)合實(shí)體或其片段。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段?？贵w經(jīng)木瓜蛋白酶消化后產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為Fab片段，其分別具有一個(gè)單獨(dú)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，和殘余的Fc片段。因而，F(xiàn)ab片段具有一條完整的輕鏈和一條重鏈的一部分。經(jīng)胃蛋白酶處理后產(chǎn)生F(ab′)2片段，其具有能夠交聯(lián)抗原的兩個(gè)抗原結(jié)合片段，和稱為pFc′片段的殘余片段。Fab'片段是將經(jīng)胃蛋白酶消化的抗體還原后獲得，其由完整的輕鏈和重鏈的一部分組成。每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)Fab'片段。Fab′片段與Fab片段不同，其在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端存在幾個(gè)附加的殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fv是含有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小的抗體片段。該區(qū)域由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以緊密的、非共價(jià)結(jié)合形式形成的二聚體（VH-VL二聚體）組成。在這種構(gòu)型中，各可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDR相互作用以限定VH-VL二聚體表面的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？偟膩?lái)說(shuō)，六個(gè)CDR使抗原與抗體特異性地結(jié)合。然而，盡管單一的可變結(jié)構(gòu)域（或僅包含對(duì)抗原具有特異性的三個(gè)CDR的半Fv）也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，但是與整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)相比其親和性較低。如本申請(qǐng)所使用的，抗體的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。其它的片段可以包括雙體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。單鏈抗體是含有輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)的基因工程化分子，其通過(guò)適宜的多肽連接子連接成基因融合的單鏈分子。這種單鏈抗體也稱為“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段。通常，所述Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包括多肽連接子，其能夠使sFv形成供抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。sFv的綜述參見(jiàn)PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.Springer-Verlag,N.Y.,pp.269-315(1994)。術(shù)語(yǔ)“雙體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，其中所述片段包括在同一多肽鏈上（VH-VL）上，與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL）連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH）。因?yàn)槭褂玫倪B接子太短，以至于在同一條鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)雙體更為詳細(xì)的描述參見(jiàn)例如EP404,097；WO93/11161，和Hollinger等，Proc.Natl.AcadSci.USA90:6444-6448(1993)。因此，本發(fā)明涉及的抗體片段不是全長(zhǎng)抗體。然而，這種抗體片段與全長(zhǎng)抗體相比能夠具有類似的或改進(jìn)的免疫學(xué)性質(zhì)。此類抗體片段可以同約4個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸、約12個(gè)氨基酸、約15個(gè)氨基酸、約17個(gè)氨基酸、約18個(gè)氨基酸、約20個(gè)氨基酸、約25個(gè)氨基酸、約30個(gè)氨基酸或更多一樣小。一般而言，本發(fā)明的抗體片段或結(jié)合實(shí)體可以具有任意尺寸上限，只要其同與GOLPH2多肽特異性結(jié)合的抗體相比，具有類似的或改善的免疫學(xué)性質(zhì)即可。例如，如果所述的抗體片段與輕鏈抗體亞基相關(guān)，則較小的結(jié)合實(shí)體和輕鏈抗體片段能夠具有小于約200個(gè)氨基酸、小于約175個(gè)氨基酸、小于約150個(gè)氨基酸、或者小于約120個(gè)氨基酸。然而，如果所述的抗體片段與重鏈抗體亞基相關(guān)，則較大的結(jié)合實(shí)體和重鏈抗體片段能夠具有小于約425個(gè)氨基酸、小于約400個(gè)氨基酸、小于約375個(gè)氨基酸、小于約350個(gè)氨基酸、小于約325個(gè)氨基酸、或者小于約300個(gè)的氨基酸。針對(duì)GOLPH2的抗體能夠由任意現(xiàn)有程序制備。多克隆抗體的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見(jiàn)，例如，Green等，ProductionofPolyclonalAntisera,in:ImmunochemicalProtocols(Manson,ed.),第1-5頁(yè)(HumanaPress)；Coligan等，ProductionofPolyclonalAntiserainRabbits,RatsMiceandHamsters,in:CurrentProtocolsinImmunology，2.4.1章(1992)，其通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明還可以包括單克隆抗體。如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本上具有同一性的抗體群體獲得的抗體。換言之，各抗體包含的群體是相同的，除了在某些抗體中可能存在少量偶發(fā)性的天然產(chǎn)生的突變。單克隆抗體是高度特異性的，其針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。而且，與通常包括針對(duì)不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制品不同，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了其具有特異性以外，優(yōu)勢(shì)還在于單克隆在其通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)物合成，無(wú)其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示從基本上具有同一性的抗體群體獲得的抗體，不能將其解釋為需要通過(guò)任何特定方法生產(chǎn)抗體。本申請(qǐng)中的單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)自特定種屬或者屬于特定類型或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或具有同源性，而所述鏈的其余部分與來(lái)自其它種屬或者屬于另一種抗體類型或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或具有同源性。還可以使用此類抗體的片段，只要其表現(xiàn)出所需的生物活性即可。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.AcadSci.81,6851-55(1984)。在某些實(shí)施方式中，抗-GOLPH2抗體的重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)是人序列。在不同實(shí)施方式中，抗-GOLPH2抗體的重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)是不會(huì)在哺乳動(dòng)物，如人類患者，中引起免疫原性反應(yīng)的序列。單克隆抗體的制備方法是常規(guī)的，可以使用任意現(xiàn)有程序制備此類單克隆抗體。參見(jiàn)，例如，Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)；Coligan等，第2.5.1-2.6.7章；和Harlow等：Antibodies:ALaboratoryManual,第726頁(yè)(ColdSpringHarborPub.(1988))，其通過(guò)引用并入本文?？梢圆捎枚喾N已建立的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。此類分離技術(shù)包括使用蛋白-A瓊脂糖親和層析、體積排阻色譜和離子交換色譜。參見(jiàn)，例如Coligan等，第2.7.1-2.7.12章和第2.9.1-2.9.3章；Barnes等，PurificationofImmunoglobulinG(IgG):MethodsinMolecularBiology,Vol.10，第79-104頁(yè)(HumanaPress(1992)。在體外和體內(nèi)操縱抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可以由上文所述的雜交瘤方法制備或者可以由重組體的方法制備，例如，如美國(guó)專利號(hào)4,816,567中所述。本發(fā)明中使用的單克隆抗體還可以采用Clackson等，Nature352:624-628(1991)，以及Marks等，J.MolBiol.222:581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離得到?？贵w片段的制備方法也是本領(lǐng)域公知的（參見(jiàn)，例如，HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,(1988)，其通過(guò)引用并入本文）。本發(fā)明中的抗體片段可以通過(guò)抗體的蛋白水解或者在適宜的宿主中表達(dá)編碼抗體片段的核酸制備?？梢酝ㄟ^(guò)使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體的常規(guī)方法獲得抗體片段。例如可以通過(guò)使用胃蛋白酶酶解抗體以提供被描述為F(ab’)2的5S片段來(lái)生產(chǎn)抗體片段?？梢允褂脦€基還原劑進(jìn)一步裂解該片段，并且任選地使用針對(duì)二硫鍵裂解得到的巰基的保護(hù)基團(tuán)，以生產(chǎn)3.5SFab’單價(jià)片段?；蛘?，使用胃蛋白酶解直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab’片段和一個(gè)Fc片段。在例如美國(guó)專利號(hào)4,036,945和4,331,647中描述了這些方法，本文中包含了所述參考文獻(xiàn)。因此，這些專利整體通過(guò)引用并入本文。還可以使用裂解抗體的其它方法，如將重鏈分離以形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段，將片段進(jìn)一步裂解，或者使用其它酶學(xué)、化學(xué)、或基因技術(shù)，只要所述片段能夠與完整抗體所識(shí)別的抗原結(jié)合即可。例如，F(xiàn)v片段包含VH和VL鏈的結(jié)合。該結(jié)合可以是非共價(jià)的或者可以通過(guò)分子間二硫鍵或使用化學(xué)試劑，如戊二醛交聯(lián)，將所述可變鏈連接。優(yōu)選地，所述Fv片段包含通過(guò)肽連接子連接的VH和VL鏈。通過(guò)構(gòu)建結(jié)構(gòu)基因制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白（sFv），該結(jié)構(gòu)基因包含由寡核苷酸連接的編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列。將結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體，隨后將所述表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌。該重組宿主細(xì)胞合成由連接子肽將兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域橋連的單一多肽鏈。在例如Whitlow等，Methods:aCompaniontoMethodsinEnzymology,Vol.2,第97頁(yè)(1991)；Bird等，Science242:423-426(1988)；Ladner等，美國(guó)專利號(hào)4,946,778；和Pack等，Bio/Technology11:1271-77(1993)中描述了生產(chǎn)sFv的方法?？贵w片段的另一種形式是編碼單一互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR）的肽。CDR肽（“最小的識(shí)別單元”）通常與抗原的識(shí)別和結(jié)合相關(guān)?？梢酝ㄟ^(guò)克隆或構(gòu)建編碼所關(guān)注抗體CDR的基因獲得CDR肽。例如，通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從抗體產(chǎn)生細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)來(lái)制備此類基因。參見(jiàn)，例如Larrick等，METHODS:ACOMPANIONTOMETHODSINENZYMOLOGY,Vol.2,第106頁(yè)(1991)。本發(fā)明涉及非人（例如，鼠源性）抗體的人和人源化形式。此類人源化抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或者其它抗體的抗原結(jié)合序列），其含有最少的來(lái)自非人免疫球蛋白的序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是受體互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR）的殘基被非人種屬（供體抗體），如具有所需特異性、親和性和相容性的小鼠、大鼠或家兔，的CDR殘基取代的人免疫球蛋白（受體抗體）。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。此外，人源化抗體可以包括不屬于受體抗體，也不屬于插入CDR或框架序列的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步完善和優(yōu)化抗體的性能。一般而言，人源化抗體將基本上包括全部的至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或基本上全部的與那些非人免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的CDR區(qū)，以及全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白共有的那些序列。優(yōu)先地，人源化的抗體還包括通常為人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)（Fc）的至少一部分。詳情參見(jiàn)：Jones等，Nature321,522-525(1986)；Reichmann等，Nature332,323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2,593-596(1992)；Holmes等，J.Immunol.,158:2192-2201(1997)和Vaswani等，AnnalsAllergy,Asthma&Immunol.,81:105-115(1998)。盡管標(biāo)準(zhǔn)程序可以生產(chǎn)抗體，但是，在某些實(shí)施方式中，抗體的尺寸、抗體的多鏈結(jié)構(gòu)和抗體中存在的六個(gè)結(jié)合環(huán)的復(fù)雜性均可能構(gòu)成對(duì)改進(jìn)和大量生產(chǎn)抗體的障礙。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用結(jié)合實(shí)體，其包括能夠識(shí)別并與GOLPH2多肽結(jié)合的多肽。多種蛋白可以作為蛋白支架，針對(duì)GOLPH2的結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與其連接，從而形成適宜的結(jié)合實(shí)體。結(jié)合結(jié)構(gòu)域與GOLPH2結(jié)合或與其相互作用，而所述蛋白支架僅支持和穩(wěn)定結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使它們能夠結(jié)合?？梢允褂枚喾N蛋白支架。例如，可以使用噬菌體衣殼蛋白。參見(jiàn)綜述Clackson&Wells,TrendsBiotechnol.12:173-184(1994)。噬菌體衣殼蛋白已用于作為展示隨機(jī)肽序列的支架，該隨機(jī)肽包括牛胰蛋白酶抑制劑（Roberts等，PNAS89:2429-2433(1992)）、人生長(zhǎng)激素（Lowman等，Biochemistry30:10832-10838(1991)、Venturini等，ProteinPeptideLetters1:70-75(1994)）和鏈球菌屬的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（O′Neil等，TechniquesinProteinChemistryV(Crabb,L,.ed.)第517-524頁(yè)，AcademicPress,SanDiego(1994)）。這些支架均具有一個(gè)單鏈隨機(jī)環(huán)或區(qū)域，可以對(duì)其進(jìn)行修飾以引入針對(duì)GOLPH2的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究者還使用小型的74個(gè)氨基酸的α-淀粉酶抑制劑Tendamistat作為在絲狀噬菌體M13上的提呈支架。McConnell,S.J.,&Hoess,R.H.,J.Mol.Biol.250:460-470(1995)。Tendamistat是一種來(lái)自唐德鏈霉菌的β-折疊蛋白。其具有的多種性質(zhì)使其成為用于結(jié)合肽的引人注目的支架，那些性質(zhì)包括其較小的尺寸、穩(wěn)定性和高分辨率NMR和X-射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的可用性。Tendamistat的整體拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域類似，具有通過(guò)一系列環(huán)連接的兩個(gè)β-折疊。與免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域不同的是，Tendamistat的β-折疊通過(guò)兩個(gè)而非一個(gè)二硫鍵連接在一起，這就解釋了為何該蛋白具有相當(dāng)強(qiáng)的穩(wěn)定性。Tendamistat的環(huán)與免疫球蛋白的CDR環(huán)具有相似的功能，并且通過(guò)體外的誘變作用能夠很容易地將其隨機(jī)化。Tendamistat來(lái)自于唐德鏈霉菌并且可以在人體內(nèi)作為抗原。因此，優(yōu)選地，在體外使用包括Tendamistat的結(jié)合實(shí)體。還使用III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域作為能夠連接結(jié)合實(shí)體的蛋白支架。III型纖連蛋白是免疫球蛋白超家族中較大亞家族（Fn3家族或s-型Ig家族）的一部分。例如，在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20020019517中提供了使用此類III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域作為結(jié)合實(shí)體（例如，CDR肽）的蛋白支架的序列、載體和克隆程序。亦參見(jiàn)，Bork,P.&Doolittle,R.F.(1992)Proposedacquisitionofananimalproteindomainbybacteria.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,8990-8994；Jones,E.Y.(1993)TheimmunoglobulinsuperfamilyCurr.OpinionStruct.Biol.3,846-852；Bork,P.,Hom,L.&Sander,C.(1994)Theimmunoglobulinfold.Structuralclassification,sequencepatternsandcommoncore.J.Mol.Biol.242,309-320；Campbell,I.D.&Spitzfaden,C.(1994)BuildingproteinswithfibronectintypeIIImodulesStructure2,233-337；Harpez,Y.&Chothia,C.(1994)。在免疫系統(tǒng)中，從大型文庫(kù)（親和度成熟）中選擇并擴(kuò)增特異性抗體。可以通過(guò)誘變作用，模擬在免疫細(xì)胞中使用的組合技術(shù)，并產(chǎn)生結(jié)合實(shí)體的組合文庫(kù)。因此，還可以通過(guò)展示型技術(shù)產(chǎn)生變體結(jié)合實(shí)體、抗體片段和抗體。這種展示型技術(shù)包括，例如，噬菌體展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體展示和其它技術(shù)。可以用本領(lǐng)域可用的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生結(jié)合實(shí)體的文庫(kù)、用于篩選那些文庫(kù)，并且可以對(duì)所選的結(jié)合實(shí)體進(jìn)行附加成熟，如親和度成熟。Wright和Harris，如上文所述，Hanes和PlucthauPNASUSA94:4937-4942(1997)（核糖體展示），Parmley和SmithGene73:305-318(1988)（噬菌體展示），ScottTIBS17:241-245(1992),Cwirla等，PNASUSA87:6378-6382(1990)，Russel等，Nucl.AcidsResearch21:1081-1085(1993)，Hoganboom等，Immunol.Reviews130:43-68(1992)，Chiswell和McCaffertyTIBTECH10:80-84(1992)，以及美國(guó)專利號(hào)5,733,743。因此，本發(fā)明還提供了優(yōu)化突變抗體、CDR或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和性、選擇性、結(jié)合強(qiáng)度和/或其它所需性質(zhì)的方法。突變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域指所選的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（例如，CDR）的氨基酸序列變體。一般而言，突變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與對(duì)照結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在不同。此類突變的抗體必然與對(duì)照氨基酸序列的序列同一性或相似性小于100%。一般而言，突變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與對(duì)照結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有至少75%的氨基酸序列同一性或相似性。優(yōu)選地，突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域與對(duì)照結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有至少80%，更優(yōu)選地至少85%、甚至更有選地至少90%、和最優(yōu)選地至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。例如，可以使用噬菌體展示的親和度成熟作為產(chǎn)生突變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一種方法。使用噬菌體展示的親和度成熟指Lowman等，Biochemistry30(45):10832-10838(1991)中描述的過(guò)程，亦參見(jiàn)Hawkins等，J.MolBiol.254:889-896(1992)。盡管未對(duì)下述描述進(jìn)行嚴(yán)格限定，但是可以將該過(guò)程簡(jiǎn)要地描述為：涉及在數(shù)個(gè)不同位點(diǎn)的若干結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體高變區(qū)的突變，其目的為在各位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣，所產(chǎn)生的結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變?cè)诮z狀噬菌體顆粒中作為融合蛋白以單價(jià)形式展示。通常將M13基因III的產(chǎn)物進(jìn)行融合。表達(dá)多種突變體的噬菌體可以在對(duì)感興趣的性狀，例如結(jié)合親和性或選擇性，進(jìn)行的若干輪的選擇中循環(huán)使用。將感興趣的突變體分離和測(cè)序。對(duì)此類方法的詳細(xì)描述參見(jiàn)美國(guó)專利5,750,373、美國(guó)專利6,290,957和Cunningham,B.C.等，EMBOJ.13(11),2508-2515(1994)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了操縱結(jié)合實(shí)體或抗體多肽或編碼它們的核酸的方法，以產(chǎn)生具有識(shí)別GOLPH2的改進(jìn)的結(jié)合性質(zhì)的結(jié)合實(shí)體、抗體和抗體片段。那些突變現(xiàn)有結(jié)合實(shí)體或抗體部分的方法涉及：將編碼針對(duì)GOLPH2的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽的核酸與編碼噬菌體衣殼蛋白的核酸融合，以產(chǎn)生編碼融合蛋白的重組核酸，將編碼融合蛋白的重組核酸突變，以產(chǎn)生編碼突變的融合蛋白的突變的核酸，在噬菌體表面表達(dá)突變的融合蛋白，并選擇與GOLPH2結(jié)合的噬菌體。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了能夠識(shí)別GOLPH2多肽并與其結(jié)合的抗體、抗體片段和結(jié)合實(shí)體多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了操縱那些抗體、抗體片段和結(jié)合實(shí)體多肽，以優(yōu)化其結(jié)合性質(zhì)或其它所需性質(zhì)（例如，穩(wěn)定性、尺寸、易用性）的方法。抑制性核酸抑制性核酸是具有長(zhǎng)度為三個(gè)以上核苷酸的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的聚合物。抑制性核酸可以包括天然存在的核苷酸；合成的、修飾的、或偽-核苷酸，如硫代磷酸酯；以及具有可檢測(cè)標(biāo)記，如32P、生物素、熒光染料或地高辛的核苷酸。能夠減少GOLPH2核酸的表達(dá)和/或活性的抑制性核酸可以完全地與GOLPH2核酸（例如，SEQIDNO:16或18）互補(bǔ)?；蛘?，可以允許在序列之間存在某些變異性。本發(fā)明的抑制性核酸能夠在細(xì)胞內(nèi)條件下或嚴(yán)格雜交條件下與GOLPH2核酸雜交。本發(fā)明的抑制性核酸與內(nèi)源性GOLPH2充分地互補(bǔ)，以便在這兩種之一或全部的條件下抑制GOLPH2核酸的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)條件指在細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，內(nèi)通常存在的條件，如溫度、pH和鹽濃度。此類哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一個(gè)例子是癌細(xì)胞（例如，肝癌細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞），或者GOLPH2表達(dá)或可以表達(dá)的任意細(xì)胞。一般地，將嚴(yán)格雜交條件選定為在給定的離子強(qiáng)度和pH下比特定序列的熱熔點(diǎn)（Tm）約低5℃。然而，嚴(yán)格條件包含比所選定序列的熱熔點(diǎn)低約1℃至約20℃的溫度范圍，這取決于本申請(qǐng)根據(jù)其它方面所期望的嚴(yán)格程度。抑制性核酸可以抑制GOLPH2核酸的功能，該抑制性核酸包括精確地與GOLPH2編碼序列互補(bǔ)的，例如2、3、4或5個(gè)，或者更多個(gè)連續(xù)核苷酸段，各段被不與鄰近的編碼序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸段所隔開(kāi)。一般情況下，各連續(xù)核苷酸段的長(zhǎng)度為至少4、5、6、7或8個(gè)，或者更多個(gè)核苷酸。非互補(bǔ)插入序列的長(zhǎng)度可以為至少1、2、3或4個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地使用計(jì)算得到與有意義核酸雜交的抑制性核酸的熔點(diǎn)，估計(jì)抑制特定靶核酸表達(dá)耐受的錯(cuò)配度。本發(fā)明的抑制性核酸包括例如核酶或反義核酸分子。反義核酸分子可以是單鏈或雙鏈的（例如，小干擾RNA（siRNA）），可以以酶依賴性方式或通過(guò)空間位阻發(fā)揮其功能。以酶依賴性方式發(fā)揮其功能的反義分子包括依賴于RNaseH活性降解靶mRNA的形式。這些包括單鏈DNA、RNA和硫代磷酸酯，以及雙鏈RNAi/siRNA系統(tǒng)，其涉及通過(guò)有意義-反義鏈配對(duì)識(shí)別靶mRNA，隨后通過(guò)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物降解靶mRNA?？臻g位阻反義，其不依賴于RNase-H，通過(guò)與靶mRNA結(jié)合并阻礙其它過(guò)程的方式，來(lái)干擾基因表達(dá)或其它mRNA依賴性細(xì)胞過(guò)程。空間位阻反義包括2′-O烷基化（通常在具有RNase-H依賴性反義的嵌合體中）、肽核酸（PNA）、鎖核酸（LNA）和嗎啉反義。例如，小干擾RNA可以用于特異性減少GOLPH2的翻譯，以降低GOLPH2多肽的水平。siRNA以序列特異性的方式介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。參見(jiàn)，例如，網(wǎng)站www.ambion.com/techlib/hottopics/rnai/rnai_may2002_print.html（末次檢索2006年5月10日）。一旦組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，siRNA介導(dǎo)同源的內(nèi)源性mRNA轉(zhuǎn)錄本的裂解，該過(guò)程通過(guò)引導(dǎo)所述復(fù)合物至同源的mRNA轉(zhuǎn)錄本，然后通過(guò)復(fù)合物裂解mRNA轉(zhuǎn)錄本來(lái)完成。siRNA可以與GOLPH2mRNA轉(zhuǎn)錄本的任意區(qū)域具有同源性。同源性區(qū)域的長(zhǎng)度可以是30個(gè)核苷酸或以下、優(yōu)選少于25個(gè)核苷酸、更有選地長(zhǎng)度約為21至23個(gè)核苷酸。siRNA通常是雙鏈，可以具有兩個(gè)核苷酸3’端突起，例如，3’端突起UU二核苷酸。設(shè)計(jì)siRNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。參見(jiàn)，例如，Elbashir等，Nature411:494-498(2001)；Harborth等，AntisenseNucleicAcidDrugDev.13:83-106(2003)。通常，選擇以AA起始，在有意義和反義siRNA鏈均具有3′UU突起且具有約50%G/C含量的靶位點(diǎn)。siRNA可以是化學(xué)合成的、由體外轉(zhuǎn)錄形成、或由siRNA表達(dá)載體或PCR表達(dá)盒表達(dá)。參見(jiàn)，例如http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506html（末次檢索2006年5月10日）。當(dāng)siRNA由表達(dá)載體或PCR表達(dá)盒表達(dá)時(shí)，可以將編碼siRNA的插入體表達(dá)為折疊成siRNA發(fā)夾的RNA轉(zhuǎn)錄本。這樣，所述的RNA轉(zhuǎn)錄本可以包括，通過(guò)形成發(fā)夾環(huán)的間隔序列與其反向互補(bǔ)反義siRNA序列連接的有意義siRNA序列，以及在3’末端的U串。發(fā)夾環(huán)可以是任意適宜的長(zhǎng)度，例如長(zhǎng)度為3至30個(gè)核苷酸，優(yōu)選地長(zhǎng)度為3至23個(gè)核苷酸，可以是不同的核苷酸序列，包括AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。還可以在體內(nèi)通過(guò)裂解直接或通過(guò)轉(zhuǎn)基因或病毒間接引入的雙鏈RNA來(lái)生產(chǎn)siRNA。在某些生物體內(nèi)可以發(fā)生利用RNA依賴性RNA聚合酶的擴(kuò)增。反義抑制性核酸還可以用于特異性減少GOLPH2的表達(dá)，例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。反義抑制性核酸與編碼GOLPH2的有意義核酸互補(bǔ)。例如，其可以與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或與mRNA序列互補(bǔ)。其可以與整個(gè)編碼鏈或僅與其一部分互補(bǔ)。其還可以與編碼GOLPH2的核酸的非編碼區(qū)的全部或一部分互補(bǔ)。非編碼區(qū)包括在編碼區(qū)翼側(cè)的5’和3’區(qū)域，例如，5’和3’非翻譯序列。通常，反義抑制性核酸的長(zhǎng)度為至少六個(gè)核苷酸，但是其可以是約8、12、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)。還可以使用更長(zhǎng)的抑制性核酸?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域公知的方法制備反義抑制性核酸，例如由編碼反義抑制性核酸的表達(dá)載體或由表達(dá)盒表達(dá)。或者，其可以使用天然存在的核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或其任意組合通過(guò)化學(xué)合成制備。在某些實(shí)施方式中，所述抑制性核酸可以由經(jīng)修飾的核苷酸或非磷酸二酯鍵制備，例如進(jìn)行設(shè)計(jì)以增加抑制性核酸的生物穩(wěn)定性或增加在反義抑制性核酸和有意義核酸之間形成的雙螺旋的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性。天然存在的核苷酸包括核糖或脫氧核糖核苷酸，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。經(jīng)修飾的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-（羧基羥基甲基）尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷（β-D-galactosylqueosine）、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露酰基Q辮苷（β-D-mannosylqueosine）、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5氧乙酸、丁氧基（butoxosine）、偽尿嘧啶、辮苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-（3-氨基-3-N-2-羧基丙基）尿嘧啶、(acp3)w、和2,6-二氨基嘌呤。因而，本發(fā)明的抑制性核酸可以包括經(jīng)修飾的核苷酸，以及天然的核苷酸，如核糖和脫氧核糖核苷酸的組合，并且本發(fā)明的反義抑制性核苷酸可以是上文所討論的任意長(zhǎng)度，并且其與SEQIDNO:16和/或18互補(bǔ)。本發(fā)明的抑制劑還可以是小發(fā)夾RNA或短發(fā)夾RNA（shRNA），其為使緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)化為能夠用于通過(guò)RNA干擾沉默基因表達(dá)的RNA序列。shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)通過(guò)細(xì)胞機(jī)制裂解為siRNA，然后其與靶mRNA結(jié)合并將其裂解。當(dāng)shRNA的編碼區(qū)可操作地與啟動(dòng)子連接時(shí)，可以通過(guò)編碼shRNA的載體將shRNA引入細(xì)胞。所選擇的啟動(dòng)子使得shRNA可以表達(dá)。例如，所述啟動(dòng)子可以是U6啟動(dòng)子，其可用于shRNA的連續(xù)表達(dá)。例如，載體可以傳遞至子代細(xì)胞，使得基因沉默被遺傳。參見(jiàn)，McIntyreG,FanningG,DesignandcloningstrategiesforconstructingshRNAexpressionvectors,BMCBIOTECHNOL.6:1(2006)；Paddison等，ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells,GENESDEV.16(8):948–58(2002)。本發(fā)明的抑制劑還可以是核酶。核酶是具有催化活性，并且能夠裂解單鏈核酸，如具有同源區(qū)的mRNA，的RNA分子。參見(jiàn)，例如，Cech,Science236:1532-1539(1987)；Cech,Ann.Rev.Biochem.59:543-568(1990)；Cech,Curr.Opin.Struct.Biol.2:605-609(1992)；Couture和Stinchcomb,TrendsGenet.12:510-515(1996)。核酶可以用于催化裂解GOLPH2的mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制所述mRNA的翻譯。參見(jiàn)，例如，Haseloff等，美國(guó)專利號(hào)5,641,673?？梢愿鶕?jù)核苷酸序列SEQIDNO:16和/或18設(shè)計(jì)對(duì)GOLPH2核酸具有特異性的核酶。在本領(lǐng)域中已開(kāi)發(fā)和描述了設(shè)計(jì)和構(gòu)建能夠以高度序列特異性的方式裂解反義RNA分子的核酶的方法。參見(jiàn)，例如Haseloff等，Nature334:585-591(1988)。通過(guò)將離散的“雜交”區(qū)工程化至核酶，可以將核酶靶向至特定RNA。含有與靶RNA序列互補(bǔ)的雜交區(qū)能夠使核酶與其靶點(diǎn)特異性雜交。參見(jiàn)，例如Gerlach等，EP321,201。所述靶序列可以是選自具有SEQIDNO:16和/或18的核苷酸序列的約5、6、7、8、9、10、12、15、20或50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段?？梢允褂酶L(zhǎng)的互補(bǔ)序列以增加針對(duì)靶點(diǎn)雜交序列的親和性。所述核酶的雜交和裂解區(qū)可以是整體聯(lián)系的；這樣，通過(guò)互補(bǔ)區(qū)與靶RNA雜交后，核酶的催化區(qū)能夠裂解所述靶點(diǎn)。這樣，通過(guò)修飾所述核酶的雜交區(qū)使其包括與靶GOLPH2核酸互補(bǔ)的序列，可以將現(xiàn)有的核酶修飾為靶向至本發(fā)明的GOLPH2核酸?；蛘?，可以使用編碼GOLPH2的mRNA從RNA分子池中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化RNA。參見(jiàn)，例如Bartel&Szostak,Science261:1411-1418(1993)?？扇苄訥OLPH2抑制劑的鑒定方法本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種分離可溶性GOLPH2抑制劑的方法。這種方法可以包括：（a）將包含可溶性GOLPH2的細(xì)胞培養(yǎng)物與待測(cè)物接觸；和（b）觀察培養(yǎng)基中的細(xì)胞是否表達(dá)IL-12和/或干擾素γ。當(dāng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞表達(dá)IL-12和/或干擾素γ時(shí)，則所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2抑制劑。在某些實(shí)施方式中，與含有可溶性GOLPH2但不含待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)基中細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少10%，則認(rèn)為所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2抑制劑。在其它實(shí)施方式中，與含有可溶性GOLPH2但不含待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)基中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少50%，則認(rèn)為所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2抑制劑。在其它實(shí)施方式中，與含有可溶性GOLPH2但不含待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)基中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少兩倍，則認(rèn)為所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2抑制劑。在其它實(shí)施方式中，如果與含有可溶性GOLPH2但不含待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)基中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少三倍，則認(rèn)為所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2抑制劑。能夠用于這種方法的細(xì)胞的例子包括活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B類淋巴母細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、惡性B細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞及其組合。在某些實(shí)施方式中，使用T細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，使用抗原呈遞細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用樹(shù)突狀細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，使用T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的組合?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行活化。在暴露于待測(cè)物和/或可溶性GOLPH2之前，可以使用刀豆蛋白A（ConA）刺激T細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，在存在可溶性GOLPH2的情況下當(dāng)活化的T細(xì)胞表達(dá)干擾素γ時(shí)，待測(cè)物是GOLPH2抑制劑。在某些實(shí)施方式中，將樹(shù)突狀細(xì)胞與T細(xì)胞共同培養(yǎng)。例如，當(dāng)在存在可溶性GOLPH2的情況下檢測(cè)干擾素γ的表達(dá)時(shí)，可以使用T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的組合。在此方法中使用的可溶性GOLPH2可以是純化的、半純化的或未經(jīng)純化的。在某些實(shí)施方式中，使用細(xì)胞培養(yǎng)物上清作為可溶性GOLPH2的來(lái)源可能是有益的。可溶性GOLPH2由多種細(xì)胞系生產(chǎn)，包括各種B細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系以及肝細(xì)胞癌細(xì)胞系。例如，可溶性GOLPH2由2E2、U266、NALM-6、REH和RAMOS細(xì)胞系生產(chǎn)?？扇苄訥OLPH2還由人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，如HepG2，生產(chǎn)。源于任何這些細(xì)胞系中的上清均可以作為GOLPH2的來(lái)源。待測(cè)物可以是小分子、藥物、抗體、抑制性結(jié)合實(shí)體、抑制性多肽、抑制性核酸、及其組合。組合物本發(fā)明還涉及含有GOLPH2抑制劑，如抗-GOLPH2抗體或抑制性核酸（例如，在表達(dá)盒或表達(dá)載體中），的組合物。本發(fā)明的組合物可以是藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，所述組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體?！八帉W(xué)上可接受的”指與處方中的其它成分具有相容性且對(duì)其受體無(wú)毒性的載體、稀釋劑、賦形劑、和/或鹽。在某些實(shí)施方式中，所述抑制劑是與具有序列如SEQIDNO:1-15、17中任意一個(gè)或其組合的GOLPH2蛋白結(jié)合的抗體或結(jié)合實(shí)體。在其它實(shí)施方式中，優(yōu)選地，所述抗-GOLPH2抗體和結(jié)合實(shí)體特異性地與可溶的、胞外形式的GOLPH2結(jié)合。抗-GOLPH2抗體/結(jié)合實(shí)體能夠結(jié)合的GOLPH2多肽序列的例子包括，具有SEQIDNO:2、4-15中任意一個(gè)的GOLPH2多肽。在其它實(shí)施方式中，所述抑制性核酸是與編碼具有序列如SEQIDNO:16或18的GOLPH2蛋白的核酸結(jié)合的核酸。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療劑（例如，GOLPH2抑制劑）以“治療有效量”給予。此類治療有效量是足以獲得希望的生理作用的量，如治療狀況、疾病、病癥等或者減輕狀況、疾病、病癥等的癥狀。例如，可以給予治療劑以治療狀況、疾病或病癥，如癌癥、病毒感染、細(xì)菌感染和/或微生物感染。為達(dá)到希望的作用，可以單劑量或多劑量給予GOLPH2抑制劑或其組合。例如，可以以至少約0.01mg/kg至約500至750mg/kg、至少約0.01mg/kg至約300至500mg/kg、至少約0.1mg/kg至約100至300mg/kg或者至少約1mg/kg至約50至100mg/kg體重的劑量給予GOLPH2抑制劑，但是其它劑量也可以提供有益的結(jié)果。給藥量將取決于多種因素，包括但不限于所給予的分子、多肽、抗體或核酸，哺乳動(dòng)物的疾病、體重、身體狀況、健康狀況、年齡。這些因素能夠容易地由臨床醫(yī)師通過(guò)本領(lǐng)域公知的動(dòng)物模型或其它檢測(cè)系統(tǒng)確定。本發(fā)明中治療劑（例如，抑制劑）的給藥可以是單劑量的、多劑量的、以連續(xù)或者間歇性方式的，其取決于，例如受體的身體狀況、給藥的目的是治療性的還是預(yù)防性的、以及本領(lǐng)域的醫(yī)師公知的其它因素。本發(fā)明的治療劑和組合物的給藥可以是在一段預(yù)定時(shí)間內(nèi)基本上連續(xù)的或者可以是一系列間隔的劑量。可以采用局部和全身給藥。為制備組合物，合成或以其它方式獲得小分子、多肽、核酸、抗體和其它試劑，并在必要或需要時(shí)對(duì)其進(jìn)行純化?？梢詫⑦@些小分子、多肽、核酸、抗體和其它試劑混懸于藥學(xué)上可接受的載體中和/或冷凍干燥或者以其它方式穩(wěn)定。可以將這些試劑調(diào)整為適宜濃度，并且任選地與其它試劑組合。單位劑量中所含的給定小分子、多肽、核酸、抗體和/或其它試劑的絕對(duì)重量可以在較寬的范圍內(nèi)變化。例如，可以給予約0.01至約2g、或約0.1至約500mg至少一種本發(fā)明的小分子、多肽、核酸、或抗體，或者多種小分子、多肽、核酸、和/或抗體。或者，單位劑量可以在約0.01g至約50g、約0.01g至約35g、約0.1g至約25g、約0.5g至約12g、約0.5g至約8g、約0.5g至約4g、或者約0.5g至約2g范圍內(nèi)變化。本發(fā)明治療劑的每日給藥劑量也可以是變化的。此類每日給藥劑量可以在，例如約0.1g/天至約50g/天、約0.1g/天至約25g/天、約0.1g/天至約12g/天、約0.5g/天至約8g/天、約0.5g/天至約4g/天、和約0.5g/天至約2g/天的范圍內(nèi)變化?？梢岳斫獾氖?，在治療中使用的小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體的量不僅隨著所選擇的特定載體的變化而改變，還與給藥途徑、待治療狀況的性質(zhì)以及患者的年齡和狀況有關(guān)。最終，可以由健康保健從業(yè)者確定適當(dāng)?shù)膭┝俊４送猓梢詫⑺幬锝M合物制成獨(dú)立單位劑型。這樣，包含小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體的一種或多種適宜的單位劑型可以通過(guò)多種途徑給予，包括胃腸外（包括皮下、靜脈、肌內(nèi)和腹腔）、口服、直腸、皮膚、透皮、胸腔、肺內(nèi)和鼻內(nèi)（呼吸）途徑。還可以將小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體制成緩釋劑型（例如，使用微囊，參見(jiàn)WO94/07529和美國(guó)專利號(hào)4,962,091）。所述制劑在適當(dāng)?shù)那闆r下可以以離散的單位劑型形式存在，并且可以采用藥物領(lǐng)域公知的任意方法制備。此類方法可以包括將所述治療劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體、精細(xì)粉碎的固體載體或其組合進(jìn)行混合的步驟，然后如有必要將所述產(chǎn)品引入所需遞送系統(tǒng)中或在所需遞送系統(tǒng)中定形。可以將本發(fā)明的組合物制成多種形式，包括水溶液、混懸液、片劑、硬膠囊或軟膠囊、以及脂質(zhì)體和其它緩釋劑型，如定形聚合物凝膠。然而，給予小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體通常涉及蛋白、核酸和/或抗體以水性溶液或持續(xù)釋放載體的形式通過(guò)胃腸外或局部給藥。這樣，有時(shí)當(dāng)小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體以口服劑型給藥時(shí)，通常將口服劑型制成使得小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體經(jīng)過(guò)胃后在腸內(nèi)釋放。在美國(guó)專利號(hào)6,306,434中對(duì)此類劑型進(jìn)行了描述，其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。液體藥物組合物可以是多種形式，例如水性或油性混懸液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑、在使用前用水或其它適宜溶劑復(fù)溶的干粉。此類液體藥物組合物可以含有常規(guī)的添加劑，如混懸劑、乳化劑、非水溶劑（可以包括食用油）或防腐劑?？梢詫⑿》肿?、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗體制成胃腸外給藥的劑型（例如，注射，如推注或連續(xù)輸注），并且其可以以單位劑型的形式置于安瓿、預(yù)充式注射器、小體積輸液容器中或置于加入防腐劑的多劑量容器中。藥物組合物可以采取這樣的形式，如在油性或水性溶劑中的混懸劑、溶液或乳劑，并且可以含有配制劑，如混懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。適宜的載體包括鹽溶液和本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它材料。所述組合物還可以含有其它成分，如化療劑、抗病毒劑、抗菌劑、抗微生物劑和/或防腐劑?？梢允褂玫母郊又委焺┑睦影ǖ幌抻冢和榛瘎?，如氮芥、烷基磺酸酯、亞硝基脲類、乙撐亞胺和三氮烯類；抗代謝物，如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物；抗生素，如蒽環(huán)類、博萊霉素、絲裂霉素、放線菌素和普卡霉素；酶，如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；激素類藥物，如糖皮質(zhì)激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素、和促黃體激素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽；微管干擾劑，如海鞘素或其類似物和衍生物；微管穩(wěn)定劑如紫杉醇（泰素）、多西紫杉醇（泰索帝）、和埃博霉素A-F或者其類似物或衍生物；植物來(lái)源的產(chǎn)品，如長(zhǎng)春花生物堿、表鬼臼毒素、紫杉烷類；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑；異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；和雜項(xiàng)試劑如羥基脲、甲基芐肼、米托坦、六甲蜜胺、鉑配位復(fù)合物，如順鉑和卡鉑；以及作為抗癌和細(xì)胞毒劑使用的其它試劑，如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、生長(zhǎng)因子；免疫調(diào)節(jié)劑，和單克隆抗體。本發(fā)明的化合物還可以與放療聯(lián)用。下述的非限制性例子對(duì)本發(fā)明研發(fā)的一些方面進(jìn)行了說(shuō)明。實(shí)施例通過(guò)下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行了進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)將其解釋為任何方式的限制。所有引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容（包括本申請(qǐng)全文中引用的參考文獻(xiàn)、已授權(quán)的專利、公開(kāi)的專利申請(qǐng)）在此明確地通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。實(shí)施例1：作用于DC的由B細(xì)胞產(chǎn)生的新型可溶性因子的鑒定本實(shí)施例描述了由B細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子的鑒定，該可溶性因子在樹(shù)突狀細(xì)胞中直接調(diào)節(jié)白介素12的產(chǎn)生，并在間接調(diào)節(jié)T細(xì)胞細(xì)胞因子，如干擾素γ（IFNγ），的產(chǎn)生中起了作用。最初將這種因子稱為BDSFIL12；隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BDSFIL12為GOLPH2。在對(duì)B細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的作用機(jī)制進(jìn)行研究的過(guò)程中，從人和小鼠的LPS或促細(xì)胞分裂劑活化的原代B淋巴細(xì)胞中鑒定出了一種可溶性的活性產(chǎn)物。這種可溶性的因子還在被測(cè)試的若干B淋巴瘤細(xì)胞系中自發(fā)產(chǎn)生，該細(xì)胞系包括2E2、U266、NALM-6、REH和RAMOS細(xì)胞系（數(shù)據(jù)未列出）。最初將這種新型的因子命名為B細(xì)胞來(lái)源的抑制IL-12的可溶性因子BDSFIL-12。方法實(shí)驗(yàn)顯示2E2細(xì)胞向上清中分泌一種分子量為約80Kda的因子（圖1B），將其稱為BDSFIL-12。2E2細(xì)胞系是CL-01的亞克隆，一種人單克隆Burkett淋巴瘤細(xì)胞系。2E2細(xì)胞表達(dá)表面IgM和IgD，其為愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒（EBV）陽(yáng)性，在使用CD40配體、IL-4和IL-10誘導(dǎo)后，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化成全部七個(gè)下游的同種型（Cerutti等，JImmunol160,2145-57(1998)）。進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)以表征2E2細(xì)胞分泌的這種因子。使用CD4+T細(xì)胞MACS分離試劑盒從C57BL/6小鼠的脾臟中分離T淋巴細(xì)胞，并在RPMI培養(yǎng)基（15%FBS，20ng/mlmIL-2）中培養(yǎng)4天。然后將細(xì)胞以1ml，1x106個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，在存在或不存在源自骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)基上清（500μl）的條件下，使用5μg/ml的刀豆蛋白A（ConA）刺激24小時(shí)。樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)自C57BL/6小鼠的骨髓，將其在添加了20ng/mlmIL-4和40ng/mlmGM-CSF的20%的L細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。將樹(shù)突狀細(xì)胞接種于2ml加入了BDSFIL-12（1ml2E2上清）和/或脂多糖（LPS）（1ug/ml）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)。作為對(duì)照，在一些2ml分裝的樹(shù)突狀細(xì)胞中不加入BDSFIL-12（2E2上清）和LPS。孵育6小時(shí)后，將樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基上清轉(zhuǎn)移至上文所述的T細(xì)胞培養(yǎng)物中。使用ELISA測(cè)定IFN-γ的產(chǎn)生情況。BDSFIL-12通過(guò)活化T淋巴細(xì)胞強(qiáng)烈抑制IFN-γ的產(chǎn)生，但是其是通過(guò)間接地調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的性質(zhì)發(fā)揮該作用。如圖1A所示，未經(jīng)刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的IFN-γ（柱1），而經(jīng)過(guò)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞分泌～20pg/ml的IFN-γ（柱2）。經(jīng)BDSFIL-12處理但未經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生很少的IFN-γ（柱3）。經(jīng)BDSFIL-12處理并經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞（柱4）產(chǎn)生的IFN-γ略多于經(jīng)LPS刺激但未經(jīng)BDSFIL-12處理的樹(shù)突狀細(xì)胞（柱2）。未經(jīng)刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生很少的IFN-γ（柱5和6），但是當(dāng)加入經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞上清后，其分泌大量的IFN-γ（柱7）。當(dāng)加入經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞上清后未經(jīng)刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的量（柱7）甚至高于經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的量（柱2），表明樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生了可刺激靜息的T細(xì)胞而產(chǎn)生IFN-γ的可溶性因子。當(dāng)將經(jīng)過(guò)BDSFIL-12處理、LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞的上清加入靜息的T細(xì)胞后（柱9），其IFN-γ的分泌情況基本上與在經(jīng)過(guò)BDSFIL-12處理和LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞中觀察到的結(jié)果相似（柱4）。經(jīng)ConA刺激的T細(xì)胞產(chǎn)生～40pg/mlIFN-γ（柱10）。然而，將經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞上清加入經(jīng)ConA刺激的T細(xì)胞后，導(dǎo)致IFN-γ的分泌顯著增加（柱12），其遠(yuǎn)高于經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞（柱2）和經(jīng)ConA刺激的T細(xì)胞（柱10）產(chǎn)生的IFN-γ之和，表明樹(shù)突狀細(xì)胞可能產(chǎn)生了額外的T-細(xì)胞刺激因子。如果樹(shù)突狀細(xì)胞未經(jīng)過(guò)刺激（柱11），或者經(jīng)LPS刺激但也經(jīng)過(guò)BDSFIL-12處理（柱14），則不存在該因子。重要的是，當(dāng)使用BDSFIL-12和經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞上清（柱14）處理經(jīng)ConA刺激的T細(xì)胞時(shí)，IFN-γ的產(chǎn)生水平降至經(jīng)LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞與經(jīng)ConA刺激的T細(xì)胞之和（柱2與柱10之和），表明BDSFIL-12對(duì)T細(xì)胞沒(méi)有直接影響。相反的是，其通過(guò)影響樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞刺激活性的能力來(lái)起作用。該結(jié)論得到了IFN-γ產(chǎn)生水平（柱13）的支持，其中未經(jīng)刺激但經(jīng)過(guò)BDSFIL-12處理的樹(shù)突狀細(xì)胞上清不會(huì)抑制ConA刺激的T細(xì)胞基線IFN-γ的產(chǎn)生（柱10）。通過(guò)生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法輔以質(zhì)譜分析，利用BDSFIL-12多種獨(dú)特的性質(zhì)，發(fā)明人鑒定發(fā)現(xiàn)BDSFIL-12是來(lái)自LPS刺激的RAMOS細(xì)胞（B淋巴瘤）的高爾基體磷蛋白2（GOLPH2）（圖1B）。實(shí)驗(yàn)證明BDSFIL-12表現(xiàn)出下述性質(zhì)：（i）其能夠以不依賴于TGF-β、IL-10、TNF-α和前列腺素E2的方式通過(guò)活化的單核細(xì)胞和骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞選擇性抑制IL-12分泌，而不抑制TNF-α、IL-10、IL-6和TGF-β的分泌。TGF-β、IL-10、TNF-α和前列腺素E2是公知的IL-12合成抑制劑（Ma&Trinchieri,AdvImmunol79,55-92(2001)）。（ii）BDSFIL-12對(duì)其它樹(shù)突狀細(xì)胞的性質(zhì)，如CD11c、CD80、CD86和MHCII的表面表達(dá)幾乎沒(méi)有影響。（iii）有趣的是，原代B細(xì)胞與經(jīng)HIV-1感染的T細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生BDSFIL-12但其本身沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病毒感染的證據(jù)。這表明在HIV感染患者中常見(jiàn)的TH1損傷至少部分是由過(guò)度活化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的BDSFIL-12所致。實(shí)施例2：GOLPH2由多種應(yīng)激和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型所分泌在多種細(xì)胞類型中對(duì)GOLPH2的蛋白表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，以便更好地確定其生理作用。如圖2所示，F(xiàn)ACS分析表明GOLPH2的細(xì)胞定位隨細(xì)胞類型的變化而改變，并且SDS聚丙烯酰胺分離顯示GOLPH2分泌至若干不同的培養(yǎng)細(xì)胞系上清中。用于FACS和western印跡分析的抗-GOLPH2抗體來(lái)自Epitomics,Burlingame,CA（目錄號(hào)：3261-1，圖2A）和AbcamInc.,Cambridge,MA（目錄號(hào)ab22209；圖2B）。采用western印跡分析對(duì)下述細(xì)胞類型進(jìn)行了檢測(cè)：RAMOS細(xì)胞（靜息的和LPS活化的B淋巴瘤細(xì)胞，分別在第2-3道）、2E2細(xì)胞（第4道）、HepG2細(xì)胞（人肝細(xì)胞癌（HCC），第5道）、B16細(xì)胞（小鼠黑色素瘤，第6道）、4T1細(xì)胞（小鼠乳腺癌，第7道）和RAW264.7細(xì)胞（小鼠巨噬細(xì)胞，第8道）。將由組氨酸標(biāo)記的表達(dá)載體表達(dá)的重組人GOLPH2作為陽(yáng)性對(duì)照（第9道）。FACS分析顯示GOLPH2在靜息和LPS活化的原代人外周血B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面上大量表達(dá)（圖2A）。但是，在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2中，GOLPH2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)多于其在細(xì)胞表面的表達(dá)。在RAW264.7細(xì)胞（小鼠巨噬細(xì)胞中），GOLPH2似乎完全在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，加入LPS，即使有影響，對(duì)GOLPH2表達(dá)的水平和位置的影響也非常小。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清的Western印跡分析顯示，人和小鼠來(lái)源的多種造血和上皮來(lái)源的癌細(xì)胞類型產(chǎn)生不同量的分泌型GOLPH2。圖2F中的western印跡顯示來(lái)自2E2細(xì)胞（人單克隆Burkett淋巴瘤細(xì)胞，第4道）、HepG2細(xì)胞（人肝細(xì)胞癌（HCC），第5道）、B16細(xì)胞（小鼠黑色素瘤，第6道）、4T1細(xì)胞（小鼠乳腺癌，第7道）和RAW264.7細(xì)胞（小鼠巨噬細(xì)胞，第8道）的培養(yǎng)基上清產(chǎn)生較大量的可溶性GOLPH2。B淋巴瘤的細(xì)胞培養(yǎng)基上清中含有與抗-GOLPH2抗體反應(yīng)的蛋白。靜息的RAMOSB淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯較少的可溶性GOLPH2（圖2B，第2道），而經(jīng)過(guò)LPS刺激的RAMOSB淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生更多的可溶性GOLPH2（圖2F，第3道）。實(shí)施例3：在多種細(xì)胞中人GOLPH2表達(dá)的作用本實(shí)施例說(shuō)明了GOLPH2抑制IL-12p35的轉(zhuǎn)錄和T細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生。方法使用表達(dá)組氨酸標(biāo)記的人GOLPH2或無(wú)關(guān)核蛋白SREBP2的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，收集無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清，如實(shí)施例1所述將上清加入樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的共培養(yǎng)物中。使用ELISA測(cè)定IFN-γ的產(chǎn)生情況。結(jié)果如圖3A所述并在下文中更加詳細(xì)的描述。為確定GOLPH2是否直接或間接地與IL-12發(fā)生相互作用，使用了人IL-12p35啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告子構(gòu)建體（參見(jiàn)，Kim等，mmunity21,643-53(2004)）。將人IL-12p35啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告子構(gòu)建體與下述效應(yīng)器構(gòu)建體之一共同轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞：表達(dá)人GOLPH2的GOLPH2表達(dá)載體和對(duì)照空載體（pCDNA3）。所使用的效應(yīng)器/報(bào)告子（E:R）的摩爾比為1:1、2:1和4:1。使用IFN-γ（16小時(shí)）和LPS（7小時(shí)）刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后收集并測(cè)定全細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性。圖3B中的數(shù)據(jù)以相對(duì)啟動(dòng)子活性表示，即IFN-γ/LPS-刺激活性與未經(jīng)刺激活性的比值。使用FLAGged空表達(dá)載體（FLAG）、或者表達(dá)人GOLPH2或無(wú)關(guān)基因SREBP2的FLAGged載體對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，收集無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上清，并將0.5ml上清加入1.5ml經(jīng)人IL-12p35報(bào)告子構(gòu)建體或人IL-12p40報(bào)告子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞中。將所述細(xì)胞孵育6小時(shí)。然后使用IFN-γ和LPS刺激RAW264.7細(xì)胞7小時(shí)，隨后收集并進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，設(shè)置三復(fù)管。圖3C中的數(shù)據(jù)以平均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。進(jìn)行另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)不同細(xì)胞上清中的可溶性因子是否能夠作為IL-12p35和/或IL-12p40表達(dá)的抑制劑。使用上文所述的，在RAW264.7細(xì)胞中進(jìn)行的報(bào)告子檢測(cè)所使用的人IL-12p35報(bào)告子構(gòu)建體和人IL-12p40報(bào)告子構(gòu)建體，只是還在RAW264.7細(xì)胞中加入凋亡細(xì)胞（AC）或經(jīng)LPS刺激的RAMOS細(xì)胞培養(yǎng)基上清。將所述細(xì)胞孵育6小時(shí)。然后使用IFN-γ和LPS刺激RAW264.7細(xì)胞7小時(shí)，隨后收集并進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，設(shè)置三復(fù)管。圖3D中的數(shù)據(jù)以平均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。結(jié)果：當(dāng)在HEK293細(xì)胞中異源性表達(dá)時(shí)，盡管作用不強(qiáng)，但是加入促細(xì)胞分裂劑活化的小鼠脾臟T細(xì)胞的培養(yǎng)基上清中的重組人GOLPH2（rGOLPH2）以與BDSFIL-12類似的方式抑制IFN-γ的產(chǎn)生（圖3A，柱d和e）。rGOLPH2以全長(zhǎng)分子表達(dá)，但是其它細(xì)胞機(jī)制可以使其裂解和分泌。與以相同方法表達(dá)和使用的無(wú)關(guān)蛋白-甾醇應(yīng)答元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）相比，rGOLPH2-表達(dá)HEK293細(xì)胞上清的抑制具有特異性，其對(duì)T細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生沒(méi)有任何影響（圖3A，柱c）。當(dāng)通過(guò)共轉(zhuǎn)染在RAW264.7巨噬細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)時(shí)，GOLPH2能夠劑量依賴性的抑制IL-12p35基因轉(zhuǎn)錄（圖3B）。當(dāng)加入RAW264.7細(xì)胞后，來(lái)自重組表達(dá)GOLPH2的HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)基上清強(qiáng)烈地和選擇性地抑制IL-12p35而非p40的轉(zhuǎn)錄（分別見(jiàn)圖3C的上圖和下圖）。這明確地確證了GOLPH2能夠作為一種可溶性因子，像BDSFIL-12，選擇性地作用于IL-12p35基因轉(zhuǎn)錄。在GOLPH2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的上清抑制IL-12p35的轉(zhuǎn)錄活性，對(duì)胰酶和煮沸具有較好的耐受性，其與獨(dú)特的BDSFIL-12活性相同。值得注意的是，與含有BDSFIL-12的2E2上清的作用效果一致，含有GOLPH2的上清對(duì)T細(xì)胞-IFN-γ的產(chǎn)生沒(méi)有抑制作用，提示在上清中存在GOLPH2以外的其它因子。這種觀點(diǎn)得到了所觀察到的結(jié)果的支持，盡管GOLPH2選擇性抑制p35轉(zhuǎn)錄，但是在LPS活化的RAMOS中BDSFIL-12對(duì)p35和p40的轉(zhuǎn)錄均具有抑制作用（圖3D）。實(shí)施例4：阻斷細(xì)胞外GOLPH2逆轉(zhuǎn)對(duì)IL-12p35轉(zhuǎn)錄的抑制該實(shí)施例說(shuō)明了抑制細(xì)胞外BDSFIL-12/GOLPH2增強(qiáng)IL-12p35的表達(dá)。IL-12具有兩個(gè)亞基：p35亞基和p40亞基。如本申請(qǐng)所述，BDSFIL-12/GOLPH2抑制IL-12p35亞基的轉(zhuǎn)錄。方法家兔抗-GOLPH2多克隆抗體GP73（N-19）來(lái)自SantaCruzBiotechnologies(SantaCruz,CA)，將其作為同型匹配的對(duì)照IgG抗體。這些抗-GOLPH2抗體識(shí)別具有氨基酸54-90的GOLPH2蛋白片段，該片段具有下述序列（SEQIDNO:7）。54RAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQ將含有與熒光素酶編碼區(qū)可操作地連接的IL-12p35啟動(dòng)子的IL-12p35報(bào)告子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞。為檢測(cè)GOLPH2的表達(dá)對(duì)來(lái)自該IL-12p35啟動(dòng)子表達(dá)水平的影響，將包括對(duì)照載體（pCR3.1）、野生型GOLPH2（WT）-表達(dá)載體、GOLPH2分泌突變體R52A-表達(dá)載體、GOLPH2分泌突變體R54A-表達(dá)載體、或Roquin-表達(dá)載體的效應(yīng)器構(gòu)建體與IL-12p35報(bào)告子構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞。效應(yīng)器構(gòu)建體與報(bào)告子構(gòu)建體（E:R）的摩爾比為0.2:1。使用較低的E:R比值（1:0.2）以使得GOLPH2和Roquin之間的相互（協(xié)同）作用被最佳檢測(cè)。當(dāng)使用更高量時(shí)，與野生型GOLPH2相比R52A和R54AGOLPH2突變體的效力弱很多（數(shù)據(jù)未列出）。使用IFN-γ和LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行刺激后，測(cè)定所述細(xì)胞的熒光素酶活性。結(jié)果將含有IL-12p35報(bào)告子構(gòu)建體的RAW264.7細(xì)胞暴露于IFNγ和LPS后，p35啟動(dòng)子的活性被極大地刺激（圖4A，柱1，標(biāo)記M）。當(dāng)存在含有可溶性BDSFIL-12的2E2上清時(shí)，IL-12p35啟動(dòng)子的活性被完全抑制（柱2，標(biāo)記0），表明在上清中存在的一種因子（BDSFIL-12）是IL-12p35轉(zhuǎn)錄的抑制劑。然而，當(dāng)存在抗-GOLPH2抗體時(shí)（柱5-6），這種抑制被極大地逆轉(zhuǎn)。當(dāng)使用對(duì)照抗體時(shí)，未觀察到這種抑制的逆轉(zhuǎn)（柱3-4）。這些數(shù)據(jù)表明BDSFIL-12是IL-12p35轉(zhuǎn)錄的抑制劑?？?GOLPH2抗體中和BDSFIL-12的抑制性活性這一事實(shí)（圖4A）也支持這個(gè)結(jié)論，即BDSFIL-12和GOLPH2具有明顯的序列同一性，通過(guò)質(zhì)譜對(duì)這一結(jié)論進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。這樣，在本公開(kāi)的大部分內(nèi)容中將BDSFIL-12稱為GOLPH2。進(jìn)一步的中和抗體實(shí)驗(yàn)確定了IL-10和TGF-β似乎未參與IL-12p35轉(zhuǎn)錄的抑制（數(shù)據(jù)未列出），提示存在一種其它的、未經(jīng)鑒定的因子，其相互作用、應(yīng)答、和/或傳遞由可溶性GOLPH2提供的信號(hào)。RAW264.7和2E2細(xì)胞分泌大量的可溶性GOLPH2（圖2F）。然而，在RAW264.7細(xì)胞中的GOLPH2的抗體介導(dǎo)的中和反應(yīng)對(duì)p35的轉(zhuǎn)錄幾乎沒(méi)有影響（數(shù)據(jù)未列出），其與當(dāng)存在2E2上清時(shí)，抗-GOLPH2抗體對(duì)p35轉(zhuǎn)錄的作用（圖4A）相反。這些均表明在2E2上清中可能存在第二種參與GOLPH2的抑制性活性的因子。的確，初步數(shù)據(jù)表明源自LPS活化RAMOS細(xì)胞上清的經(jīng)質(zhì)譜鑒定的蛋白中存在第二種命中（Roquin），其可能是GOLPH2的第二種因子和/或輔因子，因?yàn)楫?dāng)將Roquin表達(dá)載體與GOLPH2共轉(zhuǎn)染時(shí)，Roquin增強(qiáng)了GOLPH2對(duì)p35轉(zhuǎn)錄的抑制性活性（圖4B）。Roquin的增強(qiáng)作用依賴于GOLPH2的分泌，因?yàn)镚OLPH2的兩個(gè)分泌突變體R52A和R54A（Puri,Traffic3,641-53(2002)）無(wú)法協(xié)同促成在野生型GOLPH2-Roquin中觀察到的增強(qiáng)的抑制性活性（圖4B）。在針對(duì)自身免疫性調(diào)節(jié)子對(duì)小鼠的基因組進(jìn)行的系統(tǒng)性篩選中首次發(fā)現(xiàn)了Roquin，其從小鼠品系sanroque中分離獲得，該品系的小鼠患有因單隱性缺陷導(dǎo)致的嚴(yán)重自身免疫性疾病，該單隱性缺陷在于此前未知的抑制針對(duì)其自身抗體應(yīng)答的機(jī)制。Sanroque突變作用于成熟的T細(xì)胞中，導(dǎo)致形成過(guò)多的濾泡輔助T細(xì)胞和生發(fā)中心。所述突變破壞了ICOS的抑制子，ICOS為濾泡T細(xì)胞必需的共刺激受體。Sanroque小鼠無(wú)法抑制糖尿病引起的T細(xì)胞，并產(chǎn)生高滴度的自身抗體和與狼瘡相符的病理表現(xiàn)（Vinuesa等，Nature435,452-8(2005)）。致病性突變M199R位于此前功能未知的基因roquin（Rc3h1），其為編碼高度保守的環(huán)形泛素連接酶蛋白家族成員。Roquin蛋白的特征為在RNA結(jié)合蛋白中存在一個(gè)CCCH鋅-指，并且定位于參與調(diào)節(jié)ICOS信使RNA的翻譯和穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)RNA顆粒中（Yu等，Nature450,299-303(2007)）。Roquin的M199R突變體無(wú)法與GOLPH2協(xié)同抑制IL-12p35的轉(zhuǎn)錄（數(shù)據(jù)未列出），其進(jìn)一步支持了在GOLPH2和Roquin之間存在功能性相互作用的這一結(jié)論。實(shí)施例5：GOLPH2通過(guò)活化GC結(jié)合蛋白抑制IL-12的表達(dá)該實(shí)施例顯示了GOLPH2抑制p35轉(zhuǎn)錄與GC結(jié)合蛋白靶向和吞噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞針對(duì)相同的啟動(dòng)子元件。該啟動(dòng)子元件被稱為“凋亡細(xì)胞應(yīng)答元件（ACRE）”，其為IL-12p35啟動(dòng)子+13和+19之間的殘基，具有序列TGCCGCG。方法將含有野生型和跨核苷酸位置-1082至+61的突變體IL-12p35啟動(dòng)子序列的核酸片段分別與編碼熒光素酶的核酸連接。野生型IL-12p35啟動(dòng)子片段（a）包括位于核苷酸位置+13至+19的TGCCGCG序列。IL-12p35啟動(dòng)子的3’缺失片段（b）僅含有跨核苷酸位置-1082至-4的區(qū)域。三個(gè)突變體IL-12p35啟動(dòng)子片段（c-e）具有特定的堿基取代突變：XXCCGCG(c)、TGXXGCG(d)和TGCCXXG(e)。將所述啟動(dòng)子-報(bào)告子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，并且在存在或缺乏2E2細(xì)胞上清（含有BDSFIL-12）的條件下共培養(yǎng)。使用LPS刺激細(xì)胞7小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖5A。培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞并將其暴露于培養(yǎng)基（Med）、或凋亡的Jurkat細(xì)胞（AC）、或者含有或不含IFNγ和LPS的2E2細(xì)胞上清（BDSFIL-12）。使用抗-GC-結(jié)合蛋白抗體（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）將核提取物免疫沉淀，隨后使用抗-磷酸-酪氨酸mAb（pY99）進(jìn)行印跡檢測(cè)。如此前所述，使用星孢菌素處理以產(chǎn)生凋亡細(xì)胞（AC）（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）。結(jié)果圖5A顯示了BDSFIL-12主要通過(guò)DNA模體TGCCGCG選擇性地抑制IL-12的IL-12p35亞基的轉(zhuǎn)錄，DNA模體為IL-12p35啟動(dòng)子+13和+19之間的殘基。該DNA模體是“凋亡細(xì)胞應(yīng)答元件（ACRE）”，其由本發(fā)明人在此前的研究中首次描述（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）。ACRE序列與鋅指核蛋白和GC-結(jié)合蛋白結(jié)合，GC-結(jié)合蛋白可能是其活性和/或表達(dá)被BDSFIL-12活化的因子。在凋亡細(xì)胞（ACs）的吞噬作用過(guò)程中，一種新型的信號(hào)通路通過(guò)外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）被活化，導(dǎo)致GC-結(jié)合蛋白（GC-BP）的酪氨酸磷酸化，其與ACRE位點(diǎn)的IL-12p35啟動(dòng)子直接結(jié)合，從而阻斷轉(zhuǎn)錄（Kim等，2004）。圖5B顯示了在培養(yǎng)細(xì)胞的上清中存在BDSFIL-12導(dǎo)致被稱為GC-結(jié)合蛋白的約80kDa蛋白的活化（磷酸化）。圖5B中的上部顯示了使用對(duì)磷酸化的GC-BP具有反應(yīng)性的抗體作為探針的，來(lái)自多種細(xì)胞類型的蛋白的western印跡。圖5B的下部顯示了使用對(duì)所有GC-BP具有反應(yīng)性的抗體作為探針的，來(lái)自多種細(xì)胞類型的蛋白的western印跡。如圖所示，BDSFIL-12刺激GC-結(jié)合蛋白的酪氨酸磷酸化。因此，BDSFIL-12與凋亡細(xì)胞類似（Kim等2004）是一種高效的通過(guò)酪氨酸磷酸化的GC-BP激活劑（第4和8道，圖5B）。這樣，可溶性BDSFIL-12可以在ACRE位點(diǎn)通過(guò)活化GC-BP抑制IL-12p35啟動(dòng)子的表達(dá)，例如通過(guò)刺激GC-BP磷酸化，然后活化的、磷酸化形式的GC-BP結(jié)合至IL-12p35啟動(dòng)子的ACRE位點(diǎn)并抑制其表達(dá)。然而，BDSFIL-12和凋亡細(xì)胞使用不同的細(xì)胞外機(jī)制抑制IL-12的表達(dá)。凋亡細(xì)胞是通過(guò)細(xì)胞間接觸依賴性的方式發(fā)揮該作用（Kim等，2004），但是BDSFIL-12是一種可溶性因子，其在細(xì)胞外發(fā)揮活性。而且，當(dāng)與凋亡細(xì)胞接觸后，吞噬細(xì)胞不產(chǎn)生BDSFIL-12（數(shù)據(jù)未列出）。這些數(shù)據(jù)表明BDSFIL-12/GOLPH2是一種GC-結(jié)合蛋白的激活劑，其作用機(jī)制不同于凋亡細(xì)胞活化GC-結(jié)合蛋白。GC-結(jié)合蛋白是一種抑制性轉(zhuǎn)錄因子，其能夠顯著降低包括TGCCGCG序列模體的啟動(dòng)子的表達(dá)，，其抑制劑活性被BDSFIL-12/GOLPH2所活化。實(shí)施例6：在攜帶B16黑色素瘤的B-細(xì)胞缺陷小鼠中具有增強(qiáng)的TH1應(yīng)答該實(shí)施例顯示了在B細(xì)胞-缺陷（IgM敲除）小鼠中IL-12和IFN-γ的產(chǎn)生顯著增加，并且在這種B細(xì)胞-缺陷（IgM敲除）小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)明顯不及在野生型小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)。因而，B細(xì)胞的存在能夠抑制抗腫瘤活性。方法皮下注射給予野生型和B細(xì)胞-缺陷（IgM敲除）小鼠（每組五只）106個(gè)腫瘤細(xì)胞以種植腫瘤。通過(guò)使用游標(biāo)卡尺定期測(cè)定腫瘤直徑來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。收集接種腫瘤的野生型和B細(xì)胞-缺陷（IgM敲除）小鼠（每組五只）的脾臟，將脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞（8:1）共培養(yǎng)7天。使用ELISA分析這些培養(yǎng)物上清中的細(xì)胞因子水平。結(jié)果分析野生型（WT）和B細(xì)胞-缺陷（IgM敲除）小鼠（均為C57BL背景）中B16黑色素瘤的生長(zhǎng)情況。如圖6A所示，在B細(xì)胞-缺陷宿主中的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，盡管不及此前Shah等（IntJCancer117,574-86(2005)）報(bào)道的顯著。對(duì)離體脾細(xì)胞-腫瘤共培養(yǎng)物的上清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，在IgM-/-小鼠中B16黑色素瘤的生長(zhǎng)被削弱與IL-12和IFN-γ的產(chǎn)生顯著增加相關(guān)（圖6B）。因此，B細(xì)胞-產(chǎn)生的GOLPH2可以抑制抗-黑色素瘤T細(xì)胞的應(yīng)答。上述實(shí)施例證明了B細(xì)胞產(chǎn)生的BDSFIL-12/GOLPH2抑制IL-12的表達(dá)。因而，BDSFIL-12/GOLPH2可能在抑制針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，例如，通過(guò)抑制IL-12的表達(dá)。實(shí)施例7：重組GOLPH2的活性該預(yù)計(jì)性的實(shí)施例描述了確證和進(jìn)一步表征僅GOLPH2的細(xì)胞外活性就能夠抑制IL-12表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。將純化的重組人GOLPH2（rGOLPH2）加入到原代人樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）中，隨后使用LPS刺激以誘導(dǎo)IL-12的產(chǎn)生。繪制劑量應(yīng)答曲線以尋找rGOLPH2的最佳劑量及其活性持續(xù)時(shí)間。為實(shí)現(xiàn)這一目的，制備過(guò)表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽的人GOLPH2的穩(wěn)定的HEK293細(xì)胞系以用于培養(yǎng)基規(guī)模的純化（圖2B）。實(shí)施例8：GOLPH2誘導(dǎo)GC-BP在體內(nèi)與ACRE的結(jié)合該預(yù)計(jì)性的實(shí)施例使用此前已描述過(guò)的程序（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）進(jìn)一步確證了活化的GC-BP在體內(nèi)與ACRE序列上的p35基因座結(jié)合。使用rGOLPH2處理原代人樹(shù)突狀細(xì)胞。實(shí)施例9：RNAi介導(dǎo)的GC-BP基因表達(dá)沉默中和或減弱GOLPH2的活性該預(yù)計(jì)性的實(shí)施例描述了設(shè)計(jì)為檢測(cè)是否GC-BP表達(dá)的沉默阻斷GOLPH2活性的實(shí)驗(yàn)，并確證了GC-BP是介導(dǎo)GOLPH2抑制p35轉(zhuǎn)錄的重要核因子。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)在體外使用若干GC-BP特異性siRNA序列的RNAi可能會(huì)下調(diào)GC-BP67。已在小鼠巨噬細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中對(duì)這些質(zhì)粒DNA形式的構(gòu)建體進(jìn)行了檢測(cè)。已發(fā)現(xiàn)序列#3，5’-ACCUCUUGUGGCUUUGCUAdTdT-3’（SEQIDNO:19）最有效地敲減GC-BP的表達(dá)（>85%）（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）。將使用慢病毒載體引入和表達(dá)上文所述的特異性siRNA序列#3，以便在原代樹(shù)突狀細(xì)胞中評(píng)估下調(diào)的GC-BP的表達(dá)對(duì)GOLPH2活性的作用。在RNA聚合酶III的作用下通過(guò)慢病毒載體引入短雙鏈siRNA模板寡核苷酸。這種遞送系統(tǒng)通常導(dǎo)致>80%的骨髓來(lái)源細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?yàn)殛?yáng)性，轉(zhuǎn)基因在移植了使用轉(zhuǎn)導(dǎo)的富集干細(xì)胞/祖細(xì)胞的長(zhǎng)期小鼠嵌合體中進(jìn)行，該濃縮慢病毒標(biāo)記基因例如如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白（eGFP）（Rivella&Sadelain,CurrOpinMolTher4,505-14(2002).）。實(shí)施例10：鑒定GOLPH2抑制劑該預(yù)計(jì)性的實(shí)施例描述了鑒定GOLPH2抑制劑的實(shí)驗(yàn)。發(fā)明人此前的工作已經(jīng)確定了GC-BP被一種有待鑒定的蛋白酪氨酸激酶（PTK）所活化（Kim等，Immunity21,643-53(2004)），并且GC-BP可能對(duì)GOLPH2作用于p35基因的轉(zhuǎn)錄起重要作用（圖5）。將采用一組廣泛的受體和非受體型PTKs的156種PTK抑制劑（EMDChemicalsInc.Gibbstown,NJ）用于鑒定對(duì)GC-BP通過(guò)酪氨酸磷酸化的活化起重要作用的特定酶。所述特異性抑制劑還應(yīng)逆轉(zhuǎn)GOLPH2的活性。作為對(duì)照，將對(duì)PTK抑制劑本身進(jìn)行檢測(cè)，以確定在不存在GC-BP的條件下其是否通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞影響IL-12的產(chǎn)生?？紤]到BDSFIL-12對(duì)GC-BP具有較強(qiáng)的活化作用（酪氨酸磷酸化），在暴露于rGOLPH2后，在原代人DCs中GC-BP的結(jié)合預(yù)計(jì)將增加（圖5B）。還預(yù)計(jì)在經(jīng)LPS刺激的原代人DCs中，GC-BP表達(dá)的敲減將通過(guò)這一途徑挽救存在rGOLPH2的情況下IL-12的產(chǎn)生。為了將表達(dá)RNAi序列的細(xì)胞數(shù)量最大化，將采用流式細(xì)胞術(shù)針對(duì)GFP的表達(dá)進(jìn)行分選，以富集已轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞。GOLPH2可能參與了翻譯后的蛋白修飾、分泌性蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)調(diào)控、或高爾基體器官功能的維持。發(fā)明人在此前使用GOLPH2的兩種分泌突變體R52A和R54A獲得的數(shù)據(jù)（Puri等，Traffic3,641-53(2002)）還表明GOLPH2可能具有細(xì)胞內(nèi)功能（圖4B）。GOLPH2的這些潛在的細(xì)胞內(nèi)性質(zhì)可以解釋GOLPH2在樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)如何調(diào)控IL-12的基因表達(dá)。將對(duì)這些性質(zhì)與細(xì)胞外性質(zhì)平行地進(jìn)行進(jìn)一步研究，以進(jìn)一步闡明GOLPH2的正常和病理活性。實(shí)施例11：GOLPH2-結(jié)合蛋白的鑒定在該預(yù)計(jì)性實(shí)施例中，將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以鑒定GOLPH2受體（GOLPH2-R）。數(shù)據(jù)顯示對(duì)IL-12p35轉(zhuǎn)錄抑制的GOLPH2釋放至細(xì)胞外間隙。GOLPH2在樹(shù)突狀細(xì)胞中顯示其作用的一個(gè)可能途徑為通過(guò)與其膜受體之間的相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，從而導(dǎo)致IL-12p35轉(zhuǎn)錄和IL-12產(chǎn)生的抑制。GOLPH2受體（GOLPH2-R）的鑒定將在分子水平闡明GOLPH2調(diào)節(jié)DC功能的過(guò)程。實(shí)施例12：rGOLPH2與樹(shù)突狀細(xì)胞的結(jié)合在該預(yù)計(jì)性實(shí)施例中，檢測(cè)rGOLPH2與細(xì)胞的結(jié)合。使用來(lái)自Pierce的EZ-連接NHS-PEG-生物素試劑（PEG4和PEG12）將人rGOLPH2生物素化。在4℃下，將漸增濃度生物素化的rGOLPH2與混懸于含葡萄糖的KrebsRinger磷酸鹽緩沖液（KRPG）中的106個(gè)人DCs孵育1小時(shí)，隨后使用冰冷的PBS緩沖液充分洗滌以除去過(guò)量的未結(jié)合的rGOLPH2。通過(guò)加入與可檢測(cè)熒光團(tuán)偶聯(lián)的卵蛋白測(cè)定結(jié)合情況。將在加入或不加入100倍過(guò)量的非生物素化rGOLPH2的條件下測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的特異性結(jié)合。最大特異性結(jié)合對(duì)生物素化rGOLPH2濃度的曲線將揭示結(jié)合是否是飽和的。為測(cè)定結(jié)合的可逆性，首先將樹(shù)突狀細(xì)胞與固定量的生物素化rGOLPH2孵育，隨后加入漸增濃度的非生物素化rGOLPH2。在存在非生物素化rGOLPH2的條件下，細(xì)胞相關(guān)的熒光出現(xiàn)劑量依賴性降低說(shuō)明結(jié)合是可逆的。rGOLPH2與樹(shù)突狀細(xì)胞可逆的和可飽和的結(jié)合支持存在rGOLPH2受體，我們將會(huì)去鑒定結(jié)合部分。實(shí)施例13：將GOLPH2拉下后，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定GOLPH2結(jié)合蛋白在該預(yù)計(jì)性實(shí)施例中，描述了拉下實(shí)驗(yàn)以鑒定與GOLPH2結(jié)合的蛋白。為防止出現(xiàn)來(lái)自GOLPH2/靶點(diǎn)相互作用與拉下使用的識(shí)別位點(diǎn)之間的干擾，使用組氨酸（His）標(biāo)簽標(biāo)記rGOLPH2。然后，制備大量人樹(shù)突狀細(xì)胞的裂解物。加入混合蛋白酶抑制劑（Roche）以防止在裂解過(guò)程中出現(xiàn)蛋白降解。實(shí)施拉下實(shí)驗(yàn)，將His標(biāo)記的rGOLPH2與Ni-NTA固相親和純化柱共同孵育，使用PBS充分洗滌柱子以除去未結(jié)合的rGOLPH2。然后將樹(shù)突狀細(xì)胞裂解物通過(guò)rGOLPH2-結(jié)合Ni-NTA柱。先使用裂解緩沖液再使用溶于PBS中的20mM亞咪二唑（immidizole）充分洗滌。使用0.2-0.5M梯度的亞咪二唑（immidizole）洗脫。在SDS-凝膠上分離所有的洗脫成分，使用考馬斯亮藍(lán)染色目測(cè)檢查。切下凝膠條帶，進(jìn)行基于肽譜的MALDI-TOF以確定蛋白水解片段的質(zhì)量。在鑒定分離的GOLPH2-結(jié)合蛋白的上述分析中，可以將細(xì)胞質(zhì)與膜GOLPH2結(jié)合蛋白相分離。將僅對(duì)具有一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)的那些進(jìn)行進(jìn)一步針對(duì)作為推定的GOLPH2受體潛在候選物的表征。實(shí)施例14：通過(guò)拉下鑒定GOLPH2-結(jié)合膜蛋白該實(shí)施例描述了一種與實(shí)施例13中所描述的方法平行的，用于縮小前述實(shí)施例中產(chǎn)生的候選物列表，并且在拉下實(shí)驗(yàn)前純化膜蛋白的方法。首先，在室溫下將108個(gè)THP1細(xì)胞與溶于Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液pH7.4中的膜-不透過(guò)性生物素化試劑-ulfo-NHS-LC-LC-生物素（Pierce,Inc.）孵育30分鐘。通過(guò)加入甘氨酸使其終濃度為20mM來(lái)終止反應(yīng)。在全量制備前，進(jìn)行較小規(guī)模的試驗(yàn)性生物素化，以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生最有效標(biāo)記的條件（細(xì)胞密度、孵育時(shí)間和溫度、生物素化試劑的濃度）。將通過(guò)在SDS-PAGE中分辨標(biāo)記的THP1細(xì)胞和通過(guò)使用針對(duì)生物素的Western印跡檢測(cè)生物素化的蛋白（SigmaCo.）確認(rèn)標(biāo)記效能。在表面生物素化后，在含有適量蛋白酶抑制劑混合物（Roche）的RIPA緩沖液中裂解THP1細(xì)胞。將裂解物通過(guò)單體卵蛋白瓊脂糖柱（Pierce）從而富集裂解物中的膜部分，使用PBS/0.6MNaCl洗滌，用PBS平衡，并使用溶于PBS的4mM生物素洗脫。如果使用His標(biāo)記的GOLPH2，則洗脫得到的蛋白進(jìn)行C.1.2b中描述的使用Ni-NTA柱（Qiagen）的拉下檢測(cè)。柱上樣、洗滌和洗脫的條件均依據(jù)C.1.2b中的描述。使用SDS-PAGE對(duì)洗脫得到的蛋白進(jìn)行分辨，并使用針對(duì)生物素的抗體通過(guò)Western印跡對(duì)其進(jìn)行分析。對(duì)照包括在初始材料中省去重組GOLPH2，或者使用來(lái)自非生物素化THP1的裂解物。對(duì)對(duì)照和待測(cè)洗脫成分的蛋白譜進(jìn)行比較將有助于鑒定GOLPH2-R的候選物。實(shí)施例15：GOLPH2受體的表征該預(yù)計(jì)性實(shí)施例描述了對(duì)由前述實(shí)施例所描述的實(shí)驗(yàn)獲得的候選GOLPH2受體蛋白進(jìn)行進(jìn)一步表征的方法。將候選GOLPH2受體蛋白分成兩組。在可用于候選GOLPH2結(jié)合蛋白的抗體的范圍內(nèi)，那些抗體將被檢測(cè)以確定其在人樹(shù)突狀細(xì)胞中是否阻斷了GOLPH2誘導(dǎo)的IL-12p35的轉(zhuǎn)錄抑制。將對(duì)這種阻斷進(jìn)行評(píng)估以確定其是否是以劑量依賴性的方式發(fā)生的。如果抗體不能用于候選GOLPH2結(jié)合蛋白，則將使用雙鏈抑制性RNA沉默各基因的表達(dá)。將對(duì)基因沉默的影響進(jìn)行評(píng)估。將不對(duì)應(yīng)于任何已知基因的亂序RNAi寡聚物作為對(duì)照。如果膜GOLPH2結(jié)合蛋白是一種功能性的GOLPH2-R，則其被沉默將減弱GOLPH2的調(diào)節(jié)活性。樹(shù)突狀細(xì)胞將通過(guò)釋放更多IL-12加重炎癥。實(shí)施例16：使用同源的并具有免疫能力的小鼠腫瘤模型對(duì)B細(xì)胞介導(dǎo)的通過(guò)GOLPH2的抗腫瘤免疫逃逸的免疫學(xué)機(jī)制的研究該預(yù)計(jì)性實(shí)施例描述了進(jìn)一步研究B細(xì)胞是如何調(diào)控抗腫瘤CTL應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)。將使用IgM-/-B細(xì)胞缺陷小鼠72以評(píng)估對(duì)原代同源性腫瘤的免疫應(yīng)答。Kitamura等Nature350,423-6(1991)中對(duì)這種小鼠進(jìn)行了描述。檢測(cè)的原代同源性腫瘤將包括腫瘤，如MC38結(jié)腸癌和B16黑色素瘤（均為C57BL/6背景）。將檢測(cè)不同試劑通過(guò)IL-12的表達(dá)和GOLPH2的調(diào)節(jié)影響腫瘤生長(zhǎng)的能力。在這些B細(xì)胞缺陷小鼠中，若干研究顯示與野生型對(duì)象相比接種后其將出現(xiàn)更強(qiáng)的抗腫瘤（TS/A、MC38、EL4、76-9橫紋肌肉瘤和B16）保護(hù)性免疫（Qin等，NatMed4,627-30(1998)；Perricone等，JImmunother27,273-81(2004)），與在野生型小鼠中的部分應(yīng)答相比，在聯(lián)合給予趨化因子和細(xì)胞因子治療后其將完全阻止肺轉(zhuǎn)移（Chapoval等，JImmunol161,6977-84(1998)）。而且，Shah等發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞缺陷小鼠中增強(qiáng)的腫瘤抗性并非因它們的非B免疫細(xì)胞的內(nèi)在變化所致，因?yàn)閷T的脾臟B細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至IgM-/-小鼠會(huì)使其腫瘤排斥消除，并導(dǎo)致抗腫瘤TH1細(xì)胞因子和CTL應(yīng)答減少（IntJCancer117,574-86(2005)）。涉及BCR-轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明B細(xì)胞可以通過(guò)抗原非特異性機(jī)制抑制抗腫瘤T細(xì)胞的應(yīng)答，因?yàn)槟[瘤特異性抗體以及同源性T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用對(duì)B細(xì)胞（id.）引起的對(duì)腫瘤免疫的抑制均不是必要的，這與BDSFIL-12/GOLPH2能夠通過(guò)抑制DC-IL-12的產(chǎn)生間接抑制T細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生的性質(zhì)是一致的。值得注意的是，與人類癌癥有關(guān)，已發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤53和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移性皮膚黑色素瘤相關(guān)（Whelchel等，InvestOphthalmolVisSci34,2603-6(1993)；Kiss等，PatholOncolRes13,21-31(2007)；Hillen等，CancerImmunolImmunother57,97-106(2008)）。實(shí)施例17：在WT和IgM-/-小鼠中原代同源性腫瘤的生長(zhǎng)該預(yù)計(jì)性實(shí)施例描述了在可以暴露于不同檢測(cè)試劑的野生型和B細(xì)胞缺陷小鼠中檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)?？梢詫?duì)試劑進(jìn)行檢測(cè)以確定其是否出現(xiàn)GOLPH2抑制。注射給予小鼠B16腫瘤細(xì)胞。接種腫瘤后三周內(nèi)每三天監(jiān)測(cè)一次腫瘤的生長(zhǎng)情況。將至第15天仍無(wú)瘤狀態(tài)確定為腫瘤排斥。B16是一種高侵襲性和弱免疫原性腫瘤。研究表明接種劑量為106個(gè)腫瘤細(xì)胞時(shí)，在第15天未達(dá)到完全的腫瘤排斥，但是腫瘤的生長(zhǎng)明顯減慢（Shah等，IntJCancer117,574-86(2005)）。為設(shè)定基線，將在WT和IgM-/-小鼠中對(duì)兩種組織學(xué)上不同的同源性腫瘤MC38和B16的生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較。表1實(shí)施例18：抗-GOLPH2抗體可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)該預(yù)計(jì)性實(shí)施例描述了說(shuō)明在野生型小鼠中使用抗-GOLPH2抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)。方法皮下注射給予野生型和IgM-/-小鼠（每組五只）106個(gè)腫瘤細(xì)胞（例如，B16或MC38腫瘤細(xì)胞）。然后每日一次注射給予小鼠抗-GOLPH2抗體（劑量范圍為0.2至2mg/kg）、同種型匹配的對(duì)照IgG抗體（對(duì)照）或磷酸鹽緩沖液（對(duì)照）。識(shí)別具有氨基酸54-90（SEQIDNO:7，如下文所示）的GOLPH2蛋白片段的抗-GOLPH2抗體可能特別有效。54RAAAERGAVELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQ接種腫瘤后三周內(nèi)每三天監(jiān)測(cè)一次腫瘤的生長(zhǎng)情況。將至第15天仍無(wú)瘤狀態(tài)確定為腫瘤排斥。結(jié)果給予抗-GOLPH2抗體的小鼠在一段時(shí)間內(nèi)以劑量依賴性的方式表現(xiàn)出大幅減小的腫瘤生長(zhǎng)。在野生型和IgM-/-小鼠中可以觀察到腫瘤排斥。因而，抗-GOLPH2抗體可以抑制腫瘤的活性。參考文獻(xiàn)1.Browning,M.J.&Bodmer,W.F.MHCantigensandcancer:implicationsforT-cellsurveillance.CurrOpinImmunol4,613-8.(1992).2.Chen,H.,Centola,M.,Altschul,S.F.&Metzger,H.Characterizationofgeneexpressioninrestingandactivatedmastcells.JExpMed188,1657-68.(1998).3.Naor,D.Suppressorcells:permittersandpromotersofmalignancy？AdvCancerRes29,45-125(1979).4.Trinchieri,G.&Scott,P.Interleukin-12:basicprinciplesandclinicalapplications.CurrTopMicrobiolImmunol238,57-78(1999).5.Rook,A.H.etal.Interleukin-12therapyofcutaneousT-celllymphomainduceslesionregressionandcytotoxicT-cellresponses.Blood94,902-8.(1999).6.Rook,A.H.etal.Theroleforinterleukin-12therapyofcutaneousTcelllymphoma.AnnNYAcadSci941,177-84.(2001).7.Ansell,S.M.etal.Phase1studyofinterleukin-12incombinationwithrituximabinpatientswithB-cellnon-Hodgkinlymphoma.Blood99,67-74.(2002).8.Mortarini,R.etal.Peripheralburstoftumor-specificcytotoxicTlymphocytesandinfiltrationofmetastaticlesionsbymemoryCD8+Tcellsinmelanomapatientsreceivinginterleukin12.CancerRes60,3559-68.(2000).9.Gollob,J.A.etal.PhaseItrialoftwice-weeklyintravenousinterleukin12inpatientswithmetastaticrenalcellcancerormalignantmelanoma:abilitytomaintainIFN-gammainductionisassociatedwithclinicalresponse.ClinCancerRes6,1678-92.(2000).10.Lee,P.etal.Effectsofinterleukin-12ontheimmuneresponsetoamultipeptidevaccineforresectedmetastaticmelanoma.JClinOncol19,3836-47.(2001).11.Kang,W.K.etal.Interleukin12genetherapyofcancerbyperitumoralinjectionoftransducedautologousfibroblasts:outcomeofaphaseIstudy.HumGeneTher12,671-84.(2001).12.Gajewski,T.F.,Fallarino,F.,Ashikari,A.&Sherman,M.ImmunizationofHLA-A2+melanomapatientswithMAGE-3orMelanApeptide-pulsedautologousperipheralbloodmononuclearcellsplusrecombinanthumaninterleukin12.ClinCancerRes7,895s-901s.(2001)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表位類似物具有兩個(gè)氨基酸取代、兩個(gè)增加的氨基酸或兩個(gè)氨基酸缺失。32.根據(jù)主張29所述的方法，其中所述肽表位類似物具有三個(gè)氨基酸取代、三個(gè)增加的氨基酸或三個(gè)氨基酸缺失。33.根據(jù)主張29所述的方法，其中所述肽表位類似物具有四個(gè)氨基酸取代、四個(gè)增加的氨基酸或四個(gè)氨基酸缺失。34.一種增加抗體的方法，所述抗體中和可溶性GOLPH2的活性，所述方法包括增加所述抗體，所述抗體針對(duì)由SEQIDNO:7組成的肽。35.根據(jù)主張29-34任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體由噬菌體抗體文庫(kù)獲得。36.根據(jù)主張29-34任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體通過(guò)親和性成熟獲得。37.根據(jù)主張29-34任意一項(xiàng)所述的方法，其中將所述肽表位或肽表位類似物給予動(dòng)物。38.根據(jù)主張29-37任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是人源化的或人抗體。39.一種分離可溶性GOLPH2抑制劑的方法，所述方法包括：（a）將包含可溶性GOLPH2的細(xì)胞培養(yǎng)物與待測(cè)物接觸；和（b）觀察培養(yǎng)物中的細(xì)胞是否表達(dá)IL-12，其中如果培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)IL-12，則所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2抑制劑。40.根據(jù)主張39所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中的細(xì)胞選自樹(shù)突狀細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞、癌細(xì)胞及其組合。41.根據(jù)主張39或40所述的方法，其中，與由包含可溶性GOLPH2但無(wú)待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少10%，則所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2的抑制劑。42根據(jù)主張39-41任意一項(xiàng)所述的方法，其中，與由包含可溶性GOLPH2但無(wú)待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少50%，則所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2的抑制劑。43.根據(jù)主張39-42任意一項(xiàng)所述的方法，其中，與由包含可溶性GOLPH2但無(wú)待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少兩倍，則所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2的抑制劑。44.根據(jù)主張39-43任意一項(xiàng)所述的方法，其中與由包含可溶性GOLPH2但無(wú)待測(cè)物的細(xì)胞培養(yǎng)物組成的對(duì)照相比，如果培養(yǎng)物中的細(xì)胞表達(dá)的IL-12增加至少三倍，則所述待測(cè)物是可溶性GOLPH2的抑制劑。