專利名稱：Il-2-和il-15-介導(dǎo)的t細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)、移植排斥和與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病。
聯(lián)邦商業(yè)研究本文描述的工作部分上得到國(guó)家衛(wèi)生研究所的授權(quán)。因此，美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明有某些權(quán)利。
背景兩種白細(xì)胞介素，IL-2和IL-15，在體外刺激T細(xì)胞增殖的功能中是多余的。然而，它們?cè)隗w內(nèi)初次免疫激活和免疫穩(wěn)態(tài)的作用還是不太清楚。在體內(nèi)，IL-2和IL-15具有不同的功能且調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活的不同方面。例如，IL-2能最初激活T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡(Lenardo，Nature 353858-861，1991)，而IL-15能支持細(xì)胞存活(Dooms等，J.Immunol.1612141-2150，1998；Bulfone等Nature Medicine 31124-1128，1997)。IL-15還顯示推動(dòng)記憶型CD8+T細(xì)胞的增殖，而IL-2限制它們的連續(xù)擴(kuò)增(Ku等，Science288675-678，2000)。此外，IL-2缺失小鼠的表型是淋巴組織增生性和自身免疫(Horak等，Immunol.Rev.14835-44，1995)，而IL-15缺失小鼠在某種程度上是淋巴細(xì)胞減少、且不能對(duì)病毒攻擊產(chǎn)生初次免疫反應(yīng)(Kennedy等，J.Exp.Med.191771-780，2000；Lodolce等，Immunity 9669-676，1998)。用于這種觸發(fā)雙歧分枝的分子機(jī)理仍然是費(fèi)解的。
IL-2和IL-15的功能受體包括一個(gè)各自獨(dú)立的α鏈，該鏈決定了IL-2和IL-15的結(jié)合特異性，他們還包括共同的IL-2受體β和γ鏈。γ鏈還是IL-4，IL-7，和IL-9受體的關(guān)鍵信號(hào)組成部分(Sugamura等，Ann.Rev.Immunol.14179-205，1996)。在淋巴區(qū)，這些受體亞基可以分別或以各種組合方式表達(dá)，以致形成了各種具有不同親和性和/或不同信號(hào)傳導(dǎo)能力的受體(Sugamura等，supra)。例如，β鏈可擇一地與α鏈或γ鏈結(jié)合，形成二聚結(jié)構(gòu)，或者與α鏈和γ鏈一起結(jié)合形成三聚結(jié)構(gòu)。同樣地，γ鏈可與β鏈互相作用，并且通過β鏈，和IL-2受體或IL-15受體的α鏈中的一條相互作用。與IL-2受體α鏈相比，單獨(dú)的IL-15受體α鏈可以高親和性地與IL-15結(jié)合(Giri等，EMBO J.143654-3663，1995)。然而，類似于IL-2受體α鏈，不認(rèn)為這種相互作用會(huì)引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)。因此，α、β和γ鏈亞基的三聚體對(duì)于IL-2和IL-15的高親和性受體的功能完整性是必需的。
體外研究已經(jīng)顯示，激活的T細(xì)胞能表達(dá)IL-2受體α鏈和IL-15受體α鏈(Chae等，J Immziiiol.1572813-2819，1996)，并且β和γ鏈由激活的T細(xì)胞表達(dá)(Ishii等，Int.Immunol.61273-1277，1994)。此外，免疫激活期間，在體內(nèi)易于檢測(cè)到IL-2和IL-15(Li等，J.Immunol.161890-896，1998)。因此，激活的T細(xì)胞如何區(qū)別IL-2、IL-15和其它依賴γ鏈的細(xì)胞因子是不清楚的。
概述本發(fā)明部分上是基于對(duì)體內(nèi)循環(huán)T細(xì)胞表達(dá)IL-2和IL-15受體亞基的研究。令人驚奇地，這些亞基以選擇性的方式直接激活T細(xì)胞對(duì)IL-2或IL-15的應(yīng)答，因此調(diào)節(jié)體內(nèi)的T細(xì)胞應(yīng)答。換言之(相對(duì)于IL-2和IL-15多余的傳統(tǒng)知識(shí))，在控制體內(nèi)T細(xì)胞增殖中，IL-2和IL-15起到不同的作用。尤其，IL-15對(duì)于引發(fā)T細(xì)胞分裂是關(guān)鍵的，而IL-2經(jīng)γc表達(dá)的下游調(diào)節(jié)(down-regulation)控制T細(xì)胞擴(kuò)增。相應(yīng)地，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了IL-2和IL-15的新型組合拮抗劑和通過這些拮抗劑給藥抑制免疫應(yīng)答的方法。在每個(gè)場(chǎng)合中，采用拮抗IL-15分子或IL-15受體(IL-15R)的第一制劑，和拮抗IL-2分子或IL2受體(IL-2R)的第二制劑給藥的方式來產(chǎn)生抑制。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括(代替，或除上述的制劑以外)，抑制編碼白細(xì)胞介素(例如，IL-2或IL-15)或編碼白細(xì)胞介素受體(例如，IL-2或IL-15受體)的核酸(例如，DNA或RNA)表達(dá)的制劑。
一般地說，本發(fā)明涉及新的藥劑組合物，當(dāng)對(duì)患者給藥時(shí)可減少抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)量。例如，本發(fā)明涉及包括兩種或更多制劑的組合物(例如，藥學(xué)上可接受的組合物)，其中每種制劑都可促進(jìn)T細(xì)胞死亡。另外，這種組合物也可包括至少一種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑和至少一種抑制T細(xì)胞增殖的制劑。促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑能促進(jìn)AICD(激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡)、被動(dòng)細(xì)胞死亡、ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)或CDC(補(bǔ)體主導(dǎo)的細(xì)胞毒性)。
促進(jìn)AICD的制劑包括IL-2和相關(guān)分子(例如，IL-2/Fc或其它起IL-2或IL-2受體拮抗劑作用的分子(例如，特異性結(jié)合IL-2受體的抗體和模擬受體天然配體的抗體))。另一種促進(jìn)AICD的制劑是Fas配體(FasL)。促進(jìn)被動(dòng)細(xì)胞死亡的制劑包括拮抗IL-15(通過靶向，例如，結(jié)合，藉此抑制IL-15和IL-15受體的活性，或者一旦結(jié)合受體立即激活胞內(nèi)信號(hào)通道的成分)的制劑，或者T細(xì)胞存活需要的任何其它的因子(例如，IL-4，IL-7，OX-4配體，IFN-β，4-1BB，或IGF-I)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括(代替，或除一種或多種上述的制劑之外)，抑制編碼白細(xì)胞介素(例如，IL-2或IL-15)或編碼白細(xì)胞介素受體(例如，IL-2或IL-15受體)的核酸(例如，DNA或RNA)表達(dá)的制劑。
將T細(xì)胞暴露在可結(jié)合T細(xì)胞表面且含有激活A(yù)DCC或CDC的Fc部分的制劑中，則可促進(jìn)ADCC或CDC。更特別地，促進(jìn)ADCC或CDC的制劑包括含白細(xì)胞介素(例如，IL-2或突變體IL-15)和Fc區(qū)(例如，IL-2/Fc)以及抗體或結(jié)合白細(xì)胞介素受體(例如，IL-2或IL-15受體)的其它含F(xiàn)c蛋白的融合蛋白。
如上敘述的，本發(fā)明的組合物不僅包括促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑，而且包括抑制T細(xì)胞增殖的制劑。抑制T細(xì)胞增殖的制劑包括雷帕霉素(Rapamycin)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)，硫唑嘌呤(azathioprine)，和任何本領(lǐng)域已知的并能用來防止細(xì)胞增殖的其它制劑(包括化學(xué)治療劑)。將抑制T細(xì)胞增殖的制劑與促進(jìn)AICD和刺激T細(xì)胞增殖(例如IL-2/Fc)的制劑組合使用尤其有效。例如，本發(fā)明公開了一種藥學(xué)上可接受的組合物，包括IL-2/Fc(該物質(zhì)，例如可促進(jìn)AICD和經(jīng)由ADCC或CDC的細(xì)胞裂解)，IL-15拮抗劑(該物質(zhì)，例如可通過拮抗一種T細(xì)胞存活必需的因子IL-15而促進(jìn)被動(dòng)細(xì)胞死亡)，和雷帕霉素(它抑制T細(xì)胞增殖)。含有其它組合物制劑的組合物如下所述。
明顯地，當(dāng)采用兩種或多種制劑時(shí)，它們不必彼此物理隔離。制劑是主要有一種功能活性(例如，通過特異結(jié)合IL-2或IL-15靶向IL-2或IL-15的抗體)的單一實(shí)體的同時(shí)，它還可以是具有至少兩種功能活性(例如，IL-2/Fc，mIL-15/Fc，或抗-IL-2或抗-IL-15抗體；在這些分子中，白細(xì)胞介素介導(dǎo)AICD，并且該分子的Fc部分介導(dǎo)CDC和ADCC)的單一實(shí)體。因此，包含(1)誘導(dǎo)AICD的制劑，(2)誘導(dǎo)CDC的制劑，和(3)抑制細(xì)胞增殖的制劑形成的組合物可能僅僅包含兩種活性成分(例如，(1)IL-2/Fc分子，它誘導(dǎo)AICD和CDC，和(2)雷帕霉素，它抑制細(xì)胞增殖)。
本文描述的這種組合物在治療會(huì)受益于免疫抑制的病人中有效(例如，已經(jīng)接受或計(jì)劃接受移植的病人；具有免疫疾病，尤其自身免疫性疾病的病人；患有癌癥(例如，免疫系統(tǒng)癌癥)的病人；或者患有移植物對(duì)抗宿主疾病(GVHD)的病人))。GVHD特征在于供體白細(xì)胞抗受體抗原的反應(yīng)。這種反應(yīng)在骨髓移植中特別成問題，但是還發(fā)生在整個(gè)器官移植中；存在于移植器官中的供體白細(xì)胞經(jīng)常是一同移植的。
盡管本發(fā)明的組合物包含一種以上的制劑，但本發(fā)明并不限于制劑同時(shí)給藥的那些方式。例如，病人在接受含IL-2拮抗劑或IL-2R拮抗劑的組合藥物之前，能接受含有IL-15拮抗劑或IL-15R拮抗劑的組合物。同樣地，在接受含IL-2激動(dòng)劑的組合物之前，病人能接受含雷帕霉素的組合物。此外，本發(fā)明的組合物(同步或順序施用)在其植入病人之前可用于治療器官或細(xì)胞移植。本發(fā)明的制劑和它們的用法，進(jìn)一步如下所述。
本發(fā)明使用的許多制劑具有有益的治療特性。例如，靶向IL-15R的制劑可以是包括突變體IL-15(mIL-15)多肽的融合蛋白。這些制劑不像是致免疫的，因?yàn)橥ㄟ^某些殘基的取代使得融合蛋白的突變體IL-15部分可不同于野生型IL-15。此外，由于mIL-15多肽能以高親和性地結(jié)合IL-15Rα，它們能夠有效地與野生型IL-15競(jìng)爭(zhēng)受體。進(jìn)一步地，本發(fā)明的制劑能夠激活宿主免疫系統(tǒng)的成分，例如補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞，它們最終介導(dǎo)帶有制劑可結(jié)合的受體(例如，IL-2受體)的細(xì)胞的消滅(或缺失)。例如，本發(fā)明的制劑能夠介導(dǎo)靶細(xì)胞的裂解或噬菌作用。IL-15受體(IL-15Rα)的α亞基由激活或惡性免疫細(xì)胞表達(dá)，而不是靜止免疫細(xì)胞，本發(fā)明的制劑能夠用于特異性地靶向已經(jīng)被激活的那些細(xì)胞(例如，抗原-激活的T細(xì)胞)或已經(jīng)成為惡性的那些細(xì)胞。因此，盡管T細(xì)胞代表本發(fā)明制劑的優(yōu)選目標(biāo)，本發(fā)明的組合物還可用于靶向其它涉及免疫疾病發(fā)病機(jī)理的細(xì)胞，例如免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞或組織的過增殖細(xì)胞。
除非另外說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。通過參考全部并入本文述及的所有公開、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從附圖、詳細(xì)說明書和權(quán)利要求可明顯的獲知。盡管類似或等同于本文描述的那些材料和方法可用本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)獲知，優(yōu)選的材料和方法如下所述。


圖1是野生型IL-15核酸序列(SEQ ID NO1)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的圖示。
圖2是突變體IL-15核酸序列(SEQ ID NO3)和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)的圖示。在位置149編碼谷氨酰胺的野生型密碼子CGA以及在位置156編碼谷氨酰胺的野生型密碼子CAA，都已經(jīng)變成編碼天冬氨酸的GAC。(在成熟的IL-15多肽中，它缺少48個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，這些位置(149和156)分別對(duì)應(yīng)于位置101和108)。
圖3A是在靜脈內(nèi)(i.v.)注射CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞3天之后，分裂宿主脾臟中的T細(xì)胞得到的IL-2受體α、β和γc鏈的表達(dá)圖表。顯示了6個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表數(shù)據(jù)。
圖3B是一系列通過體外分裂T細(xì)胞而描繪的IL-2受體α、β和γ鏈的表達(dá)的圖表。用抗-CD3(2μg/ml)體外刺激CFSE標(biāo)記的細(xì)胞淋巴細(xì)胞3天。通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析細(xì)胞分裂和IL-2受體亞基表達(dá)。
圖3C是在體內(nèi)通過分裂T細(xì)胞而描繪的L-選擇蛋白的表達(dá)圖表。靜脈內(nèi)注射CFSE標(biāo)記細(xì)胞3天之后從宿主小鼠的淋巴結(jié)收獲細(xì)胞，并且用PE-抗-CD62L mAb染色。基于以同種型對(duì)照mAb染色的細(xì)胞設(shè)置象限。
圖3D是一系列描寫體內(nèi)分裂T細(xì)胞之間IL-2受體α鏈差異表達(dá)的圖表。體內(nèi)刺激CFSE標(biāo)記的細(xì)胞三天，分選第二次細(xì)胞分裂的細(xì)胞。分選過的細(xì)胞用抗-CD3和抗-CD28體外再刺激3天。通過FACS分析細(xì)胞分裂和IL-2受體α鏈的表達(dá)。
圖4A是在靜脈內(nèi)注射CFSE標(biāo)記細(xì)胞3天之后，通過體內(nèi)分裂T細(xì)胞而描繪的一系列IL-15受體α鏈表達(dá)的圖表。用IL-15-FLAG融合蛋白將細(xì)胞染色，接著用生物素化抗FLAG mAb和PE-鏈霉抗生物素蛋白染色。缺少IL-15-FLAG時(shí)的細(xì)胞染色作為對(duì)照。
圖4B是顯示體內(nèi)分裂T細(xì)胞對(duì)IL-2和IL-15體外的不同反應(yīng)的直方圖。體內(nèi)刺激CFSE-標(biāo)記的淋巴細(xì)胞3天后，通過檢查CFSE分布圖分析細(xì)胞分裂。分選第二次細(xì)胞分裂的T細(xì)胞，將細(xì)胞(1×104)和IL-2或IL-15體外共培養(yǎng)2天。通過3H-TdR攝取測(cè)定細(xì)胞增殖。結(jié)果表示為三重測(cè)定的平均CPM±SD。
圖4C是一對(duì)顯示抗-CD25處理對(duì)T細(xì)胞體內(nèi)分裂作用的圖表。在CFSE標(biāo)記的細(xì)胞靜脈內(nèi)注射之前，宿主小鼠立即以1mg/天腹膜內(nèi)(i.p.)給予抗-CD25 mAb 3天。包括作為對(duì)照的以同種型對(duì)照mAb(大鼠IgG1)治療的小鼠。
圖5A是一系列顯示體內(nèi)分裂T細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)IL-2染色的圖表。體內(nèi)刺激CFSE標(biāo)記的細(xì)胞3天。從宿主脾臟收獲的細(xì)胞，在有GolgiStopTM的條件下，用PMA和離子霉素(ionomycin)體外刺激4小時(shí)。接著進(jìn)行細(xì)胞固定、透化和染色以便生產(chǎn)IL-2。包括作為對(duì)照的以同種型對(duì)照mAb染色的細(xì)胞。
圖5B是顯示源自IL-2缺失小鼠的CD4+T細(xì)胞的γc表達(dá)的一對(duì)圖表。IL-2缺失小鼠和野生型對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞用PE-抗-小鼠CD4 mAb和FITC-抗-小鼠IL-2受體γc mAb染色。通過FACS分析CD4+T細(xì)胞的γc表達(dá)。
圖5C是一系列顯示抗-CD25對(duì)體內(nèi)分裂T細(xì)胞中γc表達(dá)的作用效果的圖表。在CFSE標(biāo)記的細(xì)胞靜脈內(nèi)注射之前，宿主小鼠立即以1mg/天腹膜內(nèi)(i.p.)給予抗-CD25 mAb 3天。體內(nèi)分裂T細(xì)胞中的IL-2受體β和γ鏈的表達(dá)在第3天測(cè)定(即，CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞注射之后3天)。也包括以同種型對(duì)照mAb(大鼠IgG1)作用的小鼠作為對(duì)照。
圖5D是一系列顯示體內(nèi)分裂T細(xì)胞的凋亡細(xì)胞死亡的圖表。體內(nèi)刺激CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞3天。由宿主脾臟收獲細(xì)胞且以PE-膜聯(lián)蛋白V染色。由FACS分析細(xì)胞分裂和凋亡細(xì)胞死亡。
圖5E是一系列顯示體內(nèi)分裂T細(xì)胞中胞內(nèi)Bc1-2表達(dá)的圖表。刺激CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞3天。由宿主脾臟收獲的細(xì)胞用PE-抗-小鼠Be1-2 mAb或同種型對(duì)照mAb染色。通過FACS分析細(xì)胞分裂和Bc1-2的表達(dá)。
圖6是顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖，其中在以各種制劑處理之后評(píng)估細(xì)胞死亡(由CTLL-2細(xì)胞釋放同種型51 Cr評(píng)估；參見x軸)。NP40是去污劑；IL-2/Fc是含有IL-2和IgG分子(這種分子是溶菌的)Fc區(qū)的融合蛋白；C′是大鼠補(bǔ)體；IL-2/FC-/-是非裂解的含IL-2-融合蛋白；且mIg是鼠免疫球蛋白。這種研究支持溶細(xì)胞IL-2/Fc裂解帶有IL-2R的CTLL-2細(xì)胞的結(jié)論，但是非裂解IL-2/Fc不會(huì)。
圖7是一系列的曲線圖。FcRI對(duì)CHO(中國(guó)倉鼠卵巢)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度是在這種細(xì)胞暴露于磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS；左上)、鼠免疫球蛋白(mIgG2a；右上)、非裂解IL-2/Fc分子(IL-2/Fc-/-；左下)和含融合蛋白的裂解IL-2(IL-2/Fc；右下)之后測(cè)量。每個(gè)曲線圖中，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于FcRI/CHO熒光強(qiáng)度繪圖。這種研究支持溶細(xì)胞IL-2/Fc結(jié)合FcRI的結(jié)論，但非-裂解IL-2/Fc不會(huì)。
圖8是一系列顯示體內(nèi)CD4+(左手側(cè))和CD8+(右手側(cè))T細(xì)胞增殖反應(yīng)的8個(gè)圖表。細(xì)胞以CFSE標(biāo)記，并且用裂解分子(IL-2/Fc)和細(xì)胞增殖劑(雷帕霉素(Rap))，或者聯(lián)合的這兩種制劑在體內(nèi)刺激三天。作為陰性對(duì)照，一組動(dòng)物不用制劑處理。通過它們的CFSE分布圖分析IL-2/FC。這種研究支持雷帕霉素抑制IL-2增生信號(hào)的結(jié)論。
圖9是一系列的四個(gè)圖表，它們來自體內(nèi)刺激CFSE-標(biāo)記的淋巴細(xì)胞3天的實(shí)驗(yàn)。通過在未接受制劑處理(左上)、接受單獨(dú)的雷帕霉素(Rap；右上)、單獨(dú)的IL-2/Fc(左下)，或者雷帕霉素和IL-2/Fc(Rap+IL-2/Fc；右下)的組合處理的動(dòng)物中的FACS，來評(píng)價(jià)分裂T細(xì)胞上的IL-2Rα鏈的表達(dá)。這種研究支持了在T細(xì)胞體內(nèi)增殖早期用雷帕霉素和IL-2/Fc處理可促進(jìn)IL-2R亞基表達(dá)的結(jié)論。
圖10是體內(nèi)刺激CFSE-標(biāo)記的淋巴細(xì)胞3天且由FACS分析時(shí)獲得的一對(duì)圖表。在未接受處理(左手區(qū))或接受雷帕霉素和IL-2/Fc(Rap+IL-2/Fc；右手區(qū))處理的動(dòng)物中評(píng)價(jià)膜聯(lián)蛋白V在分裂T細(xì)胞(CD4+)上的表達(dá)。這種研究支持在T細(xì)胞體內(nèi)增殖早期，雷帕霉素和IL-2/Fc處理能促進(jìn)CD4+細(xì)胞凋亡的結(jié)論。
圖11是顯示在自身免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠中檢查胰島同種異體移植存活的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表格。依據(jù)初始同種異體移植功能(此欄顯示的百分比表示同種異體移植功能(功能由監(jiān)測(cè)血糖水平評(píng)價(jià))小鼠)和功能移植物平均存活時(shí)間(MST)評(píng)價(jià)移植。n＝試驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)量。治療如標(biāo)題″治療″下所示(還參見伴隨表的圖例和以下的說明)。這里呈現(xiàn)的結(jié)果支持雷帕霉素、IL-2/Fc和mIL-15/Fc組合治療引起胰島同種異體移植的長(zhǎng)期存活的結(jié)論。
圖12是表示在NOD小鼠中檢查皮膚同種異體移植存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表格。根據(jù)功能移植物的平均存活時(shí)間(MST)評(píng)價(jià)移植。n＝試驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)量。治療如標(biāo)題″治療″下所示(還參見伴隨表的圖例和以下的說明)。這里呈現(xiàn)的結(jié)果支持雷帕霉素、IL-2/Fc和mIL-15/Fc組合治療引起皮膚同種異體移植的長(zhǎng)期存活的結(jié)論。
圖13是經(jīng)裂解IL-2/Fc分子、鼠免疫球蛋白(mIg)和非裂解IL-2/Fc分子治療之后，整個(gè)時(shí)間內(nèi)仍然無糖尿病的動(dòng)物的％曲線圖。溶細(xì)胞IL-2/Fc阻斷自身免疫性，但是裂解IL2/Fc不會(huì)。
詳細(xì)說明當(dāng)抗原或促細(xì)胞分裂原觸發(fā)T細(xì)胞激活時(shí)便開始了有效的免疫應(yīng)答。T細(xì)胞激活的過程中，會(huì)發(fā)生很多的細(xì)胞變化，它包括細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的表達(dá)。包含于免疫應(yīng)答中的細(xì)胞因子之一是白細(xì)胞介素-15(IL-15)，它是體外刺激B細(xì)胞、T細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞增殖和分化的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子。在體內(nèi)，這些細(xì)胞類型的增殖增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。包含于免疫應(yīng)答中的且本文描述的另一細(xì)胞因子是IL-2。
本發(fā)明的組合物包括靶向IL-15或其受體，和IL-2或其受體的制劑，以及那些組合物用于抑制免疫應(yīng)答(例如，體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答)的方法。在許多情況下，病人受益于的免疫應(yīng)答的抑制，例如，在器官移植或免疫疾病的事件中，尤其是自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。其它情況下，例如選擇已經(jīng)變成惡性或自攻擊性的免疫細(xì)胞時(shí)，積極地毀壞它們是有益的。
本發(fā)明是一種基于抑制免疫應(yīng)答的新途徑的發(fā)現(xiàn)?？赏ㄟ^給予組合制劑實(shí)現(xiàn)抑制，其中一種靶向IL-15或IL-15R，其中一種靶向IL-2或IL-2R(給藥模式，包括體外治療移植，是本領(lǐng)域已知的且以下進(jìn)一步描述)。一般地說，人們通過激活導(dǎo)致激活T細(xì)胞死亡的信號(hào)通道(通過，例如，AICD)可以減少抗原反應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量；除去細(xì)胞存活必需的因子(這種除去之后死亡的細(xì)胞稱為以被動(dòng)細(xì)胞死亡)；或者靶向激活細(xì)胞以便通過免疫系統(tǒng)的成分裂解(以這種方式死亡的細(xì)胞據(jù)稱是以ADCC或CDC方式死亡)。因此，本發(fā)明的組合物包括達(dá)到這些目標(biāo)之一或更多目標(biāo)的制劑(即，經(jīng)識(shí)別出的細(xì)胞死亡途徑(例如，AICD，被動(dòng)細(xì)胞死亡，ADCC，或CDC)促進(jìn)T細(xì)胞死亡)。除了含有一種或多種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑之外，本發(fā)明的組合物還包括一種或多種抑制T細(xì)胞增殖(如，例如在對(duì)抗原的反應(yīng)中發(fā)生的)的制劑。例如，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種組合物(例如，藥學(xué)上可接受的組合物或配制的用于器官或細(xì)胞培養(yǎng)的組合物)，它包括IL-2/Fc(它，例如，促進(jìn)經(jīng)ADCC或CDC的AICD和細(xì)胞裂解)，mIL-15/Fc(它拮抗IL-15(并且因此促進(jìn)被動(dòng)細(xì)胞死亡)和經(jīng)ACDD或CDC促進(jìn)細(xì)胞裂解)，和雷帕霉素(抑制T細(xì)胞增殖)。
術(shù)語″制劑″指基本上包括任何一種類型的可用于治療劑的分子。蛋白質(zhì)，例如抗體，融合蛋白，和可溶性配體，它們中的任何或者等同于野生型蛋白，或者包含突變(即，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、添加或取代)，以及編碼它們的核酸分子(或者它們的″反義″；即，與編碼IL-2、IL-15或它們受體的成分(例如，亞基)的核酸反義的寡核苷酸)都是″制劑″。本發(fā)明的制劑或者可以全身、局部給藥，或者通過細(xì)胞水平治療(即，本發(fā)明的制劑可通過在表達(dá)該制劑至病人的細(xì)胞上給藥)給藥。將這種細(xì)胞給予病人僅僅是為了表達(dá)治療劑。這種細(xì)胞還可以是細(xì)胞、組織或器官移植的細(xì)胞。例如，移植細(xì)胞(例如，胰島細(xì)胞)或組織或器官內(nèi)細(xì)胞(例如，皮膚或肝臟、腎臟或心臟的小塊內(nèi)的細(xì)胞)，它們可以用制劑治療或用編碼制劑的核酸分子體外(例如，移植之前)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這樣，移植細(xì)胞產(chǎn)生它們自身的免疫抑制劑。例如，具有期望的表型的細(xì)胞(例如，胰島素生成細(xì)胞)可以被修飾成為包括可產(chǎn)生一種或多種本發(fā)明的免疫抑制因子的基因。移植的細(xì)胞、組織或器官可以在移植之前，或者移植之后進(jìn)行治療。對(duì)病人的給藥(或培養(yǎng)中的細(xì)胞或器官)方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知和常規(guī)使用的，并且以下進(jìn)一步討論。
靶向IL-15或IL-15R的制劑本發(fā)明的組合物包括靶向IL-15或IL-15受體的一種或多種制劑。如上所述，單一的制劑具有多功能域。靶向IL-15或IL-15R的制劑包括結(jié)合(或另外的相互作用于)IL-15、IL-15R的制劑或編碼它們的核酸的制劑，以及結(jié)合且隨后破壞具有IL-15R的細(xì)胞的制劑，例如激活的T細(xì)胞。因此，用于獲得免疫抑制的制劑包含兩個(gè)功能部分靶向具有IL-15R的細(xì)胞的靶向功能部分，和清除具有IL-15R的細(xì)胞的清除(例如，裂解)功能部分。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，靶向功能部分結(jié)合IL-15R，而不會(huì)通過受體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。例如，靶向部分包括突變體IL-15多肽，并且清除靶細(xì)胞部分包括免疫球蛋白分子的Fc區(qū)。Fc區(qū)衍生于IgG，例如人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，或類似的哺乳動(dòng)物IgG，或者衍生于IgM，例如人IgM或類似的哺乳動(dòng)物IgM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括人IgG1或鼠IgG2a的鉸鏈、CH2和CH3域。盡管本發(fā)明不限于任何具體機(jī)理的制劑，但據(jù)信Fc區(qū)介導(dǎo)補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的含有IL-15R的細(xì)胞的清除。
已經(jīng)生產(chǎn)出突變體IL-15多肽，它以類似于野生型IL-15的親和性結(jié)合IL-15受體復(fù)合物，但是完全不能激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些突變體多肽與野生型IL-15多肽有效競(jìng)爭(zhēng)，并且能夠抑制在對(duì)IL-15信號(hào)應(yīng)答中通常發(fā)生的一種或多種現(xiàn)象，例如細(xì)胞增殖?！逡吧虸L-15多肽″本文指等同于天然產(chǎn)生的IL-15的多肽(例如，圖1所示的野生型IL-15多肽)。相反，″突變體IL-15多肽″是相對(duì)于野生型IL-15具有至少一個(gè)突變的多肽，它抑制通常由野生型IL-15促進(jìn)的體內(nèi)或體外活性中的至少一種。
按照本發(fā)明使用的突變體IL-15多肽通常會(huì)阻斷野生型IL-15分子的一種或多種活性的至少40％，更優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少90％。突變體IL-15多肽阻斷野生型IL-15活性的能力可通過多種分析評(píng)價(jià)，包括本文描述的BAF-BO3細(xì)胞增殖分析(其中細(xì)胞以編碼IL-2Rβ的構(gòu)建子轉(zhuǎn)染)。進(jìn)一步地，本發(fā)明的突變體多肽可按照它們顯示與野生型IL-15的具體相同百分比定義。檢查兩個(gè)多肽之間的相同百分比時(shí)，被比較的序列的長(zhǎng)度通常會(huì)是至少16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少25個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至少35個(gè)氨基酸。參照多肽或DNA序列使用的術(shù)語″相同性″，指兩個(gè)比較的多肽或DNA序列內(nèi)亞基(蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或DNA分子的核苷酸)之間的相同性。兩個(gè)分子中的亞基位置由相同的單體亞基(即，相同的氨基酸殘基或核苷酸)占據(jù)時(shí)，則這些分子在那個(gè)位置相同。兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性是相同位置數(shù)目的同向功能(direct function)。因此，100個(gè)氨基酸長(zhǎng)的50％等同于參照多肽的多肽有50個(gè)氨基酸多肽，它完全等同于參照多肽的50個(gè)氨基酸長(zhǎng)的部分。它還可以是在其整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)50％等同于100個(gè)氨基酸長(zhǎng)的參照多肽。當(dāng)然，許多其它的多肽會(huì)符合同樣的標(biāo)準(zhǔn)。通常，采用序列分析軟件能最方便地測(cè)量相同性，例如Wisconsin大學(xué)生物工程中心(1710 University大街，Madison，WI 53705)的Genetics Computer Group的序列分析軟件包和其設(shè)置的參數(shù)。
本發(fā)明的突變體IL-15多肽至少65％等同于野生型IL-15，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％(例如，96％，97％，98％或99％)。突變由氨基酸殘基數(shù)目或內(nèi)容上的變化組成。例如，突變體IL-15具有比野生型IL-15更多或更少數(shù)量的氨基酸殘基。此外，突變體多肽含有位于野生型IL-15中的一種或多種氨基酸殘基的取代。突變體IL-15多肽通過單個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或取代不同于野生型IL-15，例如，位置156的殘基的添加、缺失或取代。同樣地，突變體多肽通過兩個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或取代不同于野生型，例如，位置156和149的殘基。例如，突變體IL-15多肽不同于野生型IL-15之處在于在殘基156和149以天冬氨酸代替谷氨酰胺(如圖2所示)。用作靶向制劑的突變體多肽，和野生型IL-15一樣，能識(shí)別和結(jié)合IL-15R的成分。一項(xiàng)實(shí)施方案中，IL-15的突變?cè)诩?xì)胞因子的羧基末端域，據(jù)信它結(jié)合IL-2Rγ(IL-2受體亞基)。此外，突變體IL-15多肽包括IL-2Rβ(IL-2受體β亞基)結(jié)合域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)突變。
在突變體IL-15多肽含有取代另一個(gè)多肽的一個(gè)氨基酸殘基的取代情形下，取代可以是，但不必需是保守取代，它包括以下基團(tuán)的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
代替使用的，或除了使用的之外，IL-15靶向多肽(例如，突變體IL-15多肽)，治療劑可以是抗體。例如，以抗體靶向(即，特異性的結(jié)合)IL-15。同樣地，以結(jié)合IL-15R成分(例如，IL-15Rα亞基)的抗體靶向IL-15R。產(chǎn)生相對(duì)于IL-15R成分的抗體，包括人源抗體，的方法是本領(lǐng)域公知的?？贵w優(yōu)選能夠激活補(bǔ)體和噬菌作用，例如，人IgG3和IgG1(優(yōu)選后者)小類，或鼠IgG2a小類。
還可以用組合物實(shí)施本發(fā)明的方法，它含有(a)兩種或多種制劑，每一種促進(jìn)T細(xì)胞死亡，或(b)至少一種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑和至少一種抑制T細(xì)胞增殖的制劑。促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑可通過促進(jìn)被動(dòng)細(xì)胞死亡而生效，被動(dòng)細(xì)胞死亡發(fā)生在除去T細(xì)胞存活所必需的因子時(shí)。IL-15是這樣一種因子(其它的如下所述)。因此，妨礙IL-15用作存活因子能力的制劑(例如，特異性結(jié)合IL-15或IL-15受體的抗體)可包含在本發(fā)明的組合物內(nèi)(例如，組合物可包括促進(jìn)AICD的制劑，促進(jìn)被動(dòng)細(xì)胞死亡的制劑(例如，抗-IL-15抗體)，和，任選地，抑制T細(xì)胞增殖的制劑)。
如上所述，用于獲得免疫抑制的制劑含有兩個(gè)功能部分制劑靶向帶有IL-15R的細(xì)胞(例如剛剛描述的突變體IL-15分子)的靶向部分，和靶細(xì)胞清除部分，例如裂解或另外導(dǎo)致帶有IL-15R的細(xì)胞損耗的功能區(qū)。因此，這種制劑可以是嵌合多肽，它包括突變體IL-15多肽和異種多肽，例如IgG和IgM抗體亞類的Fc區(qū)。Fc區(qū)可包括抑制補(bǔ)體結(jié)合和Fc受體結(jié)合的突變，或者它是清除靶細(xì)胞的結(jié)構(gòu)(即，通過結(jié)合補(bǔ)體或通過另一機(jī)理，例如依賴抗體的補(bǔ)體裂解來破壞細(xì)胞)。
Fc區(qū)可從天然來源中分離，被重組或合成(可以是如本發(fā)明表征的任何多肽)。例如，同源于IgG C-末端域的Fc區(qū)可用木瓜蛋白酶消化IgG而得到。IgG Fc具有大約50kDa的分子量。本發(fā)明的多肽包括整個(gè)的Fc區(qū)，或保留裂解細(xì)胞能力的較小部分。此外，全長(zhǎng)或片段Fc區(qū)可以是野生型分子的變體。換言之，它們可以包含可能或不會(huì)影響多肽功能的突變。
此處涉及到″靶″白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體的制劑。靶向發(fā)生在制劑以影響白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體活性的方式，與白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體直接或間接結(jié)合，或相互作用?；钚钥捎杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員且以常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法評(píng)價(jià)。例如，人們可評(píng)價(jià)信號(hào)傳導(dǎo)的強(qiáng)度，或者評(píng)價(jià)受體結(jié)合之后發(fā)生或通常會(huì)發(fā)生的另一下游生物現(xiàn)象。靶向白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體的制劑產(chǎn)生的活性可以，但非必需地，不同于天然的白細(xì)胞介素結(jié)合天然的白細(xì)胞介素受體時(shí)產(chǎn)生的活性。例如，即使該制劑實(shí)質(zhì)上產(chǎn)生的活性和天然IL-2結(jié)合受體產(chǎn)生的活性一樣，靶向IL-2受體的制劑也落入本發(fā)明的范圍。當(dāng)制劑產(chǎn)生基本上等于或大于天然配體產(chǎn)生的活性時(shí)，該制劑被稱為受體激動(dòng)劑(該制劑和天然配體在同樣條件下檢查)。當(dāng)制劑產(chǎn)生活性小于天然配體產(chǎn)生的活性時(shí)，該制劑被稱為受體(如果制劑的初始相互作用是和受體；例如，mIL-15)或白細(xì)胞介素(如果制劑的初始相互作用是和白細(xì)胞介素；例如，抗-EL-15抗體)拮抗劑。活性水平是在同樣條件下試驗(yàn)制劑和天然受體(或配體)而評(píng)價(jià)。
可以是本發(fā)明制劑一部分的Fc區(qū)是″清除靶細(xì)胞″或″不清除靶細(xì)胞″的結(jié)構(gòu)。不清除靶細(xì)胞的Fc區(qū)通常缺乏高親和性Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′lq結(jié)合位點(diǎn)。鼠IgG Fc的高親和性Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括IgG Fc的235位置的Leu殘基。因此，通過突變或刪除Leu 235可破壞鼠Fc受體結(jié)合位點(diǎn)。例如，Glu代替Leu 235會(huì)抑制Fc區(qū)結(jié)合高親和性的Fc受體的能力。通過IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基的突變或刪除可在功能上破壞鼠C′lq結(jié)合位點(diǎn)。例如，Ala殘基取代Glu 318，Lys 320，和Lys 322使得IgG1 Fc不能指導(dǎo)依賴抗體的補(bǔ)體裂解。相反，清除靶細(xì)胞的IgG Fc區(qū)具有高親和性的Fc受體結(jié)合位點(diǎn)和C′lq結(jié)合位點(diǎn)。高親和性的Fc受體結(jié)合位點(diǎn)包括IgG Fc的235位置的Leu殘基，并且C′lq結(jié)合位點(diǎn)包括IgG1的Glu 318，Lys 320，和Lys 322殘基。清除靶細(xì)胞IgG Fc在這些位點(diǎn)具有野生型殘基或保守的氨基酸取代。缺失IgG Fc的靶細(xì)胞能靶向細(xì)胞進(jìn)行抗體依賴的細(xì)胞細(xì)胞毒性或補(bǔ)體主導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)。人IgG適當(dāng)?shù)耐蛔円彩且阎?參見，例如，例如，Morrison等，The Immunologist 2119-124，1994；和Brekke等，The Immunologist 2125，1994)。
靶向IL-15R的制劑可以是突變體IL-15多肽，任意地融合抗原標(biāo)記(例如，F(xiàn)LAG序列)。如本文所述，F(xiàn)LAG序列由生物素化、高特異性、或抗FLAG抗體識(shí)別(還參見Blanar等，Science 2561014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898145，1992)。
此外，可溶的IL-15Rα鏈可用作拮抗劑。而由αβγ亞基組成的IL-15受體復(fù)合物，其中的α鏈單獨(dú)表現(xiàn)出對(duì)IL-15的高親和性。因此，可溶的IL-15Rα鏈會(huì)結(jié)合IL-15，并防止IL-15結(jié)合至細(xì)胞表面-結(jié)合IL-15R的復(fù)合物。因此，可溶的IL-15Rα鏈充當(dāng)受體特異性拮抗劑。
可溶的IL-15Rα鏈的構(gòu)建包括從帶有受體的細(xì)胞中克隆IL-15Rα鏈的細(xì)胞外片段，例如激活的T細(xì)胞或者表達(dá)受體的細(xì)胞系，并且任選地將它融合到分子標(biāo)記序列上。標(biāo)記序列可以是例如，F(xiàn)LAG、GST或組氨酸。表達(dá)載體中的基因構(gòu)建子能被轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞系中。由表達(dá)細(xì)胞系產(chǎn)生的標(biāo)記的可溶IL-15Rα鏈會(huì)采用特異于標(biāo)記序列的mAb純化。此外，IL-15R胞外域能連接(例如，通過肽鍵融合)至免疫球蛋白Fc域(例如免疫球蛋白G的絞鏈，CH2和CH3域)，優(yōu)選IgG或IgM亞型。這樣一種融合蛋白會(huì)以適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型表達(dá)，它們中的許多是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
靶向IL-2或IL-2受體的制劑為了抑制免疫應(yīng)答，上述靶向帶有IL-15R的細(xì)胞的制劑，可和靶向IL-2或IL-2R的制劑一起給藥。與另一種一起給藥的制劑可以是，但非必需，同時(shí)或以同樣的方式給藥(涉及IL-2的制劑的討論的上下文中闡明了這個(gè)注解，它適用于在本發(fā)明的組合物中聯(lián)合的任何制劑或分子)。例如，靶向IL-15R的制劑可以在靶向IL-2R的制劑之前或之后給藥。同樣地，靶向IL-15或IL-15R的制劑可以體外給藥(治療，例如，預(yù)定移植的細(xì)胞、組織或器官)，同時(shí)靶向IL-2或IL-2R的制劑對(duì)病人(例如已經(jīng)接受以靶向IL-15的制劑體外治療的移植物的病人)全身給藥(例如，靜脈內(nèi))。同樣地，與抑制細(xì)胞增殖的制劑相比，人們可以在不同時(shí)間或以不同方式服用促進(jìn)AICD的制劑。因此，本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的組合物中聯(lián)合的任何制劑或類型的分子可以分別給藥。
為了抑制IL-2R，人們可服用任何結(jié)合且拮抗IL-2或IL-2R的制劑。靶向IL-2或IL-2R的制劑包括結(jié)合IL-2或IL-2R的制劑，以及結(jié)合且隨后破壞帶有IL-2R的細(xì)胞(例如激活的T細(xì)胞)的制劑。如上所述在IL-15靶向的上下文中，用于獲得免疫抑制的制劑包含將制劑靶向帶有IL-2R的細(xì)胞的功能區(qū)，以及包含導(dǎo)致帶有IL-2R的細(xì)胞消失的清除靶細(xì)胞(例如，裂解)的功能區(qū)。例如，靶向功能部分結(jié)合IL-2R，而不會(huì)通過該受體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。在該現(xiàn)象中，包括Fc區(qū)，該區(qū)可從上述同樣的免疫球蛋白分子中獲得。
靶向制劑，例如IL-2/Fc制劑(例如，參見Zheng等，J.Immunol.1634041-4048，1999)能夠和阻止IL-2介導(dǎo)的IL-2R信號(hào)傳導(dǎo)的制劑一起給藥，例如雷帕霉素。抑制細(xì)胞增殖的制劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的(以下進(jìn)一步討論)。代替使用的，或除了使用的IL-2R靶向多肽(例如，IL-2多肽)之外，與IL-15拮抗劑組合使用的治療劑可以分別是拮抗IL-2或IL-2R的抗-IL-2或抗-IL-2R抗體(例如，人源抗體)。
如上說明，本發(fā)明的方法(例如，抑制免疫應(yīng)答(例如，細(xì)胞免疫應(yīng)答)的方法，抑制移植排斥的方法和治療癌癥的方法)也可以以組合物(例如，藥學(xué)上可接受的組合物)實(shí)施，該組合物含有(a)兩種或多種制劑，它們的每一種都能促進(jìn)T細(xì)胞死亡，或(b)至少一種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑和至少一種抑制T細(xì)胞增殖的制劑。促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑可通過促進(jìn)AICD(激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡)來實(shí)現(xiàn)，這種制劑包括IL-2和作為IL-2激動(dòng)劑的分子。例如，本發(fā)明的組合物可包括IL-2/Fc，保留經(jīng)IL-2受體結(jié)合和傳導(dǎo)信號(hào)能力的IL-2突變體，和特異性結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)IL-2受體的抗體(例如，特異性結(jié)合IL-2受體亞基的抗體)。其它促進(jìn)AICD的制劑包括Fas配體(FasL)，它通過在激活的T細(xì)胞和其生物學(xué)上的活性突變體上，激活Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)而刺激T細(xì)胞死亡。
促進(jìn)被動(dòng)細(xì)胞死亡的制劑T細(xì)胞失去其存活必需的因子時(shí)，被動(dòng)T細(xì)胞死亡發(fā)生。除了IL-15外，包括IL-4、IL-7、OX-40配體、IFNβ、41BB和IGF-I在內(nèi)的因子是必需的(即，在缺少這些因子中的每一種時(shí)T細(xì)胞都會(huì)死亡；參見，例如，Tu等，J.ImmunoL 1651331-1336，2000；Tsudaetal.，JImmzmol.Meth.23637-51，2000；Bertolino等，Int.ImmunoL 111225-1238，1999；Takahash等，J.ImmunoL 1625037-5040，1999；Pilling等，Eur.J.Immunol.291041-1050，1999；Chu等，J Immunol.1621896-1903，1999；and Weinberg等，Semiz Immunol.10471-480，1998)。人們通過，例如，在體內(nèi)或培養(yǎng)物中將細(xì)胞暴露于選擇性結(jié)合一種或多種這些因子的制劑，或另外阻止它們?nèi)缤ǔＲ粯优cT細(xì)胞相互作用的制劑，則可使T細(xì)胞失去這些因子中的一種或多種(IL-15，IL-4，IL-7等)(除去這些因子的結(jié)果是被動(dòng)細(xì)胞死亡)。
促進(jìn)ADCC或CDC的制劑ADCC和CDC可通過能結(jié)合T細(xì)胞表面并且包含激活A(yù)DCC或CDC的免疫球蛋白分子的Fc部分的制劑引起。這種制劑的例子包括能夠與激活的免疫細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)結(jié)合(例如，細(xì)胞表面受體，如CD154，IL-2受體，和IL-15受體)的抗體。此外，人們可使用配體/Fc嵌合融合蛋白，它結(jié)合激活的細(xì)胞表面上的受體蛋白(例如，IL-2/Fc或mIL-15/Fc)。由舉出的這些例子，其它適合的制劑對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是明顯的。
抑制細(xì)胞增殖的制劑抑制細(xì)胞增殖的制劑包括雷帕霉素(Sirolimus)、霉酚酸酯(MMF)，硫唑嘌呤(azathioprine)和任何其它的已知用于過增殖性疾病(例如癌癥)治療的制劑。良好定義的化學(xué)治療劑包括抑制核酸代謝的制劑(例如嘌呤和嘧啶生物合成抑制劑、RNA合成抑制劑和DNA結(jié)合、DNA修飾或插入劑)。當(dāng)組合物用于，例如，抑制免疫應(yīng)答時(shí)這些制劑是特別有效的，也包含如IL-2/Fc的制劑，它不僅能促進(jìn)AICD，而且還能刺激T細(xì)胞增殖。
抑制細(xì)胞增殖的制劑還包括葉酸抗代謝產(chǎn)物，例如氨甲喋呤(MTX)和乙胺嘧啶；嘌呤抗代謝產(chǎn)物(例如6-巰基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤)以及嘧啶拮抗劑，如阿糖孢苷(ara-C)，5-氮胞苷，和5-氟尿嘧啶(以上述及這些種類)；烷基化和其它的DNA-連接劑(例如，環(huán)磷酰胺(CPA)；絲裂霉素C，和阿霉素(亞德里亞霉素))；長(zhǎng)春堿(例如，長(zhǎng)春新堿)；和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(例如，環(huán)孢霉素A，F(xiàn)K506，和布喹那)。
其它的可用于抑制細(xì)胞增殖的制劑包括直接干擾涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的蛋白(例如抗-CDKs(細(xì)胞分裂激酶)或抗-細(xì)胞周期蛋白)或影響細(xì)胞增殖關(guān)卡(check points)(所有增殖細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同階段都具有關(guān)卡，以便在它們結(jié)束先前步驟之前，防止它們進(jìn)入下一細(xì)胞分裂周期階段(CDC)的)的蛋白的制劑。注入關(guān)卡調(diào)控的路徑包括DNA-，RNA-和蛋白-合成抑制劑(例如，S6激酶和PI-3-激酶抑制劑)。還可以使用胞質(zhì)分裂抑制劑。
篩選抑制免疫應(yīng)答制劑的方法除了在以下實(shí)例描述的體外檢測(cè)中試驗(yàn)候選制劑(例如，突變體IL-15或IL-2多肽)之外，人們還可采用以下任何體內(nèi)檢測(cè)，以試驗(yàn)本文描述的哪一種具體組合的制劑最能有效地產(chǎn)生免疫抑制。例如，人們可以試驗(yàn)一種或多種靶向IL-15R的制劑與一種或多種拮抗IL-2或其受體的制劑的組合。這些體內(nèi)檢測(cè)僅僅表示某些常規(guī)方法，其中本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能進(jìn)一步試驗(yàn)本發(fā)明制劑的功效。由于它們與適合采用靶向IL-2、IL-15和它們的受體的制劑治療的各種的臨床條件的關(guān)聯(lián)性，在此將它們包含進(jìn)來。例如，與器官移植、免疫疾病(尤其是自身免疫性疾病)、移植物抗宿主病和免疫系統(tǒng)癌癥(例如，T細(xì)胞成為惡性時(shí)發(fā)生的癌癥)相關(guān)的檢測(cè)。
移植范例為了確定本發(fā)明的制劑的組合是否能實(shí)現(xiàn)免疫抑制，在上下文的良好建立的移植范例中給予(或者直接地，通過基因治療，或者通過細(xì)胞水平的治療)這種組合。
在對(duì)動(dòng)物實(shí)施同種異體或異種皮膚移植、器官移植或者細(xì)胞移植之前，本發(fā)明的制劑，編碼它們的核酸分子(或與它們雜交，由此抑制它們)，可通過標(biāo)準(zhǔn)方式全身或局部給予任何常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，例如大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或狗。小鼠的品系，如C57B1-10，B10.BR，和B10.AKM(Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor，ME)，它們具有同樣的基因背景，但是錯(cuò)配于H-2部位，非常適于評(píng)價(jià)各種器官移植。
心臟移植Ono等首先公布了通過供體心臟與宿主腹部大脈管吻合實(shí)施心臟移植的方法(J.Thorac.Cardiolsasc.Surf.57225，1969；還參見Corry等，Transplantation 16343，1973)。用這種外科手術(shù)的方法，采用標(biāo)準(zhǔn)的微血管技術(shù)使供體心臟的主動(dòng)脈與宿主腹部主動(dòng)脈吻合，供體心臟的肺動(dòng)脈與毗鄰的腔靜脈吻合。一旦在適當(dāng)?shù)奈恢靡浦残呐K且以林格乳酸鹽溶液加熱至37℃，則可恢復(fù)正常的室性節(jié)律?？赏ㄟ^腹壁的心室收縮來經(jīng)常評(píng)價(jià)移植心臟的功能。排斥被定義為心肌收縮的停止。如果接受這些制劑的宿主，與未接收治療的宿主相比，能經(jīng)受更長(zhǎng)時(shí)期的植入供體心臟，則本發(fā)明的制劑(例如，突變體IL-15/Fc和結(jié)合并抑制IL-2或IL-2R的抗體的組合物，或者突變體IL-15/FC，IL-2/Fc，和雷帕霉素的組合物)被認(rèn)為在減少器官排斥中有效。
皮膚移植本發(fā)明制劑的各種組合物的效力還可通過皮膚移植進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了在嚙齒動(dòng)物上實(shí)施皮膚移植，將一供體動(dòng)物麻醉，從尾部部分除去全部厚度皮膚。麻醉受體動(dòng)物，從剃過的橫腹部上除去一片皮膚以預(yù)備移植床。通常，這片皮膚大小近似0.5×0.5cm。供體的皮膚制成適合移植床的形狀，安置，以紗布覆蓋，并包扎。在手術(shù)日后第6天開始每天檢查移植物，當(dāng)超過一半的移植上皮顯示不能存活時(shí)則認(rèn)為排斥。如果接受這些制劑的宿主，與未接收治療的宿主相比，能經(jīng)受更長(zhǎng)時(shí)期的植入供體皮膚，則本發(fā)明的制劑(例如，突變體IL-15/Fc和結(jié)合且抑制IL-2或L-2R的抗體的組合物，或者突變體IL-15/FC，IL-2/Fc，和雷帕霉素的組合物)會(huì)被認(rèn)為在減少器官排斥中有效。
實(shí)施例(以下)中描述并且附圖12概述了皮膚移植試驗(yàn)的典型例子，它的結(jié)果證明含有IL-2/Fc，mIL-15/Fc和雷帕霉素的組合物的有效。
胰島同種異體移植模型DBA/2J胰島細(xì)胞同種異體移植可被移植入嚙齒動(dòng)物，例如6-8周齡B6 AF1小鼠，該鼠通過一次腹膜內(nèi)注射鏈佐星(225mg/kg；SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)患上了糖尿病。作為對(duì)照，同系胰島細(xì)胞移植物移植入糖尿病小鼠。依出版的方案進(jìn)行胰島細(xì)胞移植(例如，參見Gotoh等，Transplantation 42387，1986)。簡(jiǎn)要地，以IV型膠原酶原位灌注供體胰腺(2mg/ml；Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ)。37℃消化40分鐘之后，以不連續(xù)的Ficoll梯度分離胰島。隨后，將300-400胰島移植到每個(gè)受體腎囊下。系列血糖測(cè)量后面是同種異體移植功能(Accu-CheckIJITM；Boehringer，Mannheim，德國(guó))。初始移植功能定義為移植3天后血糖水平在11.1 mmol/l以下，移植排斥定為初始移植功能期后，血糖升高超過16.5mmol/l(每個(gè)至少2個(gè)連續(xù)工作日)。
自身免疫性疾病模型自身免疫性疾病模型提供了另一種體內(nèi)評(píng)價(jià)本發(fā)明的制劑組合物的方式。這些模型對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的，并且可用于確定給定的制劑組合物在治療特異性自身免疫性疾病中是否有效，例如，靶向IL-15R的制劑，在直接地，經(jīng)基因治療，或者經(jīng)細(xì)胞水平治療時(shí)，是否對(duì)特異性自身免疫性疾病有效。
已經(jīng)有動(dòng)物模型的自身免疫性疾病包括風(fēng)濕性疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和全身性紅斑狼瘡(SLE)，I型糖尿病，以及甲狀腺、腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病。例如，SLE動(dòng)物模型包括MRL小鼠、BXSB小鼠，和NZB小鼠以及它們的F1雜種。為了研究風(fēng)濕疾病過程的特別方面，雜交這些動(dòng)物；與NZW小鼠雜交時(shí)NZB系子代發(fā)生嚴(yán)重的狼瘡性腎小球性腎炎(Bielschowsky等，Proc.Unit.Otago Med.Sch.379，1959；還參見Fundamental Immunology，Paul，Ed.，Raven Press，New York，NY，1989)。同樣地，在NBZ X SWR交配的子代中可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移成致使的腎炎(Data等，Nature 263412，1976)。已經(jīng)良好表征了SNF1小鼠中腎損害組織學(xué)外表(Eastcott等，J.Imm2mol.1312232，1983；還參見FundamentalImmunology，supra)。因此，動(dòng)物的總體健康以及腎組織的組織學(xué)外表可用于確定靶向IL-15R的制劑，例如靶向IL-2R的制劑給藥后能否有效地抑制SLE動(dòng)物模型中的免疫反應(yīng)。
發(fā)生SLE、MRL-lpr/lpr的MRL系小鼠中的一只，還發(fā)生了一種形式的類似人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎(Theofilopoulos等，Adv.Immunol.37269，1985)。此外，通過尾部注射1∶1混合Freund完全佐劑的大鼠II型膠原(2mg/ml)(總計(jì)100μl)，在嚙齒動(dòng)物中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎。免疫后2-3周發(fā)生關(guān)節(jié)炎?？赏ㄟ^靶向T淋巴細(xì)胞的核酸分子，來評(píng)價(jià)編碼本發(fā)明制劑的核酸分子(例如，靶向IL-15R的制劑和靶向Il-2R的制劑或者結(jié)合和滅活抗原-激活T細(xì)胞的制劑)抑制免疫應(yīng)答的能力。靶向T淋巴細(xì)胞的一種方式如下。在關(guān)節(jié)炎開始之后2-3天制備脾細(xì)胞懸浮液，并以膠原培養(yǎng)(100μg/ml)48小時(shí)以誘導(dǎo)膠原激活T細(xì)胞的增殖。此時(shí)間期間，用編碼所需多肽制劑的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。作為對(duì)照，生長(zhǎng)平行培養(yǎng)物不轉(zhuǎn)導(dǎo)，或以″空″載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。接著腹膜內(nèi)注射這些細(xì)胞(5×107細(xì)胞/動(dòng)物)。通過隨后2周期間的疾病癥狀評(píng)價(jià)治療的效力，如Chernajovsky等所述(Gene Therapy2731-735，1995)。與對(duì)照組相比，較少的癥狀表明本發(fā)明的聯(lián)合制劑，和編碼它們的核酸分子起到了免疫抑制作用，并且因此在免疫疾病，特別是自身免疫性疾病的治療中有效。
在BB大鼠系上試驗(yàn)I型糖尿病的情形下，各種組合的制劑抑制免疫應(yīng)答的能力，該鼠系產(chǎn)生于Ottawa Bio-Breeding實(shí)驗(yàn)室的Wistar大鼠商業(yè)群體。這些大鼠自發(fā)地產(chǎn)生抗胰島細(xì)胞和胰島素的自身抗體，正如發(fā)生在人I型糖尿病中的。此外，NOD(非肥胖性糖尿病)小鼠可用作模型系統(tǒng)。在下文和附圖11中概述了實(shí)驗(yàn)的典型例子，其中NOD小鼠在同種異體供體胰島移植之后血糖水平復(fù)原。該動(dòng)物以IL2/Fc，IL-15/Fc，和雷帕霉素的組合治療。結(jié)果是長(zhǎng)期移植。
已經(jīng)在小雞中制造了甲狀腺的自身免疫性疾病模型。肥胖系(OS)小雞連續(xù)發(fā)生類似橋本甲狀腺炎(hashimoto′s disease)的自發(fā)自身免疫甲狀腺炎(Cole等，Science 1601357，1968)。這些禽中的約15％產(chǎn)生對(duì)胃壁細(xì)胞的自身抗體，正如在自身免疫性甲狀腺炎的人對(duì)應(yīng)物中一樣。OS小雞中疾病的表現(xiàn)，包括體格大小、脂肪沉積、血脂、寒冷敏感度和不育癥，都能在任何治療方案的過程中被監(jiān)控。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)上的自身免疫性疾病模型可被實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)。會(huì)引起麻痹的CNS炎癥，可通過在許多不同的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中一次注射含有佐劑的腦或脊髓組織來誘導(dǎo)，這些動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類。這種模型稱為實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，它是T細(xì)胞介導(dǎo)。同樣地，通過一次注射有佐劑的乙酰膽堿受體可產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)重癥肌無力(Lennon等，Afin.N.Y.Acad.Sci.274283，1976)。
在IL-2或IL-10″剔除″小鼠，或者在接受含牛血清白蛋白灌腸的小鼠中，建立消化道自身免疫性疾病模型。
編碼本發(fā)明制劑的核酸分子本發(fā)明的多肽制劑，包括那些融合蛋白(例如，突變體IL-15/Fc和IL-2/Fc分子)，不僅能通過在體外適當(dāng)?shù)恼婧嘶蛟吮磉_(dá)系統(tǒng)中經(jīng)核酸的表達(dá)并且隨后純化該多肽制劑獲得，而且還可通過編碼核酸分子的適當(dāng)?shù)幕蛑委煴磉_(dá)載體對(duì)病人給藥。此外，核酸在移植物移植之前可引入移植物細(xì)胞。因此，編碼上述制劑的核酸分子在本發(fā)明的范圍內(nèi)。正如本發(fā)明的多肽可依照它們和野生型多肽的同一性來描述，編碼它們的核酸分子和編碼相應(yīng)野生型多肽的核酸必需具有某些同一性。例如，編碼突變體IL-15多肽的核酸分子至少65％等同于編碼野性型IL-15的核酸，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少95％(例如，96％，97％，98％，或99％)。對(duì)于核酸，比較的序列長(zhǎng)度通常會(huì)是至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸，最優(yōu)選110個(gè)核苷酸。
編碼本發(fā)明制劑的核酸分子包含天然序列，或者由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，不同于天然的核酸但是編碼同樣多肽的序列。這些核酸分子由RNA或DNA(例如，基因組DNA，cDNA，或合成DNA，例如由亞磷酰胺基合成產(chǎn)生)，或這些類型核酸內(nèi)組合或修飾的核苷酸組成。此外，核酸分子可以是雙鏈或單鏈(即，或者有義或者反義鏈)。
本發(fā)明的核酸分子被稱為″分離的″，由于它們由或者5′或者3′編碼序列分離，在天然基因組的生物中它們是直接連接的。因此，核酸分子不限于編碼多肽的序列；還包括位于編碼序列上游或下游的非編碼序列部分或全部。分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟悉分離核酸分子的常規(guī)方法。例如，他們可以用限制性內(nèi)切酶處理基因組產(chǎn)生，或者通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情形下，分子可由體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。
本發(fā)明分離的核酸分子包括天然狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)的片段。因此，本發(fā)明包括重組分子，例如其中核酸序列(例如，編碼突變體IL-15的序列)摻入載體(例如，質(zhì)?；虿《据d體)或摻入異源細(xì)胞基因組(或者同源細(xì)胞基因組，在非天然染色體位置)。
如上所述，本發(fā)明的制劑可以是融合蛋白。除了，或代替上述的異源多肽，編碼本發(fā)明制劑的核酸分子還包含編碼″標(biāo)記″或″報(bào)告基因″的序列。標(biāo)記或報(bào)道基因的例子包括β-內(nèi)酰胺酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，腺苷脫氨酶(ADA)，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo1，G4181)，二氫葉酸還原酶(DHFR)，潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)，胸苷激酶(TK)，lacZ(編碼β-半乳糖苷酶)，和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)。由于許多標(biāo)準(zhǔn)方法與本發(fā)明的實(shí)踐有關(guān)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到另外有益的試劑，例如適合標(biāo)記或報(bào)道基因功能的另外序列。
本發(fā)明的核酸分子可通過在本發(fā)明的制劑(例如，IL-15分子或IL-2分子)中引入突變而獲得，其中本發(fā)明的制劑可以是從任何生物細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中獲得，或者由常規(guī)克隆方法制備得到。因此，本發(fā)明的核酸可以是小鼠、大鼠、豚鼠、母牛、綿羊、馬、豬、兔、猴、狒狒、狗或貓的。優(yōu)選地，核酸分子是人的。
上述的核酸分子可包含在能夠使它們表達(dá)的載體內(nèi)，例如，已經(jīng)被載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。因此，除了多肽制劑之外，含有編碼那些制劑的核酸分子的表達(dá)載體和用那些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在優(yōu)選的實(shí)施方案之中。
適用于本發(fā)明的載體包括適用于細(xì)菌的T7-載體(T7-based vector)(參見，例如，Rosenberg等，Gene 56125，1987)，適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的pMSXND表達(dá)載體(Lee和Nathans，A Biol.Chem.2633521，1988)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，例如畢赤酵母(Pichia pastoris)(例如Invitrogen的PICZ族的表達(dá)載體，Carlsbad，CA)和適用于昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒衍生載體(例如Clontech的表達(dá)載體pBacPAK9，Palo Alto，CA)。在這樣的載體中，編碼所需特定多肽的核酸插入物能夠可操作地與啟動(dòng)子連接，啟動(dòng)子是根據(jù)例如表達(dá)所需的細(xì)胞類型選擇的。例如，T7啟動(dòng)子可用于細(xì)菌中，多角體蛋白啟動(dòng)子可用于昆蟲細(xì)胞中，細(xì)胞肥大病毒或金屬硫蛋白啟動(dòng)子可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使。同樣，在高等真核生物的情形下，組織特異性和細(xì)胞型特異性啟動(dòng)子是廣泛有效的。如此命名這些啟動(dòng)子，是由于它們指導(dǎo)核酸在體內(nèi)給定的組織或細(xì)胞類型中表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能很好地意識(shí)到各種啟動(dòng)子和其它的能用于指導(dǎo)核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。
除了促進(jìn)插入核酸分子轉(zhuǎn)錄的序列之外，載體包含復(fù)制起點(diǎn)和其它編碼可選擇標(biāo)記的基因。例如，新霉素耐藥性(neo1)基因使得表達(dá)它的細(xì)胞具有G418抗性，因此允許轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表型選擇。其它的允許細(xì)胞表型選擇的可行選擇標(biāo)記基因包括熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)和其變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定給定的調(diào)節(jié)元件或選擇標(biāo)記是否適用于具體的實(shí)驗(yàn)中。
用于本發(fā)明的病毒載體包括，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)載體、皰疹病毒、猴病毒40(SV40)和牛乳頭瘤病毒載體(參見，例如，Gluzman(Ed.)，真核Viral Vectors，CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約)。
含有編碼本發(fā)明制劑的核酸分子和在體外表達(dá)該核酸分子編碼的蛋白的原核或真核細(xì)胞也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的細(xì)胞是轉(zhuǎn)染細(xì)胞，即，通過重組DNA技術(shù)在細(xì)胞中引入核酸分子，例如編碼變體IL-15多肽的核酸分子。這種細(xì)胞的子代也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。表達(dá)系統(tǒng)的精確組分不是關(guān)鍵的。例如，突變體IL-15多肽可以在原核宿主，例如細(xì)菌E.coli，或真核宿主，例如昆蟲細(xì)胞(例如，Sf21細(xì)胞)，或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞，CHO細(xì)胞，293細(xì)胞，NIH 3T3細(xì)胞，或HeLa細(xì)胞)中生產(chǎn)。這些細(xì)胞可從多種渠道獲得，包括美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American TypeCulture Collection，Manassas，VA)。在選擇表達(dá)系統(tǒng)中，重要性僅在于該組分相互兼容。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠進(jìn)行這種測(cè)定。此外，如果在選擇表達(dá)系統(tǒng)中需要指導(dǎo)，可查閱Ausubel等(Cztrrent Protocols in MolecitlarBiology，John Wiley and Sons，紐約，NY，1993)和Pouwels等(CloningVectorsA Laboratory Manual，1985 Suppl.1987)。
含有編碼本發(fā)明制劑的核酸分子，并且在體內(nèi)表達(dá)該核酸分子編碼的蛋白的真核細(xì)胞也是本發(fā)明的特征。
此外，本發(fā)明的真核細(xì)胞是為細(xì)胞移植、組織或器官移植的一部分的細(xì)胞。這樣的移植物包括或者取自供體組織的原始細(xì)胞，或者在移植入受體生物之前，體外培養(yǎng)、修飾和/或選擇的細(xì)胞(例如，真核細(xì)胞系，包括干細(xì)胞或祖細(xì)胞)。由于移植入受體生物之后，會(huì)發(fā)生細(xì)胞增殖，這樣的子代細(xì)胞也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。細(xì)胞作為細(xì)胞、組織或器官移植的一部分，可以用編碼突變體IL-15多肽的核酸轉(zhuǎn)染，并且隨后移植入受體生物中來表達(dá)突變體IL-15多肽。此外，這樣的細(xì)胞可包含一種或多種額外的核酸構(gòu)建子，它允許在移植入受體生物之前應(yīng)用選擇步驟，核酸構(gòu)建子可以是例如特異性細(xì)胞譜系或細(xì)胞類型。
表達(dá)的多肽可由表達(dá)系統(tǒng)采用常規(guī)的生化方法純化，并且如下所述，可用作診斷工具或作為治療劑。
靶向IL-15R的制劑在進(jìn)行診斷中有用靶向IL-15R的制劑可用于測(cè)定病人是否具有適于本文描述的組合制劑治療的疾病(例如，免疫疾病，尤其自身免疫性疾病)。例如，通過由懷疑具有免疫疾病，尤其自身免疫性疾病，或表現(xiàn)為惡性免疫細(xì)胞的癌的病人的組織中采樣，接著暴露該組織于靶向IL-15R的抗原標(biāo)記的多肽中，以實(shí)施診斷。樣品是任何生物樣品，例如血液、尿、血清或血漿樣品。此外，樣品可以是組織樣品(例如，生檢組織)，或關(guān)節(jié)滲出液(例如，滑液)、腹腔(例如，腹水)、胸腔(例如，胸膜腔積液)，或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲出液(例如，腦脊液)。該樣品還包括最初得自病人的培養(yǎng)細(xì)胞(例如，外周血單核細(xì)胞)。該樣品可以取自哺乳動(dòng)物，例如病人。如果該樣品包含的細(xì)胞能被它們所暴露的制劑結(jié)合，那么極有可能它們會(huì)由那種制劑(例如，靶向IL-15R的制劑)體內(nèi)結(jié)合且因此被體內(nèi)抑制增生或破壞，這是很可能的。侯選病人表現(xiàn)的適于這種試驗(yàn)的癥狀和給出具體一組癥狀的取樣的相關(guān)組織對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。
順從治療的病人本發(fā)明的組合物在抑制涉及抗原的免疫應(yīng)答或可能涉及抗原的免疫應(yīng)答的T細(xì)胞中有效；本發(fā)明化合物還可有效抑制包含于免疫學(xué)疾病的致病原因中的其它細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，和其它位于細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞中的抗原)；和破壞過增殖細(xì)胞(例如，在包含于免疫學(xué)疾病的組織中，例如關(guān)節(jié)成纖維細(xì)胞(它在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中受影響)角質(zhì)化細(xì)胞(它在牛皮癬中受影響)，或皮膚纖維原細(xì)胞(它在全身性紅斑狼瘡受影響)。給出這些例子，其它的可用作靶的細(xì)胞類型對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是明顯的。過增殖細(xì)胞也可以是癌性細(xì)胞(例如，惡性T細(xì)胞)。
因此，本發(fā)明的組合物可用于治療患有免疫疾病，特別是自身免疫性疾病的病人，它們包括但不限于以下(1)風(fēng)濕性疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡，斯耶格倫氏綜合征，硬皮病，混合性結(jié)締組織病，皮肌炎，多肌炎，萊特爾氏綜合征或貝切特氏??；(2)I型或II型糖尿病；(3)甲狀腺自身免疫性疾病，例如橋本甲狀腺炎或格雷夫斯氏病；(4)中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化，重癥肌無力，或腦脊髓炎；(5)各種天皰瘡(phemphigus)，例如尋常性天皰瘡，增殖性天皰瘡，落葉性天皰瘡，塞-阿二氏綜合征，或巴西天皰瘡；(6)皮膚病，例如牛皮癬或神經(jīng)性皮炎，和(7)炎癥性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩氏病)。本發(fā)明制劑的組合還可用于治療獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)。同樣地，這些制劑的給藥方法可用于治療已經(jīng)接受合成或生物材料，或者兩者組合移植的病人。這種移植可以是器官、組織或細(xì)胞移植，或者細(xì)胞接種的合成移植物，例如以血管細(xì)胞接種的合成移植物。此外，患有GVHD或已經(jīng)受到血管損傷的病人會(huì)受益于這種方法。
由于本發(fā)明包括清除靶細(xì)胞形式的靶向IL-15R(或IL-2受體，或IL-15或IL-15R和IL-2或IL-2R的組合)的制劑的給藥，它可能選擇性殺死自反應(yīng)或″移植破壞″的免疫細(xì)胞，而不量破壞正常T細(xì)胞。因此，本發(fā)明的特征在于提供了一種殺死體內(nèi)表達(dá)IL-15R的細(xì)胞的方法，它包括激化或自反應(yīng)或″移植破壞″免疫細(xì)胞或惡性細(xì)胞。該方法通過給予病人組合制劑，它包括靶向IL-15R且激活補(bǔ)體系統(tǒng)的制劑，通過ADCC機(jī)理裂解細(xì)胞、或另外殺死表達(dá)野生型IL-15受體復(fù)合物細(xì)胞的制劑。這種方法可用于治療患有IL-15R+白血病、淋巴瘤或其它IL-15R+惡性疾病，例如結(jié)腸癌的病人。
適于使用的制劑和給藥途徑本發(fā)明的方法和用于實(shí)現(xiàn)它們的治療組合物包含″充分純的″制劑。例如，在制劑是多肽的情形下，以所需的多肽重量計(jì)(干重)多肽至少是60％，例如，結(jié)合且破壞含IL-15R的細(xì)胞的多肽。優(yōu)選地，以需的制劑重量計(jì)，制劑(例如，肽)至少是75％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少99％。通過任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法，例如，柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳，或HPLC分析，可測(cè)量純度。
盡管用于本發(fā)明方法的制劑可從天然來源得到，它們還可合成或另外制造(例如，結(jié)合且破壞含IL-15R的細(xì)胞的制劑可通過重組核酸分子的表達(dá)生產(chǎn))。來源于真核生物或在E.coli或其它原核生物中合成的多肽，和化學(xué)合成的多肽實(shí)質(zhì)上不含它們天然相關(guān)成分。在多肽是嵌合體的情形下，它可通過含有一個(gè)編碼全部或部分制劑的序列(例如，編碼突變體IL-15多肽的序列和編碼IgG Fc區(qū)的序列)的雜交核酸分子編碼。本發(fā)明的制劑(例如，多肽s)可融合至六組氨酸標(biāo)記中以促進(jìn)細(xì)菌表達(dá)蛋白的純化，或者融合至紅細(xì)胞凝集素標(biāo)記中以促進(jìn)真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白的純化。
制備本發(fā)明的制劑需要的技術(shù)是本領(lǐng)域常規(guī)的，并且可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施，不需要求助于過度的實(shí)驗(yàn)。例如，IL-15內(nèi)由一種或多種氨基酸殘基取代形成的突變體可采用借助PCR的突變發(fā)生技術(shù)制得，如本文描述的制備突變體IL-15多肽，其中位置149和156的谷氨酰胺殘基變成天冬氨酸殘基。由氨基酸殘基缺失或添加組成的突變(對(duì)于IL-15多肽或任何一種本文描述的其它有用多肽，例如，抑制共刺激或結(jié)合激活T細(xì)胞的多肽)也可以標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)進(jìn)行。在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的制劑可和生理學(xué)上可接受的載體一起給藥，例如生理鹽水。本發(fā)明的治療組合物還包含載體或賦形劑，它們中的許多對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。使用的賦形劑包括緩沖劑(例如，枸椽酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液，醋酸鹽緩沖液，和碳酸氫鹽緩沖鹽)，氨基酸，尿素，乙醇，抗壞血酸，磷脂，蛋白質(zhì)(例如，血清白蛋白)，EDTA，氯化鈉，脂質(zhì)體，甘露醇，山梨醇，和甘油。本發(fā)明的制劑可以各種方式按照相應(yīng)的給藥途徑配制。例如，制備咽入或注射用液體溶液；制備咽入、吸入或局部施用的凝膠或粉末。制備這些制劑的方法是公知的，并且見于，例如，″Remington′s PharmaceuticalSciences.″。
給藥途徑對(duì)于熟練藥理學(xué)家和醫(yī)生也是公知的，并且包括腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)給藥。其它的途徑包括顱內(nèi)(例如，腦池內(nèi)或心室內(nèi))，眶內(nèi)，眼，囊內(nèi)，脊柱內(nèi)，腹膜內(nèi)，透粘膜，局部，皮下，和口服給藥。預(yù)計(jì)對(duì)于靶向IL-15受體的制劑給藥，靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)途徑是優(yōu)選的。皮下途徑也可經(jīng)常使用，因?yàn)槠は陆M織提供多肽穩(wěn)定的環(huán)境，它們從中可緩慢釋放。
在細(xì)胞水平治療(基因治療)的情形，細(xì)胞/組織/器官在用核酸組合物移植之前，可由培養(yǎng)、灌輸或灌注三者擇一地轉(zhuǎn)染，以表達(dá)治療蛋白，并且隨后由移植的細(xì)胞/組織/器官在受體生物內(nèi)釋放。同樣，細(xì)胞/組織/器官在移植之前與治療蛋白灌注或簡(jiǎn)單的培養(yǎng)來進(jìn)行預(yù)處理，以便消除粘著在供體細(xì)胞/組織/器官上的有關(guān)移植的免疫細(xì)胞(盡管這僅僅是次要方面，它或許不具有任何臨床相關(guān)性)。在細(xì)胞移植的情形下，細(xì)胞或者通過移植方法或者以導(dǎo)管介導(dǎo)的注射法經(jīng)血管壁給藥。某些情形下，細(xì)胞通過釋放入脈管系統(tǒng)給藥，從中通過血流分布和/或滲透進(jìn)入周圍組織(這在胰島細(xì)胞移植中實(shí)施，其中胰島細(xì)胞釋放入門靜脈并且隨后滲入肝臟組織)。
醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知，任何一名病人的劑量取決于許多因素，包括總體健康，性別，體重，體表面積，和病人年齡，以及給予的具體化合物，給藥的時(shí)間和途徑，和同時(shí)給予的其它藥物。本發(fā)明的多肽劑量會(huì)變化，但是靜脈內(nèi)給藥時(shí)，以大約1微克至10mg/kg體重的量或以大約0.01mg/l至100mg/l血液體積量的劑量給予。劑量可每天一次或多次給藥，如果需要的話可持續(xù)治療長(zhǎng)時(shí)期。確定適于給出用途的正確劑量正好在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
實(shí)施例試劑下列試劑用于本文描述的研究來源于Hoffman-La Roche(Nutley，NJ)的重組人IL-2；來源于Wyeth-Ayerst(Princeton，NJ)的雷帕霉素；來源于Sandoz(East Hanover，NJ)的環(huán)孢霉素-A(CsA)；來源于Bio Wittaker(Walkersville，MD)的RPMI-1640和胎牛血清；青霉素，鏈霉素，G418，和鏈霉和素(strepavidin)-RED670，來源于Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)；地塞米松，PHA，溶菌酶，Nonidet P-40，NaCl，HEPES，和PMSF，來源于Sigma(St.Louis，MO)；Ficoll-Hypaque，來源于Pharmacia Biotech(Uppsala，瑞典)；重組人IL-15和抗人IL-15 Ab，來源于PeproTech(Rocky Hill，NJ)；抗FLAG Ab和抗FLAG-親和玻珠，來源于International Biotechnologies，Inc.(Kodak，New Haven，CT)；pRcCMV，來源于InVitrogen Corporation(San Diego，CA)；染料木黃酮，來源于ICN Biomedicals(Irvine，CA)；二琥珀酰胺辛二酸鹽(DSS)，來源于Pierce(Rockford，IL)；限制性內(nèi)切酶，來源于新英格蘭Biolabs(Beverly，MA)；[3H]TdR，來源于新英格蘭Nuclear(Boston，MA)；和熒光染料接合抗體CD25-PE3，CD14-PE，CD16-PE，CD122-PE，CD4-FITC，CD8-FITC，IgG1-PE或 IgG1-FITC，來源于Beckton/Dickinson(San Jose，CA)。在合佛醫(yī)學(xué)院的肽合成設(shè)備中合成FLAG肽。
FIAG-WK-II-15融合蛋白的制備為了研究人IL-15受體表達(dá)細(xì)胞的模式，構(gòu)建能用于表達(dá)IL-15融合蛋白的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒編碼N-末端共價(jià)結(jié)合18氨基酸FLAG-HMK序列的IL-15多肽(FLAG-HMK-IL-15)。FLAG序列由生物素化、高特異性抗-FLAG抗體識(shí)別(Blanar等，Science 2561014，1992)；LeClair等，Proc，.Natl.Acad.Sci，.USA 898145，1992)同時(shí)HMK(心肌激酶識(shí)別位點(diǎn))序列允許引入放射性標(biāo)記[32P]至該分子(Blanar等，supra，LeClair等，supra)。
為了構(gòu)建質(zhì)粒FLAG-E3MK-IL-15，通過PCR擴(kuò)增編碼成熟IL-15蛋白的322 bp cDNA片段，利用合成的寡核苷酸[有義5′-GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3′(SEQ ID NO5；EcoRI位點(diǎn)(加下劃線)加145-162堿基；反義5′-CGGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAA-3′(SEQ IDNO5；BamHI位點(diǎn)[加下劃線]加472-489堿基)]。模板DNA來源于PHA-激活的人PBMCs。純化PCR產(chǎn)品，并用EcoRI和BamHI消化，并將其克隆到如文獻(xiàn)所述的，用EcoRI-BamHI消化的pAR(DRI)59/60質(zhì)粒中(Blanar等，Science 2561014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA898145，1992)。pAR(DRI)59/60質(zhì)粒主鏈包含在編碼FLAG和HMK識(shí)別肽序列的框序列中(Blanar等，Science 2561014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898145，1992)。
FLAG-HMK-IL-15融合蛋白的表達(dá)和純化如文獻(xiàn)介紹的，IL-15-相關(guān)的融合構(gòu)建子，F(xiàn)LAG-SK-IL-15，在BL21株E.coli中表達(dá)，并用抗-FLAG包被玻珠親和純化(Blanar等，Science2561014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898145，1992)。在用0.1M甘氨酸(pH3.0)廣泛洗脫之后，從親和柱洗脫融和蛋白。含有FLAG-HMK-IL-15的洗脫物用含50mM Tris(pH7.4)和0.1M NaCl的緩沖液在4℃透析18小時(shí)，經(jīng)0.2μm膜過濾，且在-20℃貯藏。
FLAG-HMK-L-15結(jié)合IL-15Rα亞基試驗(yàn)純化的FLAG-HMK-IL-15融合蛋白，以測(cè)定它是否與細(xì)胞表面IL-15受體相互作用。如上所述，[32P]-FLAG-HMK-IL-15加到由促細(xì)胞分裂原，PHA激活的PBMCs培養(yǎng)物中。為了永久結(jié)合彼此相互作用的蛋白，加入化學(xué)交聯(lián)劑二琥珀酰胺辛二酸鹽(DSS)。細(xì)胞被洗滌、裂解、離心，由SDS-PAGE分離去污劑-可溶的蛋白。SDS-PAGE分離蛋白放射自顯影揭示，單獨(dú)的75-80kDa帶對(duì)應(yīng)于聯(lián)合分子量的FLAG-HMK-IL-15(15kDa)和人IL-1SRα亞基(60-65kDa)。鑒定該條帶是IL-15Rα亞基，是通過在hIL-15摩爾過量條件實(shí)施的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的。這些條件下，我們不能檢測(cè)放射標(biāo)記的15kDa帶。因此，[32p]-FLAG-FEVIK-IL-15融合蛋白的構(gòu)象允許位點(diǎn)特異性地結(jié)合到表達(dá)在促細(xì)胞分裂原-激活PBMCs上的60-65kDa IL-15Rα亞基。
FLAG-HMK-IL-15是需要IL-2Rβ表達(dá)的生物活性生長(zhǎng)因子在下一系列實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)FLAG-HMK-IL-15融合蛋白，以測(cè)定它是否起生物活性生長(zhǎng)因子作用。在對(duì)FLAG-HMK-IL-15或者人重組IL-2的應(yīng)答中，PHA-激活的人PBMCs擴(kuò)增，可經(jīng)[3H]-TdR摻入分析所檢測(cè)。缺失IL-15序列的FLAG肽不會(huì)刺激細(xì)胞增殖。如IL-2所為，F(xiàn)LAG-HMK-IL-15融合蛋白會(huì)刺激表達(dá)IL-2Rβ亞基的IL-2Rγ+BAF-BO3細(xì)胞轉(zhuǎn)染子的增殖。然而，F(xiàn)LAG-HMK-IL-15融合蛋白不會(huì)刺激用缺失IL-2Rβ鏈序列的載體轉(zhuǎn)染的親本BAF-BO3細(xì)胞的增殖。因此，F(xiàn)LAG-HMK-IL-15是生物學(xué)活性生長(zhǎng)因子，它需要在靶細(xì)胞上的IL-2R鏈的表達(dá)，以便刺激細(xì)胞增殖。
促細(xì)胞分裂原激活的。但未靜息的，PBMCs表達(dá)IL-15Rα亞基采用FLAG-HMK-IL-15融合蛋白、生物素化的抗FLAG抗體，和鏈霉抗生物素蛋白-RED670，通過細(xì)胞熒光分析以檢測(cè)人PBMCs上IL-15結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)。試驗(yàn)的PBMCs是新鮮分離或者PHA-激活的。將細(xì)胞洗滌，并單獨(dú)與培養(yǎng)基或者FLAG-HMK-IL-15孵育培養(yǎng)，接著用抗-FLAG生物素化Ab和鏈霉抗生物素蛋白-RED670培養(yǎng)細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)分析染色細(xì)胞。以PHA激活的PBMCs表達(dá)IL-15Rα蛋白，但是靜息的PBMCs不會(huì)表達(dá)。上述交聯(lián)試驗(yàn)結(jié)果放在一起，F(xiàn)LAG-HMK-IL-15與PHA激活的PBMCs結(jié)合會(huì)被摩爾過量的rIL-15阻滯，因此證明了FLAG-HMK-IL-15對(duì)IL-15結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合特異性。激活的CD4+和CD8+細(xì)胞都表達(dá)IL-15α鏈。在CD14+(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)細(xì)胞和CD16+(天然殺傷)細(xì)胞上也能檢測(cè)到誘導(dǎo)的IL-15Rα鏈。
IL-2Rα和IL-2Rβ亞基對(duì)IL-15結(jié)合不是必需的針對(duì)IL-2Rα亞基的，以FLAG-HMK-IL-15蛋白和抗-CD25 Mab染色的PHA-激活的PBMCs的FACS分析揭示了既表達(dá)IL-15Rα又表達(dá)IL-2Rα的細(xì)胞群，以及表達(dá)IL-15Rα或IL-2Rα的細(xì)胞群。這里有不結(jié)合FLAG-HMK-IL-15的IL-2Rα+細(xì)胞。幾乎所有的以PHA刺激僅一天的PBMCs表達(dá)IL-15Rα或IL-2Rβ鏈，但不是兩者都表達(dá)。相反地，PHA刺激3天后，觀察到非常多的IL-15Rα+、IL-2Rβ+細(xì)胞(雙陽性)和較少量的IL-15Rα+、IL-2Rβ-細(xì)胞(單陽性)。有趣地，有不結(jié)合IL-15的IL-2Rβ+細(xì)胞。因此，表達(dá)IL-2Rβ鏈的細(xì)胞并不完全結(jié)合IL-15。
總之，這些數(shù)據(jù)表明IL-15能結(jié)合IL-15Rα+，IL-2Rα-，和IL-2Rβ-細(xì)胞。通過檢測(cè)IL-15和以IL-15Rα亞基轉(zhuǎn)染的IL-2Rα-、β-細(xì)胞相互作用的實(shí)驗(yàn)可獲得同樣的結(jié)論(Anderson等，J.Biol.Chen.27029862，1995；Giri等，EMBO J.143654，1995)。除了需要IL-15Rα亞基表達(dá)之外，還需要IL-2Rβ和IL-2Rγ亞基使細(xì)胞對(duì)IL-15觸發(fā)的生長(zhǎng)敏感。
總之，上述的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明(i)IL-15Rα亞基由激活的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞迅速表達(dá)，和(ii)IL-15Rα亞基的誘導(dǎo)可由地塞米松而不是CsA或雷帕霉素來阻斷。此外，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)IL-15Rα亞基對(duì)于IL-15結(jié)合是必需和充分的，并且FLAG-HMK-IL-15融合蛋白對(duì)于研究IL-15受體是極其有用的工具。
IL-2Rβ亞基對(duì)于IL-2和IL-15的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是關(guān)鍵減少激活的T細(xì)胞的活力并且因此減少激活細(xì)胞提供了一種減少淋巴因子和促細(xì)胞分裂原產(chǎn)生的方法，其中淋巴因子和促細(xì)胞分裂原有助于加速動(dòng)脈粥樣硬化、同種異體移植排斥、某些白血病和其它免疫調(diào)節(jié)病變。另外，阻斷由IL-15激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑也提供了一種減少淋巴因子和促細(xì)胞分裂原的產(chǎn)生的方法，其中淋巴因子和促細(xì)胞分裂原有助于加速動(dòng)脈粥樣硬化、同種異體移植排斥、某些白血病和其它免疫調(diào)節(jié)病變的。激活時(shí)，T細(xì)胞增殖并在它們細(xì)胞表面上表達(dá)適于白細(xì)胞介素的受體。另外，激活的T細(xì)胞釋放至少3個(gè)淋巴因子γ干擾素，B細(xì)胞分化因子II，和IL-3。這些淋巴因子能產(chǎn)生各種不希望的現(xiàn)象，例如同種異體移植排斥。相反，靜息T細(xì)胞和長(zhǎng)期記憶T細(xì)胞不表達(dá)淋巴因子受體。受體表達(dá)的差異提供了一種靶向激活的免疫細(xì)胞且不干擾靜息細(xì)胞的方式。設(shè)計(jì)的用于識(shí)別IL-15R部分亞基的分子會(huì)識(shí)別激活的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及激活的T細(xì)胞，并且可選擇性抑制或破壞這些細(xì)胞。結(jié)合IL-15R亞基但無IL-15活性的IL-15衍生物，由于阻斷了真正的IL-15的結(jié)合和/或攝取，它們?cè)诒景l(fā)明的方法中有效。下述突變體IL-15分子提供了這種衍生物的實(shí)施例。
靶向IL-15R的突變體IL-15多肽突變體IL-15的基因構(gòu)建有雙突變(Q149D；Q156D)的人IL-15蛋白設(shè)計(jì)成靶向結(jié)合IL-2Rγ亞基的關(guān)鍵的推定位點(diǎn)。利用借助PCR誘變，將位置149和156極性但不帶電的谷氨酰胺殘基突變成天冬氨酸酸性殘基。PCR擴(kuò)增編碼這種雙突變體IL-15的cDNA，擴(kuò)增時(shí)采用合成的有義寡核苷酸[5′-GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3′(SEQ ID NO_)；EcoRI位點(diǎn)(加下劃線的六聚物)加145-162堿基]和合成的反義寡核苷酸(5′-CGGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAACATGTCGACAAT-ATGTACAAAACTGTCCAAAAAT-3′(SEQ ID NO_)；BamHI位點(diǎn)(加下劃線的六聚物)加438-489堿基；突變的堿基單獨(dú)地加下劃線]。模板是含有編碼人FLAG-HMK-IL-15的cDNA的質(zhì)粒。擴(kuò)增片段用EcoRI/BamHI消化并克隆入所述的以EcoRI/BamRI消化的pAR(DRI)59/60質(zhì)粒(LeClair等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 898145，1989)。經(jīng)SalI消化確定了在156位殘基上存在突變，該突變引入了一個(gè)新的SalI限制酶切位點(diǎn)。此外，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由DNA測(cè)序證實(shí)了該突變。生產(chǎn)、純化FLAG-HMK-IL-15(Q149D；Q156D)雙突變體蛋白，并通過上述用于FLAG-HMK-IL-15野生型蛋白的測(cè)序確定。
采用同樣的策略，制備在位置149或者在位置156的單氨基酸取代的突變體。如上所述，這些位置(149和156)分別對(duì)應(yīng)于成熟IL-15多肽的位置101和108，它缺少48-氨基酸信號(hào)序列。
同樣地，這種策略可用于在位置149或156引入任何其它突變體代替谷氨酰胺殘基，或者在149和/或156之外的位置引入氨基酸取代。
有IL-15相關(guān)蛋白的條件下BAF-B03細(xì)胞的增殖雙突變體IL-15多肽可以劑量依賴的方式抑制BAF-BO3增殖與加入20μl同樣濃度的雙突變體IL-15相比，加入30μl(約50g/ml)雙突變體IL-15能更徹底地抑制增殖。
PHA-刺激的人PBMCs的擴(kuò)增如下證實(shí)FLAG-HMK-IL-15雙突變體多肽結(jié)合PHA激活的人PBMCs的能力。將PHA-激活的PBMCs洗滌，并在單獨(dú)的培養(yǎng)基中或FLAG-HMK-IL-15突變體中孵育培養(yǎng)。細(xì)胞接著在抗-FLAG生物素化的抗體中培養(yǎng)，并且用偶聯(lián)RED670的鏈霉抗生物素蛋白染色。采用流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞。
FACS分析以野生型FLAG-HMK-IL-15染色的白血病細(xì)胞系在一系列和上述類似的實(shí)驗(yàn)中，顯示了野生型FLAG-HMK-IL-15多肽結(jié)合白血病細(xì)胞的能力。這種處理過的細(xì)胞來源于白血病細(xì)胞系MOLT-14，YT，HuT-102，以及目前在Beth Israel Hospital(Boston，MA)確定的名為2A和2B的細(xì)胞系。將PHA-激活的PBMCs洗滌，并在單獨(dú)的培養(yǎng)基中或FLAG-HMK-IL-15突變體中孵育培養(yǎng)。細(xì)胞接著以生物素化的抗-FLAG抗體培養(yǎng)，并且用偶連RED670的鏈霉抗生物素蛋白染色。采用流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞。
基因構(gòu)建額外的突變體IL-15嵌合體多肽除了提供具有抗原標(biāo)記的突變體IL-15的FLAG-HMK-IL-15嵌合體之外，很多其它的多肽可與IL-15或IL-2的任何突變體連接。例如，突變體IL-15或IL-2按照以下方法能與IgG小類抗體的Fc片段連接。
基因構(gòu)建突變體IL-15/Fc采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT；Gibco-BRL，Grand Island，NY)和合成寡-dT(12-18)寡核苷酸(GibcoBRL)，從IgG2a分泌性雜交瘤中提取的mRNA生產(chǎn)Fcγ2a的cDNA。突變體IL-15 cDNA采用IL-15特異性合成寡核苷酸由質(zhì)粒模板通過PCR擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)5′寡核苷酸，在翻譯起始密碼子位置插入獨(dú)特的NotI限制位點(diǎn)40核苷酸5′，同時(shí)3′寡核苷酸除去終止密碼子并且修飾C-末端Ser殘基密碼子由AGC至TCG，以適應(yīng)獨(dú)特的BamHI位點(diǎn)在突變體IL-15/Fc接頭產(chǎn)生。用于Fcγ2a域cDNA擴(kuò)增的合成寡核苷酸改變鉸鏈的第一密碼子，由Glu至Asp，以便產(chǎn)生獨(dú)特的生成鉸鏈第一密碼子的BamHI位點(diǎn)，并在終止密碼子位置引入獨(dú)特的XbaI位點(diǎn)3′。
修飾Fc片段以便使之不是針對(duì)靶細(xì)胞的清除，即，不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)。為了制備這種不清除靶細(xì)胞的突變體IL-15結(jié)構(gòu)(mIL-15/Fc)，寡核苷酸位點(diǎn)介導(dǎo)的突變用Ala殘基取代C′lq結(jié)合區(qū)域的Glu318、Lys320、Lys322。同樣，用Glu代替Leu235以使FcγRI結(jié)合位點(diǎn)失活。細(xì)胞因子和正確的翻譯閱讀框內(nèi)Fc″成分在獨(dú)特的BamHI位點(diǎn)的連接產(chǎn)生了一個(gè)1,236個(gè)堿基對(duì)的開放閱讀框，它編碼一個(gè)單一的總共有13個(gè)半胱氨酸殘基的411個(gè)氨基酸多肽(包括18個(gè)氨基酸的IL-15信號(hào)肽)。除糖基化以外，成熟分泌性相同雙體(homodimeric)IL-15/Fc預(yù)計(jì)有總計(jì)高達(dá)8個(gè)分子內(nèi)和3個(gè)中-重鏈二硫鍵，并且分子量約85kDa。
mIL-15受體Fc融合蛋白的表達(dá)知純化在將Notl-XbaI框的融合基因克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)之后，通過DNA測(cè)序證明合適的mIL-15/Fc基因構(gòu)建。這種質(zhì)粒攜帶CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸信號(hào)和適于G418選擇的新霉素耐藥性基因。攜帶mIL-15/Fc融合基因的質(zhì)粒通過電穿孔(1.5kV/3μF/0.4cm/PBS)轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1，來源于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所)，并且在含有1.5mg/ml的G418(Geneticin，Gibco BRL)的無血清超-CHO培養(yǎng)基(Bio Whittaker Inc.，Walkerville，MD)中選擇。亞克隆之后，通過ELISA(PharMingen，San Diego，CA)由IL-15篩選上清液，選擇產(chǎn)生高水平融合蛋白的克隆。來自培養(yǎng)物上清液的mIL-15/Fc融合蛋白通過蛋白A瓊脂糖親和柱層析純化，接著用PBS透析且經(jīng)0.22μm過濾滅菌。純化蛋白在使用之前于-20℃貯藏。
進(jìn)行還原(有DTT)和非還原(無DTT)條件下的SDS-PAGE之后，采用單克隆或多克隆抗-mIL-15或抗Fcγ原發(fā)抗體實(shí)施蛋白質(zhì)印跡分析，以評(píng)估融合蛋白的大小和同型特異性。如上所述，突變體IL-15/Fc的功能活性可由標(biāo)準(zhǔn)的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)評(píng)價(jià)。下列mAb來源于PharMingen(San Diego，CA)PE-抗-小鼠CD25(IL-2Rα鏈，IgG1，PC61)，大鼠抗-小鼠CD122(IL-2Rα鏈，IgG2b，TM-b1)，大鼠抗-小鼠CD132(IL2Rγc，IgG2b，TUGm2)，倉鼠抗-小鼠CD3(IgG，145-2C11)，倉鼠抗-小鼠CD28(IgG，37.51)，PE-抗-小鼠CD62L(IgG2a，MEL14)，PE偶聯(lián)的倉鼠抗-小鼠Bc1-2(IgG，3F11)，PE偶聯(lián)的抗-小鼠IL-2(IgG2b，JES6-5H4)，PE膜聯(lián)蛋白V，生物素化抗-大鼠IgG2b，PE-鏈霉抗生物素蛋白，PE-細(xì)胞色素基因(CyChrome)，和PE偶聯(lián)的同型對(duì)照mAb。生物素化小鼠抗-FLAG mAb和大鼠IgG1對(duì)照mAb來源于Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)。B-細(xì)胞雜交瘤分泌大鼠抗小鼠CD25 mAb(TIB 222，IgG1)來源于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC；Manassas，VA)。細(xì)胞在不含血清的UltraCulture培養(yǎng)基(Bio Whittaker，Walkerville，MD)中生長(zhǎng)，并且培養(yǎng)物上清液中的mAb以蛋白G柱純化。
IL-2和IL-15的體內(nèi)表達(dá)研究重組人IL-2和IL-15購自R&D System(Minneapolis，Mon)。如先前報(bào)道的方法來構(gòu)建、表達(dá)和試驗(yàn)IL-15-FLAG和IL-15突變體/Fc融合蛋白(Chae等，J.Immunol.1572813-2819，1996；Kim等，J Immacnol.1615742-5748，1998)。如先前報(bào)道的方式使用大鼠抗-小鼠γc mAb(4G3/3E12，IgG2b)(Li等J.Immunol.1641193-1199，2000)。
以熒光染料5-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺基酯(CFSE；MolecularProbes，Inc.，Portland，OR)標(biāo)記淋巴細(xì)胞，如下所述。從供體小鼠中收集脾和外周淋巴結(jié)，在Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中制備單細(xì)胞懸浮液。用低滲透壓沖擊裂解紅細(xì)胞。細(xì)胞以1×107/ml濃度再懸浮于HBSS溶液中并用CFSE標(biāo)記，參見Wells等所述(J Clin.Invest.1003173-3183，1997)。
為了在體內(nèi)激活CFSE-標(biāo)記的T細(xì)胞，用Gammacell Exactor(Kanata，Ontario，加拿大)輻射DBA/2小鼠(1000rad)。接著每個(gè)小鼠經(jīng)尾靜脈注射含有4-6×107個(gè)CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞的0.5ml HBSS溶液。三天之后，處死宿主小鼠，分別收集脾和外周淋巴結(jié)。制備單細(xì)胞懸浮液，用于細(xì)胞表面染色和FACS分析。
在一些實(shí)驗(yàn)中，用抗-CD25 mAb或抗-γc mAb處理經(jīng)輻射的宿主小鼠(先在靜脈內(nèi)注射CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞，然后腹膜內(nèi)注射抗-CD25 mAb或抗-γc mAb，劑量為每天1mg，持續(xù)3天)。注射CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞之后第三天測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞分裂。先在靜脈內(nèi)注射標(biāo)記細(xì)胞，然后用IL-15突變體/Fc融合蛋白處理小鼠，每天腹膜內(nèi)注射1.5μg，持續(xù)3天。
在輻射過的同種宿主中，體內(nèi)激活的CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)染色以測(cè)定IL-2和IL-15受體亞基的表達(dá)。為了檢測(cè)IL-2受體α鏈的表達(dá)，細(xì)胞(2×106)在冰上用PE-抗-小鼠CD25 mAb染色30分鐘，洗滌，然后再懸浮于含有0.5％BSA的1ml PBS中。為了檢測(cè)IL-2R的β和γc的表達(dá)，細(xì)胞和大鼠抗-小鼠β鏈(IgG2b)或γc mAb(IgG2b)在冰上孵育培養(yǎng)30分鐘，接著用生物素化的抗-大鼠IgG2b孵育培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)洗滌并進(jìn)一步用PE-鏈霉抗生物素蛋白染色20分鐘。細(xì)胞經(jīng)洗滌并在PBS-0.5％BSA中再懸浮以便用于分析。為了檢測(cè)IL-15Rα鏈的表達(dá)，細(xì)胞與結(jié)合α鏈的IL-15-FLAG融合蛋白孵育培養(yǎng)(Chae等，J.Inzmunol.1572813-2819，1996)，接著用生物素化抗-FLAG mAb染色。接著洗滌細(xì)胞并用PE-鏈霉抗生物素蛋白染色。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都用同型匹配的對(duì)照mAbs作為對(duì)照。所有樣品都用帶有CellQuestTM軟件的FACSort(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析。通過CFSE+細(xì)胞上的選通(gating)來收集和分析數(shù)據(jù)。如表達(dá)CD3的細(xì)胞一樣，所有分裂的CFSE+細(xì)胞都是T細(xì)胞。每個(gè)樣品至少收集100,000個(gè)結(jié)果。
分裂中的T細(xì)胞在體內(nèi)的凋亡分析如下。如上所述，在輻射過的同種宿主中，體內(nèi)刺激CFSE-標(biāo)記的淋巴細(xì)胞。3天之后從宿主的脾和外周淋巴結(jié)中收集細(xì)胞，并且在標(biāo)記緩沖液中用PE偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V在冰上染色15分鐘。用細(xì)胞CFSE標(biāo)記分布圖鑒別細(xì)胞分裂，通過膜聯(lián)蛋白V染色分析每個(gè)不同細(xì)胞的凋亡。
將細(xì)胞染色，以便能觀察到胞內(nèi)IL-2和Bc1-2細(xì)胞因子的表達(dá)。從宿主的脾和淋巴結(jié)中收集經(jīng)體內(nèi)刺激3天的CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞。用PMA(50ng/ml)和離子霉素(ionomycin)(500ng/ml)再刺激細(xì)胞4小時(shí)，然后在培養(yǎng)的最后兩小時(shí)加入GolgiStopTM(PharMingen)。細(xì)胞在4℃用Cytofix/Cytoperm(PharMingen)固定和滲透10分鐘，接著用PE-偶聯(lián)的抗-小鼠IL2 mAb染色，用同型匹配的對(duì)照mAb作為對(duì)照。為了將Bc1-2染色，細(xì)胞用Cytofix/Cytoperm固定和滲透10分鐘，接著用PE-偶聯(lián)的抗-小鼠IL2 mAb或同型對(duì)照Ab染色30分鐘。洗滌細(xì)胞，并用FACS分析。
如下所述實(shí)施細(xì)胞分選和體外再刺激。經(jīng)靜脈內(nèi)注射標(biāo)記細(xì)胞3天后，從輻射過的同種宿主中制備CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞。通過它們的CFSE標(biāo)記分布圖鑒別體內(nèi)細(xì)胞增殖。用FACS VantageTM分選儀(Becton Dickinson)以2000結(jié)果/秒來選擇、選通和分選第二次細(xì)胞分裂。分選的細(xì)胞在添加有10％FCS和1％青霉素和5×105/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中再次懸浮，并涂覆在包被有抗-CD3(2μg/ml)和抗-CD28 mAb(1μg/ml)的板上。三天后收集細(xì)胞，并用PE-偶聯(lián)的抗-小鼠CD25和同型對(duì)照Ab染色。用FACS分析細(xì)胞增殖和IL-2受體α鏈的表達(dá)。
細(xì)胞分選和體外增殖試驗(yàn)如下所述。在靜脈內(nèi)注射標(biāo)記的細(xì)胞3天后，從輻射過的同種宿主中制備CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞，并用細(xì)胞的CFSE分布圖分析鑒別體內(nèi)細(xì)胞增殖。用FACS VantageTM選擇、選通和分選第二次細(xì)胞分裂。將細(xì)胞(1×104/ml)再次懸浮于含有10％FCS和1％青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并且用IL-2(40μ/ml至50μ/ml)或IL-15(5ng/ml)刺激48小時(shí)。細(xì)胞以1mCi3H-TdR(Amersham，Boston，MA)脈沖16小時(shí)，并用閃爍計(jì)數(shù)器(Beckman Instrument，Columbia，MD)測(cè)定3H-TdR的攝取。
上述的試劑和技術(shù)為幾種發(fā)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。首先，與同系對(duì)照相比(Li等，Nature Medicine 51298-1302，1999)，CFSE-標(biāo)記的B6AF1(H-2b/d.k)同種淋巴細(xì)胞在輻射過的DBA/2(H-2d)宿主中增殖很快。過繼性轉(zhuǎn)移三天內(nèi)，由宿主脾回收得到的大約20％的CFSE-標(biāo)記的T細(xì)胞進(jìn)入了細(xì)胞周期，并且能清楚地識(shí)別七至八個(gè)細(xì)胞分裂的不連續(xù)過程(圖3A)。令人驚奇的是，高親和性的IL-2受體信號(hào)傳導(dǎo)所必需的IL-2受體α鏈，在頭5次分裂期間不能被檢測(cè)到，即這種受體亞基僅僅在五次細(xì)胞分裂之后表達(dá)。相反，所有正在分裂的T細(xì)胞都表達(dá)IL-2受體的β亞基，當(dāng)細(xì)胞持續(xù)分裂時(shí)它們的表達(dá)水平逐漸地升高。γc體內(nèi)表達(dá)的模式明顯不同于α鏈和β鏈的表達(dá)(圖3A)。未分裂的T細(xì)胞(0分裂)表達(dá)極低水平的γ鏈(＜10％)。隨著進(jìn)入細(xì)胞周期，正在分裂的T細(xì)胞高水平表達(dá)γ鏈，并且在各自連續(xù)的細(xì)胞分裂后表達(dá)水平持續(xù)升高。然而，五次細(xì)胞分裂后，γ鏈的表達(dá)急劇下調(diào)，第六次細(xì)胞分裂后幾乎達(dá)到基線水平(圖3A)。
IL-2受體亞基的差異表達(dá)不是因?yàn)樗拗髌?nèi)部分激活的T細(xì)胞的選擇性積累，而是由于從外周淋巴結(jié)收集的CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞對(duì)這三種IL-2受體亞基表現(xiàn)出顯著相同的表達(dá)模式。
第二，體外刺激CFSE-標(biāo)記的T細(xì)胞導(dǎo)致IL-2受體所有三種亞基的均勻表達(dá)(圖3B)。這表明IL-2受體體內(nèi)表達(dá)的調(diào)節(jié)不同于體外的調(diào)節(jié)。已知IL-2受體α鏈在體內(nèi)對(duì)解蛋白剪切敏感，該方式類似于對(duì)選擇蛋白(Hemar等，J.Cell.Biol.12955-64，1995)。對(duì)體內(nèi)正在分裂的T細(xì)胞表達(dá)的L-選擇蛋白進(jìn)行染色，顯示L-選擇蛋白在頭五次細(xì)胞分裂期間高水平表達(dá)(圖3C)，這就說明頭五次細(xì)胞分裂期間檢測(cè)不到IL-2受體α鏈的表達(dá)不是因?yàn)榻獾鞍椎目焖偌羟小榱藴y(cè)定在頭五次細(xì)胞分裂期間T細(xì)胞是否能夠表達(dá)IL-2受體α鏈，分選第二次細(xì)胞分裂期的T細(xì)胞，該T細(xì)胞不表達(dá)IL-2受體α鏈，并且以固定化抗-CD3和可溶的抗-CD28刺激3天。緊接著體外再刺激這些分選的T細(xì)胞繼續(xù)分裂，所有分裂的T細(xì)胞表達(dá)IL-2受體α鏈。非常明顯，IL-2受體α鏈在體內(nèi)和體外的表達(dá)受不同的調(diào)節(jié)。
由于IL-15受體也采用IL-2受體α和γ鏈作為關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)元件(Tagaya等，Inmunity 4329-336，1996)，這些鏈在頭五次分裂期間被高度表達(dá)，于是我們就會(huì)問細(xì)胞會(huì)不會(huì)在分裂初始期間表達(dá)對(duì)IL-15起反應(yīng)的IL-15受體α鏈。將IL-15-FLAG融合蛋白用作初始的染色試劑(Chae等，J.Immunol.1572813-2819，1996)，證實(shí)了在分裂T細(xì)胞上IL-15受體α鏈盡管水平低，不考慮細(xì)胞分裂的數(shù)目是可清楚檢測(cè)的，(圖4A)。IL-2受體α鏈不是在所有體內(nèi)分裂T細(xì)胞上都能檢測(cè)到。因此，在頭五次細(xì)胞分裂期間IL-15受體而不是IL-2受體上的α鏈的選擇性表達(dá)，與共享的β、γ鏈的表達(dá)一道，暗示了體內(nèi)初始細(xì)胞分裂有可能是IL-15-依賴的，但是不是IL-2-d依賴的。
為了測(cè)試這種假設(shè)，在體內(nèi)分裂T細(xì)胞內(nèi)評(píng)價(jià)IL-2的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)的IL-2染色揭示IL-2僅僅在已分裂超過五次的細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)。用飽和劑量的溶細(xì)胞抗-CD25 mAb處理宿主小鼠未能抑制頭五次分裂(相對(duì)于對(duì)照Ab處理的小鼠)，經(jīng)抗-CD25處理的小鼠和對(duì)照小鼠的第一次和第五次分裂中的分裂細(xì)胞明顯類似。此外，分選體內(nèi)第二次細(xì)胞分裂的T細(xì)胞，并在有IL-2或IL-15的條件下體外培養(yǎng)，通過3H-TdR攝取分析細(xì)胞增殖。含高達(dá)500u/ml劑量的IL-2培養(yǎng)物不能支持T細(xì)胞增殖。相反，IL-15強(qiáng)烈地刺激增殖(圖4B)。
IL-2體內(nèi)表達(dá)模式與IL-2受體α和β鏈的上調(diào)緊密相關(guān)，還和普通的γ鏈表達(dá)的顯著減少緊密相關(guān)(圖5A)。這暗示IL-2調(diào)節(jié)γ鏈的體內(nèi)表達(dá)。為了測(cè)試這種可能性，在IL-2缺失小鼠和野生型對(duì)照鼠中檢測(cè)γ鏈的表達(dá)。與野生型對(duì)照組相比，IL-2缺失小鼠的CD4+T細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)了高水平的γ鏈(圖5B)。用抗-CD25處理宿主小鼠抑制了體內(nèi)分裂T細(xì)胞γ鏈的下調(diào)，但是這種處理對(duì)IL-2受體β鏈表達(dá)無影響(圖5C)。
對(duì)于所有已知的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子而言γ鏈?zhǔn)顷P(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)元素，并且γ鏈信號(hào)對(duì)于細(xì)胞存活是必需的，它至少部分上經(jīng)Bc1-2族抗凋亡蛋白的持續(xù)表達(dá)完成(Nakajima等，J.Exp.Med.185189-195，1997)。為了測(cè)定在五次細(xì)胞體內(nèi)分裂后，γ鏈表達(dá)的下降是否會(huì)調(diào)節(jié)克隆擴(kuò)增，CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞在從宿主回收后用PE-膜聯(lián)蛋白V染色，并且在體內(nèi)分析正在分裂的T細(xì)胞的凋亡。突然的細(xì)胞死亡發(fā)生在四次細(xì)胞分裂之后。未分裂的細(xì)胞(0分裂)中具有＜10％的膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞。然而，第六次分裂之后，～40％的細(xì)胞是膜聯(lián)蛋白V陽性。由于取自Fas突變體MRL-lpr小鼠的T細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞凋亡模式類似，因此這種類型的細(xì)胞死亡不是Fas依賴性的(Li等，J.Immlmol.1632500-2507，1999)。對(duì)Bc1-2表達(dá)染色顯示了Bc1-2染色的平均通道熒光強(qiáng)度在四次細(xì)胞分裂之后顯著減小(圖5E)。因此，緊接著γ鏈下調(diào)的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)果不能支持持續(xù)的Bc1-2表達(dá)，并且細(xì)胞變得對(duì)凋亡的細(xì)胞死亡敏感(Nakajima等，J.Exp.Med.185189-195，1997)。
這些結(jié)果暗示阻斷IL-2或IL-15的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)展有不同的影響。為了進(jìn)一步探究這種可能性，將取自IL-2缺失小鼠(H-2b)的CFSE-標(biāo)記的淋巴細(xì)胞注射到輻射過的DBA/2宿主(H-2d)，三天后體內(nèi)分析細(xì)胞分裂并且與野生型對(duì)照小鼠內(nèi)的結(jié)果比較。來自IL-2缺失小鼠的T細(xì)胞連續(xù)分裂并且在體內(nèi)擴(kuò)增。約30％的CFSE-標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，與對(duì)照組相比，這些細(xì)胞的大多數(shù)分裂超過五次。
用IL-15突變體/Fc處理宿主小鼠，以充當(dāng)IL-15受體特異性拮抗劑(Kim等，J.Immunol.1615742-5748，1998)，經(jīng)處理的小鼠明顯減少了CFSE-標(biāo)記T細(xì)胞的增殖頻率，并且在處理過的小鼠內(nèi)，絕大多數(shù)的CFSE-標(biāo)記細(xì)胞不能進(jìn)入細(xì)胞周期。此外，通過采用mAb阻斷IL-2與IL-15受體都具有的信號(hào)傳導(dǎo)元件γ鏈來處理宿主小鼠，結(jié)果顯示能明顯抑制體內(nèi)T細(xì)胞分裂。因此，IL-2和IL-5調(diào)節(jié)體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增的不同方面，并且如上所述，通過給予這些白細(xì)胞介素的拮抗劑能夠抑制免疫應(yīng)答。
這些結(jié)果也證實(shí)γ鏈的下調(diào)需要T細(xì)胞激活和細(xì)胞周期進(jìn)程以及IL-2的信號(hào)傳導(dǎo)。很明顯，γ鏈在體內(nèi)表達(dá)的下調(diào)與IL-2生產(chǎn)和高親和性的IL-2受體表達(dá)密切相關(guān)。在缺少IL-2條件下，細(xì)胞在極高水平表達(dá)γ鏈，并且IL-2受體功能的阻斷抑制了體內(nèi)周期性T細(xì)胞中γ鏈表達(dá)水平的下調(diào)。因此，這些研究提供IL-2和IL-15在體內(nèi)調(diào)節(jié)原始T細(xì)胞激活的不同方面的新證據(jù)。與傳統(tǒng)的基于體外研究的看法和結(jié)論相反，IL-15在初始化T細(xì)胞體內(nèi)分裂中是一個(gè)關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子，IL2在體內(nèi)的獨(dú)特作用是通過調(diào)節(jié)周期性T細(xì)胞上γ鏈表達(dá)來控制克隆擴(kuò)增的大小。
這些結(jié)果支持上述的臨床應(yīng)用。用外源IL-2在腫瘤免疫和AIDS患者中激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答會(huì)促進(jìn)早熟的T細(xì)胞死亡，并且在誘導(dǎo)耐受和自體免疫患者中阻斷IL-2的治療會(huì)誘導(dǎo)不希望的T細(xì)胞擴(kuò)增。此外，IL-15和IL-2分階段和聯(lián)合的靶向代表了在T細(xì)胞依賴的細(xì)胞變性條件中阻斷T細(xì)胞激活的一種重要方法。
裂解性IL-2/Fc裂解帶有IL-2R的細(xì)胞且結(jié)合FcRIT細(xì)胞系細(xì)胞(CTLL-2細(xì)胞；106)用100mCi51Cr標(biāo)記，并且與裂解形式的IL-2/Fc和大鼠低毒性補(bǔ)體(C′)，非裂解形式的IL-2/Fc和C′，鼠免疫球蛋白和C′(陰性對(duì)照)或單獨(dú)的C′(0.5μg/ml濃度的陰性對(duì)照)孵育培養(yǎng)。另一組的相同細(xì)胞用去污劑(1％NP40)(陽性對(duì)照)處理。通過51Cr的釋放測(cè)量細(xì)胞裂解。在有去污劑條件下觀察到的裂解度代表100％裂解。處理之后按照這種公式計(jì)算如上所述的特異裂解％特異裂解＝[(實(shí)驗(yàn)的cpm-背景cpm)/(總的釋放cpm-背景cpm)×100％]。圖6所示的結(jié)果支持下述結(jié)論溶細(xì)胞IL-2/Fc裂解帶有IL-2R的CTLL-2細(xì)胞，但非-裂解IL-2/Fc不會(huì)的。
為了評(píng)價(jià)在FcRI-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中(鼠FcRI，F(xiàn)cRII，和IL-2R-陰性)裂解和非裂解IL-2/Fc結(jié)合Fc受體的能力，F(xiàn)cRI轉(zhuǎn)染子和PBS，mIgG2a，裂解性IL-2/Fc，或非裂解性IL-2/Fc預(yù)培養(yǎng)。洗滌之后，用熒光接合的山羊抗小鼠Fc染色細(xì)胞用于FACS分析。如圖7所示，溶細(xì)胞IL-2/Fc可結(jié)合FcRI，但是裂解性IL-2/Fc不會(huì)。
裂解性IL-2/Fc在過繼轉(zhuǎn)移模型中能有效預(yù)防的糖尿病創(chuàng)建兩個(gè)不同突變體IL-2/Fc。第一個(gè)突變體包含一個(gè)取自鼠IgG2a的Fc末端，它會(huì)介導(dǎo)CDC和CDCC(IL-2/Fc)，第二個(gè)突變體是一個(gè)點(diǎn)突變Fc部分，它不會(huì)激活CDC或CDCC(IL-2/Fc-/-)的。然而，IL-2/Fc能在含有IL-2R的細(xì)胞中介導(dǎo)CDC(例如鼠CTLL-2T細(xì)胞系中的那些)并且結(jié)合FcRI，而IL-2/Fc-/-則不會(huì)(圖6和7)。此外，在一個(gè)NOD過繼轉(zhuǎn)移模型中，裂解性IL-2/Fc分子會(huì)防止糖尿病的發(fā)生，但是該分子的非裂解形式(IL-2/Fc-/-)則不具有這種能力(圖13)。在動(dòng)物模型中，用ACK裂解緩沖液處理單分散的脾細(xì)胞，去除了其中的紅細(xì)胞(Bio Whittaker Inc.，Walkersville，MD)。用取自急性糖尿病雌性NOD小鼠(高血糖＜兩周)的2×107個(gè)脾白細(xì)胞，注射8至12周齡的輻射(700拉德)過的無糖尿NOD病雄性受體。每周檢驗(yàn)血糖水平(BGL)，當(dāng)任何一次測(cè)量中BGL大于16.5mmol/L或者連續(xù)三天大于13.8mmol/L時(shí)，診斷為糖尿病。如圖13所示，即使在這種處理中止后，大多糖的動(dòng)物仍然無糖尿病。
如上所提到的，本文中出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型可用于試驗(yàn)各種組合的本發(fā)明制劑的治療功效。
在體內(nèi)移植物抗宿主模型中雷帕霉素抑制T細(xì)胞增殖，但是不抑制激活T細(xì)胞的凋亡在體內(nèi)移植物抗宿主模型(如上所述)中，分析在IL-2/Fc和雷帕霉素存在的條件下宿主反應(yīng)性T細(xì)胞的命運(yùn)。如圖8所示，即使在有BL-2/Fc的條件下，雷帕霉素也會(huì)抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，但是會(huì)允許功能性IL-2R的表達(dá)。如膜聯(lián)蛋白V染色證明的，在有IL-2/Fc和雷帕霉素(圖10)的條件下，抗原激活的宿主反應(yīng)性T細(xì)胞在會(huì)凋亡。
本發(fā)明的組合物可使胰島和皮膚同種異體移植長(zhǎng)期存活為了防止移植入急性糖尿病NOD受體中的同種異體胰島排斥或移植到NOD小鼠上的皮膚移植物被排斥，使用促進(jìn)T細(xì)胞死亡和抑制T細(xì)胞增殖的制劑組合物。如圖11和12所示，裂解IL-2/Fc，mutlL-15/Fc和雷帕霉素的組合物被證明在防止移植排斥中有效(并且比其它的試驗(yàn)的治療方案更有效)。在整個(gè)觀察期都表現(xiàn)出移植物存活和移植物功能，并且在治療停止之后大多數(shù)移植物都存活。這種驚人作用相信是因?yàn)槭褂昧私M合制劑(促進(jìn)T細(xì)胞死亡以及抑制T細(xì)胞增殖的制劑)。
已經(jīng)描述了本發(fā)明大量的實(shí)施方案。然而，在不背離本發(fā)明的精神和范圍下實(shí)施的各種修正是可以理解的。因此，其它的實(shí)施方案在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療組合物，它包括靶向白細(xì)胞介素15受體(IL-15R)的第一制劑，和靶向白細(xì)胞介素-2受體(IL-2R)的第二制劑。
2.權(quán)利要求1的治療組合物，其特征在于第一制劑包括實(shí)質(zhì)上純的突變體IL-15多肽，其中該多肽能結(jié)合IL-15R的一個(gè)亞基。
3.權(quán)利要求2的治療組合物，其特征在于所述的亞基是IL-15Rα亞基。
4.權(quán)利要求3的治療組合物，其特征在于突變體IL-15多肽在SEQ IDNO2的156位點(diǎn)有一個(gè)突變。
5.權(quán)利要求4的治療組合物，其中突變體IL-15多肽在SEQ ID NO2的149位點(diǎn)有一個(gè)突變。
6.權(quán)利要求4的治療組合物，其中在SEQ ID NO2的156位置的突變是天冬氨酸取代谷氨酰胺。
7.權(quán)利要求5的治療組合物，其中在SEQ ID NO2的149位置的突變是天冬氨酸取代谷氨酰胺。
8.權(quán)利要求5的治療組合物，其中突變體IL-15多肽在SEQ ID NO2的位置149和156以天冬氨酸取代谷氨酰胺。
9.權(quán)利要求2的治療組合物，其中第一制劑進(jìn)一步包括一個(gè)使具有IL-15R的細(xì)胞被清除的功能部分。
10.權(quán)利要求9的治療組合物，其中裂解具有IL-15R的細(xì)胞的部分是IgG分子的Fc區(qū)。
11.權(quán)利要求1的治療組合物，其中第一制劑包括實(shí)質(zhì)上純的抗-IL15R抗體。
12.權(quán)利要求1的治療組合物，其中第二制劑包括特異性結(jié)合IL-2或IL-2R的抗體。
13.一種抑制病人免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予病人一種治療組合物，該治療組合物包括靶向IL-15R的第一制劑和靶向IL-2R的第二制劑的。
14.權(quán)利要求13的方法，其中病人具有免疫疾病，特別是自身免疫性疾病，或者具有發(fā)生免疫疾病，特別是自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是風(fēng)濕性疾病，包括全身性紅斑狼瘡，斯耶格倫氏綜合征，硬皮病，混合性結(jié)締組織病，皮肌炎，多肌炎，萊特爾氏綜合征或貝切特氏病。
16.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
17.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是I型糖尿病。
18.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是選自橋本甲狀腺炎和格雷夫斯氏病的甲狀腺自身免疫性疾病。
19.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是選自多發(fā)性硬化、重癥肌無力和腦脊髓炎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。
20.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是選自尋常性天皰瘡、增殖性天皰瘡、落葉性天皰瘡、塞-阿二氏綜合征和巴西天皰瘡的各種天皰瘡。
21.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是牛皮癬。
22.權(quán)利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是炎癥性腸病。
23.權(quán)利要求13的方法，其中病人患有獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)。
24.權(quán)利要求13的方法，其中病人已經(jīng)接受了生物器官、組織或細(xì)胞移植。
25.權(quán)利要求13的方法，其中病人患有移植物抗宿主病。
26.消除表達(dá)IL-15受體的細(xì)胞的方法，它包括將細(xì)胞暴露于含有靶向IL-15R的第一制劑和靶向IL-2R的第二制劑的治療組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中細(xì)胞是免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
28.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中細(xì)胞是惡性細(xì)胞。
29.一種診斷病人的方法，其中該病人所患的疾病或病癥能用權(quán)利要求1的治療組合物治療，該方法包括測(cè)定取自病人的生物樣品中是否含有能被包含IL-15的多肽和抗原標(biāo)記結(jié)合的細(xì)胞，結(jié)合結(jié)果表明細(xì)胞可在體內(nèi)被靶向IL-15R的制劑結(jié)合，因此在體內(nèi)抑制應(yīng)答野生型IL-15的增殖。
30.一種藥學(xué)上可接受的組合物，它包括兩種或更多制劑的，并且它們中的每一種都能促進(jìn)T細(xì)胞死亡。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物，進(jìn)一步包括抑制T細(xì)胞增殖的制劑。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中這種組合物包括裂解性IL-2/Fc分子，拮抗IL-15受體的突變體IL-15分子，以及雷帕霉素。
33.一種藥學(xué)上可接受的組合物，它包括至少一種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑和至少一種抑制T細(xì)胞增殖的制劑。
34.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中T細(xì)胞死亡是AICD(激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡)，被動(dòng)細(xì)胞死亡，ADCC(依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)或CDC(補(bǔ)體主導(dǎo)細(xì)胞毒性)。
全文摘要
本發(fā)明部分是基于對(duì)體內(nèi)周期性T細(xì)胞的IL－2和IL－15受體亞基的表達(dá)研究。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種IL－2和IL－15拮抗劑的新型組合物，以及通過這些拮抗劑給藥抑制免疫應(yīng)答的方法。每種情形下，通過給予靶向IL－15分子或IL－15受體(IL－15R)的第一制劑，和靶向IL－2分子或IL2受體(IL－2R)的第二制劑來實(shí)現(xiàn)抑制。一般地說，本發(fā)明涉及一種新的組合制劑，當(dāng)對(duì)患者給藥(或體外移植物)時(shí)能減少抗原反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量。例如，本發(fā)明的涉及一種包括兩種或多種制劑的組合物(例如，藥學(xué)上可接受的組合物)，其中每一種都能促進(jìn)T細(xì)胞死亡。此外，這種組合物包含至少一種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑，和至少一種抑制T細(xì)胞增殖的制劑。這種促進(jìn)T細(xì)胞死亡的制劑能促進(jìn)AICD(激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡)、被動(dòng)細(xì)胞死亡、ADCC(依賴抗體細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)或CDC(補(bǔ)體主導(dǎo)細(xì)胞毒性)。
文檔編號(hào)A61P21/00GK1478098SQ01818533
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月14日
發(fā)明者李賢昌, 斯特羅姆, 特瑞·斯特羅姆, 鄭鑫曉 申請(qǐng)人:貝斯以色列護(hù)理醫(yī)療中心有限公司