專利名稱：對炎癥介導(dǎo)感染的抗炎癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用抗炎藥來治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。本發(fā)明具體關(guān)系到HIV感染的治療。
背景技術(shù)：
HIV感染周期起始于病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。據(jù)信人CD4是T細(xì)胞上HIV識別的主要受體。HIV包膜糖蛋白(env)與CD4受體結(jié)合導(dǎo)致病毒與細(xì)胞膜的融合，進(jìn)而促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主。evn在HIV感染的宿主細(xì)胞表面上的最終表達(dá)使該細(xì)胞與未被感染的CD-4陽性細(xì)胞融合，從而病毒蔓延。但HVI也能進(jìn)入其他細(xì)胞如單核細(xì)胞、B細(xì)胞和樹狀細(xì)胞，雖然它們不表達(dá)CD4，但可作為病毒的儲存地。已知細(xì)胞因子影響著HIV的復(fù)制。前炎癥性細(xì)胞因子可促進(jìn)HIV復(fù)制(Fauci，Nature 384529-534，1996)，而β-趨化因子則抑制專性利用CCR5的病毒的復(fù)制(Moore，等人，J.Viorl.70551-562，1996)，并提高利用CXCR4的病毒分離物的復(fù)制(Dolei等人，AIDS 12183-190，1998)。
在胸腺依賴性體液免疫發(fā)展中，體內(nèi)輔助T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的物理性接觸(受到例如CD4、T細(xì)胞受體和MHC II類分子的介導(dǎo))是必須的。CD40與CD40配體之間的相互作用是免疫發(fā)展和維持的中心。CD40是一種45kDa的透膜糖蛋白，它是與神經(jīng)生長因子受體、TNF受體、Fas、CD17和CD30的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域同源的表面分子家族中的成員(Armitage等人，Nature 35780-82，1992)。已在未成熟和成熟B淋巴細(xì)胞上鑒定出了CD40，當(dāng)與抗體交聯(lián)時其誘導(dǎo)單核細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞上的B細(xì)胞增殖(Vall等人，Eur.J.Immunol.191464-1467，1989)?？乖岢始?xì)胞(APC)上的CD40的功能是促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞活化的協(xié)同刺激受體(綜述見Clark等人，Adv.Immunol.6343-68，1996)。還從分子上鑒定了CD40的配體(也稱為gp39、CD40配體或CD40L)(Armitage等人，1992，同上)，并發(fā)現(xiàn)其在活化的CD4+Th細(xì)胞上表達(dá)(Spriggs等人，J.Exp.Med.1761543-1550，1992)。表達(dá)gp39蛋白質(zhì)的細(xì)胞能引發(fā)B細(xì)胞增殖，且能通過其他刺激信號誘導(dǎo)抗體增生(Armitage等人，1992，同上)。還有報道說CD40L與CD40的接合將提高CD80和CD86的表達(dá)以及前炎癥性細(xì)胞因子的分泌。
正常腸道的特點(diǎn)是有低水平的輕度炎癥，其是由基礎(chǔ)水平局部分泌的趨化因子和細(xì)胞因子所支持的(Shanahan和Anton，Gut Peptides，J.Walsh編輯(RavenPress，Ltd，New York，1994，第851頁；Schreiber等人，Gastroenterology1011020(1991)；MacDermott等人，Inflammatory Bowel Diseases 4，54(1998)；Luster，N.Engl.J.Med.338436(1998))。對健康的對照而言，已知腸胃淋巴細(xì)胞與外周血淋巴細(xì)胞在功能和表型上有所不同(Allison等人，Gastroenterology99421(1990)；Jarry等人，Eur.J.Immunol.201097(1990)；McGowan等人，Neuroimmunomodulation 470(1997))。實(shí)際上，所有粘膜CD4+淋巴細(xì)胞都表達(dá)活化標(biāo)記，且都是CD45RO+記憶亞組(Schieferdecker等人，J.Virol.1492816(1992))。在HIV感染過程中，所描述的腸T淋巴細(xì)胞的各種表型異常常與CD4+淋巴細(xì)胞的缺失相關(guān)(Schnieder等人，Clin.Exp.Immunol.95430(1994))。
如果沒有有效的疫苗，受HIV感染的人數(shù)將持續(xù)增加。另外，由于缺少有效的治療方法，大部分受HIV感染的個體都將發(fā)展為獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，且都將死于機(jī)會感染或免疫系統(tǒng)衰竭所致的惡性腫瘤。雖然現(xiàn)已有一些抗HIV藥能減緩疾病的發(fā)展，但依舊迫切需要更有效的治療方法和藥物組合。
發(fā)明概述本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))引發(fā)一種炎癥狀態(tài)，這與以前認(rèn)為HIV是一種靜態(tài)的或進(jìn)行性的免疫缺陷狀態(tài)的觀點(diǎn)相反。這種炎癥狀態(tài)通過在含有HIV感染所需受體的炎癥部位補(bǔ)充其他炎性細(xì)胞，以及通過活化受感染的炎性細(xì)胞(產(chǎn)生病毒顆粒)而有利于HIV感染擴(kuò)散。
在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種抑制粘膜組織的炎癥介導(dǎo)性感染的方法，即通過使該組織與抑制有效量的抗炎藥或與抗病毒藥聯(lián)合接觸。炎癥介導(dǎo)的感染可能是由病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒(lentivirus)，如選自1型人免疫缺陷病毒(HIV)、2型HIV和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的免疫缺陷病毒)所引起。使粘膜組織與抗炎藥單獨(dú)或與抗病毒藥聯(lián)合接觸可以在體內(nèi)、體外或活體外。粘膜組織通常是哺乳動物的，較佳地是人的粘膜組織。這種粘膜組織的例子包括泌尿生殖組織(如陰道組織)、腸胃組織、下腸胃道組織、和鼻-咽組織等。抗炎藥可局部或全身給予，如分別通過局部給藥、靜脈內(nèi)給藥、口服或腸胃外給藥。當(dāng)抗炎藥與抗病毒藥聯(lián)用時，可在給予抗病毒藥之前、同時或之后給予?？寡姿幙梢允侨魏慰寡姿?，如能減少炎性細(xì)胞補(bǔ)充、減少趨化因子的產(chǎn)生、減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、或抑制趨化因子或細(xì)胞因子受體與其配體相互作用的那些抗炎藥。這些抗炎藥可單獨(dú)給予也可聯(lián)合給予，還可與其他抗病毒化合物單獨(dú)給予或聯(lián)用。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種通過使受病毒感染的細(xì)胞與抑制病毒活化劑量的抗炎藥單獨(dú)接觸或與抗病毒藥聯(lián)合接觸來抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒活化的方法。通過前炎癥調(diào)節(jié)劑的自分泌和旁分泌作用活化炎性細(xì)胞將導(dǎo)致炎癥部位炎性細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的變化。通過這種過程激活炎性細(xì)胞將導(dǎo)致活化潛伏性感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒包括慢病毒如1型免疫缺陷病毒HIV、2型HIV和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。使細(xì)胞與抗炎藥單獨(dú)或與抗病毒藥聯(lián)合接觸可以在體內(nèi)、體外或活體外。當(dāng)抗炎藥與抗病毒藥聯(lián)用時，可在給予抗病毒藥之前、同時或之后給予。細(xì)胞可以是粘膜細(xì)胞，通常是哺乳動物的，較佳地是人的粘膜組織。這些粘膜細(xì)胞的例子包括泌尿生殖組織(如陰道組織)、腸胃組織、下腸胃道組織、口-頰組織和鼻-咽組織等的粘膜細(xì)胞。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種通過使患者與有效量的抗炎藥單獨(dú)或與抗病毒藥聯(lián)合接觸來抑制對象中炎癥介導(dǎo)的粘膜感染的方法。所述的炎癥介導(dǎo)的粘膜感染可以由病毒或其他病原所引起。病毒可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒如1型免疫缺陷病毒HIV、2型HIV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。當(dāng)這種接觸在體內(nèi)時，可以通過局部或全身(如分別通過局部給藥、靜脈內(nèi)、口服或腸胃外給藥)給予抗炎藥。當(dāng)與抗病毒藥聯(lián)用時，抗炎藥可以在給予抗病毒藥之前、同時或之后給予。給藥的對象通常為哺乳動物，較佳地是人。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種抑制炎癥介導(dǎo)的粘膜感染從患有或可能患有炎癥介導(dǎo)的粘膜感染的對象傳播給另一對象的方法，通過使患有或可能患有炎癥介導(dǎo)的粘膜感染的對象與有效量的抗炎藥單獨(dú)或與抗病毒藥聯(lián)合接觸，從而抑制炎癥介導(dǎo)的粘膜感染傳播給其他對象。所述的炎癥介導(dǎo)的粘膜感染可以由病毒或其他病原所引起。所述的病毒可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒如1型免疫缺陷病毒、2型HIV和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。當(dāng)患有或可能患有炎癥介導(dǎo)的粘膜感染的對象接觸藥物是在體內(nèi)時，可以通過局部或全身(如分別通過局部給藥、靜脈內(nèi)、口服或腸胃外給藥)給予抗炎藥。當(dāng)與抗病毒藥聯(lián)用時，抗炎藥可以在給予抗病毒藥之前、同時和之后給予?；加谢蚩赡芑加醒装Y介導(dǎo)的粘膜感染的給藥對象通常為哺乳動物，較佳地是人。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種通過使患者與有效量的抗炎藥單獨(dú)或與抗病毒藥聯(lián)合接觸來抑制對象中炎癥介導(dǎo)的粘膜感染發(fā)展的方法。所述的炎癥介導(dǎo)的粘膜感染可以由病毒或其他病原所引起，或與病毒或其他病原的感染相關(guān)。病毒可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒如1型免疫缺陷病毒HIV、2型HIV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。當(dāng)這種接觸在體內(nèi)時，可以通過局部或全身(例如分別通過局部給藥、靜脈內(nèi)、口服或腸胃外給藥)給予抗炎藥。當(dāng)與抗病毒藥聯(lián)用時，抗炎藥可以在給予抗病毒藥之前、同時或之后給予。給藥對象通常為哺乳動物，較佳地是人。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或減少對象被人免疫缺陷病毒感染的可能性，通過單獨(dú)給予可能有HIV感染的對象預(yù)防有效量的抗炎藥或與抗病毒藥聯(lián)用，通過減少指定組織(如泌尿生殖組織、腸胃或其他粘膜組織)中存在的炎性細(xì)胞的數(shù)量，來抑制HIV的復(fù)制、活化或發(fā)展。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或降低將人免疫缺陷病毒從被HIV感染的對象傳播給另一對象的可能性，通過單獨(dú)給予已感染對象有效量的抗炎藥或與抗病毒藥聯(lián)用，通過減少指定組織(如泌尿生殖組織、腸胃或其他粘膜組織)中存在的炎性細(xì)胞的數(shù)量來抑制HIV的復(fù)制、活化或發(fā)展，從而預(yù)防或減少HIV從感染對象傳播給其他對象的可能性。
還提供了一種藥物組合物，其在設(shè)計用于向粘膜組織送遞藥學(xué)上可接受的載體中含有至少一個劑量的治療有效量的抗炎藥，該劑量是能有效抑制或減少免疫缺陷病毒發(fā)展、感染或傳播可能性的量。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種制品，包括至少一種抗炎藥和該藥物在抑制免疫缺陷病毒感染中的使用說明書。該制品可包括至少一種抗炎藥(單獨(dú))，或與抗病毒藥組合。這種制品包括例如陰莖套、衛(wèi)生棉、隔膜、子宮帽、陰道環(huán)、栓劑和灌腸劑。使用說明可以包括在該制品中，例如預(yù)防免疫缺陷病毒感染的使用說明，或預(yù)防或抑制免疫缺陷病毒從一個對象傳播給另一對象的使用說明。
在以下的附圖和描述中列出了本發(fā)明的一個或多個實(shí)施例的詳述。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)可以從本文的敘述、附圖和權(quán)利要求中顯見。
附圖簡述

圖1顯示了血液和腸粘液CD+4淋巴細(xì)胞上表達(dá)的CCR5受體。流式細(xì)胞計量術(shù)散射圖顯示其代表性對象血液(A)和腸(B)中表達(dá)CCR5和/或CD4的細(xì)胞的定量百分比的淋巴細(xì)胞亞組分析。各圖右上象限的數(shù)量表示該對象中表達(dá)CCR5的CD4+淋巴細(xì)胞的百分比。(C)各個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表六個對象，數(shù)據(jù)來自各對象的血液和腸。所有6個對象的腸樣品與血液相比具有較高的CCR5+CD4+細(xì)胞百分比(P＝0.03)；差異范圍2.0-5.4倍。
圖2顯示了血液和腸粘液CD4+淋巴細(xì)胞上每個細(xì)胞的CCR5受體數(shù)量。流式計數(shù)頻率曲線顯示6個對象之一的CD4+淋巴細(xì)胞上CCR5表達(dá)的量，(A)表示血液和(B)表示腸。CCR5+CD4+粘膜細(xì)胞中平均熒光指數(shù)的右移表明每個CD4+淋巴細(xì)胞的CCR5受體數(shù)量增加。A和B柱上的數(shù)值表示該個體血液和腸中每個CCR5+CD4+淋巴細(xì)胞表達(dá)的CCR5的分子數(shù)量。(C)所有六個對象的腸樣品與與血液相比具有較高的CCR5表達(dá)(P＝0.03)；差異范圍為1.4-3.5倍。每個人的符號與圖1中所用的相同。
圖3顯示了血液和腸粘液CD4+淋巴細(xì)胞上的CXCR4受體的表達(dá)。流式細(xì)胞計量術(shù)散射圖顯示其代表性患者血液(A)和腸(B)中表達(dá)CXCR4和/或CD4的細(xì)胞的定量百分比的淋巴細(xì)胞亞組分析。各圖右上象限的數(shù)量表示該對象中表達(dá)CXCR4的CD4+淋巴細(xì)胞的百分比。(C)各個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表六個對象。兩組參數(shù)之間的百分比沒有差異(P＝0.3)。每個人的符號與圖1中所用的相同。
圖4顯示了用HIVSX和HIVNL4-3感染后，MMC和PBMC產(chǎn)生的p24的微微克量。線形圖表示用M-向性HIVSX(A)或T-向性HIVNL4-3(B)感染3小時后，在第18、72和130小時p24的產(chǎn)量(每104個CD4+淋巴細(xì)胞，微微克)。72和130小時后，存在20IU/ml IL-2(●)的MMC培養(yǎng)上清液比有(○)或沒有()20IU/ml IL-2的PBMC培養(yǎng)上清液含有更高濃度的p24。培養(yǎng)的粘膜細(xì)胞產(chǎn)生更多的p24表明它們比PBMC更易復(fù)制M-或T-向性的HIV-1。
圖5顯示了與常規(guī)的膠原酶/分散酶消化相比，分離的粘膜單核細(xì)胞的3天/IL-2培養(yǎng)物產(chǎn)生了數(shù)量增加的CD45+、CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞。用各方法分離的單核細(xì)胞群在它們的T細(xì)胞亞組組成中沒有表現(xiàn)出明顯差異。
圖6顯示了預(yù)擴(kuò)增處理活檢組織樣品導(dǎo)致5-10％RNA喪失。血清反應(yīng)陰性樣品用250份提取前的標(biāo)準(zhǔn)LTR序列點(diǎn)樣(左)平行樣品為提取后樣品(右)。數(shù)字化定量32P發(fā)射表明提取前和提取后加入相同量LTR RNA存在5-10％差異。標(biāo)準(zhǔn)品顯示試驗靈敏度為10份拷貝。
圖7顯示了在相同周長水平(30cm)的結(jié)腸的不同部位得到的樣品之間的內(nèi)部一致性。每份樣品一式兩份跑電泳。各個體樣品之間的差異平均為0.2log SD。所有對象血漿中都未檢測到病毒。
圖8顯示了直腸活檢組織中HIV的定量測定。從未檢測到血漿HIV RNA的對象的一式兩份活檢組織中提取了DNA。進(jìn)行了HIV LTR序列的qPCR，并且精確檢測了各登記對象的2份樣品的拷貝數(shù)(下圖)。(4個不同對象分別標(biāo)記為“樣品#1-4”)。對每個的對象的2份樣品一式三份進(jìn)行β-珠蛋白定量測定和繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(僅顯示了一個活檢組織的結(jié)果在上圖中)。HIV DNA拷貝的計算值以每2×106個β-珠蛋白拷貝(1×106個細(xì)胞)報告。
圖9顯示了此分離方法不改變相關(guān)受體的表達(dá)。如水平軸和垂直軸所示，上圖為直接用CD4、CD8、CCR5或CXCR4抗體染色的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的流式圖。下圖顯示在接觸用于粘膜單核細(xì)胞分離步驟后對同一個體PBMC平行染色的結(jié)果。
圖10顯示了與血液相比CCR5受體在明顯更高百分比的粘膜CD4+T細(xì)胞上表達(dá)。染色健康的血清反應(yīng)陰性對照(n＝6)樣品的CD4和CCR5粘膜樣品的初始開啟閥門CD45與側(cè)散射)。右上象限中的數(shù)值表示表達(dá)CCR5受體的CD4T細(xì)胞的百分比。
圖11顯示了在與圖10所示的同一對象樣品中，與血液CD4T細(xì)胞相比，粘膜CD4T細(xì)胞上每個細(xì)胞的CCR5受體數(shù)量明顯增加。矩形圖顯示與粘膜制備物中每個細(xì)胞受體數(shù)量增加相關(guān)的平均通道熒光量顯著右移。
圖12顯示在正常的炎癥性和HIV感染的樣品中檢測到粘膜CD4+細(xì)胞的CCR5表達(dá)比血液CD4+T細(xì)胞表達(dá)增加。顯示了血清反應(yīng)陰性健康對照(n＝6)、炎性對照(n＝4)和HIV感染(n＝8)者的CD4+和CCR5+雙染色細(xì)胞的平均百分比。對象組x軸下的P值表示臨床組中血液和腸細(xì)胞之間的顯著性差異。圖上部的P值表示臨床組之間粘膜表達(dá)CCR5的CD4T細(xì)胞之間的顯著水平。
圖13A和13B顯示了在IBD和HIV中(A)血液和(B)腸中CCR5+CD4CD8比例下降。左圖顯示健康者、血清反應(yīng)陰性對照、血清反應(yīng)陰性炎癥對照者和HIV感染對象血液中CCR5的相對表達(dá)。圖下方框中顯示的是表達(dá)CCR5的CD4+T細(xì)胞與表達(dá)CCR5的CD8+T細(xì)胞的比例。(A)中顯示了粘膜淋巴細(xì)胞的類似圖形。
圖14顯示了與外周血單核細(xì)胞(PBMC)相比，粘膜單核細(xì)胞(MMC)中p24(HIV產(chǎn)生的指標(biāo))的量明顯較高。
圖15A和15B顯示了HIV感染患者結(jié)腸中CD8+細(xì)胞增加?；顧z組織來自(A)HIV(-)和(B)HIV(+)結(jié)腸。CD8+細(xì)胞呈棕色(在黑白照片中呈暗色)。
圖16A和16B顯示了HIV感染患者結(jié)腸中CCR5+細(xì)胞的增加。活檢組織來自(A)HIV(-)和(B)HIV(+)結(jié)腸。CCR5+細(xì)胞呈棕色(在黑白照片中呈暗色)。
圖17A到17D顯示了在未感染者、粘膜病毒低量的HIV(+)和粘膜病毒高量的HIV(+)患者中(A)RANTES、(B)IFNγ和(C)THF的量。(D)顯示了活化CD4細(xì)胞數(shù)量的增加(由于HIV誘導(dǎo)了前炎癥性細(xì)胞因子的增加而至HLA-DR增加所示)。y軸表示活化的CD4細(xì)胞％，x軸表示病毒的量。
圖18顯示了由粘膜細(xì)胞(MMC)與血細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生的病毒(Nlegfp)量的增加，如Nlegfp在細(xì)胞中復(fù)制時綠色熒光蛋白質(zhì)表達(dá)增加所顯示。
圖19顯示了Asacol(氨水楊酸)對HIV復(fù)制的影響。用所示量的5-ASA或AZT處理受HIV感染的培養(yǎng)細(xì)胞。用發(fā)光光度計定量熒光素酶的表達(dá)(其表示HIV復(fù)制的量)。所示的數(shù)據(jù)代表9次獨(dú)立的試驗。
發(fā)明詳述必需注意到，除非特別指出，本文及所附權(quán)利要求中的單數(shù)形式“一”、“和”和“該”包括復(fù)數(shù)。所以，例如“一種細(xì)胞”也包括許多這種細(xì)胞。
除非特別指出，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。雖然與本文所述相類似的任何方法、裝置和材料也可用于實(shí)施或測試本發(fā)明，但這里描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
出于描述和公開細(xì)胞系、抗體和方法學(xué)的目的，本文將所有引用的出版物都納入作為參考，這些出版物中所述的可能與本發(fā)明描述的相結(jié)合使用。若有沖突時，以本發(fā)明的說明書包括定義為對照。上述及本文中所述的出版物都是單獨(dú)提供在本申請?zhí)岢銮八鼈兯_的內(nèi)容。本文不能解釋為允許發(fā)明者有權(quán)把已有發(fā)明所公開的日期說得比實(shí)際早。
本文所用的術(shù)語“抑制”或“抑制性”指以可測定量減低活性、功能或特性，如減少至少30％或以上。當(dāng)存在多種不同可能被抑制的活性時(如防止細(xì)胞補(bǔ)充、前炎癥性調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生、細(xì)胞或病毒活化、病毒復(fù)制、或病毒發(fā)展或增殖)，任何單種活性(有或無其他活性)的降低都足以包括在本發(fā)明的定義范圍中。另外，當(dāng)給予一種或多種藥物來抑制活性時，由一種藥物引起的任何單種活性的降低或由藥物組合引起的任何單種活性的降低都足以包括在本發(fā)明的定義范圍中。“炎癥抑制量”指能調(diào)節(jié)、抑制或壓制炎癥反應(yīng)或癥狀所需的抗炎藥的量。
本文所用的術(shù)語“活化”(當(dāng)用于病毒時)指全身或局部病毒顆?；虿《玖康脑黾?，或細(xì)胞中病毒蛋白質(zhì)或核酸合成的增加。這種增加通常是由感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的變化所誘導(dǎo)的，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生病毒的增加。這種增加也可能不依賴于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的這種變化而發(fā)生。感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的變化可能由細(xì)胞因子、趨化因子和/或其他調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化或活動(趨化性)的分子所誘導(dǎo)。感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的變化也可能由病毒或其他病原(細(xì)菌、真菌、分枝桿菌等)所誘導(dǎo)，或者由于接觸免疫調(diào)節(jié)性抗原(如LPS)誘導(dǎo)。通?；罨瘜?dǎo)致病毒量增加進(jìn)而可導(dǎo)致受病毒感染的細(xì)胞數(shù)量增加，也稱為“病毒擴(kuò)散”。
本文所用的術(shù)語“炎癥介導(dǎo)的”當(dāng)用于感染、疾病、紊亂或病癥時，指對象對炎癥應(yīng)答的反應(yīng)中使感染、疾病、紊亂或病癥發(fā)展或擴(kuò)散、或加速或惡化。在逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV)感染的例子中，可能發(fā)生病情發(fā)展，如通過靶(未感染)細(xì)胞遷移到感染細(xì)胞和病毒存在的炎癥部位。補(bǔ)充的細(xì)胞為病毒感染提供了新的靶細(xì)胞，從而導(dǎo)致病毒擴(kuò)散使感染發(fā)展。炎癥介導(dǎo)的情況還包括當(dāng)感染的細(xì)胞(如處于潛伏狀態(tài)的)與免疫調(diào)節(jié)分子或其他信號分子(如前炎癥細(xì)胞因子或其他增強(qiáng)炎癥應(yīng)答的分子)接觸時，調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，從而刺激或增加細(xì)胞產(chǎn)生病毒的量。
本文所用的術(shù)語“粘膜組織”指任何能找到粘膜細(xì)胞的組織，例如包括胃-腸組織(如胃、小腸、大腸、直腸)、泌尿生殖組織(如陰道組織、陰莖組織、尿道)、鼻-喉組織(如鼻組織、喉組織)、口(頰組織)等。其他粘膜組織是已知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(如免疫缺陷病毒感染如HIV感染)是對象組織(如粘膜組織)中存在的一種炎癥。許多報道強(qiáng)調(diào)這是一種粘膜中淋巴細(xì)胞減少或“抗炎癥”狀態(tài)與感染者的血液中進(jìn)行所見相似。因為在健康未感染個體的粘膜組織中存在著數(shù)量增加的活化的、記憶性、表達(dá)共同受體的CD4+細(xì)胞，通過這些組織的易感染性非常高。在對感染的典型應(yīng)答中，粘膜免疫細(xì)胞(大部分如CD8+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)分泌前炎癥性趨化因子和細(xì)胞因子的水平提高而補(bǔ)充其他T-淋巴細(xì)胞到粘膜感染的部位。這種升高的應(yīng)答或“炎癥應(yīng)答”(雖然企圖是限制感染)起著向感染提供數(shù)量明顯增加的新的靶細(xì)胞作用，而有利于病毒的擴(kuò)散。所以，本發(fā)明涉及處理多范圍的逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染、逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)的疾病和紊亂，通過單用抗炎藥或與抗病毒藥聯(lián)用，以預(yù)防或抑制其他易感細(xì)胞補(bǔ)充入對象的發(fā)炎組織，從而預(yù)防炎性細(xì)胞通過發(fā)炎機(jī)制活化炎性細(xì)胞，和通過抑制這些途徑的其他前炎癥介質(zhì)以及預(yù)防其他對象(如未感染的或感染的)與粘膜組織接觸的傳播。能用本發(fā)明的方法治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染包括由許多逆轉(zhuǎn)錄病毒造成的逆轉(zhuǎn)錄病毒紊亂。
例如，在SIV感染的獼猴中，腸胃道是早期CD4+淋巴細(xì)胞缺失和病毒復(fù)制的主要部位，從而提示SIV感染可能主要是一種粘膜免疫系統(tǒng)疾病(Veazey等人，Science 280427(1998)；MacDonald和Spencer，“腸胃和肝免疫學(xué)”，R.H.Heatley編輯(Cambridge University Press，1994)。對人而言，HIV感染也包括粘膜免疫系統(tǒng)，從粘膜樣品中直接回收到感染性病毒顆粒，原位研究已顯示固有層T淋巴細(xì)胞屬于首先受感染的細(xì)胞(Koteler等人，Am.J.Pathol.139823(1991)；Heise等人，J.Infect.Dis.1691116(1994)；Heise等人，Am.J.Pathol.1421759(1993)；SmitMcBride等人，J.Virol.726646(1998)；Clayton等人，Gastroenterology 103919(1992)；Ellakay等人，Am.J.Clin，.Pathol.，153481(1998)。另外，在肛門插入性性交過程中直腸乙狀結(jié)腸的粘膜內(nèi)壁是病毒引入的主要部位(Patterson等人，Am.J.Pathol.153481(1998))。
炎癥炎癥是由許多由前炎癥性介質(zhì)(包括細(xì)胞因子、前列腺素、白細(xì)胞三烯、趨化因子、粘附分子(如LFA-1)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他介質(zhì))引起的許多單一反應(yīng)或相關(guān)級連反應(yīng)造成的。例如，趨化因子受體在允許病毒進(jìn)入CD4+細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用。這些受體的配體(稱為趨化因子)也非常重要。這些趨化因子與前炎癥性細(xì)胞因子都是細(xì)胞的主要刺激劑，但也在炎癥級聯(lián)反應(yīng)的擴(kuò)大中起著其他作用。這些可溶性炎癥介質(zhì)主要從CD8+細(xì)胞產(chǎn)生的。一旦產(chǎn)生它們就可以旁泌性或自分泌方式起作用進(jìn)一步激活它們附近的細(xì)胞和募集其他T細(xì)胞到炎癥部位。這些補(bǔ)充的淋巴細(xì)胞自身已被激活，從而擴(kuò)大了炎癥級聯(lián)反應(yīng)。
炎癥導(dǎo)致刺激淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(CD4+細(xì)胞)。那些包藏HIV的炎性細(xì)胞受刺激時將誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的病毒。腸中(即使是健康的未感染HIV的患者)維持著一種低水平的生理性炎癥狀態(tài)，這是保護(hù)腸內(nèi)壁免受其表面接觸的潛在病原體侵入所必需的。構(gòu)成這種滲透表達(dá)的大部分淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是激活的。HIV的主要靶細(xì)胞(在其中病毒能最有效地復(fù)制)是激活的CD4+細(xì)胞。這種類型的細(xì)胞充滿腸胃粘膜。病毒復(fù)制的增加導(dǎo)致HIV通過粘膜更大擴(kuò)散和更高的粘膜HIV病毒負(fù)荷量?？笻IV治療的主要目的是減少HIV復(fù)制的能力，從而減少其在CD4+細(xì)胞(最終被病毒破壞)間的擴(kuò)散。當(dāng)HIV復(fù)制被有效地減少以致使病毒不能在其遺傳物質(zhì)中產(chǎn)生導(dǎo)致對抗病毒藥物耐受的突變。本文所用的免疫抑制活性指抑制或降低B和T細(xì)胞的反應(yīng)能力而不被募集到炎癥部位或成為活化細(xì)胞。NSAID能減少前列腺素(PG)的合成。PG是細(xì)胞靜止劑。
其他活化炎性細(xì)胞的信號包括粘附受體如LFA-1(CD11a和CD18)結(jié)合于其配對受體如ICAM-1(CD54)(Staunton等人，1990，Cell 61243-254)。如果第二信號被封阻，則抗原特異性T細(xì)胞將通過細(xì)胞程序死亡而死亡，或進(jìn)入細(xì)胞無反應(yīng)性狀態(tài)。用LFA-1和ICAM-1的單克隆抗體阻斷這種相互作用將增加接受心臟異體移植小鼠的存活時間(Isobe等人，1992，Science 255I 125-1 127)。
腸胃粘膜是淋巴組織的一組成部分，增長的證據(jù)提示在疾病所有階段HIV都牽連到粘膜。腸胃道不僅是大部分患者疾病傳播的路徑，也是最大的淋巴組織。如上所述，腸胃粘膜的特征是低水平的生理炎癥狀態(tài)，且它的大部分淋巴細(xì)胞是活化的。存在于粘膜中的天然高濃度的前炎癥細(xì)胞因子看來增加了該部位HIV的復(fù)制，導(dǎo)致粘膜HIV病毒量高且連續(xù)感染新的腸胃靶CD4+細(xì)胞。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)大部分腸胃CD4+細(xì)胞表達(dá)HIV進(jìn)入所必需的趨化因子受體。腸胃粘膜的絕大部分淋巴細(xì)胞表達(dá)CCR5和CXCR4。對CCR5而言，似乎粘膜單核細(xì)胞(MMC)表達(dá)該受體的水平比血液衍生的單核細(xì)胞高(以每個細(xì)胞計算)。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)體外粘膜細(xì)胞比外周血細(xì)胞更易受HIV感染。
可在大部分HIV感染的個體的粘膜中找到HIV核酸；Kotler等人用gag特異性引物通過PCR在其所研究的70％患者(20名)中檢測到HIV DNA。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)即使是血漿中未檢測到病毒的患者在它們的粘膜中也有正復(fù)制的病毒。無論獼猴是通過腸或通過腸胃外途徑感染，都在腸胃粘膜中發(fā)現(xiàn)大量SIV，這表明粘膜先天性高度易受HIV感染。感染后，這些獼猴表現(xiàn)出早期(在7-21天內(nèi))腸胃粘膜CD4+細(xì)胞嚴(yán)重喪失。在其他淋巴組織部位未觀察到如此旺盛的HIV活性信號。在人類，已有人描述在慢性感染的早期無癥狀階段和臨床AIDS發(fā)病后，結(jié)腸和十二指腸中粘膜CD4+細(xì)胞的缺失。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，如與免疫缺陷病毒相關(guān)的感染，尤其是HIV伴有的炎癥狀態(tài)。炎癥可以是細(xì)胞性、可溶性或兩者。炎癥可以發(fā)生在任何數(shù)量易受病毒感染的組織(如粘膜組織)中。證實(shí)炎癥過程與HIV感染有關(guān)及與趨化因子和趨化因子受體(其功能是HIV的共同受體)的作用有關(guān)提供了一種新型的治療這種由免疫缺陷相關(guān)病毒(如HIV-1/2)引起的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。
在粘膜炎癥區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的炎性細(xì)胞(包括大部分CD4-陽性T淋巴細(xì)胞)是活化的、記憶表型、表達(dá)高水平HIV必需的共同受體的細(xì)胞，是HIV的優(yōu)選靶細(xì)胞。包括趨化因子受體等的共同受體(如β-趨化因子的受體)是內(nèi)源性炎癥免疫應(yīng)答功能的一個正常部分。當(dāng)活化時這些趨化因子及其受體引發(fā)循環(huán)性炎性細(xì)胞顯著補(bǔ)充到粘膜部位，導(dǎo)致細(xì)胞性可溶性炎癥。通過用抗炎藥抑制粘膜組織感染(由于存在炎癥而增強(qiáng))將提供一種有效的方法來減少這種粘膜組織疾病的活化、發(fā)展和擴(kuò)散。
因此，采用抗炎藥提供了一種有用的方法來緩和、控制或降低逆轉(zhuǎn)錄病毒感染造成的炎癥應(yīng)答。由于炎癥常通過前炎癥介質(zhì)(包括，但不限制于前列腺素、白細(xì)胞三烯、細(xì)胞因子、趨化因子和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他介質(zhì))導(dǎo)致其他炎性細(xì)胞的補(bǔ)充和活化，因此減少這種補(bǔ)充和活化將能減少HIV感染可用的CD-4陽性細(xì)胞的數(shù)量。
所以，可用于本發(fā)明的抗炎藥包括那些能減少炎性細(xì)胞補(bǔ)充、降低趨化因子和前炎癥細(xì)胞因子(維持炎癥級聯(lián)反應(yīng))產(chǎn)生的藥物，和抑制趨化因子或細(xì)胞因子受體(如通過抑制趨化因子受體與其配體的相互作用)來預(yù)防炎癥信號傳播的藥物。這些藥物包括“抗炎癥抗體”，它們能結(jié)合于上述抗體所識別的蛋白質(zhì)分子并抑制其生物活性。這些抗體包括所設(shè)計的能與細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、趨化因子、趨化因子受體反應(yīng)的抗體，設(shè)計它們來降低或預(yù)防炎癥應(yīng)答或提供給患者(例如人)。
本發(fā)明還考慮了各種藥物組合物，它們能阻斷逆轉(zhuǎn)錄和免疫缺陷病毒的復(fù)制或在對免疫缺陷病毒復(fù)制的反應(yīng)中阻斷細(xì)胞因子的分泌。本發(fā)明的藥物組合物可以通過將抗體、分離的肽、核酸序列或其他抗炎藥或本發(fā)明的藥物，用載體、賦形劑和添加劑或輔助劑制備成適合給予對象的形式(如藥學(xué)上可接受的載體)。通常使用的載體或輔助劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其他糖、滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動物和植物油、聚乙二醇和溶劑(如無菌水、醇、甘油和多元醇)。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑。防腐劑包括抗菌藥、抗氧化劑、鰲合劑和惰性氣體。其他藥學(xué)上可接受的載體包括水溶液、無毒賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑等，參見Remington’sPharmaceutical Sciences，第15版，EastonMack Publishing Co.，1405-1412，1416-1487，1975和The National Formulary XIV，第14版，WashingtonAmerican Pharmaceutical Association，1975，本文將它們的內(nèi)容納入作為參考。按本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)調(diào)節(jié)藥物組合物中各種成分的pH和精確濃度。參見Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis for Therapeutics，第7版。這些藥物組合物可包括一種或多種抗炎藥和聯(lián)合一種或多種抗病毒藥。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及阻斷或抑制免疫缺陷病毒復(fù)制或擴(kuò)散，或在對免疫缺陷病毒的反應(yīng)中阻斷或抑制細(xì)胞因子分泌的方法。該方法包括給予對象治療有效量的含有本發(fā)明化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物?！敖o予”本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法實(shí)現(xiàn)?！皩ο蟆敝溉魏尾溉閯游?，尤其指人。
較佳地制備好藥物組合物并以劑量單位給予。固體劑量單位是片劑、膠囊和栓劑。對于治療患者而言，根據(jù)化合物的活性、給藥方式、疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、患者的年齡和體重，需要不同的日劑量。而在某些情況中，較高或較低的日劑量可能是適當(dāng)?shù)?。日劑量的給予，可以單劑量形式單次給予或分成幾次較少的劑量，以特定間隔時間多次給予。
劑量不能大到引起不良副作用，如不良的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等。通常，劑量應(yīng)按患者的年齡、病癥、性別和疾病或感染的程度而不同，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。如果有禁忌癥時可由病人的醫(yī)生調(diào)節(jié)劑量，這無需過多試驗就可確定。任何情況下，治療的有效性可通過例如監(jiān)測免疫缺陷病毒感染患者炎癥部位(如粘膜組織)的HIV RNA水平或DNA病毒負(fù)荷量來確定，或通過其他方法包括測定炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子和/或CD4+細(xì)胞來確定。組織中CD4+細(xì)胞的相對數(shù)量、細(xì)胞因子、前炎癥介質(zhì)或趨化因子水平的減少或穩(wěn)定應(yīng)與個體或組織中的炎癥水平相關(guān)。
本發(fā)明的藥物組合物通常以局部、靜脈內(nèi)、口服或腸胃外方式給予，或植入。直腸和陰道給藥證明更有效，因為通常它們是首先接觸病毒和粘膜組織發(fā)炎的部位。藥物可以接觸這些部位以預(yù)防或抑制感染或傳播。合適的固態(tài)或液態(tài)藥物制劑形式如顆粒、粉末、藥片、糖衣片、微膠束、栓劑、糖漿、乳劑、懸浮劑、乳膏、凝膠、氣霧劑、滴液或安瓿形式的注射溶液，也可制備成緩釋的活性化合物，制備中如上所述通常使用賦形劑、調(diào)節(jié)劑和/或輔助劑如崩解劑、結(jié)合劑、涂層劑、膨脹劑、潤滑劑、調(diào)味劑、甜味劑或增溶劑。該藥物組合物適合用各種藥物送遞系統(tǒng)。已有藥物送遞的方法的簡短綜述參見Langer，Science，2491527-1533，1990，本文將其納入作為參考。
本發(fā)明的藥物組合物可以局部或全身給予?！爸委熡行┝俊敝割A(yù)防或治療或至少部分制止或減少疾病癥狀及其并發(fā)癥所必需的本發(fā)明化合物的量。如此使用的有效量當(dāng)然取決于疾病或感染的嚴(yán)重程度和對象的體重和總體狀況。通常，體外使用的劑量可提供原位給予該藥物組合物有用量的指南，動物模型可用于確定治療特定紊亂的有效劑量。已描述了各種要考慮的因素，如Gilman等人編輯的Goodman和Gilman的“the Pharmacological Bases of Therapeutics”第8版，Pergamon Press，1990；和Remington’s Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa，1990，本文將它們分別納入作為參考。通過確定免疫缺陷病毒感染患者的炎癥部位(如粘膜組織)的HIV RNA或DNA水平或病毒負(fù)荷量；通過與感染相關(guān)的一種或多種癥狀的減少；或通過其他方法包括用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法測定炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子和/或CD4+細(xì)胞的量，來監(jiān)測劑量的有效性。
本發(fā)明的免疫治療方法包括對處在被免疫缺陷病毒感染危險者進(jìn)行預(yù)防的方法。例如，用于對處于HIV感染危險的人的方法?？寡姿幍摹邦A(yù)防有效”量指通過減少、抑制或預(yù)防炎癥應(yīng)答能抑制HIV復(fù)制、活化或發(fā)展的量。HIV傳播通過至少三種已知的路徑性交、輸血(血產(chǎn)品)和胎盤。通過血液的感染包括靜脈內(nèi)藥物使用者之間的傳播。由于接觸HIV不一定導(dǎo)致有癥狀的感染(如血清轉(zhuǎn)變所測定)，所有人都有潛在的危險，所以用本發(fā)明治療方法作預(yù)防性治療是值得考慮的。
本發(fā)明的抗炎性組合物可用于預(yù)防活性或預(yù)防傳播，包括如涂有抗炎藥或以抗炎藥潤滑的陰莖套；包括膠囊的陰莖套，膠囊用于破裂后釋放出抗炎藥；陰道用品，包括隔膜、子宮帽、衛(wèi)生棉、涂有或以抗炎藥潤滑的環(huán)；陰道沖洗液、乳膏、凝膠潤滑劑、栓劑、泡沫、或含有抗炎藥的殺精凝膠和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的將抗炎藥局部送遞給性交時接觸的粘膜組織的其他組合物和制品。這些制品可用于預(yù)防或抑制患者傳染給他人，或用于預(yù)防或抑制受感染者傳播給其他人。
本文所述和在本發(fā)明方法中使用的組合物可以是在受免疫缺陷病毒之前(即預(yù)防性地)、或在如下所述的任何階段、和初期感染之后給予患者，或在感染后給予以預(yù)防隨后的傳播。例如，HIV感染可以分為如下過程(1)約15％感染者具有急性病，特征為發(fā)燒、皮疹、和淋巴結(jié)腫大和接觸HIV六周內(nèi)發(fā)生腦膜炎。這種急性感染后，這些個體變成無癥狀。
(2)其余的HIV感染者可以沒有癥狀幾年。
(3)某些個體發(fā)生持續(xù)性全身性淋巴腺病(PLG)，特征為頸部、腹股溝和腋窩淋巴結(jié)腫脹。5-10％PGL的個體將回復(fù)成無癥狀。
(4)任何這些個體可能發(fā)展成AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)，ARC患者不能回復(fù)成無病癥狀態(tài)。
(5)ARC和PGL患者以及無癥狀者最終(數(shù)月或幾年后)都將發(fā)展成AIDS，而必然導(dǎo)致死亡。
抗炎藥本文所用的“抗炎藥”指能減少、預(yù)防或調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的藥物，如通過減少炎性細(xì)胞的補(bǔ)充；減少趨化因子的產(chǎn)生；減少前炎癥趨化因子的產(chǎn)生；減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生；或抑制趨化因子或細(xì)胞因子與其受體的相互作用。這些藥物包括如抗炎抗體(如抗細(xì)胞因子、抗受體的抗體)、肽(如炎癥介質(zhì)的促效劑或拮抗劑，細(xì)胞因子如IL-1、或受體如IL-1受體的拮抗劑，或可溶性TNF受體)、核酸(如編碼抗炎藥、抗炎肽、核糖酶或反義分子的核酸)、類固醇(如強(qiáng)的松)、非甾類抗炎藥(如阿司匹林)、5-ASA產(chǎn)物、通常使用的抗炎藥和它們的組合。
用于本發(fā)明的抗炎抗體的例子包括細(xì)胞因子及其受體的抗體，如抗白細(xì)胞介素受體的抗體、抗細(xì)胞因子的抗體(如抗THF的抗體，如Centocor制造的REMICAD)、抗趨化因子抗體(參見Olson等人，J.of Virol.73(5)4145-4155(1999)，本文將其納入作為參考)抗趨化因子受體的抗體(如抗CCR5或抗CXCR4受體抗體)和它們的組合。其他抗體包括針對產(chǎn)生前炎癥介質(zhì)的酶通路的酶的抗體，如美國專利No.5,767,249中所述的1型磷酸酯酶A2的抗體，本文將該專利納入作為參考)。
用于本發(fā)明的抗炎癥核酸的例子包括編碼抗炎癥肽的核酸、切割編碼前炎癥多肽(如細(xì)胞因子或趨化因子)的RNA的核糖酶、能與編碼前炎癥介質(zhì)(如細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、趨化因子、趨化因子受體、本文所公開的其他炎性肽或受體)的核酸序列雜交的反義分子和它們的組合，或本領(lǐng)域技術(shù)人員不難鑒定的反義分子。
抗炎癥肽的例子包括LFA粘附分子拮抗劑、細(xì)胞因子受體拮抗劑、轉(zhuǎn)錄因子、可溶性THF-α受體多肽。其他抗炎癥肽包括例如轉(zhuǎn)錄因子如NF-卡巴B(Schottelius AJ等人，Int J Colorectal Dis 1999 Feb；14(1)18-28)、血小板因子4的肽(美國專利No.5,776,892，本文將其納入作為參考)、和基于美國專利No.5,766,593(本文將其納入作為參考)所公開的CD14的肽。
抗炎癥細(xì)胞因子的例子包括如細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子?？寡装Y細(xì)胞因子包括如IL-13(Watson ML，Am J Respir Cell Mol Biol 1999年5月1日；20(5)1007-1012)；IL-4和IL-10(Jarvelainen HA等人，Hepatology 1999年5月；29(5)1503-10)、IL-6(Klimiuk PA等人，J Immunol.1999年4月1162(7)429-4299)和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗炎癥細(xì)胞因子。
用于本發(fā)明的抗炎藥的例子包括各種甾類、非甾類、水楊酸水溶性和水不溶性藥物和它們的酸加成鹽或金屬鹽。只要抗炎藥保持其藥用價值，也可采用其有機(jī)和無機(jī)鹽?？寡姿幙蛇x自廣泛范圍的治療劑和治療劑的混合物(可以緩釋或持續(xù)作用形式給予)。
非甾類抗炎藥(NASID)包括各種多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物。據(jù)信如果不是全部其大部分都具有共同的作用機(jī)制，幾乎所有的都是有機(jī)弱酸。這一大類化合物可分為2組，羧酸(R-COOH)和烯醇酸(R-COH)。還可按化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分組。烯醇酸的主要分組是吡唑啉酮如苯基保泰松、羥保泰松、安乃近和異吡林堿，以及包括吡羅昔康和米羅昔康(miloxicam)的昔康(xicam)。羧酸亞組包括水楊酸酯，如乙酰水楊酸(阿司匹林)；丙酸如布洛芬和萘普生；氨茴酸如甲氯滅酸；苯基乙酸如醋氨酚；氨基煙酸如氟氨煙酸(flunixin)；和二氫吲哚如吲哚美辛。
就那些作用機(jī)制已知的NASID而言，已發(fā)現(xiàn)大部分通過抑制環(huán)氧合酶和脂肪氧合酶通路來抑制花生四烯酸代謝產(chǎn)物的形成，從而降低這些代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的炎癥。環(huán)氧合酶將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成環(huán)形內(nèi)過氧化物、PGG2和PGH2(也稱為PGs)。通過其他特異性酶的作用，這些化合物轉(zhuǎn)化成炎癥介質(zhì)家族其包括PGE2和PGI2的不同成員-類二十烷酸。然而，不同組織中環(huán)氧合酶的結(jié)構(gòu)各不相同，且NASID與這些酶聯(lián)合的能力也各不相同，這就解釋了效力和品種應(yīng)答間的差異。
非甾類抗炎藥(具有商標(biāo)名、一般名稱、劑量的標(biāo)準(zhǔn)量和化學(xué)結(jié)構(gòu))的非限制性說明例子，包括如下藥物布洛芬(如MOTRIN300、400、600、800mg，ADVIL200mg)(±)-2-(對-異丁基苯基)丙酸；托美丁(TOLECTIN)5-(對-甲苯酰)-1-甲基吡咯-2-乙酸；萘普生(如ALEVE、ANAPRFX或NAPROSYN)250、375和500mg，6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸，(+)；氟比洛芬(ANSAID)，50mg和100mg，2-氟-α-甲基-[1，1’-二苯基]-4-乙酸，(±)；舒林酸(CLINORN)150和250mg，5-氟-2-甲基-1-[[對-(甲基亞磺酰)苯基]-亞甲基]-1H-茚-3-乙酸；二氟尼柳(FLOVACIL)250和500mg，2’，4’-二氟-4-羥基-[1，1’-二苯基)-3-羧酸；吡羅昔康(FELDENE)4-羥基-2-甲基-N-2-吡啶基-2H-1，2-苯并噻嗪-3-甲酰胺1，1-二氧化物；吲哚美辛(INDOCIN)25和50mg，1-(4-氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-乙酸；依托度酸(ULTRADOL)1，8-脫乙基-1，3，4，9-四氫吡喃-[3，4-b]吲哚-1-乙酸；甲氯滅酸鈉(MECLOMEN)50和100mg，N-(2，6-二氯-M-甲苯基)氨茴酸鈉鹽，一水合物；非諾洛芬和非諾洛芬鈣(NALFON)作為二水合物，200mg和300mg，芳基乙酸的衍生物，α-甲基-3-苯氧基苯乙酸；酮咯酸氨丁三醇；酮洛芬(ORUDIS)，25、50和75mg，2-(3-苯甲?；交?-丙酸；甲氯芬鈉酸鈉；甲芬那酸(BONABOL)N-(2，3-二甲苯基)氨茴酸；萘丁美酮；酮咯酸氨丁三醇；雙氯芬酸鈉(PROPHENATIN)2-[(2，6-二氯苯基)氨基]苯乙酸單鈉鹽；溴芬酸鈉；保泰松(BUTAZOLIDIN)100mg，4-丁基-1，2-二苯基-3，5-吡咯烷二酮；其他COX-2抑制劑如賽羅可比(celocoxib)、美洛昔康、尼美舒利和羅非可比(rofecoxib)；舒洛芬；芬布洛芬(fenbuprofen)；氟洛芬；Midol-PMS、醋氨酚，500mg；Tylenol Extra Strength，醋氨酚，500mg；酞胺哌啶酮；噁丙嗪；含水楊酸酯化合物和月見草油(含有約72％亞油酸和約9％γ-亞油酸)，其單異構(gòu)體和它們的組合。
水楊酸酯抗炎藥的非限制性具體實(shí)例包括以下藥物水楊酸亞鉍；雙水楊酯；水楊酸和水楊酸衍生物，如硫代水楊酸鈉、膽堿水楊酸酯、水楊酸鎂、二氟尼柳、布洛芬、甲氧萘丙酸、舒林酸、二氟尼柳、水楊酰水楊酸、膽堿三水楊酸鎂、乙?；畻钏帷㈦p水楊酯、水楊酸鈉和它們的組合；5-氨基水楊酸(5-ASA)和含有5-ASA的產(chǎn)物或化合物，如口服氨水楊酸(由Procter & GamblePharmaceuticals制造的ASACOL，Roberts Pharmaceuticals制造的PENTASA)、氨水楊酸直腸灌腸劑或泡沫或栓劑、硫氮磺胺吡啶、巴柳氮、伊普柳氮和奧撒拉嗪(Pharmacia Upjohn制造的DEPENTUM)和它們的混合物。
甾類抗炎藥包括糖皮質(zhì)激素。甾類抗炎藥的非限制性具體實(shí)例包括以下藥物氟尼縮松、曲安西龍、丙酮曲安西龍、二丙酸倍氯米松、二丙酸倍他米松、氫化可的松、可的松、地塞米松、丁地去炎松、潑尼松、甲潑尼龍、潑尼龍，這些化合物的酯和它們的組合?？寡姿幍钠渌窍拗菩詫?shí)例包括沙利度胺(由Celgene制造)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，即病毒的基因組是RNA。當(dāng)宿主細(xì)胞被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染時，其基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA中間產(chǎn)物，此DNA產(chǎn)物高效地整合入被感染細(xì)胞的染色體DNA中。被整合的DNA中間產(chǎn)物稱為原病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒家族包括單鏈包膜RNA病毒，通常感染哺乳動物如牛、猴、羊和人。逆轉(zhuǎn)錄病毒在RNA病毒中非常獨(dú)特的，因為它們的復(fù)制包括合成RNA的DNA拷貝，隨后將其整合如被感染細(xì)胞的基因組中。
逆轉(zhuǎn)錄病毒家族由三類組成泡沫病毒(或泡沫狀病毒)例如人泡沫病毒(HFV)；慢病毒如綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒；和致癌病毒(雖然該組中不是所有病毒都是致癌的)。本文所用的術(shù)語“慢病毒”其常規(guī)意義用于描述含有逆轉(zhuǎn)錄酶的一個病毒屬。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，其包括1型和2型人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在缺乏有效的治療方法時，大部分感染人免疫缺陷病毒的個體將發(fā)展成獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)并死于機(jī)會性感染和由于免疫系統(tǒng)損壞或病毒的直接作用而致的惡性腫瘤。致癌病毒可根據(jù)顆粒的形態(tài)(如病毒成熟過程中在電子顯微鏡下所見)進(jìn)一步分成A類、B類、C類和D類。A類顆粒為被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中所見的B-和D-型病毒的不成熟顆粒。這些顆粒沒有感染性。B類顆粒作為成熟的病毒粒子，由胞質(zhì)內(nèi)的A類顆粒包裹著胞質(zhì)膜從膜上出芽。在膜上它們具有一個75mm的環(huán)形核心，一個長的糖蛋白釘狀物由此突起。出芽后，B類顆粒含有一位于偏心位置的密電子核心。原型B類病毒是小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)。在C類病毒感染的細(xì)胞中沒有觀察到胞漿內(nèi)顆粒。相反，成熟顆粒通過月牙狀‘C’形凝聚從細(xì)胞表面直接出芽，然后自身閉合，被胞質(zhì)膜包圍。包膜糖蛋白突起物與均勻的密電子核心一起可以看見。出芽可能從表面的胞質(zhì)膜上發(fā)生或直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的液泡。C類病毒是最普遍研究的，包括許多禽類和鼠類白血病病毒。牛白血病病毒(BLV)和I和II型人T-細(xì)胞白血病病毒(HTL-I/II)因它們自細(xì)胞表面出芽的形態(tài)，類似地歸類為C類顆粒。但它們也具有規(guī)則的六角形形態(tài)，且比原型C類病毒(如鼠白血病病毒(MLV))具有更復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)。D型顆粒與B型顆粒類似，因為它們在被感染的細(xì)胞中呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)(自細(xì)胞表面出芽)，但病毒顆粒摻入了短的表面糖蛋白突起。顆粒中密電子核心也位于偏心位置。麥菲猿猴病毒(MPMV)是原型D類病毒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是根據(jù)它們復(fù)制遺傳物質(zhì)的方式定義的。在復(fù)制過程中，RNA轉(zhuǎn)化成DNA。細(xì)胞感染后，由攜帶在病毒顆粒中的2分子DNA，通過稱為逆轉(zhuǎn)錄的分子加工，生成DNA的雙鏈分子。DNA形式作為原病毒共價整合入宿主細(xì)胞基因組中，借助細(xì)胞內(nèi)因子和/或病毒因子表達(dá)病毒RNA。表達(dá)的病毒RNA被包裝成顆粒，并作為傳染性病毒顆粒釋放。
逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒由兩種相同的RNA分子構(gòu)成。各基因組是正義單鏈RNA分子，其在5端加帽并在3’端有聚酰苷酸化尾。二倍體病毒顆粒含有與gag蛋白復(fù)合的2條RNA鏈、病毒酶(pol基因產(chǎn)物)和宿主tRNA分子(在gag蛋白的‘核心’結(jié)構(gòu)中)。環(huán)繞和保護(hù)此衣殼的是一脂雙層，其產(chǎn)生自宿主細(xì)胞膜并含有病毒包膜蛋白。包膜蛋白結(jié)合于病毒的細(xì)胞受體，病毒顆粒通常通過受體介導(dǎo)的胞吞作用和/或膜融合而進(jìn)入宿主細(xì)胞。
當(dāng)外包膜被屏蔽后，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA被拷貝成DNA。這是由pol區(qū)域所編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶催化的，并利用包裝入病毒顆粒的宿主細(xì)胞tRNA作為DNA合成的引物。由此RNA基因組轉(zhuǎn)變成DNA基因組。
在整合入宿主細(xì)胞基因組之前，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的雙鏈線性DNA可能也可能不需要在細(xì)胞核中環(huán)化。此時原病毒在各端具有2個相同的重復(fù)序列，稱為長末端重復(fù)序列(LTR)。兩個接合的LTR序列之間的連接產(chǎn)生了pol產(chǎn)物(催化整合的整合酶蛋白)識別的位點(diǎn)，從而原病毒總是結(jié)合于宿主DNA的LTR端的2個堿基對(bp)。可在這兩個LTR的末端可以看到一式兩份的細(xì)胞序列，使人聯(lián)想到轉(zhuǎn)座遺傳元件的整合模式。據(jù)信整合基本是在靶細(xì)胞基因組中隨機(jī)發(fā)生的。
整合的病毒DNA的轉(zhuǎn)錄、RNA剪接和翻譯是由宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)所介導(dǎo)的。產(chǎn)生各種剪接轉(zhuǎn)錄物。對人逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV-1/2和HTLV-I/II而言，病毒蛋白質(zhì)也用于調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。細(xì)胞和病毒因子之間的相互作用對控制病毒的潛伏狀態(tài)和時序序列(其中有病毒基因表達(dá))是重要的。
逆轉(zhuǎn)錄病毒可水平和垂直性傳播。逆轉(zhuǎn)錄病毒的有效傳染性傳播需要其受體在靶細(xì)胞(其特異性識別病毒的包膜蛋白)上的表達(dá)，雖然病毒可以用受體非依賴性非特異性途徑進(jìn)入(效率較低)。另外，當(dāng)病毒結(jié)合和滲透后(病毒的核酸進(jìn)入細(xì)胞)，靶細(xì)胞的類型必需能夠支持復(fù)制周期的所有階段。當(dāng)病毒的基因組整合入宿主的種系時，發(fā)生垂直性傳播。雖然原病毒是細(xì)胞內(nèi)基因，但其將一代傳一代。因此，內(nèi)源性原病毒確立了，其通常是潛伏的，但當(dāng)宿主與適當(dāng)因子接觸時可活化。本發(fā)明組合物和方法中所用抗病毒藥可靶向病毒生命周期中的任何階段。
已將致癌病毒(通常稱為RNA腫瘤病毒)再分為以下兩類病原，稱為急性轉(zhuǎn)化和慢性轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
急性轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)錄病毒能轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的細(xì)胞并迅速導(dǎo)致易感動物疾病。這些病毒在病毒基因組中通常攜帶有一癌基因(v-onc)，其直接負(fù)責(zé)它們的致腫瘤性，且各類病毒中各不相同。已從獲得病毒的細(xì)胞基因衍生得到病毒癌基因，可能是病毒顆粒中包含細(xì)胞RNA的結(jié)果。隨后在逆轉(zhuǎn)錄期間病毒和細(xì)胞RNA之間發(fā)生重組使細(xì)胞的序列摻入病毒基因組中，并將此新的單元送遞入宿主細(xì)胞的DNA中。如果轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因通常在控制細(xì)胞生長和分化中起中心作用，編碼序列和/或表達(dá)控制(其經(jīng)歷了摻入病毒基因組)的變化可能賦予其致癌性。通過置于新的決定病毒轉(zhuǎn)錄的控制(定量和時序)下和/或通過對編碼序列作持久的關(guān)鍵性突變，這些細(xì)胞的原型癌基因(c-onc)可能變成癌基因。然而，完全的細(xì)胞轉(zhuǎn)化通常需要表達(dá)v-onc并聯(lián)合以靶細(xì)胞中的其他遺傳和后成性改變。
慢性轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒通常不含有‘經(jīng)典’的癌基因。據(jù)信轉(zhuǎn)化機(jī)制包括原病毒插入到細(xì)胞原型癌基因的編碼區(qū)域中或附近，稱為插入性誘變。病毒LTR中的強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子序列可以從距原癌基因幾千個堿基對的距離發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。細(xì)胞基因表達(dá)的正常調(diào)節(jié)被破壞，且過量表達(dá)或不適當(dāng)時間的表達(dá)可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化。
HTLV-I是一種慢性轉(zhuǎn)化病毒，通常與成人T細(xì)胞白血病(ATL)相關(guān)，但它可能通過不同的途徑(涉及病毒編碼的調(diào)節(jié)蛋白，尤其是p40tax，其反式激活細(xì)胞原癌基因的表達(dá))促進(jìn)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化。也已指出HIV-1和2二者直接和間接促進(jìn)各種類型的惡性腫瘤(如Kaposi肉瘤)，這些腫瘤在AIDS患者中發(fā)生的頻率比普通人群中高得多。然而，HIV在惡性腫瘤轉(zhuǎn)化中的直接作用依舊令人懷疑，因為許多因其他感染或治療(如移植接受者)而致免疫抑制的患者產(chǎn)生腫瘤的比率增加。
雖然MPMV最初與獼猴的乳腺腫瘤相關(guān)，但D類病毒與惡性腫瘤沒有病因?qū)W關(guān)系。D類病毒通過未知的機(jī)制導(dǎo)致靈長類猿的免疫抑制。免疫抑制也是慢病毒(如HIV和SIV)和貓白血病病毒(FeLV)變異菌株感染的一種特征。被HIV和FeLV感染(n)后，已觀察到大量未整合的原病毒DNA，這可能與發(fā)病機(jī)理相關(guān)。
包括HIV-1/2和綿羊脫脊鞘性腦白質(zhì)炎病毒的慢病毒與導(dǎo)致免疫抑制和神經(jīng)紊亂的慢性進(jìn)行性疾病相關(guān)。HIV是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的廣為人知的致病因子。
本發(fā)明的藥物組合物和方法包括單用抗炎藥(抗體、肽、模擬肽(peptidomimetic)、化學(xué)組合物等)或與抗病毒藥(如抗體、肽、病毒蛋白、酶抑制劑等)聯(lián)用，來治療患有或有危險患免疫缺陷病毒(如HIV)相關(guān)疾病，或傳播或可能傳播HIV相關(guān)疾病的人。AIDS和ARC是這些疾病的具體例子。已認(rèn)識到HIV相關(guān)疾病主要見于“危險”人群包括同性戀活躍的男性、靜脈藥物使用者、血液或血制品接受者和中非和加勒比海地區(qū)的某些人群。該綜合癥還在所有“危險”人群的異性戀伴侶和受感染母親的嬰兒中發(fā)現(xiàn)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒與許多疾病相關(guān)，包括貧血、神經(jīng)紊亂、免疫抑制和惡性腫瘤。例如HTLV-I與熱帶痙攣性下身輕癱有關(guān)，這是一種在某些方面與多發(fā)性硬化癥類似的疾病。
抗病毒藥本文所用的“抗病毒藥”指能夠抑制、減少、預(yù)防或調(diào)節(jié)病毒感染或病毒生命周期的各步驟或階段產(chǎn)生病毒的藥物，例如通過抑制、減少、預(yù)防病毒感染的起始步驟，如病毒通過細(xì)胞表面的受體或不依賴于細(xì)胞表面受體融合于細(xì)胞，隨后病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞(“進(jìn)入抑制劑”)；病毒核酸的逆轉(zhuǎn)錄(“逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑”)；逆轉(zhuǎn)錄的病毒核酸整合入細(xì)胞的基因組(“整合抑制劑”)；原病毒核酸轉(zhuǎn)錄或復(fù)制；成熟病毒蛋白質(zhì)的翻譯或形成；傳染性病毒顆粒的形成/裝配；減少成熟的病毒顆粒從細(xì)胞出芽或釋放；和減少與病毒融合或感染、復(fù)制、成熟或從細(xì)胞出芽或釋放相關(guān)的酶的活性和數(shù)量。
抗病毒藥的例子包括多肽或其功能性模擬物，如結(jié)合病毒的可溶性細(xì)胞表面受體肽、細(xì)胞表面受體的配體、結(jié)合細(xì)胞表面受體或病毒顆粒的抗體或抗體片斷，從而防止病毒和細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面受體之間的結(jié)合。對抗病毒藥靶向性特別有吸引力的病毒蛋白質(zhì)包括包膜多肽gp120或pg41。對抗病毒藥靶向性尤其有吸引力細(xì)胞表面受體包括X4和R5受體。
本文所用的術(shù)語“功能性模擬物”指經(jīng)過化學(xué)或結(jié)構(gòu)修飾的分子，但其具有一種或多種未修飾分子的活性(即功能)或甚至活性提高。所以，就抗病毒藥的功能性模擬物而言，該模擬物保留了該抗病毒藥的一種或多種抗病毒活性。功能性模擬物的具體類型是多肽或肽模擬物(“肽模擬物”)，它是一種模擬肽三維結(jié)構(gòu)的化合物，模擬意即模仿。通過三維計算機(jī)模型方法可以輔助肽模擬物的設(shè)計，可將其設(shè)計成具有其他特性(提高治療應(yīng)用)。例如，可將反義分子設(shè)計成含有非天然核苷酸或進(jìn)行化學(xué)修飾，以抑制體內(nèi)核酸酶消化該反義分子。
抗病毒藥的其他例子是抑制對病毒生命周期重要的細(xì)胞或病毒酶，如病毒蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶?？共《舅幍木唧w例子包括例如病毒融合抑制劑如T20和T20模擬物(Trimeris，Inc.)；進(jìn)入抑制劑；整合酶抑制劑；蛋白酶抑制劑(如沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、那非那韋、安潑那韋)；核苷逆轉(zhuǎn)錄抑制劑(如齊多夫定(AZT)、斯塔夫定(d4T)、拉米夫定(larnivudine)(3TC)、雙脫氧胞苷(DDI)、扎西他賓(ddC)、阿巴卡韋(abacavir))；非核苷逆轉(zhuǎn)錄抑制劑(如奈韋拉平、地拉夫定、埃法韋茲(efavirenz))；抑制病毒成熟成為傳染性病毒的抑制劑(如“鋅指注射劑(zinc finger iniectors)”，一類抑制適當(dāng)病毒α核殼體蛋白質(zhì)裝配的抑制劑，從而防止傳染性病毒顆粒的形成)；和它們的混合物。用抑制病毒成熟或病毒蛋白質(zhì)成熟的藥物可抑制病毒出芽或從細(xì)胞釋放。
粘膜炎癥的控制大部分感染HIV的患者使用的高活性抗病毒治療(HAART)使感染HIV的患者預(yù)期壽命延長。但不幸的是，盡管血漿病毒量降低至不能測得的水平，但許多研究表明淋巴器官中HIV依舊在不斷復(fù)制。研究顯示88％病人血漿病毒負(fù)荷量不能檢查到但在他們的腸胃粘膜中有可定量的HIV核酸。
所以，雖然HARRT將血漿病毒負(fù)荷量降低至不能檢查水平，但當(dāng)治療停止時絕大部分患者血漿病毒血癥反彈性升高，推測是由于血液外存在著病毒儲存。已在淋巴組織中發(fā)現(xiàn)這種病毒儲存，其中居留著機(jī)體的大部分(98％)淋巴細(xì)胞。由于腸胃粘膜含有機(jī)體的大部分淋巴細(xì)胞(40-65％)，其很可能代表HIV的最大儲存，并因此是抗HIV治療的主要靶標(biāo)。鑒于HIV疾病中粘膜炎癥狀態(tài)升高，本發(fā)明具體方法的一個重點(diǎn)就是減少粘膜炎癥。通過治療降低粘膜區(qū)室中前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平能預(yù)防病毒增強(qiáng)的復(fù)制也可能預(yù)防病毒產(chǎn)生耐藥性突變。另外，降低可溶性炎癥還能減弱新的CD4+細(xì)胞補(bǔ)充入HIV感染的粘膜，從而預(yù)防或抑制HIV在機(jī)體淋巴細(xì)胞群中的潛伏擴(kuò)散。
鑒定抗炎藥的有效性可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法來評估體外以及體內(nèi)抗炎藥對抑制、治療或減少粘膜細(xì)胞、組織和對象中逆轉(zhuǎn)錄病毒的活化或發(fā)展的影響。這些方法適用于廣泛范圍的抗炎藥和粘膜細(xì)胞感染。例如，用如下所述的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以評估抗炎藥對粘膜組織中HIV感染和對象的粘膜組織的作用。僅為了說明，以下概括了對含有沙利度胺和5-ASA化合物或制品作用的評估方法，但這些實(shí)施例僅起說明的作用對本發(fā)明的范圍沒有任何限制。還顯示了用氨水楊酸(Asacol)抑制細(xì)胞中HIV復(fù)制的資料。
沙利度胺沙利度胺是一種強(qiáng)抗炎藥。它的免疫調(diào)節(jié)作用大部分取決于其下調(diào)TNFα產(chǎn)生的能力，看來它影響到炎癥級聯(lián)反義的多個位點(diǎn)。其他公認(rèn)的抗炎機(jī)制包括減弱T細(xì)胞增殖，下調(diào)淋巴細(xì)胞活化的水平、抑制淋巴細(xì)胞趨化作用和調(diào)節(jié)前炎癥細(xì)胞因子的水平。通過降低HIV在全身和在腸胃粘膜中的復(fù)制，沙利度胺證明是一種有益于HIV治療的成分。由此看來，沙利度胺可作為HAART的輔助劑給予血漿病毒負(fù)荷量檢查不到的患者。
用沙利度胺治療能使在有利于HIV復(fù)制的淋巴環(huán)境中的HIV復(fù)制能力降低，這可由接受治療的對象具有較低的HIV RNA組織水平所證明。
在體外就沙利度胺對細(xì)胞受HIV感染的作用進(jìn)行了研究。鑒定并召集患有中度或嚴(yán)重活動性回腸炎病并開始用沙利度胺治療的患者，來協(xié)助區(qū)分非特異性炎癥反應(yīng)與感染的作用。采用這些對象的粘膜和血細(xì)胞來評估沙利度胺降低感染性的能力。
HIV感染的存在增加了炎癥狀態(tài)，特征是前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的水平升高。這些可溶性介質(zhì)在將攜帶趨化因子受體的CD4+細(xì)胞趨化性吸引到粘膜中起著非常重要的作用。在粘膜環(huán)境中HIV的這些靶細(xì)胞被可溶性介質(zhì)進(jìn)一步活化，從而增加HIV的復(fù)制。為了進(jìn)一步明確粘膜的炎癥狀態(tài)，測定了許多前炎癥趨化因子(TNFα、IL-1、IL-6、γ-IFN)和趨化因子(MIP 1a、MIP 1b、RANTES)。
召集了血漿病毒負(fù)荷陰性的HIV血清反應(yīng)陽性患者，但他們的粘膜病毒負(fù)荷量陽性。這些對象病情穩(wěn)定，CD4細(xì)胞計數(shù)大于250，沒有顯著的粘膜炎癥或消化系統(tǒng)癥狀。將這些對象視為內(nèi)窺鏡評估的基線。由這些患者得到標(biāo)準(zhǔn)水平(30cm)的經(jīng)內(nèi)窺鏡的活檢組織。將粘膜活檢組織用于粘膜單核細(xì)胞(MMC)的分離、RNA酶保護(hù)試驗(RPA)、HIV RNA和原病毒DNA的PCR以及定量性圖像分析(QIA)。流式細(xì)胞術(shù)要染色MMC測定CD45、CD4、CD8、HLA-DR、CD45RO、CXCR4、CCR5、LFA-1和ICAM-1。
對自粘膜分離的MMC和自血液分離的PBMC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，以測定這些區(qū)室中淋巴細(xì)胞群的基線組成。要關(guān)注淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)和記憶狀態(tài)，以及趨化因子受體和粘附標(biāo)記物的表達(dá)。用沙利度胺治療后將分析這些基線參數(shù)。
用多個探針RPA(Riboquant，Pharmingen)來定量測定β-趨化因子和細(xì)胞因子。這種敏感和特異的試驗可以定量測定從冰凍的活檢組織提取的RNA中的趨化因子和細(xì)胞因子的mRNA。將各種mRNA的數(shù)量與GADPH(作為持家基因)進(jìn)行比較。如果趨化因子和細(xì)胞因子不能用PRA定量測定，則可以用ELISA測定受刺激培養(yǎng)的MMC上清液中的趨化因子和細(xì)胞因子。
QIA用免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋的組織來精確測定活檢組織中攜帶CD4、CD8、CD38、HLA-DR、CD45RO CXCR4和CCR5的淋巴細(xì)胞的數(shù)量和解剖位置。另外，它可以測定活檢組織中那些細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和β-趨化因子，以及這些因子的組織濃度。在HIV血清反應(yīng)陽性的活檢組織中，可以測定p24的組織水平。可得到計算機(jī)成像分析儀和專用軟件來評估整個組織區(qū)域中的染色細(xì)胞、趨化因子、細(xì)胞因子和p24水平。
結(jié)果證明對HIV的粘膜應(yīng)答反應(yīng)的特征為組織趨化因子和細(xì)胞因子水平增加。這將導(dǎo)致粘膜炎性浸潤的中度增加。通過觀察趨化因子和細(xì)胞因子，通過簡單的檢驗細(xì)胞指數(shù)將證實(shí)“可溶性”炎癥可忽略。
用沙利度胺(一種強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)劑)治療，將減少HIV感染者的粘膜感染。這很可能表現(xiàn)為HIV在此最大的淋巴器官中復(fù)制能力減弱。由沙利度胺引起病毒在粘膜中和可能全身性復(fù)制的減少，可能預(yù)防抗病毒藥耐藥性HIV突變的產(chǎn)生和改善HAART的長期效果。作為HAART治療的一種輔助劑，沙利度胺能進(jìn)一步改善全球受此病毒感染的數(shù)百萬患者的預(yù)期壽命。
血漿不能檢測到HIV的且經(jīng)歷基線活檢組織檢測的對象，以每天200克沙利度胺的劑量口服治療16周。治療4和16周后，給這些對象進(jìn)行重復(fù)內(nèi)窺鏡活檢組織檢查和重復(fù)靜脈放血，得到PBMC，并如上所述進(jìn)行相同的生物分子實(shí)驗。另外，將每一時間點(diǎn)采集活檢組織用于分析患者的粘膜病毒負(fù)荷量，并將每一時間點(diǎn)靜脈放血得到的血漿用Roche超靈敏試驗(檢測水平＝40個HIVRNA拷貝)進(jìn)行分析。進(jìn)行RT-和DNA-PCR以分析基線和治療后粘膜和血漿病毒負(fù)荷量之間的變化。對統(tǒng)計學(xué)評估而言，效力的唯一指數(shù)是粘膜HIV病毒負(fù)荷量的減少，而沒有血漿病毒負(fù)荷量相伴隨的增加。
另外，檢查了用沙利度胺治療前和后，沙利度胺治療對分離自局限性回腸炎患者的MMC和PBMC體外對M-向性和T-向性HIV易感性的影響。該研究可以評估沙利度胺體外對HIV感染得自其他炎癥性粘膜疾病的淋巴細(xì)胞能力的影響。該數(shù)據(jù)將更好地與流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)現(xiàn)相關(guān)聯(lián)，其涉及趨化因子的表達(dá)和活化水平以及粘膜病毒負(fù)荷量的變化。對于感染性試驗而言，將已知滴定度的M向性HIVsx和T向性的HIVNL4-3與基線處和沙利度胺治療4和16周時獲得的MMC和PBMC一起培養(yǎng)。收集上清液作ELISA來定量測定0小時、36小時、3天和7天的p24。在治療之前和之后進(jìn)行配對T檢驗來分析IBD患者的MMC易感性的變化。
用沙利度胺治療HIV患者將改變腸胃粘膜的炎癥環(huán)境，導(dǎo)致可溶性炎癥介質(zhì)(即前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子)的減少，進(jìn)而降低HIV可以感染的免疫細(xì)胞的補(bǔ)充。用沙利度胺治療降低炎癥將影響體外感染實(shí)驗中PBMC和MMC的p24產(chǎn)生。預(yù)期沙利度胺治療的主要好處是由于減弱了粘膜中可溶性炎癥介質(zhì)，通過減少攜帶有共同受體的CD4+T細(xì)胞(病毒的靶)的補(bǔ)充而致，但也可能是粘附分子表達(dá)減少所起的作用。
5-ASA化合物或產(chǎn)物氨水楊酸(如Asacol)是一種以口服或通過灌腸、泡沫或栓劑(可用于局部治療)給藥的粘膜抗炎藥。通過減少腸胃粘膜中HIV的復(fù)制，其是一種有益于HIV治療的成分。用氨水楊酸努力使粘膜炎癥最小化，可通過減少粘膜區(qū)室中前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的濃度并因此減少HIV靶細(xì)胞的補(bǔ)充和活化，而有益于治療。通過減少復(fù)制性HIV的濃度和活性，可延緩HIV產(chǎn)生對常用抗病毒藥的耐藥性。所以氨水楊酸可能是一種強(qiáng)效有局部活性的輔助劑，用于治療、抑制HIV對象中的病毒增殖/擴(kuò)散，以及抑制或預(yù)防處于感染危險中的對象的感染HIV，和抑制或預(yù)防HIV感染者將病毒傳播給另一對象(未感染或感染的)。
將研究那些根據(jù)臨床、內(nèi)窺鏡和組織檢查具有已知中度活動性感染的，但未接受氨水楊酸或其他5-ASA藥物4周治療，且未接受免疫調(diào)節(jié)藥物或甾類(口服或局部)3個月治療的患者。無結(jié)腸炎的對照患者與結(jié)腸炎患者(它們的結(jié)腸沒有癥狀并且內(nèi)窺鏡檢查無炎癥)進(jìn)行年齡匹配。結(jié)腸炎患者在治療前一周和治療開始時進(jìn)行2次基線內(nèi)窺鏡評價。無結(jié)腸炎對照患者要進(jìn)行2次內(nèi)窺鏡檢查，相隔1周。比較潰瘍性結(jié)腸炎和無結(jié)腸炎對照粘膜樣品的可溶性和細(xì)胞性炎癥狀態(tài)。
從每個患者獲得15份自標(biāo)準(zhǔn)水平(30cm)的內(nèi)窺鏡活檢組織(3.3mm OD)。這些活檢組織中，12份用于MMC分離；1份用于RPA；2份用于QIA。用于流式細(xì)胞術(shù)的MMC作染色測定CD45、CD4、CD8、CD38、HLA-DR、CD45RO、CCR5、和CXCR4。
用ELISA定量測定了在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)MMC和PBMC后獲得的上清液中的β-趨化因子和細(xì)胞因子。采用6孔板每1ml培養(yǎng)液1萬個細(xì)胞。培養(yǎng)18小時后，取出200ml培養(yǎng)液測定RANTES、MIP-1a、MIP-1b、IL-1b、IL-12、TNF-α和IFN-γ。如果需要，可從液氮冷凍的活檢組織提取核酸，用多個探針RPA(Riboquant，Pharmingen)測定這些細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA水平。將各種mRNA的數(shù)量與GADPH(作為持家基因)進(jìn)行比較。
QIA采用免疫組織化學(xué)染色新鮮冷凍的或石蠟包埋的組織來精確測定活檢組織中攜帶CD4、CD8、CD38、HLA-DR、CD45RO和CCR5的淋巴細(xì)胞的數(shù)量和解剖位置。另外，其可以測定活檢組織中那些細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和β-趨化因子，這些因子的組織濃度，并推測這些配體對附近細(xì)胞的趨化因子受體的表達(dá)的影響?？傻玫接嬎銠C(jī)成像分析儀和專用軟件來評估整個細(xì)胞區(qū)域的染色細(xì)胞、趨化因子和細(xì)胞因子(表示為％區(qū)域)。
中度嚴(yán)重的潰瘍性結(jié)腸炎的特征是趨化因子和細(xì)胞因子“可溶性炎癥”水平升高以及已知的細(xì)胞炎癥增加。潰瘍性結(jié)腸炎的粘膜的特征是可溶性和細(xì)胞性炎癥比非結(jié)腸炎對照明顯嚴(yán)重。檢測了氨水楊酸降低可溶性和細(xì)胞性炎癥介質(zhì)的能力。
用氨水楊酸治療降低了細(xì)胞因子和趨化因子的水平、使帶CCR5的CD4+細(xì)胞補(bǔ)充和粘膜淋巴細(xì)胞中HIV的側(cè)向擴(kuò)散最小化；氨水楊酸引起的β-趨化因子分泌減少可能接受能阻斷病毒共同受體的配體的量，這有利于HIV的擴(kuò)散；氨水楊酸擇優(yōu)地抑制前炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致抑制了T細(xì)胞的補(bǔ)充同時不明顯削弱趨化因子受體的阻斷。當(dāng)治療HIV感染患者時這看來是最有利的結(jié)果。通過用氨水楊酸治療患中度活動性炎癥性腸病的患者16周，并檢查粘膜淋巴細(xì)胞亞組、趨化因子受體表達(dá)和粘膜細(xì)胞因子和β-趨化因子水平的變化，來檢驗可能的結(jié)果。
每天用4.8克劑量的氨水楊酸治療中度活動性潰瘍性結(jié)腸炎(經(jīng)歷2次基線活檢組織檢查)對象16周。接受治療4周后和16周治療完成后，他們再次接受內(nèi)窺鏡活檢組織檢驗，對治療后樣品重復(fù)進(jìn)行試驗。這些研究包括進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)來定量測定淋巴細(xì)胞亞組和趨化因子受體的表達(dá)、進(jìn)行RPA來定量測定β-趨化因子和進(jìn)行QIA作原位分析?；颊邔⒗^續(xù)接受氨水楊酸治療，或由他們的臨床醫(yī)生決定治療。
用氨水楊酸治療IBD患者將改變腸胃粘膜的炎癥環(huán)境，致使可溶性和細(xì)胞性炎癥介質(zhì)減少。
HIV感染活化的CD4+、帶趨化因子受體的細(xì)胞導(dǎo)致HIV復(fù)制提高。這種炎癥環(huán)境的特征是腸胃粘膜可能誘導(dǎo)旺盛的HIV復(fù)制。用氨水楊酸治療，通過降低炎癥，將下調(diào)HIV在感染的腸胃粘膜中的復(fù)制能力。
為了檢驗氨水楊酸治療對HIV在粘膜單核細(xì)胞中復(fù)制的作用，用有或無梯度劑量氨水楊酸的培養(yǎng)物中檢驗MMC和PBMC(來自未治療的潰瘍性結(jié)腸炎患者)對M向性和T向性HIV感染的易感性。在患者接受4和16周氨水楊酸治療后，再用這些患者的細(xì)胞進(jìn)行類似的感染性實(shí)驗。
在感染性實(shí)驗中，用已知滴定度的M向性HIVSX和T向性HIVNL4-3(有和無梯度)在含有生理濃度氨水楊酸(根據(jù)已知的粘膜組織濃度)中，培養(yǎng)在基線時間點(diǎn)得到的MMC和PBMC。通過測定培養(yǎng)上清液中HIV蛋白質(zhì)p24的產(chǎn)生比較每份這些樣品的HIV復(fù)制情況。將治療4周和16周后對象的MMC和PBMC與M和T向性HIV一起培養(yǎng)，不加氨水楊酸。將這些樣品收集的p24結(jié)果與基線樣品相比。這些試驗每次都收集上清液，用ELISA定量測定0小時、36小時、3天和7天的p24。進(jìn)行配對T檢驗以分析這些細(xì)胞對HIV易感性的變化。
如我們已顯示的那樣，由于活化的CCR5+表型，MMC比PBMC更易感HIV。IBD中粘膜炎癥的加劇進(jìn)一步有利于HIV感染MMC。用氨水楊酸治療減少炎癥，對MMC產(chǎn)生p24的影響比對PBMC更高。
前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子濃度升高表明HIV的粘膜環(huán)境是炎性的。氨水楊酸能明顯減少這些可溶性介質(zhì)，并因此減少了HIV感染移入粘膜和其他靶細(xì)胞移入粘膜和活化。
實(shí)施例在HIV-1能利用的多種共同受體中，CCR5和CXCR4起主要作用，在感染初期CCR5-向性病毒占優(yōu)勢，在晚期疾病中CXCR4-向性病毒更多，且雜合者CCR5使病毒存活更長。CCR5在粘膜CD4+T淋巴細(xì)胞上的不同表達(dá)可能擇優(yōu)地傳播M向性病毒。為了比較共同受體在粘膜和循環(huán)性淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，從直腸乙狀結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查的活檢組織分離得到粘膜單核細(xì)胞(MMC)，并從HIV-1血清反應(yīng)陰性健康個體得到未受刺激的靜脈放血樣品。我們用流式細(xì)胞術(shù)定量測定了共同受體在CD4+細(xì)胞上的表達(dá)。
與已的研究相一致，血液中所有CD4+淋巴細(xì)胞的23％中值(四分位數(shù)區(qū)間即18-30％范圍)表達(dá)CCR5。如圖1所示，腸CD4+淋巴細(xì)胞的中值71％(即50-87％范圍)表達(dá)CCR5，比血液百分?jǐn)?shù)的高2.8倍(P＝0.03)。粘膜CD4+淋巴細(xì)胞也比血液中其對應(yīng)的表達(dá)CCR5+的CD4+淋巴細(xì)胞每個細(xì)胞表達(dá)明顯更多的CCR5受體。如圖2所示，每個CD4+粘膜淋巴細(xì)胞的中值CCR5受體數(shù)量為6,946分子(即范圍為6,306-10,416)，與每個CD4+血淋巴細(xì)胞約3,841(即3,259-4,441范圍)個CCR5受體相比高2.2倍(P＝0.03)。綜合起來看，這使腸CD4+淋巴細(xì)胞總體表達(dá)的CCR5受體比血高6.2倍，而CCR5受體是病毒能進(jìn)入CD4+淋巴細(xì)胞可能需要的。這些發(fā)現(xiàn)提示粘膜CD4+淋巴細(xì)胞比他們的血對應(yīng)細(xì)胞更易被M向性的HIV-1感染。
幾乎所有(97％)表達(dá)CCR5的血和腸CD4+淋巴細(xì)胞都是記憶性CD45RO+表型細(xì)胞。與已發(fā)表的研究一致，我們發(fā)現(xiàn)與血CD4+淋巴細(xì)胞細(xì)胞(中值4％，即38-53％范圍)相比，腸CD4+淋巴細(xì)胞中CD45RO+記憶細(xì)胞的比例增加(中值95％，即90-97％范圍)。
已有報道說大部分外周T細(xì)胞CXCR4表達(dá)在原初CD45RO上，而不是在記憶CD4+RO+T細(xì)胞上。所以，最初所預(yù)計MMC的高水平CCR5表達(dá)和CD45RO+表型占優(yōu)勢可能提供了解釋至少在接受肛門性交過程中M向性病毒傳播占優(yōu)勢的解剖和細(xì)胞機(jī)制。然而，還發(fā)現(xiàn)如圖3所示的在血液(中值83％，即75-87％范圍)和腸(中值64％，即59-79％范圍)中有高水平表達(dá)CXCR4的細(xì)胞。這兩個區(qū)室之間無論是百分比(P＝0.03)或用抗CXCR4抗體染色的熒光密度都沒有明顯差異。用三名獻(xiàn)血員提供的充足細(xì)胞分析CXCR4在記憶CD4+淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，并證明血液記憶細(xì)胞(中值69％，即范圍57-73％)和腸記憶細(xì)胞(中值62％，即范圍57-65％)的基本組分表達(dá)可檢測水平的CXCR4。通過比較血記憶(CD45RO+)和天然(CD45RO-)CD4+細(xì)胞上CXCR4表達(dá)的熒光密度，估計表明記憶CD4+細(xì)胞表達(dá)的CXCR4水平只比原始CD4+細(xì)胞表達(dá)的水平略低。我們的實(shí)驗結(jié)果表明記憶CD45RO+細(xì)胞不僅可表達(dá)CCR5還可表達(dá)CXCR4，表達(dá)的水平足以有利于感染。
我們發(fā)現(xiàn)與用獼猴進(jìn)行的研究(在直腸和結(jié)腸組織切片中鑒定到少量表達(dá)CXCR4的細(xì)胞)相反，人體中有HIV感染所需的高水平的共同受體表達(dá)。獼猴研究中攜帶CCR5的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞更稀疏。這種差異可能反映了種族差異或組織獲得上的差異。我們的發(fā)現(xiàn)是建立在采用保存CCR5和CXCR4細(xì)胞表面表達(dá)的方法獲得的分離的活細(xì)胞基礎(chǔ)上的。
為了評估粘膜單核細(xì)胞對HIV感染的易感性，我們將從內(nèi)窺鏡活檢組織分離的MMC和從健康HIV-血清反應(yīng)陰性志愿者分離的PBMC體外用HIV感染。存在20IU白細(xì)胞介素-2(IL-2)下用HIV的實(shí)驗室病毒株(M-向性HIVSX或T向性HIVNL4-3)感染粘膜細(xì)胞，如數(shù)據(jù)所示需要IL-2來維持粘膜細(xì)胞群的生存力。作為對照，已知IL-2能上調(diào)CCR5并能提高病毒的復(fù)制，還感染了同一患者的PBMC，加和不加IL-2。在第18、72、和130小時，定量測定上清液中p24的產(chǎn)量，表示為每104個CD4+淋巴細(xì)胞產(chǎn)生p24的pg量。如圖4所示，在代表性實(shí)驗(2次中的1次)中，與有或無IL-2的PBMC相比，在培養(yǎng)中粘膜單核細(xì)胞能支持旺盛的病毒復(fù)制。無IL-2時感染的PBMC不能支持HIVSX或HIVNL4-3的復(fù)制。當(dāng)存在IL-2時與類似培養(yǎng)的PBMC相比，粘膜細(xì)胞比PBMC明顯更易受M向性和T向性HIV感染。例如，第72小時，MMC培養(yǎng)物中M向性HIVSX的上清液p24水平為每104個CD4+淋巴細(xì)胞164pg/ml，與此相比PBMC培養(yǎng)物為51pg/ml。對T向性的HIVNL4-3而言，病毒在整個過程中生長都加速，且在第130小時MMC培養(yǎng)物上清液p24水平為1194pg/ml(每104個CD4+淋巴細(xì)胞)，與其相比PBMC培養(yǎng)物中的p24水平不能檢測。這些數(shù)據(jù)表明對HIV感染的易感性提高，提示粘膜CD4+淋巴細(xì)胞共同受體表型從功能上使細(xì)胞在體外易受M和T向性HIV-1病毒株的感染。
這些數(shù)據(jù)提出了三點(diǎn)令人感興趣的方面。首先，可由腸的粘膜內(nèi)層(一種可再生的組織來源)輕易安全地獲得和分離組織免疫細(xì)胞。由于HIV-1發(fā)病機(jī)理研究的重點(diǎn)越來越注重組織區(qū)室的持續(xù)和傳播研究，容易且安全接觸淋巴組織的技術(shù)是必需的。淋巴結(jié)和扁桃體切除/吸取方法是最常報道的研究方法。用這些方法進(jìn)行的研究已提供了說明性的改變觀念的發(fā)現(xiàn)，包括當(dāng)血漿HIV水平穩(wěn)定或不能檢測到時淋巴組織中HIV-1的活性持續(xù)存在。這些組織來源揭示了在HIV感染過程中的二級組織淋巴結(jié)構(gòu)中所發(fā)生的生物學(xué)活動，但需要侵入性外科手術(shù)來獲得組織。相反，腸粘膜淋巴組織豐富、易獲得、愈合迅速、自身可補(bǔ)充和直接可視。內(nèi)窺鏡活檢組織檢驗安全、迅速、無痛，提供了可接觸含有淋巴細(xì)胞100％樣品的淋巴區(qū)室方法?；顧z組織保留了結(jié)構(gòu)取向，且可以進(jìn)行組織學(xué)檢查，或可解離用于流式細(xì)胞術(shù)和進(jìn)行本文所述的組織培養(yǎng)評估。
這些研究提出的第二個令人感興趣的方面是CCR5在人粘膜CD4+淋巴細(xì)胞的表達(dá)明顯提高，與外周血細(xì)胞相比總CD4+淋巴細(xì)胞和每個細(xì)胞CCR5表達(dá)的百分比都高。這些粘膜T細(xì)胞比血CD4+淋巴細(xì)胞支持了更高水平的病毒復(fù)制(圖4)。由于在感染初期CCR5是與HIV-1最相關(guān)的共同受體，且腸胃道是傳播最常見的部位之一并且是人體主要的淋巴器官，檢測到的CCR5表達(dá)量對HIV的傳播、初次感染、局部播散和治療有著重要的暗示。M向性HIV-1對T細(xì)胞的傳染性(根據(jù)血細(xì)胞中CCR5的表達(dá))的推測，可以得到明顯不同的疾病進(jìn)展的數(shù)學(xué)模式。當(dāng)CD4不是限制因子時，每個細(xì)胞最少700-2000個CCR5受體足以使對HIV傳染的易感性最大。通過我們的計算，血T細(xì)胞上CCR受體的數(shù)量(中值約為3000個/細(xì)胞)將在體外感染性的這個范圍內(nèi)。而粘膜水平(中值約為7000個受體/細(xì)胞)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了這個最小范圍。包括MMC中b-趨化因子產(chǎn)量水平和是否存在細(xì)胞活化因子等因素也可能影響這些細(xì)胞支持復(fù)制的能力。在腸粘膜中發(fā)現(xiàn)高水平的細(xì)胞因子(包括TNF-a和IL-2)，它們也可能使腸中的病毒復(fù)制增加。
第三個令人感興趣的方面是與PBMC相比，粘膜淋巴細(xì)胞對HIV-1的CCR5-和CXCR4-向性株感染的敏感性升高。存在IL-2但不進(jìn)一步刺激細(xì)胞時，MMC培養(yǎng)物中產(chǎn)生異常高水平的HIVNL4-3，表明粘膜T細(xì)胞為HIV-1變種(來源任一主要的共同受體進(jìn)入)的復(fù)制提供了富裕的微環(huán)境。為什么利用CCR5-的變種被優(yōu)先傳播(雖然在粘膜傳播HIV-1的部位有充足的CD4+淋巴細(xì)胞)以及這些淋巴細(xì)胞對這兩型病毒感染有易感性依舊是待解答的重要問題。我們的發(fā)現(xiàn)提出了如下問題利用CXCR4作為共同受體的HIV-1變種是否首先被傳播，但被清除了可能是通過免疫機(jī)制。另外，當(dāng)利用CCR5的變種擴(kuò)散到PBMC時，利用CXCR-4的變種有可能留在傳播的部位。
我們的結(jié)果顯示可以用腸粘膜的組織活檢樣品來獲得關(guān)于免疫和病毒決定因子(可能影響HIV-1傳播和發(fā)病)的定量信息。對腸胃粘膜的原發(fā)性和持續(xù)性HIV-1感染的潛在易感性，性接觸和易受創(chuàng)傷的內(nèi)層是引入注意的。這種易感性包括在該粘膜部位的活化的記憶CD4+淋巴細(xì)胞的優(yōu)勢。我們的結(jié)果還顯示CCR5和CXCR4高度表達(dá)于健康人HIV-1血清反應(yīng)陰性患者的粘膜CD4+淋巴細(xì)胞上，且這些粘膜細(xì)胞在體外比血液細(xì)胞對感染的易感性高得多。
患者群征集了六名健康個體，3男3女(平均年齡45歲，范圍為24-68歲)，來研究淋巴細(xì)胞表型。征集了另外2名男性作病毒培育試驗(見下)，在進(jìn)行選擇性內(nèi)窺鏡檢驗便血史或常規(guī)息肉篩查之前取得同意。沒有人患有腹瀉或腸炎或感染性疾病的歷史。在相同區(qū)域采集的經(jīng)蘇木精和曙紅染色的活檢組織作為研究用的活檢組織，顯示沒有病理學(xué)，而且當(dāng)腸胃外科病理學(xué)家以盲法形式復(fù)驗時都是正常表現(xiàn)。該研究由UCLA人受試驗保護(hù)委員會(Human SubjectsProtection Committee)批準(zhǔn)。常規(guī)在直腸乙狀結(jié)腸中的30cm部位采集所有樣品，以避免因創(chuàng)傷或感染性直腸炎所引起的潛在混雜性炎癥。從各人四次內(nèi)窺鏡檢查活檢組織分離得到粘膜單核細(xì)胞(MMC)。用3.3OD鑷子將活檢組織收集到15ml組織培養(yǎng)基(RPMI 1640，Irvine Scientific)中。室溫將活檢組織維持在轉(zhuǎn)臺上，直到分離(約20-60分鐘)，然后用18G針移至裝有磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(含有1mM EDTA和50mM 2-巰基乙醇)的10×35mm培養(yǎng)皿(帶有樣品測試分室)中。37℃用振蕩式水浴培育破碎的組織20分鐘。離心后，在37℃用膠原酶和分散酶的混合物(Boehringer Mannheim#269638；0.1mg/ml，在RPMI中)消化組織樣品1小時。將樣品通過裝有一系列遞減針號的注射器進(jìn)行進(jìn)一步破碎。用70微米細(xì)胞篩網(wǎng)(Falcon#2350)除去碎片。將得到的細(xì)胞重懸于含有10％胎牛血清的RPMI中。用血細(xì)胞計數(shù)器目視計算包括原代上皮細(xì)胞和白細(xì)胞的單核細(xì)胞，并計算單核細(xì)胞(即白細(xì)胞)的比例。每四份活檢組織得到平均值1.3×106±1.1×106S.D.(n＝6)的細(xì)胞，約20％單核細(xì)胞是白細(xì)胞。臺盼藍(lán)排斥測定，活力＞90％。將供者的血液收集到EDTA中，用全血染色方法染色。
購得的單克隆抗體包括CD4-熒光異硫氰酸酯和CD45-包被葉綠素蛋白(BDIS)、CD8-別藻藍(lán)蛋白(Caltag)和抗-CXCR4-R-藻紅蛋白(PE；Pharmingen)。由Leukosite(Cambridge，MA)的Dr.Walter Newman提供抗-CCR5，并由KennethDavis和Noel Earner博士用PE制備了BDIS的1∶1的偶聯(lián)物。在FACSCaliburo(BDIS)上進(jìn)行分析，并用Cell Questo軟件分析。用側(cè)散射和CD45熒光對分離的MMC進(jìn)行初始門脈沖(gating)，然后進(jìn)行正向散射和側(cè)散射門脈沖。鑒定出明確定義和分離的粘膜白細(xì)胞群，約占初始單核樣品群的10-50％。其中20-40％為CD4+淋巴細(xì)胞26-41％為CD8+細(xì)胞。
為了測定每個CD4+淋巴細(xì)胞的CCR5分子數(shù)，用標(biāo)定因子(對我們的FACSCalibur測定而言具體為44)乘以所觀察到的CCR4相對熒光強(qiáng)度(RFI)。該標(biāo)定因子是每RFI通道數(shù)所探測到的PE分子數(shù)。對于制備的單抗與PE的1∶1偶聯(lián)物，可將RFI通道數(shù)乘以此標(biāo)定因子以估計每個細(xì)胞結(jié)合的但抗數(shù)目。對CXCR4不進(jìn)行這種計算，因為不能得到1∶1的偶聯(lián)物。
為了確保對腸活檢組織用膠原酶/分散酶分離步驟不會降解條狀表面抗原，用Ficoll-Hypaque分離方法分離得到外周血單核細(xì)胞(PBMC)，然后染色或直接用流式細(xì)胞術(shù)分析CD45、CD4、CD8、CCR5和CXCR4表達(dá)的百分比或通過粘膜分離方法加工(膠原酶/分散酶處理)然后染色和分析抗原。在25％用于所有抗體研究中常規(guī)分離的PBMC和那些與粘膜分離酶接觸的PBMC沒有顯示可辨別的差異。因此，所觀察到的腸細(xì)胞CCR5百分比和表達(dá)的增加(與血細(xì)胞相比)并不是分離方法所致，因為用膠原酶/分散酶處理并未增加CCR5的表達(dá)。
在機(jī)械性破碎后，從4次內(nèi)窺鏡檢查的粘膜活檢組織分離得到各健康人HIV-血清反應(yīng)陰性志愿者的MMC，然后在補(bǔ)充有10％人血清的Iscove’sDMEM培養(yǎng)基(含有10mg/ml慶大霉素、青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺)中培育3天。加入每ml 20IU的白細(xì)胞介素-2(IL-2，Amgen)。用50mgHIVSX或PBMC感染后3小時，將總量為105個的粘膜單核細(xì)胞和PBMC置于96孔板中(100微升培養(yǎng)基)。在置于平板之前，洗滌這些細(xì)胞2次以除去游離病毒和粘附的p24。在各時間點(diǎn)18小時、第3天(第72小時)和第5天(第130小時)采集30微升上清液，用ELISA(Coulter)測定p24。用流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+的百分比，用其來確定培養(yǎng)物中CD4+淋巴細(xì)胞的數(shù)量。由于收獲的細(xì)胞不夠充足，所以沒有測定這些人腸細(xì)胞上的共同受體的表達(dá)情況。
為了增加用于功能性、傳染性和流式細(xì)胞術(shù)研究的粘膜單核細(xì)胞的收獲量，使用了其他分離方法。將新鮮收集的內(nèi)窺鏡檢查活檢組織剁碎，直接加到在100×300mm培養(yǎng)皿中的10ml Iscove培養(yǎng)基(補(bǔ)充有20單位/ml IL-2)中，37℃、5％CO2培育3天。通過70μm細(xì)胞網(wǎng)格收獲細(xì)胞，用血細(xì)胞計數(shù)器目視計數(shù)單核細(xì)胞總收率。用TruCount珠測定CD45+、CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞的收率，并與用常規(guī)膠原酶/分散酶方案從同一個體收集的活檢組織產(chǎn)率相比較。粘膜淋巴細(xì)胞的收率增加了6倍(圖5)。
組織中HIV的定量測定從直腸乙狀結(jié)腸活檢組織提取的RNA可以回收到＞95％的組織RNA。我們開發(fā)了一種用于組織RNA的定量RT PCR試驗和用于組織DNA的定量PCR試驗，這是由上述Chen實(shí)驗室的方法改進(jìn)的。我們的初步結(jié)果顯示可用RTPCR來定量測定低至10份拷貝水平的HIV-1 RNA(圖6)。
將冷凍狀態(tài)(用Powergen 125組織勻漿器)的樣品立即勻漿，Trizol提取含有RNA和DNA的分離物。用Rneasy柱進(jìn)一步提取RNA。定量對照研究證實(shí)RNA降解最小，且沒有DNA污染(RNA模板的PCR)。用帶有HIV LTR特異性引物667/AA55(設(shè)計用來捕獲未剪接的/多次剪接的HIV RNA)改進(jìn)的rTTHRNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer)來定量測定HIV RNA拷貝數(shù)。用667/AA55引物對識別的127bp序列產(chǎn)生線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。用乙醇沉淀(至少用0.1M檸檬酸鈉/10％乙醇緩沖液洗滌2次)分離DNA。對HIV DNA，PCR擴(kuò)增中使用相同的引物對(667/AA55)。用β-珠蛋白引物產(chǎn)生線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。
為了使我們的方法標(biāo)準(zhǔn)化并使得到的結(jié)果更接近地反映體內(nèi)HIV RNA的量，核酸分離之前和之后在血清陰性活檢組織中加入已知量的HIV LTR RNA。用純化的HIV LTR RNA(用0.5μg/μl Hela-細(xì)胞總RNA稀釋)產(chǎn)生線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，如上所述進(jìn)行RT-PCR。定量測定樣品補(bǔ)充LTR前和后之間的差異，發(fā)現(xiàn)差異最小(＞95％回收)。
為了定量評估回收情況，用已知量的熒光素酶DNA，含有未知人同源性的的細(xì)菌序列來定量測定組織DNA回收情況(通常＞75％)；血清反應(yīng)陰性樣品得到了已知量的LTR HIV序列來定量測定RNA的回收(＞95％)。
在血漿病毒負(fù)荷量檢測不到的病人的直腸乙狀結(jié)腸活檢組織中重復(fù)性地檢測到HIV-RNA進(jìn)行了努力來證明與從同一患者的相同周邊水平(30cm)腸粘膜同時得到的其他活檢組織相比，一次活檢組織結(jié)果的重復(fù)性。將從血漿病毒負(fù)荷量檢測不到的對象的一次活檢組織(每份10mg)冰凍，如上所述提取RNA并用LTR-特異性引物667/AA55擴(kuò)增。每一活檢組織平均收獲25μg RNA，其中1/100用于定量測定。圖7結(jié)果顯示在敏感性試驗中用直腸乙狀結(jié)腸的活檢組織定量測定RNA病毒負(fù)荷量有重復(fù)性。數(shù)據(jù)顯示在基線乙狀結(jié)腸鏡檢查血漿病毒負(fù)荷量檢測不到的對象過程中從2份活檢組織得到的組織HIV RNA病毒負(fù)荷量。據(jù)報告這些個體血漿病毒負(fù)荷量檢測不到已＞1年。同一對象樣品之間的差異平均＜0.2log10。這些數(shù)據(jù)顯示了用活檢組織來定量測定組織病毒負(fù)荷量的重復(fù)性和樣品與樣品間的最小變化。同樣重要的是證明血漿HIV RNA檢測不到的對象其組織有可檢測水平的HIV RNA(通常為每μg RNA為102-103)。
在血漿病毒負(fù)荷量檢測不到的對象的直腸乙狀結(jié)腸活檢組織中重復(fù)性檢測到HIV-DNA。
在血漿病毒負(fù)荷量檢測不到的對象的分離組中，用定量性PCR擴(kuò)增了HIVDNA，其中使用LTR區(qū)域的特異性667/AA55引物和用于內(nèi)部線性標(biāo)準(zhǔn)的b-珠蛋白特異性引物。圖8顯示了用于分析b-珠蛋白特異性引物的一式三份實(shí)驗，和HIV原病毒DNA定量測定的一式兩份實(shí)驗結(jié)果。雖然檢測的下限是3份拷貝，但在我們的下截止點(diǎn)使用了10份拷貝。該圖顯示定量測定的實(shí)際拷貝數(shù)和根據(jù)b-珠蛋白-依賴性細(xì)胞計數(shù)的計算拷貝數(shù)。這些結(jié)果顯示我們的方法可以用于檢測血漿病毒負(fù)荷量檢測不到的患者低至10份的原病毒DNA拷貝。
CCR5共同受體在粘膜CD4 T細(xì)胞上的表達(dá)粘膜單核細(xì)胞的分離不改變CD4、CD8、CCR5和CXCR4的表型表達(dá)。
從健康的、血清反應(yīng)陰性的對照者血液(外周血單核細(xì)胞PBMC)和腸粘膜(粘膜單核細(xì)胞MMC)分離樣品，以建立這兩種區(qū)室中基線CCR5和CXCR4的表達(dá)。圖9顯示我們的分離方法既不去除相關(guān)的受體(CD4、CD8、CCR5、CXCR4)又不改變它們的表面表達(dá)。
與PBMC相比，CCR5在CD4 T細(xì)胞上的粘膜表達(dá)大大增加。由健康的血清反應(yīng)陰性對照對象得到分離的粘膜單核細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞，并且進(jìn)行評估以確定各區(qū)室中表達(dá)CCR5受體的CD4 T淋巴細(xì)胞的相對百分比。以1∶1的比例將2D7 CCR5抗體偶聯(lián)于藻紅蛋白；校準(zhǔn)所用的流式細(xì)胞儀以檢測每個RFI通道中的44藻紅蛋白分子(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的CD4表達(dá)和每個細(xì)胞結(jié)合的抗體數(shù)量)。隨后，可將每個細(xì)胞結(jié)合的抗CCR5抗體數(shù)翻譯成每個細(xì)胞的受體數(shù)(假定抗體單價結(jié)合于受體)。
與血細(xì)胞(11％)相比，腸細(xì)胞(87％)表達(dá)CCR5的CD4+細(xì)胞的百分比明顯增加(p＝0.0019)(圖10)。
進(jìn)一步增加HIV感染的易感性，圖11顯示與血CD4 T細(xì)胞相比(平均值2700)粘膜CD4 T細(xì)胞每個細(xì)胞還表達(dá)明顯更多的受體(平均值8500)(p＝0.007)。
粘膜CD4細(xì)胞的CCR5表達(dá)幾乎專一性是記憶性亞組細(xì)胞。用CD45RO抗體作為記憶亞組細(xì)胞的指示物，染色計數(shù)了從相同的血清反應(yīng)陰性健康對照者得到的血液和粘膜樣品，來測定CCR5染色細(xì)胞的相對分布。對CD4+熒光門脈沖后，與血液中匹配的細(xì)胞組(24％)相比，91％ CD4+CD45RO+粘膜細(xì)胞表達(dá)CCR5(p＝0.017)。
與HIV感染的和炎性樣品中的PBMC相比，粘膜CD4 T細(xì)胞的CCR5表達(dá)仍舊較高。
已初步確定了健康血清反應(yīng)陰性對象的粘膜和血CD4 T細(xì)胞中CCR5表達(dá)的基線，評估了慢性HIV感染者CD4細(xì)胞上的CCR5表達(dá)，以檢驗以下假設(shè)與血細(xì)胞相比粘膜中CCR5的表達(dá)仍然較高，這有利于HIV復(fù)制。包括炎性對照患者來分辨與HIV感染不直接相關(guān)的變化。炎性對照患者是那些明確具有炎癥性腸病(IBD)尤其是潰瘍性結(jié)腸炎的對象。這些對象臨床上處在緩解期(有持續(xù)的但控制的粘膜炎癥)，僅給予5-ASA抗炎藥，而不使用任何甾類或免疫抑制藥物。HIV感染者的外周血CD4計數(shù)為200-700個細(xì)胞/mm3的血漿病毒負(fù)荷量范圍(用超靈敏試驗檢測不到n＝2；血漿病毒負(fù)荷量范圍在200-2000份拷貝/ml之間n＝2；血漿病毒負(fù)荷量范圍在20,000-40,000份拷貝/ml之間n＝4)。
在炎癥對照者(p＝0.012)和HIV感染者(p＝0.04)(圖12)中仍保持血清反應(yīng)陰性健康對照者中所觀察到的粘膜和血CD4 T細(xì)胞之間的CCR5表達(dá)的差異。與我們的假設(shè)相一致，如該圖所示與正常對照相比，有一種趨勢，明顯鑒定到在HIV時粘膜CCR5在CD4 T細(xì)胞上的表達(dá)減少。
在HIV和IBD時血和腸表達(dá)CCR5的T細(xì)胞中CD4∶CD8比值減少CD4 T細(xì)胞上的CCR5受體也在CD8+T細(xì)胞上表達(dá)。為了進(jìn)一步確定粘膜CD4 T細(xì)胞CCR5的表達(dá)是否真的減少，評估了三種臨床情況這兩種區(qū)室中CD4和CD8 T淋巴細(xì)胞之間CCR5受體的相對分布。圖13顯示表達(dá)CCR5細(xì)胞的CD4∶CD8的比值明顯向下漂移，血和腸樣品在IBD時減少約50％，在HIV時減少70～90％。這可能是CCR5的一種保護(hù)性下調(diào)以抑制HIV擴(kuò)散。鑒于在炎癥對照者中也有類似傾向，減少表面表達(dá)的初步刺激可能與炎癥微環(huán)境有關(guān)。加工樣品以證明在這兩種情況中b-趨化因子水平升高，但在HIV樣品中甚至比在IBD樣品中更高。除支持我們的假設(shè)外，這些發(fā)現(xiàn)還提示盡管組織學(xué)報告淋巴細(xì)胞相對減少，HIV時存在特別的活動炎性粘膜狀態(tài)(由趨化因子的活性所確定)。
用QIA定量測定β趨化因子的組織濃度為了進(jìn)一步評估我們的假設(shè)(HIV感染引發(fā)顯著的粘膜炎性應(yīng)答)，與JanAndersson博士在Karolinska Institute進(jìn)行了先導(dǎo)研究，以定量測定組織中的趨化因子濃度。將在鋁箔上迅速定向和快速冷凍的內(nèi)窺鏡檢查活檢組織，用干冰送至瑞典作冷凍切片(7μm)，并用抗體進(jìn)行定量性免疫組織化學(xué)染色以鑒定RANTES、MIP-1a和MIP-1b。并用CD4、CD8和CCR5抗體進(jìn)行定量圖像分析(QIA)。研究了取自健康的、血清反應(yīng)陰性對照者和HIV感染者(可檢測到血漿的病毒負(fù)荷量)的樣品。結(jié)果以占過氧化物酶標(biāo)記抗體染色陽性的組織測定總區(qū)域的百分比表示。在健康對照者中發(fā)現(xiàn)RANTES、MIP-1a和MIP-1b分別為2.04％、1.39％和1.65％。HIV感染者樣品中，這些值分別增至15.1％、6.2％和12.1％。這些趨化因子的功能是將補(bǔ)充的炎性細(xì)胞召集到已發(fā)炎的粘膜中。表1提供了與粘膜炎癥相關(guān)的HIV感染的這種明顯的增加。
表1
體外粘膜單核細(xì)胞(MMC)比PBMC明顯更易受感染初步觀察表明粘膜細(xì)胞對HIV感染的易感性的增加部分是由于共同受體表達(dá)的增加。在體外檢驗此假設(shè)，用從同一個體分離的MMC和PBMC，與M向性的HIVSX培育2小時，洗滌并培育3-10天。在所指示的時間收集等份上清液，并檢測p24產(chǎn)生(作為感染的證據(jù))。與同時培育的PBMC相比，在第一個時間點(diǎn)(3天)p24的產(chǎn)生明顯增加(MMC中為4000ng p24/ml，在PBMC中為550ng p24/ml)。圖14中所總結(jié)數(shù)據(jù)支持了如下假設(shè)粘膜CD4 T細(xì)胞共同受體表達(dá)的增加提高了HIV感染性。
分析結(jié)腸中的CD8+和CCR5細(xì)胞通常在上皮內(nèi)區(qū)室中的主要細(xì)胞是CD8+，但主要的固有層淋巴細(xì)胞是CD4+。為了測定結(jié)腸中CD8+細(xì)胞的相對數(shù)目，分析了結(jié)腸粘膜活檢組織中CD8+細(xì)胞存在與否。圖15的結(jié)果表明HIV感染者的活檢組織中的CD8+染色程度(褐色細(xì)胞，在黑/白成像中呈暗色)比HIV陰性活檢組織中高(比較圖A和圖B)。尤其是，HIV感染者固有層中大部分細(xì)胞是CD8+而不是CD4+。另外，在HIV感染者結(jié)腸粘膜中CD4+細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少。在這種情況中，如果活檢組織用顯微鏡檢查，其可以說是正常細(xì)胞狀的而不是炎性的，這是由于CD8細(xì)胞的增加，其平衡了HIV誘導(dǎo)的CD4細(xì)胞被殺死而導(dǎo)致的CD4細(xì)胞的丟失。這可能解釋為何早期觀察粘膜不能檢測到受HIV影響的粘膜組織中的炎癥。這是CD8細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞性炎癥。
如上所述的b-趨化因子(如上述因HIV而升高)召集帶有CCR5受體的細(xì)胞補(bǔ)充入粘膜(圖16)。CCR5受體是HIV用于進(jìn)入這些細(xì)胞的主要共同受體。所以，HIV確保它能夠通過誘導(dǎo)該環(huán)境中的炎癥進(jìn)一步增殖，至少部分通過產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子，從而召集補(bǔ)充更多可感染的靶細(xì)胞。
用PCR分析定量測定β-趨化因子的組織濃度圖17(A-C)顯示了進(jìn)一步的證據(jù)HIV是一種粘膜炎癥疾病并因此可以用抗炎藥來治療。數(shù)據(jù)顯示了正常健康對照患者、粘膜中有少量病毒的HIV患者和粘膜中有較高數(shù)量的HIV患者的粘膜活檢組織中的前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子(mRNA)、RNATES、IFNγ和TNF(RNA)的濃度。可以從這些研究中清楚地看出與健康的患者相比，HIV患者的粘膜中有更高水平的前炎癥趨化因子RANTES、干擾素-γ(IFNγ)和TNF。另外，粘膜中病毒量較高的HIV患者比粘膜中病毒量較低的患者具有高得多的RNATES、IFNγ和TNF水平。在這些比較中HIV患者與健康正常人間的比較有統(tǒng)計學(xué)顯著性(RANTES，分別為p＝0.008和0.001；IFNγ分別為，p＝0.0008和0.002；和TNF分別為p＝0.002和0.01)。
HIV的負(fù)荷量增加使CD4+細(xì)胞活化和病毒后代產(chǎn)生圖17D顯示隨著粘膜病毒負(fù)荷量的增加，粘膜中被活化的CD4+細(xì)胞的百分比也增加(如HLA-DR的表達(dá)增加所顯示)。如圖18所示，一旦粘膜細(xì)胞被感染就將產(chǎn)生更多的病毒。這是由在細(xì)胞中復(fù)制時T向性的受體病毒(Nlegfp)表達(dá)的綠色熒光蛋白增加所顯示的。這些結(jié)果表明產(chǎn)生病毒的粘膜細(xì)胞的百分比比血細(xì)胞中的高300倍。
所以，這些結(jié)果證明HIV增加前炎癥細(xì)胞因子的水平，其導(dǎo)致CD4+細(xì)胞的活化(這是受HIV感染的確切細(xì)胞類型)。感染的CD4+細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生的病毒后代能感染其他CD4+細(xì)胞和產(chǎn)生的各種前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子召集補(bǔ)充的細(xì)胞，從而感染擴(kuò)散。
抗炎藥5-ASA抑制細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制為了評估5-ASA抑制體外HIV病毒復(fù)制的能力，在存在梯度劑量的5-ASA(3，30，300，3,000μM)時，用1×106活化的PBMC進(jìn)行HIV感染的研究。PBMC包括存在于培養(yǎng)基中的帶有趨化因子和細(xì)胞因子受體的CD4和CD8細(xì)胞的異質(zhì)性群體。據(jù)信所用的5-ASA劑量范圍代表每天口服4.8g 5-ASA的患者腸胃粘膜中所見的生理范圍。用帶有M-向性JRFL或T向性LAI包膜的不具有復(fù)制能力的HIV pNLlucΔBgl假型病毒進(jìn)行感染。用熒光素酶的表達(dá)來評估培育4天后的HIV復(fù)制程度。將用藥物處理的培養(yǎng)物與未接受藥物的樣品相比較。4天后用7-AAD染色，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的死亡。
圖2結(jié)果顯示5-ASA處理抑制3-67％熒光素酶的表達(dá)，在最高劑量抑制顯著(p＜0.005)(N＝7感染/處理組)。細(xì)胞死亡看來并不是因為所觀察到的抑制(未處理對照的死亡％＝7.8％，30μM5-ASA＝7.3％，300μM 5-ASA＝9.4％和3000μM 5-ASA＝13.3％)。
表2
*P＜0.05圖19顯示用Asacol(氨水楊酸)(一種局部抗炎藥)能抑制HIV復(fù)制。用復(fù)制時表達(dá)熒光素酶的HIV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(但不作任何處理)作為對照，Asacol最低劑量(30和300微克)能抑制約20％HIV的復(fù)制。在3000微克劑量時，抑制量較高，但這部分是因為該劑量藥物的細(xì)胞毒性(約30％細(xì)胞死亡而在30和300微克劑量時13-15％細(xì)胞死亡；5μg劑量AZT產(chǎn)生約16％細(xì)胞死亡)。將這些結(jié)果與更有效的已知直接抗病毒的AZT比較，后者阻斷病毒將其遺傳物質(zhì)(RNA)逆轉(zhuǎn)錄入DNA(隨后整合入細(xì)胞的DNA中)的能力。雖然Asacol的抗炎癥活性不如AZT那樣強(qiáng)烈來抑制HIV復(fù)制，但此活性仍然有統(tǒng)計學(xué)顯著性的。
總之，數(shù)據(jù)顯示在推斷的生理濃度下5-ASA(Asacol)抑制HIV的復(fù)制(最高劑量時)，而且抑制活性看來不依賴于藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。5-ASA的抑制活性可能(至少部分)是由于它的抗炎活性。所以，這些結(jié)果表明可以廣泛地使用抗炎藥來治療HIV。
已描述了大量本發(fā)明的實(shí)施例。然而可以理解可以進(jìn)行不脫離本發(fā)明精神和范圍的各種改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒活化的方法，其特征在于，所述的方法包括使該病毒感染的細(xì)胞與抑制病毒活化量的抗炎藥和抗病毒藥接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒是免疫缺陷病毒。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫缺陷病毒選自1型人免疫缺陷病毒HIV、2型HIV和猿猴免疫缺陷病毒SIV。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的接觸是在體內(nèi)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的接觸是在體外。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動物細(xì)胞是人細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥抑制病毒融合于或進(jìn)入細(xì)胞，病毒的逆轉(zhuǎn)錄或核酸復(fù)制，病毒整合入細(xì)胞DNA中，病毒出芽或從細(xì)胞釋放，產(chǎn)生傳染性病毒；或抑制與病毒融合或感染、逆轉(zhuǎn)錄或核酸復(fù)制、病毒整合入細(xì)胞DNA中、病毒出芽或從細(xì)胞釋放、或產(chǎn)生傳染性病毒相關(guān)的酶。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是多肽或其功能性模擬物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的多肽或其功能性模擬物結(jié)合于病毒或細(xì)胞表面受體。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的多肽是配體、病毒受體、抗體或它們的片斷。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的酶是蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥選自蛋白酶抑制劑、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、整合酶抑制劑和它們的組合。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的核苷抑制劑是齊多夫定(AZT)、斯塔夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、雙脫氧胞苷(DDI)、扎西他賓(ddC)、阿巴卡韋和它們的組合。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的非核苷抑制劑選自奈韋拉平、地拉夫定和埃法韋茲。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是蛋白酶抑制劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶抑制劑是沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、那非那韋或安潑那韋。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥減少炎性細(xì)胞的補(bǔ)充、減少趨化因子的產(chǎn)生、減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、或抑制趨化因子受體與其配體的相互作用。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥選自抗炎癥的抗體、抗炎癥肽、抗炎癥細(xì)胞因子、抗炎癥趨化因子、抗炎癥核酸、甾類、非甾類抗炎藥、5-ASA產(chǎn)物和它們的組合。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥抗體選自抗細(xì)胞因子抗體、抗細(xì)胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體、抗趨化因子受體抗體、抗前炎癥肽抗體和它們的組合。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥肽選自LFA粘附分子拮抗劑、細(xì)胞因子受體拮抗劑、轉(zhuǎn)錄因子和可溶性TNF-α受體多肽。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥細(xì)胞因子選自IL-4、IL-10、IL-13、IL-16和它們的組合。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥核酸選自核酶、編碼抗炎癥肽的核酸、反義核酸和它們的組合。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述的反義核酸與編碼趨化因子受體、炎癥細(xì)胞因子、趨化因子受體或趨化因子的核酸雜交。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的甾類是糖皮質(zhì)激素。
27.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的甾類選自氟尼縮松、曲安西龍、丙酮曲安西龍、二丙酸倍氯米松、二丙酸倍他米松、氫化可的松、可的松、地塞米松、丁地去炎松、潑尼松、甲潑尼龍、潑尼龍和它們的組合。
28.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的非甾類抗炎藥選自水楊酸衍生物，包括水楊酸、硫代水楊酸鈉、膽堿水楊酸酯、水楊酸鎂、二氟尼柳、布洛芬、甲氧萘丙酸、舒林酸、二氟尼柳、水楊酰水楊酸、膽堿三水楊酸鎂、乙?；畻钏帷㈦p水楊酯、水楊酸鈉和它們的組合。
29.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的非甾類抗炎藥選自氟比洛芬、非諾洛芬、萘丁美酮、酮洛芬、吡羅昔康、吲哚美辛、托美丁、甲氯芬鈉酸、甲芬那酸、依托度酸、酮咯酸氨丁三醇、雙氯芬酸、噁丙嗪、溴芬酸鈉、羅非可比、舒洛芬、芬布洛芬、氟洛芬、沙利度胺、月見草油、它們的單異構(gòu)體和它們的組合。
30.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的5-ASA產(chǎn)物選自氨水楊酸、巴柳氮、伊普柳氮、奧撒拉嗪、硫氮磺胺吡啶和它們的組合。
31.一種抑制炎癥介導(dǎo)的粘膜組織感染的方法，其特征在于，所述的方法包括使粘膜組織與抑制有效量的抗炎藥和抗病毒藥接觸。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的炎癥介導(dǎo)的感染是由病毒導(dǎo)致的。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述的病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒是免疫缺陷病毒。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述的免疫缺陷病毒選自1型人免疫缺陷病毒HIV、2型HIV和猿猴免疫缺陷病毒SIV。
37.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的接觸是在體內(nèi)。
38.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的接觸是在體外。
39.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的接觸是活體外。
40.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的組織是哺乳動物組織。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動物組織是人的組織。
42.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的粘膜組織是陰道組織、腸胃組織、鼻組織或下腸胃道組織。
43.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的接觸是在給予抗病毒藥之前、同時或之后，局部或全身給予抗炎藥。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述的給藥是通過局部給藥的局部接觸實(shí)現(xiàn)的。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述的全身給藥是通過靜脈內(nèi)、口服或腸胃外給藥實(shí)現(xiàn)的。
46.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥抑制病毒融合于或進(jìn)入細(xì)胞，病毒的逆轉(zhuǎn)錄或核酸復(fù)制，病毒整合入細(xì)胞DNA中，病毒出芽或從細(xì)胞釋放，產(chǎn)生傳染性病毒；或抑制與病毒融合或感染、逆轉(zhuǎn)錄或核酸復(fù)制、病毒整合入細(xì)胞DNA中、病毒出芽或從細(xì)胞釋放、或產(chǎn)生傳染性病毒相關(guān)的酶。
47.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是多肽或其功能性模擬物。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述的多肽或其功能性模擬物結(jié)合于病毒或細(xì)胞表面受體。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述的多肽是配體、病毒受體、抗體或它們的片斷。
50.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述的酶是蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶。
51.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是蛋白酶抑制、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、整合酶抑制劑和它們的組合。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述的核苷抑制劑選自齊多夫定(AZT)、斯塔夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、雙脫氧胞苷(DDI)、扎西他賓(ddC)、阿巴卡韋和它們的組合。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述的非核苷抑制劑選自奈韋拉平、地拉夫定和埃法韋茲。
54.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或整合酶抑制劑。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶抑制劑是沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、那非那韋或安潑那韋。
56.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥減少炎性細(xì)胞的補(bǔ)充、減少趨化因子的產(chǎn)生、減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、或抑制趨化因子受體與其配體的相互作用。
57.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥選自抗炎癥抗體、抗炎癥肽、抗炎癥細(xì)胞因子、抗炎癥趨化因子、抗炎癥核酸、甾類、非甾類抗炎藥、5-ASA產(chǎn)物和它們的組合。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥的抗體選自抗細(xì)胞因子抗體、抗細(xì)胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體、抗趨化因子受體抗體、抗前炎癥肽抗體和它們的組合。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥肽選自LFA-1拮抗劑、細(xì)胞因子受體拮抗劑、轉(zhuǎn)錄因子和可溶性TNF-α受體。
60.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥細(xì)胞因子選自IL-4、IL-10、IL-13、IL-16和它們的組合。
61.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥核酸選自核酶、編碼抗炎癥肽的核酸、反義核酸和它們的組合。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述的反義核酸與編碼趨化因子受體、炎癥細(xì)胞因子、趨化因子受體或趨化因子的核酸雜交。
63.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的甾類是糖皮質(zhì)激素。
64.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的甾類選自氟尼縮松、曲安西龍、丙酮曲安西龍、二丙酸倍氯米松、二丙酸倍他米松、氫化可的松、可的松、地塞米松、丁地去炎松、潑尼松、甲潑尼龍、潑尼龍和它們的組合。
65.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的非甾類抗炎藥選自水楊酸衍生物，包括水楊酸、硫代水楊酸鈉、膽堿水楊酸酯、水楊酸鎂、二氟尼柳、布洛芬、甲氧萘丙酸、舒林酸、二氟尼柳、水楊酰水楊酸、膽堿三水楊酸鎂、乙酰基水楊酸、雙水楊酯、水楊酸鈉和它們的組合。
66.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的非甾類抗炎藥選自氟比洛芬、非諾洛芬、萘丁美酮、酮洛芬、吡羅昔康、吲哚美辛、托美丁、甲氯芬鈉酸、甲芬那酸、依托度酸、酮咯酸氨丁三醇、雙氯芬酸、噁丙嗪、溴芬酸鈉、羅非可比、舒洛芬、芬布洛芬、氟洛芬、沙利度胺、月見草油、它們的單異構(gòu)體和它們的組合。
67.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述的5-ASA產(chǎn)物選自氨水楊酸、巴柳氮、伊普柳氮、奧撒拉嗪、硫氮磺胺吡啶和它們的組合。
68.一種降低有患炎癥介導(dǎo)的粘膜感染危險的對象患炎癥介導(dǎo)粘膜感染的可能性的方法，其特征在于，所述的方法包括使該對象與有效量的抗炎藥和抗病毒藥接觸。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述炎癥介導(dǎo)的感染是由病毒導(dǎo)致的。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述的病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒是免疫缺陷病毒。
73.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述的免疫缺陷病毒選自1型人免疫缺陷病毒HIV、2型HIV和猿猴免疫缺陷病毒SIV。
74.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的接觸是在體內(nèi)。
75.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的體內(nèi)接觸是在給予抗病毒藥之前、同時或之后，局部或全身給予抗炎藥。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，所述的給藥是通過局部給藥的局部接觸實(shí)現(xiàn)的。
77.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，所述的全身給藥是通過靜脈內(nèi)、口服或腸胃外給藥實(shí)現(xiàn)的。
78.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的對象是哺乳動物。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動物是人。
80.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥抑制病毒融合于或進(jìn)入細(xì)胞，病毒的逆轉(zhuǎn)錄或核酸復(fù)制，病毒整合入細(xì)胞DNA中，病毒出芽或從細(xì)胞釋放，產(chǎn)生傳染性病毒；或抑制與病毒融合或感染、逆轉(zhuǎn)錄或核酸復(fù)制、病毒整合入細(xì)胞DNA中、病毒出芽或從細(xì)胞釋放、或產(chǎn)生傳染性病毒相關(guān)的酶。
81.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是多肽或其功能性模擬物。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述的多肽或其功能性模擬物結(jié)合于病毒或細(xì)胞表面受體。
83.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述的多肽是配體、病毒受體、抗體或它們的片斷。
84.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述的酶是蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶。
85.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥選自蛋白酶抑制劑、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、整合酶抑制劑和它們的組合。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述的核苷抑制劑是齊多夫定(AZT)、斯塔夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、雙脫氧胞苷(DDI)、扎西他賓(ddC)、阿巴卡韋和它們的組合。
87.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述的非核苷抑制劑選自奈韋拉平、地拉夫定和埃法韋茲。
88.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的抗病毒藥是蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或整合酶抑制劑。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶抑制劑是沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、那非那韋或安潑那韋。
90.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥減少炎性細(xì)胞的補(bǔ)充、減少趨化因子的產(chǎn)生、減少前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、或抑制趨化因子受體與其配體的相互作用。
91.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥選自抗炎癥抗體、抗炎癥肽、抗炎癥細(xì)胞因子、抗炎癥趨化因子、抗炎癥核酸、甾類、非甾類抗炎藥、5-ASA產(chǎn)物和它們的組合。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥的抗體選自抗細(xì)胞因子抗體、抗細(xì)胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體、抗趨化因子受體抗體、抗前炎癥肽抗體和它們的組合。
93.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥肽選自LFA-1拮抗劑、細(xì)胞因子受體拮抗劑、轉(zhuǎn)錄因子和可溶性TNF-α受體。
94.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥細(xì)胞因子選自IL-4、IL-10、IL-13、IL-16和它們的組合。
95.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的抗炎癥核酸選自核酶、編碼抗炎癥肽的核酸、反義核酸和它們的組合。
96.如權(quán)利要求95所述的方法，其特征在于，所述的反義核酸與編碼趨化因子受體、炎癥細(xì)胞因子、趨化因子受體或趨化因子的核酸雜交。
97.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的甾類選自氟尼縮松、曲安西龍、丙酮曲安西龍、二丙酸倍氯米松、二丙酸倍他米松、氫化可的松、可的松、地塞米松、丁地去炎松、潑尼松、甲潑尼龍、潑尼龍和它們的組合。
98.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的非甾類抗炎藥選自水楊酸衍生物，包括水楊酸、硫代水楊酸鈉、膽堿水楊酸酯、水楊酸鎂、二氟尼柳、布洛芬、甲氧萘丙酸、舒林酸、二氟尼柳、水楊酰水楊酸、膽堿三水楊酸鎂、乙?；畻钏?、雙水楊酯、水楊酸鈉和它們的組合。
99.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的非甾類抗炎藥選自氟比洛芬、非諾洛芬、萘丁美酮、酮洛芬、吡羅昔康、吲哚美辛、托美丁、甲氯芬鈉酸、甲芬那酸、依托度酸、酮咯酸氨丁三醇、雙氯芬酸、噁丙嗪、溴芬酸鈉、羅非可比、舒洛芬、芬布洛芬、氟洛芬、沙利度胺、月見草油、它們的單異構(gòu)體和它們的組合。
100.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述的5-ASA產(chǎn)物選自氨水楊酸、巴柳氮、伊普柳氮、奧撒拉嗪、硫氮磺胺吡啶和它們的組合。
101.一種抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒活化的方法，其特征在于，所述的方法包括將被病毒感染的細(xì)胞與抑制活化量的抗炎藥接觸，其中抗炎藥不是5-ASA或ASA。
102.如權(quán)利要求101所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥選自抗炎癥抗體、抗炎癥肽、抗炎癥細(xì)胞因子、抗炎癥趨化因子、抗炎癥核酸、甾類、非甾類抗炎藥和它們的組合。
103.一種抑制粘膜組織的炎癥介導(dǎo)的感染的方法，其特征在于，所述的方法包括使該組織與抑制有效量的抗炎藥接觸，其中抗炎藥不是5-ASA或ASA。
104.如權(quán)利要求103所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥選自抗炎癥抗體、抗炎癥肽、抗炎癥細(xì)胞因子、抗炎癥趨化因子、抗炎癥核酸、甾類、非甾類抗炎藥和它們的組合。
105.一種抑制有患炎癥介導(dǎo)的粘膜感染危險的對象患炎癥介導(dǎo)的粘膜感染的方法，其特征在于，所述的方法包括使該對象與有效量的抗炎藥接觸，其中抗炎藥不是5-ASA或ASA。
106.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥選自抗炎癥抗體、抗炎癥肽、抗炎癥細(xì)胞因子、抗炎癥趨化因子、抗炎癥核酸、甾類、非甾類抗炎藥和它們的組合。
107.一種抑制攜帶人免疫缺陷病毒的對象中與HIV相關(guān)的紊亂發(fā)展的方法，其特征在于，所述的方法包括給予該患HIV病毒感染的對象治療有效量的抑制HIV病毒發(fā)展的抗炎藥。
108.如權(quán)利要求107所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥不是ASA或5-ASA。
109.如權(quán)利要求107所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括給予抗病毒藥。
110.一種預(yù)防或減少有被HIV感染危險的對象發(fā)生感染的可能性的方法，其特征在于，所述的方法包括給予該對象預(yù)防有效量的抗炎藥，所述的抗炎藥抑制或減少該對象感染HIV的可能性。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥不是ASA或5-ASA。
112.如權(quán)利要求110所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括在給予抗炎藥之前、同時或之后給予抗病毒藥。
113.如權(quán)利要求107或110所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥是局部給予的。
114.如權(quán)利要求107或110所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥是全身給予的。
115.一種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中至少一個劑量的治療有效量的抗炎藥，其中該劑量是能抑制或減少被免疫缺陷病毒感染可能性的有效量。
116.如權(quán)利要求115所述的藥物組合物，其特征在于，所述的組合物還包括抗病毒藥。
117.如權(quán)利要求115所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的凝膠、乳膏、泡沫劑或栓劑。
118.一種制品，其特征在于，所述的制品包括至少一種抗炎藥，和該藥物用于治療、預(yù)防或減少被免疫缺陷病毒感染可能性的說明書。
119.如權(quán)利要求118所述的制品，其特征在于，所述的制品還包括抗病毒藥。
120.如權(quán)利要求118所述的制品，其特征在于，所述的制品選自陰莖套、衛(wèi)生棉、隔膜、子宮帽、陰道環(huán)、栓劑和灌腸劑。
121.一種抑制被病毒感染的組織中逆轉(zhuǎn)錄病毒活化的方法，其特征在于，所述的方法包括使該組織與抑制活化有效量的抗炎藥接觸。
122.如權(quán)利要求121所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥不是ASA或5-ASA。
123.如權(quán)利要求121所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括在給予抗炎藥之前、同時或之后使所述的組織與抗病毒藥接觸。
124.一種抑制被病毒感染的對象中逆轉(zhuǎn)錄病毒活化的方法，其特征在于，所述的方法包括使該對象與抑制活化有效量的抗炎藥接觸。
125.如權(quán)利要求124所述的方法，其特征在于，所述的抗炎藥不是ASA或5-ASA。
126.如權(quán)利要求124所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括在給予抗炎藥之前、同時或之后使所述的對象與抗病毒藥接觸。
127.一種制品，其特征在于，所述的制品包含至少一種抗炎藥和該抗炎藥用于預(yù)防免疫缺陷病毒感染用法的說明書。
128.如權(quán)利要求127所述的制品，其特征在于，所述的制品還包括抗病毒藥。
129.如權(quán)利要求127所述的制品，其特征在于，所述的制品選自陰莖套、衛(wèi)生棉、隔膜、子宮帽、陰道環(huán)、栓劑和灌腸劑。
全文摘要
本文提供了抑制炎癥介導(dǎo)的粘膜感染發(fā)展的方法。這些方法包括給予有效量的抗炎藥。還提供了用于預(yù)防和抑制粘膜感染活化和發(fā)展的組合物和制品。
文檔編號A61K31/606GK1353573SQ00807547
公開日2002年6月12日 申請日期2000年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月14日
發(fā)明者P·A·安東尼, M·A·波萊斯, J·V·喬治, J·E·埃利奧特 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會