專(zhuān)利名稱(chēng)：治療或預(yù)防免疫介導(dǎo)的疾病的方法以及用于該方法中的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥有效量的雌激素成分治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物免疫介導(dǎo)的疾病的方法。該方法特別適用于治療或預(yù)防T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和/或慢性炎性疾病，包括但不限于自身免疫疾病如多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴(lài)性糖尿病(I型糖尿病)、全身性紅斑狼瘡和銀屑病，由感染物如蠕蟲(chóng)(例如利什曼病)和某些包括HIV的病毒性感染誘導(dǎo)的免疾病理，以及由細(xì)菌性感染誘導(dǎo)的免疾病理，包括萊姆病、結(jié)核病和瘤型麻風(fēng)，移植排斥、移植物對(duì)抗宿主疾病和特異反應(yīng)性病癥，如哮喘和過(guò)敏癥，包括過(guò)敏性鼻炎、包括食物過(guò)敏的胃腸過(guò)敏反應(yīng)，嗜酸粒細(xì)胞增多、結(jié)膜炎和腎小球腎炎。
本發(fā)明的另一方面涉及在上述方法中使用的藥物組合物，其中該組合物包含雌激素成分、免疫治療劑和藥物學(xué)可接受的賦形劑。
背景技術(shù)：
雌性性激素在各種免疫介導(dǎo)的疾病中的作用已成為許多科技文獻(xiàn)的主題。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，如多發(fā)性硬化和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病優(yōu)先影響女性(Jansson等，Inflamm Res 1998 Jul；47(7)290-301)。另外，還發(fā)現(xiàn)在妊娠期，當(dāng)雌性性激素的水平較高時(shí)，細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病通常會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀的緩解，而當(dāng)分娩后性激素水平降低時(shí)，常發(fā)現(xiàn)疾病惡化(Kim等，Neurology 1999 Apr 12；52(6)1230-1238)。而且已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，異常高比例的多發(fā)性硬化患者的尿中促性腺激素和雌激素值降低(Poser等，Geburtshilfe Frauenhielkd 1981 May；41(5)353-358)。
用去勢(shì)小鼠進(jìn)行進(jìn)一步研究證明，以誘導(dǎo)在妊娠后期可見(jiàn)的血清水平的量給藥雌二醇和雌三醇，會(huì)延遲實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)病，EAE是一種Th1細(xì)胞依賴(lài)性自身免疫疾病，用作多發(fā)性硬化的模型(Jansson等，Inflamm Res 1998 Jul；47(7)290-301)。使用DNA微陣列評(píng)價(jià)17β-雌二醇對(duì)EAE基因表達(dá)的作用的結(jié)果揭示了有限組的已知的和先前未為人知的雌二醇敏感性基因可能對(duì)于抑制EAE和潛在的人類(lèi)疾病——多發(fā)性硬化——是至關(guān)重要的(Matejuk等，Endocrinology 2002Jan；143(1)313-319)。
WO 01/185154涉及一種通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥低劑量的雌激素，特別是低劑量的17β-雌二醇、雌三醇或雌酮來(lái)改善Th1介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物免疾病理的方法。低劑量的這些雌激素被認(rèn)為是避免高水平的雌激素對(duì)生殖系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的潛在副作用以及在雄性中預(yù)防不良的副作用所必需的。
前述的雌激素17β-雌二醇、雌三醇和雌酮共同之處為它們都是女性身體內(nèi)源性的，即它們是生物生成的雌激素。這些生物生成的雌激素表現(xiàn)出嚴(yán)重的藥物動(dòng)力學(xué)缺陷。它們的口服生物利用度非常低，并且明顯地因人而異，這意味著不能提供通用的推薦劑量。另外一個(gè)相關(guān)的問(wèn)題是這些雌激素會(huì)很快地從血液中消除。例如，主要的人體生物生成的雌激素17β-雌二醇的半衰期為約1小時(shí)。結(jié)果，在間隔(每天)給藥事件之間，該生物生成的雌激素的血清水平容易明顯地波動(dòng)。這樣，給藥后很短的時(shí)間內(nèi)，血清濃度通常比最優(yōu)濃度高出數(shù)倍。另外，如果拖延下一次給藥事件，血清濃度會(huì)迅速降低到雌激素不再具有生理活性的水平。
除了藥物動(dòng)力學(xué)問(wèn)題外，已知的雌激素還表現(xiàn)出藥效學(xué)缺陷。從腸腔吸收后，口服給藥的活性組分通過(guò)肝臟進(jìn)入機(jī)體。該事實(shí)對(duì)于雌激素藥物是特別重要的，因?yàn)楦闻K是雌激素的靶器官；口服雌激素導(dǎo)致肝中的強(qiáng)烈的雌激素作用。由人肝臟中的雌激素控制的分泌功能包括增加合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CBG、SHBG、TBG、對(duì)血液凝結(jié)的生理功能重要的幾種因子和脂蛋白。如果將生物生成的雌激素導(dǎo)入雌性機(jī)體中且避免通過(guò)肝臟(例如通過(guò)透皮給藥)，所述的肝功能大部分沒(méi)有改變。當(dāng)口服應(yīng)用時(shí)給藥治療等效劑量的常見(jiàn)生物生成雌激素會(huì)導(dǎo)致明顯的肝參數(shù)反應(yīng)，如SHBG、CBG、血管緊張素原和HDL(高密度脂蛋白)的升高。
因此，需要雌激素物質(zhì)，它們(a)在治療免疫介導(dǎo)的疾病的方法中比前述生物生成的雌激素更有效；和/或(b)具有比前述生物生成的雌激素明顯更長(zhǎng)的半衰期；和/或(c)可以口服給藥，且不會(huì)對(duì)肝造成明顯的影響；和/或(d)比前述生物生成的雌激素產(chǎn)生更少的不良的副作用。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，下式代表的雌激素物質(zhì)能夠滿(mǎn)足這些要求 其中，R1、R2、R3、R4獨(dú)立地為氫原子、羥基或含有1-5個(gè)碳原子的烷氧基；R5、R6、R7各自是羥基；且R1、R2、R3、R4中的不超過(guò)3個(gè)為氫原子。
該組雌激素物質(zhì)的已知的代表是1，3，5(10)-雌三烯-3，15α，16α，17β-四醇，也被稱(chēng)作雌四醇(estetrol或oestetrol)和15α-羥基雌三醇。雌四醇是在人類(lèi)妊娠期間由胎兒肝臟生成的雌激素。未結(jié)合的雌四醇在母體血漿中的水平在足月妊娠中達(dá)到頂峰約1.2ng/ml，且在胎兒中的水平比在母體血漿中高約12倍(Tulchinsky等，1975.J.Clin.Endocrinol.Metab.，40，560-567)。
1970年，F(xiàn)ishman等人在“Fate of 15α-hydroxyestriol-3H in Adult Man”，J Clin Endocrinol Metab(1970)31，436-438中報(bào)導(dǎo)了研究結(jié)果，其中將氚標(biāo)記的15α-羥基雌三醇(雌四醇)經(jīng)靜脈給藥于兩個(gè)成年婦女。發(fā)現(xiàn)雌四醇作為葡糖苷酸酯迅速、徹底地從尿中排出，并且事實(shí)上除了結(jié)合以外沒(méi)有發(fā)生代謝。
在1975和1985年之間，幾位研究人員研究了雌四醇的屬性，并報(bào)導(dǎo)了其雌激素效力和親子宮活性。在此期間公開(kāi)的最相關(guān)文獻(xiàn)如下●Levine等，1984.Uterine vascular effects of estetrol in nonpregnantewes.Am.J.Obstet.Gynecol.，14873，735-738“當(dāng)由靜脈向未懷孕的母羊給藥雌四醇時(shí)，其在子宮血管舒張中的效力比雌三醇和17β-雌二醇低15～30倍”；●Jozan等，1981.Different effects of oestradiol，oestriol，oestetrol andof oestrone on human breast cancer cells(MCF-7)in long termtissue culture.Acta Endocrinologica，98，73-80“雌四醇在體外細(xì)胞增殖中的激動(dòng)效力是17β-雌二醇所觀察到的大小的2％”；●Holinka等，1980.Comparison of effects of estetrol and tamoxifenwith those of estriol and estradiol on the immature rat uterus.Biol.Reprod.22，913-926“皮下給藥雌四醇具有非常弱的親子宮活性，且其效力被認(rèn)為低于17β-雌二醇和雌三醇”；●Holinka等，1979.In vivo effects of estetrol on the immature ratuterus.Biol.Reprod.20，242-246“皮下給藥雌四醇具有非常弱的親子宮活性，且其效力被認(rèn)為低于17β-雌二醇和雌三醇”；●Tseng等，1978.Heterogeneity of saturable estradiol binding sites innuclei of human endometrium.Estetrol studies.J.Steroid Biochem.9，1145-1148“雌四醇向人子宮內(nèi)膜中的雌激素受體的相對(duì)結(jié)合是17β-雌二醇的1.5％”；●Martucci等，1977.Direction of estradiol metabolism as a control ofits hormonal action-uterotrophic activity of estradiol metabolites.Endocrin.101，1709-1715“雌四醇從皮下儲(chǔ)庫(kù)型制劑連續(xù)給藥顯示出非常弱的親子宮活性，且其效力被認(rèn)為低于17β-雌二醇和雌三醇”；●Tseng等，1976.Competition of estetrol and ethynylestradiol withestradiol for nuclear binding in human endometrium.J.SteroidBiochem.7，817-822“雌四醇的人子宮內(nèi)膜雌激素受體相對(duì)結(jié)合常數(shù)是17β-雌二醇(100％)的6.25％”；●Martucci等，1976.Uterine estrogen receptor binding of catecholestrogens and of estetrol(1，3，5(10)-estratriene-3，15α，16α，17β-tetrol).Steroids，27，325-333“雌四醇大鼠子宮胞液雌激素受體相對(duì)結(jié)合親和力是17β-雌二醇(100％)的0.5％。而且，雌四醇大鼠子宮細(xì)胞核雌激素受體相對(duì)結(jié)合親和力是17β-雌二醇(100％)的0.3％”。
所有的上述文獻(xiàn)的共同點(diǎn)是，作者們已經(jīng)研究了雌四醇的雌激素效力。沒(méi)有例外，它們都表明雌四醇是弱雌激素。在一些引用的文獻(xiàn)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌四醇的雌激素效力比廣泛應(yīng)用且相對(duì)較弱的雌激素17β-雌二醇的效力低許多?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，就不會(huì)對(duì)這一情形感到奇怪了自上世紀(jì)八十年代早期以來(lái)人們對(duì)雌四醇的興趣已經(jīng)減少，并且此后再?zèng)]有發(fā)表關(guān)于雌四醇的性質(zhì)的文獻(xiàn)。
發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，盡管它的效力低，雌四醇和相關(guān)的雌激素物質(zhì)可以有利地用在治療免疫介導(dǎo)的疾病的方法中。盡管發(fā)明人不想受理論的約束，還是確信本發(fā)明的雌四醇類(lèi)物質(zhì)的意外功效是來(lái)自下述因素的組合這些物質(zhì)的意外有利的藥效學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，它們對(duì)雌激素受體α(ERα)的親和力比對(duì)雌激素受體β(ERβ)的親和力更高。后一特征是在本發(fā)明中使用的雌激素物質(zhì)的獨(dú)特特征。
關(guān)于本發(fā)明的雌激素物質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它們的體內(nèi)半衰期明顯地比其它生物生成的雌激素長(zhǎng)。因此，即使雌四醇和雌四醇類(lèi)物質(zhì)具有相對(duì)低的雌激素效力，它們也可以有效地用于治療免疫介導(dǎo)的疾病的方法中，因?yàn)槿绨胨テ陂L(zhǎng)所證明，它們的低效力通過(guò)相對(duì)高的代謝穩(wěn)定性得以彌補(bǔ)。
發(fā)明人認(rèn)為，本發(fā)明的雌激素物質(zhì)對(duì)ERα受體相對(duì)高的親和力，或相反地對(duì)ERβ受體相對(duì)低的親和力，在一定程度上與本發(fā)明物質(zhì)在治療免疫介導(dǎo)的疾病中的高功效相關(guān)。但是，盡管正努力對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究，如下文將要說(shuō)明的，仍不清楚控制負(fù)責(zé)該功效的ER信號(hào)通道的機(jī)制。
已知大多數(shù)雌激素能結(jié)合兩種ER，在存在組織特異性的輔激活物和/或輔阻遏物的條件下，ER與基因調(diào)節(jié)區(qū)的雌激素反應(yīng)元件或其它的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合?？紤]到ER信號(hào)以及ERα和ERβ及其輔因子的組織特異性表達(dá)的復(fù)雜性，現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，ER配體能以組織特異性的方式作為雌激素激動(dòng)劑或者甚至雌激素拮抗劑起作用。
還已知ERα和ERβ受體在配體結(jié)合域和羧基端轉(zhuǎn)活性域具有明顯不同的氨基酸序列(約56％的氨基酸相同)，在它們的氨基端轉(zhuǎn)活性域僅有20％的同源性。這解釋了為什么有些配體對(duì)一個(gè)受體的親和力比對(duì)其它受體的更高。另外，與輔因子的相互作用可以導(dǎo)致單個(gè)配體的非常不同的生物學(xué)作用。換句話(huà)說(shuō)，作為激動(dòng)劑作用于ERα的配體不一定也作為激動(dòng)劑作用于ERβ，反之亦然。
而且，現(xiàn)在已知雌激素通過(guò)基因表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞的藥理學(xué)，雌激素的作用通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)。雌激素受體在基因調(diào)節(jié)上的作用可以通過(guò)ER直接結(jié)合到雌激素反應(yīng)元件上、ER結(jié)合到其它轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、C/EBPβ上以及通過(guò)包含離子通道受體的非基因組作用來(lái)介導(dǎo)。最近幾年的進(jìn)展表明，ER與輔激活物(例如SRC-1、CBP和SRA)和輔阻遏物(例如SMRT和N-CoR有關(guān)聯(lián)，它們也以組織特異性和配體特異性的方式調(diào)節(jié)ER的轉(zhuǎn)錄活性。另外，目前的證據(jù)表明，大多數(shù)雌激素調(diào)節(jié)的基因不具有典型的雌激素反應(yīng)元件。在這種情況下，ER與調(diào)節(jié)這些基因的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子相互作用。已知由ER調(diào)節(jié)其活性的轉(zhuǎn)錄因子包括，例如，AP-1、NF-κB、C/EBP和Sp-1。
考慮到ER信號(hào)以及各種類(lèi)型的表達(dá)ER及其輔因子的組織的復(fù)雜性，通常認(rèn)為，ER配體不能再簡(jiǎn)單地分成純拮抗劑或激動(dòng)劑。該觀點(diǎn)得到了Paech等人(Science 277，1508-1510，1997)的發(fā)現(xiàn)的支持，他們已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，17β-雌二醇在ERα存在下激活A(yù)P-1位點(diǎn)，但是在ERβ存在下則抑制該位點(diǎn)。相反地，ER配體雷洛昔芬(Eli Lilly & Co.)和他莫西芬以及ICI-182、780(Zeneca Pharmaceuticals)通過(guò)ERβ刺激AP-1位點(diǎn)，但是在ERα存在下則抑制該位點(diǎn)。
如主要通過(guò)RT-PCR或原位雜交所分析的，已知ERα和ERβ具有重疊的和不同的組織分布。組織經(jīng)常表達(dá)ERα和ERβ二者，但是受體位于不同的細(xì)胞類(lèi)型中。另外，有些組織(例如腎)不含有ERα，而其它組織(例如子宮、垂體和附睪)則存在大量的Erα(Couse等，Endocrinology138，4613-4621，1997；Kuiper等，Endocrinology 138.，863-870，1997)。Erg(Korach，Science 266，1524-1527，1994)和Erβ(Krege等，Proc.Natl.AcadSci.USA 95，15677-82，1998)剔除小鼠的開(kāi)發(fā)已經(jīng)提供了進(jìn)一步的證據(jù)，表明各個(gè)ER在不同的組織中具有不同的功能。
總之，雖然尚不清楚本發(fā)明的雌激素物質(zhì)發(fā)揮其有益效果的機(jī)制，顯而易見(jiàn)的是，這些物質(zhì)在至少兩個(gè)相關(guān)方面與其它生物生成的雌激素不同。首先，本發(fā)明的雌激素物質(zhì)表現(xiàn)出出人意料的長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。其次，與對(duì)ERβ受體的親和力相比，這些物質(zhì)對(duì)ERα受體的親和力比已經(jīng)從其它(生物生成的)雌激素觀察到的更高。
本發(fā)明的雌激素物質(zhì)的另外一個(gè)有益性質(zhì)存在于以下事實(shí)，即性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)難以結(jié)合這些雌激素物質(zhì)，這意味著，與大多數(shù)已知的雌激素相反，血清水平代表生物活性且獨(dú)立于SHBG水平。
本發(fā)明的雌激素物質(zhì)的另外一個(gè)重要益處來(lái)自它們對(duì)其它藥物的相互作用(藥-藥相互作用)的相對(duì)不敏感性。眾所周知，某些藥物會(huì)降低雌激素如乙炔基雌二醇的有效性，而其它藥物則會(huì)增加它們的活性，導(dǎo)致有可能增加副作用。類(lèi)似地，雌激素會(huì)干擾其它藥物的代謝。通常，其它藥物對(duì)雌激素的作用是由于對(duì)這些雌激素吸收、代謝或排泄的干擾，而雌激素對(duì)其它藥物的作用是由于代謝通道的競(jìng)爭(zhēng)。
臨床上最重要的雌激素藥物相互作用組出現(xiàn)在可以誘導(dǎo)肝微粒體酶的藥物中，所述的肝微粒體酶可以將雌激素的血漿水平降低至治療水平以下(例如，抗驚厥藥；苯妥英、撲米酮、巴比妥酸鹽、卡馬西平、乙琥胺和甲琥胺；抗結(jié)核藥如利福平；抗真菌藥如灰黃霉素)。本發(fā)明的雌激素物質(zhì)較少地依賴(lài)于微粒體肝酶(例如P450的)的向上-和向下-調(diào)節(jié)，并且對(duì)其它P450底物的競(jìng)爭(zhēng)的敏感性也更低。類(lèi)似地，它們不明顯地干擾其它藥物的代謝。
大多數(shù)雌激素結(jié)合物，如在肝中形成的，排泄到膽汁中，并會(huì)被結(jié)腸中的腸道細(xì)菌分解，以釋放出活性激素，它可被再吸收(腸肝循環(huán))。已有臨床報(bào)導(dǎo)支持該觀點(diǎn)，即在服用抗生素(例如氨芐青霉素、四環(huán)素等)的女性中雌激素的腸肝循環(huán)減少。結(jié)合物形式的本發(fā)明的雌激素物質(zhì)難以排泄到膽汁中，這意味著它們基本上對(duì)影響其它雌激素的腸肝循環(huán)的藥物不敏感。
上面的發(fā)現(xiàn)用于解釋為什么本發(fā)明的雌激素物質(zhì)幾乎不受藥物-藥物相互作用的干擾，并從而產(chǎn)生非常一致的，即可預(yù)測(cè)的效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的免疫介導(dǎo)的疾病的方法，所述的方法包括向所述的哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的雌激素成分，其中雌激素成分是選自由以下物質(zhì)組成的組中
如下式所示的物質(zhì) 其中，R1、R2、R3、R4獨(dú)立地為氫原子、羥基或含有1-5個(gè)碳原子的烷氧基；R5、R6、R7各自是羥基；且R1、R2、R3、R4中的不超過(guò)3個(gè)為氫原子；本發(fā)明還涉及當(dāng)在本方法中使用時(shí)能夠釋放出如上式所示的物質(zhì)的前體；以及一種或多種前述物質(zhì)和/或前體的混合物。
本發(fā)明的雌激素物質(zhì)不同于通常應(yīng)用于藥物組合物的生物生成的和合成的雌激素之處在于它們含有至少4個(gè)羥基。本發(fā)明的物質(zhì)的特征在于，甾體骨架中的5元環(huán)包含3個(gè)而不是0-2個(gè)羥基取代基?？缮虡I(yè)購(gòu)得的含有至少4個(gè)羥基的雌激素和它們的前體的實(shí)例是1，3，5(10)-雌三烯-2，3，15α，16α，17β-五醇2-甲基醚1，3，5(10)-雌三烯-2，3，15β，16α，17β-五醇2-甲基醚1，3，5(10)-雌三烯-2，3，16α，17β-四醇1，3，5(10)-雌三烯-3，4，16α，17β-四醇4-甲基醚1，3，5(10)-雌三烯-3，15α，16α，17β-四醇1，3，5(10)-雌三烯-3，15α，16α，17β-四醇四乙酸酯1，3，5(10)-雌三烯-3，15β，16β，17β-四醇四乙酸酯優(yōu)選地，用作本發(fā)明的組合物的活性成分的雌激素成分是所謂的生物生成的雌激素即自然存在于人體內(nèi)的雌激素、生物生成的雌激素的前體或它們的混合物。因?yàn)樯锷傻拇萍に刈匀坏卮嬖谟谔汉痛菩缘捏w內(nèi)，預(yù)期不會(huì)產(chǎn)生副作用，特別是當(dāng)外源性給藥這種雌激素導(dǎo)致的血清水平?jīng)]有大大超過(guò)自然濃度時(shí)。自然存在的雌激素成分典型地表現(xiàn)出8β，9α，13β，14α的甾體骨架構(gòu)型。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雌激素物質(zhì)含有4個(gè)羥基。同樣地，在前述式中，R1優(yōu)選地代表氫原子。在所述的式中，R1、R2、R3、R4基中的優(yōu)選至少2個(gè)、更優(yōu)選至少3個(gè)代表氫原子。
因?yàn)榫哂辛u基取代基R5、R6和R7的碳原子是手性活性的，如該式的雌激素物質(zhì)包含不同的對(duì)映異構(gòu)體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的雌激素物質(zhì)是15α-羥基取代的。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該物質(zhì)是16α-羥基取代的。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該物質(zhì)是17β-羥基取代的。最優(yōu)選地，該雌激素物質(zhì)是15α，16α，17β-三羥基取代的。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R3代表羥基或烷氧基。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R1、R2和R4代表氫原子，在該情況下，如果R3、R5、R6和R7是羥基，該物質(zhì)是1，3，5(10)-雌三烯-3，15，16，17-四醇。后一種物質(zhì)的優(yōu)選的異構(gòu)體是1，3，5(10)-雌三烯-3，15α，16，17β-四醇(雌四醇)。
本發(fā)明還包括雌激素物質(zhì)的前體的應(yīng)用，它用作本發(fā)明的方法中的活性成分。例如作為代謝轉(zhuǎn)化的結(jié)果，這些前體當(dāng)用在本發(fā)明的方法中時(shí)能釋放出前述的雌激素物質(zhì)。這些前體優(yōu)選地選自本發(fā)明的雌激素物質(zhì)的衍生物，其中至少一個(gè)羥基的氫原子已經(jīng)被以下基團(tuán)取代含有1-25個(gè)碳原子的羧酸、磺酸或氨基磺酸的?；?；四氫呋喃基；四氫吡喃基；或每個(gè)殘基含有1-20個(gè)糖苷單元的直鏈或支鏈的糖苷殘基。適用于本發(fā)明的前體的典型實(shí)例是酯，它可以通過(guò)將雌激素物質(zhì)的羥基與含有一個(gè)或多個(gè)羧基的物質(zhì)(M+-OOC-)反應(yīng)制得，其中M+代表氫或(堿)金屬陽(yáng)離子。由此，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，前體是雌激素物質(zhì)的衍生物，其中所述式中的至少一個(gè)羥基的氫原子被-CO-R取代，其中R是包含1-25個(gè)碳原子的烴基。優(yōu)選地，R是氫或包含1-20個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或芳基。
當(dāng)用于治療或預(yù)防慢性免疫介導(dǎo)的疾病時(shí)，本發(fā)明的方法特別有效。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括在一段為期至少為5天、優(yōu)選地至少為30天的時(shí)間內(nèi)，不間斷地給藥雌激素成分。
本方法可以合適地采用經(jīng)腸或非胃腸道給藥雌激素成分。這里使用的術(shù)語(yǔ)“非胃腸道給藥”包括透皮、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、經(jīng)肺、口腔、皮下、肌肉內(nèi)、子宮內(nèi)給藥。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)腸給藥”包括口服和直腸給藥。
優(yōu)選地，給藥模式選自口服、透皮、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、經(jīng)肺、直腸、口腔、皮下、肌肉內(nèi)或子宮內(nèi)給藥。更優(yōu)選地，給藥模式選自口服、透皮、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、經(jīng)肺或陰道給藥。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法采用口服、透皮、鼻內(nèi)或皮下給藥。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法采用口服或皮下給藥。
口服、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、口腔和經(jīng)肺給藥同等地適合于每天給藥(至少)一次。透皮給藥利于以每天一次至每月一次的頻率使用。陰道內(nèi)和子宮內(nèi)給藥利于以每周一次至每月一次的頻率使用。皮下和肌肉內(nèi)給藥也適于以?xún)?chǔ)庫(kù)型注射劑的形式以1周～6個(gè)月、優(yōu)選地4周～3個(gè)月的間隔使用。
為了方便起見(jiàn)，本發(fā)明的方法優(yōu)選采用的給藥間隔為1天、1周或1個(gè)月。特別優(yōu)選的方案是每天一次口服、皮下、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)給藥，每周一次透皮給藥或每月一次陰道內(nèi)或皮下給藥。
不考慮給藥模式，雌激素成分優(yōu)選地以可有效達(dá)到至少5納克/升、更優(yōu)選為至少50納克/升、最優(yōu)選為至少500納克/升的血清濃度的量給藥。通常，得到的雌激素成分的血清濃度不會(huì)超過(guò)200μg/l，優(yōu)選地不會(huì)超過(guò)10μg/l，更優(yōu)選地不會(huì)超過(guò)50μg/l。
根據(jù)本發(fā)明的方法，雌激素成分通常的給藥量低于2mg/kg體重/天，優(yōu)選為低于0.8mg/kg體重/天。為了使給藥雌激素成分達(dá)到明顯的效果，建議的給藥量為至少5μg/kg體重/天。優(yōu)選地，給藥量至少為25μg/g體重/天。
活性成分的口服給藥的優(yōu)選量為低于800μg/kg體重/天，優(yōu)選低于400μg/kg體重/天。為了使給藥活性成分達(dá)到明顯的效果，建議的口服給藥量為至少10μg/kg體重/天。優(yōu)選地，口服給藥量為至少25μg/kg體重/天。在本方法中，特別是當(dāng)用于人時(shí)，通常給藥雌激素成分的平均劑量為至少0.25mg/天，優(yōu)選為至少0.5mg/天。最大劑量通常保持為低于80mg/天，優(yōu)選為低于40mg/天。
本發(fā)明的治療方法優(yōu)選地包括向需要該治療的人給藥有效量的雌激素成分。達(dá)到有效所需要的量在個(gè)體和個(gè)體之間存在差異，并由多種因素決定，如個(gè)體的雌激素缺乏水平、體重、給藥途徑和使用的特定雌激素物質(zhì)的功效。
在本方法中，特別是當(dāng)用于人時(shí)，通?？诜o藥雌激素成分的平均劑量為0.05～40mg/天，優(yōu)選為0.25～20mg/天。類(lèi)似地，非胃腸道劑量?jī)?yōu)選為至少0.25mg/天，優(yōu)選至少0.5mg/天。平均最大非胃腸道劑量通常保持為低于80mg/天，優(yōu)選為低于40mg/天。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法采用了口服給藥活性雌激素成分。這里使用的術(shù)語(yǔ)“口服給藥”也包括經(jīng)口管飼給藥。發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，盡管它們效力低，但是雌四醇和相關(guān)的雌激素物質(zhì)可利于口服給藥。盡管發(fā)明人不想受理論的約束，還是確信口服給藥雌四醇類(lèi)物質(zhì)的意外功效的原因是這些物質(zhì)的特殊藥物動(dòng)力學(xué)(ADME)和藥效學(xué)性質(zhì)的組合。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雌四醇類(lèi)物質(zhì)的口服生物利用度出人意料地高，并且它們的體內(nèi)半衰期明顯比常用的生物生成的雌激素長(zhǎng)。這樣，即使雌四醇和雌四醇類(lèi)物質(zhì)具有相對(duì)較低的雌激素效力，它們也能有效地通過(guò)口服給藥。
雌四醇和雌四醇類(lèi)物質(zhì)口服給藥的另外一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)在于一個(gè)事實(shí)，即認(rèn)為這些物質(zhì)的肝作用是非常小的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谒^的“首過(guò)”期間難以代謝。口服給藥的藥物的首過(guò)效應(yīng)是指藥物在從起始攝入到血液循環(huán)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中被肝降解的過(guò)程。從腸道吸收后，口服應(yīng)用的活性成分經(jīng)肝進(jìn)入機(jī)體。該事實(shí)對(duì)雌激素劑是非常重要的，因?yàn)楦问谴萍に氐陌衅鞴伲淮萍に氐目诜z入在肝中產(chǎn)生強(qiáng)烈的雌激素作用。治療等效劑量的常用生物生成的雌激素在口服給藥時(shí)，會(huì)產(chǎn)生明顯的肝參數(shù)反應(yīng)，例如SHBG、CBG、血管緊張素原和HDL(高密度脂蛋白)的升高。
該方法適用于(預(yù)防性地)治療廣泛種類(lèi)的免疫介導(dǎo)的疾病。這里使用的術(shù)語(yǔ)“免疫介導(dǎo)的疾病”指任何不希望發(fā)生的免疫反應(yīng)或病理，它們由淋巴系統(tǒng)(包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞)或骨髓系統(tǒng)(包括粒細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞和單核細(xì)胞)的細(xì)胞介導(dǎo)或部分介導(dǎo)，且它們對(duì)于發(fā)生這些反應(yīng)或病理的哺乳動(dòng)物是有害的。這種不希望發(fā)生的免疫反應(yīng)或病理學(xué)可以由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)或是多因素的，例如慢性炎性疾病，包括但不限于自身免疫疾病、由感染物誘導(dǎo)的免疾病理、同種異體移植引起的免疫反應(yīng)、遺傳性過(guò)敏反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)和免疫增生病。
本方法特別適合用于治療T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和/或慢性炎性疾病，包括但不限于自身免疫疾病如多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴(lài)性糖尿病(I型糖尿病)、全身性紅斑狼瘡和銀屑病，由感染物如蠕蟲(chóng)(例如利什曼病)和某些包括HIV的病毒性感染誘導(dǎo)的免疾病理，以及由細(xì)菌性感染誘導(dǎo)的免疾病理包括萊姆病、結(jié)核病和瘤型麻風(fēng)，移植排斥、移植物對(duì)抗宿主疾病和特異反應(yīng)性病癥，如哮喘和過(guò)敏癥，包括過(guò)敏性鼻炎、包括食物過(guò)敏的胃腸過(guò)敏反應(yīng)，嗜酸粒細(xì)胞增多、結(jié)膜炎和腎小球腎炎。
許多免疫介導(dǎo)的疾病是多因素的，其特征在于多種類(lèi)型的炎性細(xì)胞、特別是淋巴系統(tǒng)(包括Th1淋巴細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞)和骨髓系統(tǒng)(包括粒細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞和單核細(xì)胞)細(xì)胞的激活。(前)炎性介導(dǎo)物包括細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)，它們由這些被激活的細(xì)胞生成，且常見(jiàn)抗體和補(bǔ)體反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本方法用于治療Th1-介導(dǎo)的免疫介導(dǎo)的疾病(“Th1介導(dǎo)的疾病”)。Th1介導(dǎo)的疾病是其中有害的免疫反應(yīng)主要地或部分地是T輔助細(xì)胞1(Th1)型免疫反應(yīng)。Th1免疫反應(yīng)的特征是(前)炎性細(xì)胞因子如IL-12、INF-γ和TNF-α的分泌。Th1介導(dǎo)的疾病包括大多數(shù)自身免疫疾病、許多同種免疫介導(dǎo)的疾病、某些過(guò)敏性疾病、某些慢性炎性疾病和某些感染物誘導(dǎo)的免疾病理學(xué)。免疫介導(dǎo)的疾病可替換地由Th2免疫反應(yīng)介導(dǎo)。與Th1-介導(dǎo)的反應(yīng)對(duì)比，Th2介導(dǎo)的反應(yīng)的特征在于抗炎性細(xì)胞因子如IL-4、IL-10、IL-13和TGF-β的分泌。
本方法特別適于治療或預(yù)防選自自身免疫病理和慢性炎性反應(yīng)的免疫介導(dǎo)的疾病?？梢杂行У刂委煹淖陨砻庖卟±淼膶?shí)例包括多發(fā)性硬化(神經(jīng)細(xì)胞)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(軟骨、結(jié)合面)、骨關(guān)節(jié)炎(軟骨)、I型糖尿病(胰腺)、全身性紅斑狼瘡(多組織)、銀屑病(皮膚)、阿爾茨海默氏病(中樞神經(jīng)系統(tǒng))、重癥肌無(wú)力(神經(jīng)肌肉接頭)、克羅恩氏病(腸)、附睪炎(附睪)、血管球性腎炎(腎)、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)(甲狀腺)、傳染性神經(jīng)元炎(神經(jīng)細(xì)胞)、橋本病(甲狀腺)、溶血性貧血(紅細(xì)胞)、天皰瘡(主要是皮膚)、風(fēng)濕熱(心臟和關(guān)節(jié))、結(jié)節(jié)病(多種組織和器官)、皮肌炎(多種組織和器官)、硬皮病(皮膚和結(jié)締組織)、舍格倫綜合征(外分泌腺和其它組織)、脊柱關(guān)節(jié)病(中軸骨和其它組織)、甲狀腺炎(甲狀腺)、脈管炎(血管)、白癲風(fēng)(皮膚)、艾迪生氏病(腎上腺)。適合用本方法治療的慢性炎性反應(yīng)的實(shí)例包括與心血管病伴隨的炎性反應(yīng)、冠心病、肝硬化、關(guān)節(jié)炎、膽汁郁積、結(jié)核病、麻風(fēng)、梅毒、牙周炎、纖維化、血管球性腎炎和某些癌癥以及對(duì)感染物如細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)和朊病毒的慢性炎性反應(yīng)。
本發(fā)明的方法被認(rèn)為特別適合用于治療導(dǎo)致神經(jīng)病理的免疫介導(dǎo)的疾病，例如多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病、重癥肌無(wú)力、傳染性神經(jīng)元炎、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。
本發(fā)明的方法還被認(rèn)為特別適合用于治療導(dǎo)致肌骨病理學(xué)的免疫介導(dǎo)的疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和相關(guān)的炎性關(guān)節(jié)炎病，包括痛風(fēng)、脊柱關(guān)節(jié)病、僵直性脊柱炎、萊特爾綜合征、牛皮癬關(guān)節(jié)病、腸性脊柱炎(enterapathric spondylitis)、青少年關(guān)節(jié)病或青少年僵直性脊椎炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)病、感染性或后感染性(post-fectious)關(guān)節(jié)炎、淋病性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核性關(guān)節(jié)炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、真菌性關(guān)節(jié)炎、梅毒性關(guān)節(jié)炎、萊姆病、與“脈管炎綜合癥”相關(guān)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、過(guò)敏性脈管炎、Luegenec氏肉芽腫病、風(fēng)濕性多肌痛、關(guān)節(jié)細(xì)胞動(dòng)脈炎、鈣結(jié)晶沉積關(guān)節(jié)病、假痛風(fēng)、非關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎、腕管綜合癥、重復(fù)性使用損傷、混雜形式的關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性關(guān)節(jié)病(盆地(charco)和關(guān)節(jié))、關(guān)節(jié)積血(關(guān)節(jié)處積血的)、亨-舍二氏紫癜、肥大性骨關(guān)節(jié)病、多中心網(wǎng)狀組織細(xì)胞增多病、與某些疾病相關(guān)的關(guān)節(jié)炎，如surcoilosis、血色沉著病、鐮狀細(xì)胞病和其它血紅蛋白病、高脂蛋白血癥、低丙球蛋白血癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、肢端肥大癥、家族性地中海熱、Behat氏病、全身性紅斑狼瘡或復(fù)發(fā)性多軟骨炎。
認(rèn)為本發(fā)明的方法在用于(預(yù)防性)治療選自下組的免疫介導(dǎo)的疾病時(shí)特別有利多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴(lài)性糖尿病(I型糖尿病)、全身性紅斑狼瘡和銀屑病。最有利地，本方法用于治療多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。
為了強(qiáng)化雌激素成分的作用，可以有利地共同給藥能預(yù)防性地或治療性地抑制免疫反應(yīng)和/或改進(jìn)免疫病理的免疫治療劑。這樣的藥劑是本領(lǐng)域熟知的，包括免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫封閉劑和/或抗炎劑，并且可以與雌激素成分組合給藥，即以單個(gè)單位劑量形式，或替換地，這些活性成分分別給藥，特別是當(dāng)給藥模式不同時(shí)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，向患有多發(fā)性硬化或?qū)Χ喟l(fā)性硬化敏感的哺乳動(dòng)物給藥與一種或多種免疫治療劑組合的本發(fā)明的雌激素成分。與一種或多種免疫治療劑組合的本發(fā)明的雌激素成分的給藥會(huì)增強(qiáng)治療的有效性。另外，該組合可能產(chǎn)生更少的顯著的副作用，和/或使得可能給藥更低劑量的已知免疫治療劑或雌激素成分，而產(chǎn)生與高得多的劑量的任何單獨(dú)組分相同的效果。用于治療多發(fā)性硬化的免疫治療劑可以合適地為(1)甾體抗炎藥如氫化可的松或地塞米松；(2)非甾體抗炎藥如乙酰水楊酸(阿司匹林)、布洛芬或萘普生；(3)D-青霉胺；(4)4-氨基喹啉藥如羥氯喹；(5)硫唑嘌呤；(6)甲氨蝶呤；(7)環(huán)孢霉素；(8)T淋巴細(xì)胞單克隆抗體；(9)粘著分子的單克隆抗體；(10)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的單克隆抗體；(11)腫瘤壞死因子受體(TNFR)-IgG；(12)IL-1受體拮抗劑；(13)ICE抑制劑；(14)β酶蛋白和/或(15)維生素D、1α，25-二羥基維生素D3和1α，25-二羥基維生素D2；(16)特異性結(jié)合選自T細(xì)胞受體、抗原或HLA分子的分子的試劑。
在另外一個(gè)具體的實(shí)施方案中，給患有多種類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或?qū)︻?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎敏感的哺乳動(dòng)物給藥與一種或多種免疫治療劑組合的本發(fā)明的雌激素成分。與一種或多種免疫治療劑組合的本發(fā)明雌激素成分的給藥會(huì)增強(qiáng)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的有效性。另外，該組合產(chǎn)生更少的副作用，和/或使得能夠給藥更低劑量的免疫治療劑或雌激素成分而產(chǎn)生與高得多的劑量的任一種單獨(dú)組分相同的效果。用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫治療劑可以為(1)甾體抗炎藥如氫化可的松或地塞米松；(2)非甾體抗炎藥如乙酰水楊酸(阿司匹林)、布洛芬或萘普生；(3)有機(jī)金衍生物如硫代蘋(píng)果酸鈉金、金硫葡糖或金諾芬；(4)D-青霉胺；(5)4-氨基喹啉藥如羥氯喹；(6)硫唑嘌呤；(7)甲氨蝶呤；(8)環(huán)孢霉素；(9)血管生成抑制劑如AGM-1470(Ingber等，1990，Nature 348，555)；(10)T淋巴細(xì)胞的單克隆抗體；(11)粘著分子的單克隆抗體；(12)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的單克隆抗體；(13)腫瘤壞死因子受體(TNFR)-IgG；(14)IL-1受體拮抗劑；(15)ICE抑制劑，和/或(16)特異性結(jié)合選自T細(xì)胞受體、抗原或HLA分子的分子的試劑。
在本發(fā)明另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本方法包括共同給藥孕激素，特別是當(dāng)該方法用于治療雌性哺乳動(dòng)物時(shí)。已經(jīng)將雌激素的給藥與女性的子宮內(nèi)膜增生聯(lián)系起來(lái)，現(xiàn)在普遍接受的是，在延長(zhǎng)的時(shí)段內(nèi)給藥“無(wú)對(duì)抗的”雌激素(雌激素治療法)大大增加患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)(Cushing等，1998.Obstet.Gynecol.91，35-39；Tavani等，1999.Drugs Aging，14，347-357)。還有證據(jù)表明，長(zhǎng)期(10-15年)使用雌激素療法會(huì)明顯增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(Tavani等，1999.Drugs AginG，14，347-357；Pike等，2000.Steroids，65，659-664)。
為了抵消長(zhǎng)期的無(wú)對(duì)抗的雌激素療法的副作用，目前普遍將附加性孕激素治療應(yīng)用到圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女的激素替代療法中。正常地給藥孕激素被確信會(huì)通過(guò)抗增生作用抑制雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜連續(xù)的刺激，而且看來(lái)好像能減少接受雌激素替代療法的絕經(jīng)后婦女中的子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生(Beral等，1999.J.Epidemiol.Biostat.，4，191-210)。為了抵消在本發(fā)明中給藥無(wú)對(duì)抗的雌激素(特別是長(zhǎng)期連續(xù)給藥)的任何潛在副作用，優(yōu)選地共同給藥孕激素成分來(lái)抑制雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜的刺激，或至少每3個(gè)月在至少10天內(nèi)給藥孕激素成分。
本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，它包含雌激素成分和此前定義的免疫治療劑以及藥物學(xué)可接受的賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地含有至少10μg雌激素成分，更優(yōu)選為至少25μg所述的雌激素成分，更優(yōu)選地，該組合物中雌激素成分的含量是至少50μg，最優(yōu)選是至少150μg。該組合物中雌激素成分的含量正常情況下不超過(guò)1000mg，優(yōu)選地，其含量不超過(guò)600mg，最優(yōu)選為不超過(guò)400mg。
免疫治療劑在組合物中的合適的含量是至少1μg，優(yōu)選地至少10μg。該組合物中的免疫治療劑的含量通常不超過(guò)50mg，優(yōu)選為不超過(guò)25mg。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物合適地為固體或半固體劑型如片劑、膠囊、扁囊劑、微型片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。術(shù)語(yǔ)“固體或半固體劑型”還包括含有液體例如油的膠囊，本發(fā)明的雌激素成分溶解或分散于該液體中。片劑或等價(jià)的固體和半固體劑型可以合適地含有下列物質(zhì)，如粘合劑(例如羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、其它的纖維素材料和淀粉)、稀釋劑(例如乳糖和其它的糖、淀粉、磷酸二鈣和纖維素材料)、崩解劑(例如淀粉聚合物和纖維素材料)和潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鹽和滑石)。
透皮傳遞系統(tǒng)包括貼劑、凝膠、膠布和乳劑，而且可以含有賦形劑，如增溶劑、促滲劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、親水性聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)、粘合劑和增粘劑(例如聚異丁烯、硅氧烷基粘合劑、丙烯酸酯和聚丁烯)。
透粘膜(特別是直腸和陰道內(nèi)的)傳遞系統(tǒng)包括貼劑、片劑、栓劑、陰道栓(pessary)、凝膠、乳劑，而且可以含有賦形劑，例如增溶劑和增強(qiáng)劑(例如丙二醇、膽汁鹽和氨基酸)、和其它載體(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物以及親水性聚合物，例如羥丙基甲基纖維素和透明質(zhì)酸)。
可注射的或可植入的儲(chǔ)庫(kù)型制劑包括注射液和植入片劑。合適的液體載體成分是生理相容性的稀釋劑，活性劑可溶入或懸浮于其中。稀釋劑的實(shí)例是水，它可以加或者不加電解質(zhì)鹽類(lèi)或增稠劑。因此，儲(chǔ)庫(kù)型制劑可以是例如水性微晶懸浮液。油類(lèi)特別適合用作稀釋劑，它可以加或者不加增溶劑、表面活性劑、助懸劑或乳化劑。合適的油的實(shí)例包括花生油(arachidis oil)、橄欖油、花生油、棉籽油、大豆油、蓖麻油和芝麻油。增溶劑的實(shí)例包括苯甲醇、苯甲酸芐酯。儲(chǔ)庫(kù)型制劑提供的優(yōu)點(diǎn)是，一次注射或植入可以滿(mǎn)足一個(gè)月或幾個(gè)月的需要。儲(chǔ)庫(kù)效果持續(xù)的時(shí)間取決于雌激素成分的性質(zhì)(優(yōu)選酯前體，因?yàn)樗鼈冡尫鸥?、雌激素成分的含量和釋放該活性藥物的載體物質(zhì)的類(lèi)型。通常，持續(xù)時(shí)間是10-30天，但是也能實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)或更短的時(shí)間。
可用于給藥本發(fā)明的藥物組合物的其它傳遞系統(tǒng)包括鼻內(nèi)和經(jīng)肺傳遞系統(tǒng)，例如噴霧劑和微粒。
另外，本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面涉及口服單位劑量形式，它包含至少50μg、優(yōu)選為至少250μg雌激素成分和至少1μg此前定義的免疫治療劑以及藥物學(xué)可接受的賦形劑。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步解釋了本發(fā)明，但是它們不應(yīng)當(dāng)理解成限制性的。在前面的說(shuō)明書(shū)中、在下文的實(shí)施例中和在權(quán)利要求書(shū)中，無(wú)論是分開(kāi)地還是以其任意結(jié)合的方式所公開(kāi)的特征，對(duì)以各種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明都是重要的。
實(shí)施例實(shí)施例1口服和皮下向低雌激素的大鼠給藥雌四醇(E4)后，選擇陰道角質(zhì)化作為組織特異性和雌激素敏感性的終點(diǎn)，以測(cè)定雌四醇的動(dòng)情力。在這些生物測(cè)定中，使用17α-乙炔基雌二醇(EE)、17β-雌二醇(E2)和載體(10％的乙醇/芝麻油)作為對(duì)照。
通常用大鼠子宮重量的增加作為動(dòng)情力的尺度。但是，子宮重量還響應(yīng)孕酮、睪酮和其它在特征上不認(rèn)為是雌激素的物質(zhì)。在二十世紀(jì)二十年代早期，發(fā)現(xiàn)來(lái)自豬卵巢的卵泡液含有的一些因子會(huì)造成大鼠陰道上皮的角質(zhì)化/角化(Allen and Doisy，1923，JAMA，81，819-821；Allen andDoisy，1924，Am.J.Physiol.，69，577-588)。隨后，所謂的大鼠的陰道角質(zhì)化反應(yīng)提供了測(cè)試動(dòng)情力的生物測(cè)定。切除卵巢的大鼠的陰道上皮的角質(zhì)化/角化只能由被認(rèn)為是真正的雌激素的化合物產(chǎn)生(Jones等，1973，F(xiàn)ert.Steril.24，284-291)。因此，陰道上皮的角質(zhì)化/角化代表著檢測(cè)雌激素效力的高度選擇性的終點(diǎn)(Reel等，1996，F(xiàn)und.Appli.Toxicol.34，288-305)。
切除成年無(wú)損傷雌性CD大鼠的卵巢以造成雌激素缺乏。每天灌洗陰道持續(xù)7天，以確保大鼠表現(xiàn)出去勢(shì)陰道涂片(白細(xì)胞在陰道涂片中占優(yōu)勢(shì)，外觀與間情期的陰道涂片相似)。去勢(shì)陰道涂片指示徹底的卵巢切除得以實(shí)施。完成7天的涂片后開(kāi)始進(jìn)行治療(第0天＝第1天給予劑量)。每天給動(dòng)物用藥一次，連續(xù)7天。開(kāi)始用藥后，繼續(xù)進(jìn)行每日陰道灌洗7天以檢測(cè)陰道的角質(zhì)化，其作為雌激素反應(yīng)的指征。將一滴陰道洗液置于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察，檢測(cè)角質(zhì)化的上皮細(xì)胞是否存在。在第0-6天的用藥和第7天的尸檢之前進(jìn)行陰道灌洗。
進(jìn)行陰道角質(zhì)化的生物測(cè)定以測(cè)定當(dāng)皮下(sc)給予切除卵巢的成年大鼠時(shí)E4的雌激素功能。E2用作陽(yáng)性對(duì)照。載體(10％乙醇/芝麻油)用作陰性對(duì)照。將甾體溶于無(wú)水乙醇，然后與芝麻油配成終濃度(芝麻油中的10％乙醇)。在以50μg/kg/天的劑量皮下注射E2 7天的大鼠中，至第2天8/8只大鼠中發(fā)生了陰道雌激素反應(yīng)，且持續(xù)到第7天(表1)。用載體處理的大鼠未表現(xiàn)出陰道上皮角質(zhì)化(表1)。在以0.1、0.3、1.0和3.0mg/kg/天的劑量皮下注射E4的大鼠中，陰道上皮角質(zhì)化的發(fā)生是劑量依賴(lài)性的，并且始于與E2所觀察到的治療的同一天(第2天)(表1)。到第7天，在0.1mg/kg/天E4的劑量已經(jīng)有4/8只大鼠且在0.3mg/kg/天E4的劑量甚至有7/8只大鼠表現(xiàn)出陰道雌激素反應(yīng)。到第7天，在1.0和3.0mg/kg/天E4的劑量，所有的大鼠都表現(xiàn)出陰道雌激素反應(yīng)(表1)。
表1在用17β-雌二醇(E2)或雌四醇(E4)皮下治療切除卵巢的大鼠時(shí)的陰道雌激素反應(yīng)。數(shù)據(jù)表示為表現(xiàn)出陰道角質(zhì)化的大鼠數(shù)目與所治療的大鼠數(shù)目之比。
進(jìn)行陰道角質(zhì)化的生物測(cè)定以測(cè)定當(dāng)口服(po)給予切除卵巢的成年大鼠時(shí)E4的雌激素功能。EE用作陽(yáng)性對(duì)照。載體(10％乙醇/芝麻油)用作陰性對(duì)照。將甾體溶解到無(wú)水乙醇中，然后與芝麻油配成終濃度(芝麻油中的10％乙醇)。到第7天，以50μg/kg/天的劑量口服給藥EE的所有大鼠(8/8)都發(fā)生陰道雌激素反應(yīng)(表2)。類(lèi)似地，在第7天，在以0.1、0.3、1.0或3.0mg/kg/天的劑量口服E4進(jìn)行治療的所有大鼠(8/8)中，都觀察到陰道上皮角質(zhì)化(表2)，而用載體處理的大鼠未表現(xiàn)出陰道上皮角質(zhì)化(0/8)。出人意料地，即使在給藥相對(duì)較低劑量的E4(例如0.1mg/kg/天)的大鼠中，口服給藥的大鼠的陰道角質(zhì)化的開(kāi)始(定義為在研究的第1-3天出現(xiàn)反應(yīng)的動(dòng)物的數(shù)量)也比皮下給藥的大鼠快，這證明了雌四醇在口服給藥后生物利用度極好的特征。
表2在用17α-乙炔基雌二醇(EE)或雌四醇(E4)口服治療切除卵巢的大鼠時(shí)的陰道雌激素反應(yīng)。數(shù)據(jù)表示為表現(xiàn)出陰道角質(zhì)化的大鼠的數(shù)目與被治療的大鼠的數(shù)目之比。
實(shí)施例2為了評(píng)價(jià)雌四醇(E4)的口服和皮下的生物利用度和消除半衰期，用雌性Sprague Dawley大鼠進(jìn)行了單一劑量研究，隨后在24小時(shí)的間隔中頻繁采集血樣。
如Kuipers等人所述(1985，Gastroenterology，88，403-411)，給雌性Sprague Dawley大鼠安裝永久性的硅化橡膠(silatic)心臟導(dǎo)管。手術(shù)后讓大鼠恢復(fù)5天，然后以0.05、0.5或5mg/kg的劑量給藥在0.5ml花生油中的E4。皮下給藥中，使用1ml注射器和20g針頭將E4注射到頸部區(qū)域。在E4的口服給藥中，用氟烷/N2O/O2輕度麻醉大鼠，使用塑料胃插管器將E4直接給藥到胃內(nèi)。隨后在0.5、1、2、4、8和24小時(shí)，通過(guò)心臟導(dǎo)管在肝素化的管中收集血樣。通過(guò)在4℃以5000×g離心10分鐘除去紅細(xì)胞，血漿儲(chǔ)存在-20℃。解凍血漿樣品后，應(yīng)用液-液萃取(己烷和乙醚)制備含有E4的血漿樣品進(jìn)行HPLC分析(Perkin Elmer 200)和使用PE Sciex 3000串聯(lián)質(zhì)譜儀和APCI界面的串聯(lián)質(zhì)譜分析。對(duì)于每一個(gè)樣品批次，記錄帶有6個(gè)校正點(diǎn)的校正曲線(xiàn)。使用線(xiàn)性回歸(相關(guān)系數(shù)＞0.98)計(jì)算校正曲線(xiàn)，其允許血漿濃度的定量。收集在不同的時(shí)間間隔取樣的所有大鼠血漿的數(shù)據(jù)。
用“WinNonLin，版本3.1”和所涉及的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析血漿E4濃度數(shù)據(jù)以獲得Cmax、半衰期和AUC0-24。特別地，使用低和中間劑量水平0.05、0.5mg/kg，E4表現(xiàn)出的口服生物利用度等于皮下給藥所得到的生物利用度(80-100％)。在實(shí)驗(yàn)的最高劑量水平，5.0mg/kg E4，吸收動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生的口服生物利用度約是E4皮下給藥的30-60％。令人感興趣的是，E4表現(xiàn)出相對(duì)較長(zhǎng)的2-3小時(shí)的半衰期，因此在皮下給藥實(shí)驗(yàn)和口服給藥實(shí)驗(yàn)中，在24小時(shí)間隔內(nèi)的所有時(shí)間點(diǎn)都可以測(cè)得未結(jié)合的E4的生物活性水平。
實(shí)施例3為了檢測(cè)雌四醇在口服給藥于人后的生物利用度和消除半衰期，在健康的絕經(jīng)后志愿者中進(jìn)行漸增單劑量實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)地給志愿者(n＝6)分配0.1、1或10mg雌四醇，在72小時(shí)期間采集血樣(每位志愿者18次)。
解凍血漿樣品后，應(yīng)用液-液萃取(己烷和乙醚)制備含有雌四醇的血漿樣品進(jìn)行HPLC分析(Perkin Elmer 200)和使用PE Sciex 4000串聯(lián)質(zhì)譜儀和APCI界面的串聯(lián)質(zhì)譜分析。對(duì)于每一個(gè)樣品批次，記錄帶有6個(gè)校正點(diǎn)的校正曲線(xiàn)。使用線(xiàn)性回歸(相關(guān)系數(shù)＞0.98)計(jì)算校正曲線(xiàn)，其允許血漿濃度的定量。
當(dāng)從0.1到1、進(jìn)而到10mg增加口服雌四醇的劑量時(shí)，觀察到較好的耐受性。AUC值表現(xiàn)出較好的劑量線(xiàn)性，這表明在整個(gè)劑量范圍內(nèi)，口服給藥的雌四醇都被較好地吸收。令人感興趣的是，雌四醇在人絕經(jīng)后對(duì)象中表現(xiàn)出超過(guò)15小時(shí)、即15-50小時(shí)的長(zhǎng)的消除半衰期。
實(shí)施例4利用確定的競(jìng)爭(zhēng)性甾體結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定雌四醇(E4)與17α-乙炔基雌二醇(EE)和17β-雌二醇(E2)相比同α-和β-形式的人雌激素受體(ER)結(jié)合時(shí)的相對(duì)結(jié)合親和力。
使用的方法修改自科技文獻(xiàn)，由Osboum等人詳細(xì)地記載(1993，Biochemistry，32，6229-6236)。從轉(zhuǎn)染的Sf9-細(xì)胞純化重組人ERα和ERβ蛋白。體外試驗(yàn)包括使用ERα或ERβ蛋白和作為被標(biāo)記配體的濃度固定為0.5nM的[3H]E2。將重組人ERα或ERβ蛋白溶解到結(jié)合緩沖液(10mMTris-HCL、pH 7.5、10％glycerol、1mM DTT、1mg/ml BSA)中，然后將其雙等份與終濃度為0.5nM的[3H]E2孵育，同時(shí)還有載體對(duì)照(o.4％DMSO)或相同量的含有遞增濃度的未標(biāo)記的作為競(jìng)爭(zhēng)劑的甾體配體的載體。在25℃孵育2小時(shí)后，除去未結(jié)合的配體，檢測(cè)結(jié)合到ERα或ERβ蛋白上的[3H]E2的量。在每一種競(jìng)爭(zhēng)劑濃度下結(jié)合到ERα或ERβ蛋白上的[3H]E2的平均量用于制作抑制曲線(xiàn)。隨后通過(guò)非線(xiàn)性的最小二乘回歸分析確定-IC50值。使用Cheng-Prusoff方程(Cheng等，1973，Biochem.Pharmacol.，22，3099-3108)，使用測(cè)得的實(shí)驗(yàn)化合物的IC50、實(shí)驗(yàn)中使用的放射性配體的濃度、和放射性配體的對(duì)于Erα和Erβ分別為0.2nM和0.13nMKd的計(jì)算值來(lái)計(jì)算抑制常數(shù)(Ki)。
E4的生化試驗(yàn)結(jié)果表述為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的特異性結(jié)合的抑制百分比(表3)。將在實(shí)驗(yàn)中得到的Ki值列在表4中用于比較E4、EE和E2與人ERα和ERβ蛋白的結(jié)合。與EE和E2相比，E4表現(xiàn)出獨(dú)特的結(jié)合功能，其對(duì)于結(jié)合到ERα蛋白具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)(400％)(表4)。相對(duì)而言，EE和E2甾體配體對(duì)ERβ蛋白的Ki值更為明顯(表4)。
表3使用E4作為未標(biāo)記的甾體配體和0.5nM[3H]作為標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)劑，特異性結(jié)合ERα和ERβ蛋白的抑制百分比。顯示了三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
nd＝未檢測(cè)到表4實(shí)驗(yàn)測(cè)定的雌四醇(E4)、17α-乙炔基雌二醇(EE)和17β-雌二醇(E2)結(jié)合到人ERα和ERβ蛋白的抑制常數(shù)(Ki)。還顯示了結(jié)合到ERα蛋白的相對(duì)優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例5用確定的競(jìng)爭(zhēng)性甾體結(jié)合試驗(yàn)(Hammond and Lahteenmaki.1983.Clin Chem Acta 132101-110)測(cè)定雌四醇(E4)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)、17β-雌二醇(E2)、睪酮(T)和5α-二氫睪酮(DHT)對(duì)人性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)的相對(duì)結(jié)合親和力。
如先前已有的記載，從轉(zhuǎn)基因小鼠血清中純化人SHBG(AvvakumovGV等，2000.J Biol Chem 27525920-25925)。在變性條件下，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳確定該方法制備的人SHBG的純度＞99％。它的甾體結(jié)合特性與人血清中的SHBG難以區(qū)分(Avvakumov GV等，2000.J Biol Chem27525920-25925)。體外實(shí)驗(yàn)包括使用純化的人SHBG和用作標(biāo)記配體的[3H]DHT或[3H]雌二醇。在室溫下，用在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的右旋糖苷包被的活性炭(DCC)懸浮液處理人SHBG 30分鐘，除去任何甾體配體。離心(2,000×g，10分鐘)沉淀DCC后，根據(jù)其甾體結(jié)合能力，用PBS將含有人SHBG的上清液稀釋至1nM的濃度。
然后，在聚苯乙烯試管中，將該人SHBG溶液的雙等份試樣(100μl)與等體積10nM的[3H]DHT或[3H]雌二醇孵育，同時(shí)還有單獨(dú)的100μlPBS或等量的含有遞增濃度的未標(biāo)記的作為競(jìng)爭(zhēng)劑的甾體配體的PBS。在室溫孵育1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物于冰浴中再放置15分鐘。然后向每個(gè)試管中加入等份DCC的冰懸浮液(600μl)，簡(jiǎn)單混合2秒后，根據(jù)是否用[3H]DHT或[3H]雌二醇作為標(biāo)記配體，分別將各試管在冰浴中孵育10分鐘或5分鐘。然后通過(guò)離心(2000×g，15分鐘，4℃)除去與DCC結(jié)合的未標(biāo)記的配體，再使用液體閃爍分光光度計(jì)在2ml ACS閃爍混合物中計(jì)算與SHBG結(jié)合的[3H]標(biāo)記的配體的量。將在每個(gè)競(jìng)爭(zhēng)劑濃度(B)結(jié)合到SHBG上的[3H]標(biāo)記的配體的平均量表達(dá)為在沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)劑(B0)的條件下結(jié)合到SHBG上的[3H]標(biāo)記的配體的平均量的百分比，并相對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)試管中的競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度做圖。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如
圖1所示。
圖1[3H]DHT(圖A)和[3H]雌二醇(圖B)在人性激素結(jié)合球蛋白甾體結(jié)合部位上的競(jìng)爭(zhēng)性置換。用作競(jìng)爭(zhēng)劑的未標(biāo)記的甾體配體如下雌四醇(E4)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)、17β-雌二醇(E2)、睪酮(T)和5α-二氫睪酮(DHT)從這些競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以清楚地看出，當(dāng)用[3H]DHT或[3H]雌二醇作為標(biāo)記配體進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，雌四醇根本不與人SHBG結(jié)合。這與參照甾體乙炔基雌二醇、17β-雌二醇、睪酮和5α-二氫睪酮形成鮮明的對(duì)比，它們以該順序顯示出遞增的相對(duì)人SHBG結(jié)合親和力。重要的是，當(dāng)與實(shí)驗(yàn)的其它雌激素乙炔基雌二醇和17β-雌二醇相比時(shí)，雌四醇與SHBG的結(jié)合是可忽略的。
實(shí)施例6實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)被廣泛地用作多發(fā)性硬化(MS)的動(dòng)物模型，多發(fā)性硬化的特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎性過(guò)程。除了它在鑒別多發(fā)性硬化的療法中的價(jià)值外，它還通常用作炎性模型。其優(yōu)點(diǎn)是炎性反應(yīng)局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有利于正確評(píng)價(jià)炎性反應(yīng)相對(duì)于臨床癥狀的大小。而且，疾病的誘發(fā)受到精確的控制，因?yàn)樗怯玫鞍谆蚝铣呻拿庖叨鸬?。?duì)動(dòng)物的臨床監(jiān)控要求不超過(guò)4-6周，因此可能快速地篩選潛在的抗炎化合物。
多發(fā)性硬化的特征在于由于圍繞著軸突的髓鞘的破壞而加重失能，且隨后喪失神經(jīng)傳導(dǎo)性。炎性損傷證明了淋巴細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞的參與，其通過(guò)分泌各種炎性介質(zhì)來(lái)破壞組織。
通過(guò)用整體髓磷脂或髓磷脂衍生的蛋白和肽來(lái)免疫，可以在敏感的動(dòng)物品系中建立EAE。在SJL/J小鼠中，可以通過(guò)來(lái)自弗氏完全佐劑中蛋白脂質(zhì)，即PLP139-151，的肽皮下免疫來(lái)再現(xiàn)地誘導(dǎo)EAE。3天后，小鼠接受109個(gè)熱滅活的百日咳桿菌(Bordetella pertussis)微生物(i.v.)以增加血腦屏障的滲透性。這激活抗原特異性T細(xì)胞分泌前炎性細(xì)胞因子如淋巴毒素和干擾素-γ。已知疾病的發(fā)展包括下述事件1.具有PLP139-151的樹(shù)突細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞激活T細(xì)胞；2.白介素-12在巨嗜細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中增加表達(dá)；3.T細(xì)胞分化成分泌前炎性細(xì)胞并表達(dá)獨(dú)特的趨化因子受體的效應(yīng)細(xì)胞；4.血腦屏障的滲透性的增加；5.效應(yīng)細(xì)胞和單核細(xì)胞與趨化因子的梯度相反地遷移進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)；6.炎性細(xì)胞的局部(重新)激活；7.釋放炎性介質(zhì)和破壞少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和髓磷脂。
典型地，在用PLP139-151免疫后10-20天之間，有70-90％的用載體處理的SJL/J小鼠發(fā)展到疾病的首次發(fā)作。令人感興趣的是，在28-42天之間，約50％的患病動(dòng)物還發(fā)展到EAE再次發(fā)作(復(fù)發(fā))。
在42天的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，使用EAE的臨床嚴(yán)重性(失能分?jǐn)?shù))作為結(jié)果參數(shù)評(píng)價(jià)口服給藥雌四醇治療EAE的效果。由Kono等人開(kāi)發(fā)的臨床打分系統(tǒng)(J Exp Med 168，213-227，1988)用于監(jiān)控SJL/J EAE模型的失能程度0無(wú)?。?.5尾部局部麻痹或部分麻痹；1完全尾部麻痹；2下肢輕癱、肢無(wú)力和尾部麻痹；2.5部分肢麻痹；3完全后肢或前肢麻痹；3.5截癱；4四肢癱瘓、垂死；5因EAE而死。用PLP139-151皮下免疫誘導(dǎo)疾病后，對(duì)由9-10只雌性SJL/J小鼠組成的組每日一次口服給藥3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg和0.1mg/kg四種不同劑量的雌四醇進(jìn)行治療，在全部42天監(jiān)控期內(nèi)持續(xù)進(jìn)行。用載體(Cavasol；羥基丙基-β-環(huán)糊精)治療的組作為陰性對(duì)照。
從Harlan(法國(guó))得到7周齡雌性SJL/J小鼠。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，處理小鼠并適應(yīng)2周，隨機(jī)分成治療組。皮下注射50μg于完全弗氏佐劑(CFA，H37Ra Lot-2116643，Difco Laboratories，USA)中乳化的來(lái)自蛋白脂質(zhì)即PLP139-151(Isogen Bioscience B.V.)的合成肽來(lái)免疫小鼠。將乳濁液分布到側(cè)腹的4個(gè)部位。在第3天，給小鼠靜脈注射109個(gè)百日咳桿菌(Bordetellapertussis)細(xì)菌(National Institute for Public Health，Bilthoven，荷蘭)。從第0天(PLP139-151免疫后)直至第42天，根據(jù)下述計(jì)劃，口服(每次強(qiáng)飼)0.2ml雌四醇溶液或載體(20％重量/體積的羥基丙基-β-環(huán)糊精水溶液)治療小鼠組A載體(n＝10)；組B雌四醇，3mg/kg/天(n＝9)；組C雌四醇，1mg/kg/天(n＝10)；組D雌四醇，0.3mg/kg/天(n＝10)和組E雌四醇，0.1mg/kg/天(n＝10)。當(dāng)需要時(shí)，根據(jù)動(dòng)物每日稱(chēng)得的體重調(diào)整劑量。對(duì)于各只小鼠，每日進(jìn)行EAE失能打分。在治療和監(jiān)控階段結(jié)束時(shí)，處死小鼠。
通過(guò)方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以測(cè)定治療組和載體組之間的失能結(jié)果參數(shù)差異的顯著性。對(duì)于ANOVA分析顯示出顯著差異的每一個(gè)參數(shù)，隨后通過(guò)事后(post-hoc)LSD(最小顯著差)檢驗(yàn)確定哪個(gè)組是不同的(P≤0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異；P＞0.05則認(rèn)為不顯著)。使用Windows下的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。
除了與EAE相關(guān)的癥狀外，在試驗(yàn)中沒(méi)有觀察到其它的臨床癥狀，這表明雌四醇沒(méi)有誘導(dǎo)任何顯著的副作用。當(dāng)在3個(gè)連續(xù)日內(nèi)達(dá)到至少3的累積分?jǐn)?shù)時(shí)，認(rèn)為小鼠患有EAE。由此，70％載體治療的小鼠發(fā)展成EAE(圖2)。用3mg/kg和1mg/kg雌四醇的治療抑制了EAE的發(fā)病率，分別導(dǎo)致40％和33％的小鼠患有EAE(圖2)。在用0.3mg/kg和0.1mg/kg雌四醇治療的小鼠中，分別有80％和70％發(fā)展成EAE。
圖2雌四醇治療對(duì)SJL/J小鼠EAE發(fā)病率的影響在免疫后第12天，用載體治療的小鼠出現(xiàn)明顯的臨床EAE癥狀。在用最高劑量的雌四醇(3和1mg/kg)治療的小鼠中，平均的發(fā)病日分別延遲到第15.7和14.7天。與載體治療的小鼠相比，用兩個(gè)最低劑量雌四醇(0.3和0.1mg/kg)治療也表現(xiàn)出延遲疾病發(fā)作的趨勢(shì)，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
對(duì)于每只小鼠，評(píng)價(jià)其在整個(gè)監(jiān)控階段的最大臨床分?jǐn)?shù)，此后將個(gè)體數(shù)據(jù)包括在組平均值中(圖3)。載體治療的小鼠的平均最大臨床分?jǐn)?shù)是1.8±0.3。用3和1mg/kg雌四醇治療抑制了平均最大失能分?jǐn)?shù)，得到的分?jǐn)?shù)分別為0.8±0.3和0.9±0.3。與載體治療的小鼠相比，用兩個(gè)最低劑量的雌四醇(0.3和0.1mg/kg)治療沒(méi)有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。以治療組之間的ANOVA對(duì)比和事后LSD分析為基礎(chǔ)，從而得出結(jié)論，與載體治療的小鼠相比，口服雌四醇治療以劑量依賴(lài)性的方式統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地抑制EAE最大失能分?jǐn)?shù)(對(duì)于3mg/kg和1mg/kg雌四醇，分別為P＝0.011和P＝0.021)。
圖3用雌四醇治療對(duì)SJL/J小鼠的最大EAE分?jǐn)?shù)的影響$與載體相比，P＝0.011(雌四醇3mg/kg)和P＝0.021(雌四醇1mg/kg)&與雌四醇0.3mg/kg相比，P＝0.016(雌四醇3mg/kg)和P＝0.029(雌四醇1mg/kg)將實(shí)驗(yàn)的最大相關(guān)臨床結(jié)果、即各小鼠的累積失能分?jǐn)?shù)表示成圖4中整個(gè)監(jiān)控階段(第0-42天)的組平均值。當(dāng)對(duì)整個(gè)治療和監(jiān)控階段分析時(shí)，載體治療的小鼠發(fā)展的平均累積EAE分?jǐn)?shù)為17.4±5.0，而用3和1mg/kg雌四醇治療將平均累積EAE分?jǐn)?shù)分別降至5.8±2.9和3.9±1.8(圖3)。與載體治療的小鼠相比，用兩個(gè)最低劑量的雌四醇(0.3和0.1mg/kg)治療沒(méi)有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。以治療組之間的ANOVA對(duì)比和事后LSD分析為基礎(chǔ)，從而得出結(jié)論，與載體治療的小鼠相比，口服雌四醇治療以劑量依賴(lài)性的方式統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地抑制EAE累積失能分?jǐn)?shù)(對(duì)于3mg/kg和1mg/kg雌四醇，分別為P＝0.025和P＝0.012)。
圖4用雌四醇治療對(duì)SJL/J小鼠累積EAE分?jǐn)?shù)(第0-42天)的影響*與載體相比，P＝0.025(雌四醇3mg/kg)和P＝0.012(雌四醇1mg/kg)#與雌四醇0.3mg/kg相比，P＝0.042(雌四醇3mg/kg)和P＝0.022(雌四醇1mg/kg)如在SJL/J小鼠的PLP139-151EAE模型中典型的，僅用載體治療的大量的對(duì)照小鼠發(fā)展到第二次疾病發(fā)作(復(fù)發(fā))。評(píng)價(jià)第二階段的疾病活性、即第26-42天的臨床EAE分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)，與用載體治療的小鼠和其它治療組不同，用3mg/kg和1mg/kg雌四醇治療的小鼠很少表現(xiàn)出疾病活性的證據(jù)(圖5)。以治療組之間的ANOVA對(duì)比和事后LSD分析為基礎(chǔ)，從而得出結(jié)論，與載體治療的小鼠相比，口服雌四醇治療以劑量依賴(lài)性的方式統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地抑制EAE復(fù)發(fā)(對(duì)于3mg/kg和1mg/kg雌四醇，分別為P＝0.045和P＝0.023)。
圖5用雌四醇治療對(duì)SJL/J小鼠的復(fù)發(fā)階段(第26-42天)累積臨床EAE分?jǐn)?shù)的影響*與載體相比，P＝0.045(雌四醇3mg/kg)和P＝0.023(雌四醇1mg/kg)#與雌四醇0.3mg/kg相比，P＝0.050(雌四醇3mg/kg)和P＝0.018(雌四醇1mg/kg)這些數(shù)據(jù)表明，以能夠有效改變內(nèi)分泌參數(shù)(特別是陰道角質(zhì)化)的量口服給藥雌四醇會(huì)出人意料地抑制EAE的臨床發(fā)展。而且，雌四醇能減輕患有EAE的動(dòng)物的癥狀，并防止動(dòng)物發(fā)展為具有嚴(yán)重疾病癥狀的疾病復(fù)發(fā)。
實(shí)施例7用患有實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)——一種自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)觸發(fā)并廣泛地用作人多發(fā)性硬化(MS)模型的炎性疾病——的B10.PL小鼠評(píng)價(jià)雌四醇(E4)減輕免疫介導(dǎo)的疾病的癥狀和嚴(yán)重性的能力。
從Jackson Laboratories(Bar Harbor，Me.)得到8-12周齡的雌性B10.PL小鼠，分成12只小鼠的治療組。在誘導(dǎo)EAE疾病前3天，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉劑混合物麻醉動(dòng)物并切除卵巢。貫穿后背皮膚切開(kāi)單一切口，貫穿腹膜切開(kāi)雙邊側(cè)腹切口，然后取出卵巢。
按照Deibler等人(Deibler，G.E.，等，Prep.Biochem.2139，1972)的方法，從豚鼠脊髓分離出髓磷脂堿性蛋白(MBP)。將MBP在-20℃凍干保藏，使用前溶于0.1M乙酸使?jié)舛葹?mg/ml。在免疫中，將MBP在等體積的含有結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H.sub.37 Ra(4mg/ml)的完全弗氏佐劑(CFA)中乳化。
為了誘導(dǎo)EAE，用含有結(jié)核桿菌H.sub.37 Ra的CFA乳濁液(0.1ml)中的400μg MBP在尾根部皮膚中免疫小鼠。MBP免疫后立即和48小時(shí)后，分別再給小鼠腹膜內(nèi)注射200ng百日咳毒素(Sigma，St.Louis，MO)。每日檢查小鼠的EAE臨床癥狀，進(jìn)行40天，并根據(jù)Clayton等人(J.Exp.Med.1691681，1989)所述對(duì)疾病癥狀打分0無(wú)麻痹，1尾部無(wú)力/遲鈍/目光呆滯，2部分后肢麻痹或肢無(wú)力，3掉頭困難，嚴(yán)重肢無(wú)力或輕度麻痹，4嚴(yán)重至全麻痹，5垂死的/死亡。
實(shí)驗(yàn)包括預(yù)防/治療組合方案，其中從實(shí)驗(yàn)的第1天(MBP-免疫的那天)開(kāi)始直到且包括第40天向小鼠給藥各種量的E4。每日一次用E4(0.1、0.3、1.0或3.0mg/kg/天)口服治療4組小鼠，一組小鼠每日接受一次口服載體治療(羥基丙基-β-環(huán)糊精20％重量/體積)作為陰性對(duì)照。類(lèi)似地，實(shí)驗(yàn)還包括，每日一次用E4(0.1、0.3、1.0或3.0mg/kg/天)皮下治療的4組小鼠，以及每日接受一次皮下載體治療(羥基丙基-β-環(huán)糊精20％重量/體積)的一組小鼠作為陰性對(duì)照。
口服和皮下載體治療都不能在MBP免疫的小鼠中有效地預(yù)防EAE疾病的發(fā)展。通常在評(píng)價(jià)階段，動(dòng)物的疾病癥狀發(fā)作迅速并逐漸嚴(yán)重地發(fā)展出更多自身免疫疾病的跡象。在第40天，大多數(shù)動(dòng)物患有嚴(yán)重形式的EAE(通常級(jí)別為3或更高)。令人感興趣的是，在40天的評(píng)價(jià)階段中，在延遲EAE疾病癥狀的發(fā)作和預(yù)防自身免疫病的嚴(yán)重發(fā)展方面，皮下和口服E4治療表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性效果。對(duì)比治療組和對(duì)照組揭示，在受試劑量范圍內(nèi)，E4治療的小鼠中受疾病折磨的動(dòng)物數(shù)量和/或EAE癥狀的嚴(yán)重性得以劑量依賴(lài)性減少。
用未去勢(shì)雌性B10.PL和雄性B10.PL小鼠單獨(dú)重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，再次證明了E4在每日皮下和/或口服給藥后劑量依賴(lài)性地減輕EAE癥狀和嚴(yán)重性的能力。
實(shí)施例8在發(fā)展出膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的小鼠中——另外一種自身免疫和慢性炎性疾病的代表人關(guān)節(jié)炎疾病、特別是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)——評(píng)價(jià)雌四醇減輕免疫介導(dǎo)的疾病的嚴(yán)重性的能力和其可能的副作用，并與地塞米松的作用進(jìn)行對(duì)比。
使用兩步免疫方案(Joosten等，″Dual role of IL-12 in early and latestages of murine collagen type II arthritis″.J Immunol 1997；1594094-4102；Joosten等，″IL-1β blockade prevents cartilage and bonedestruction in murine type II collagen-induced arthritis，whereas TNFαblockade only ameliorates joint inflammation″.J Immunol 1999；1635049-55)在雄性DBA/1小鼠中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。該品系對(duì)用牛II型膠原誘導(dǎo)的CIA高度敏感。在第0天，用在完全弗氏佐劑中乳化的牛II型膠原(100μg)免疫小鼠(在背部皮下注射4次)。在第21天，腹膜內(nèi)注射100μg在PBS中稀釋的II型膠原以加強(qiáng)小鼠。
在6周的實(shí)驗(yàn)方案中，研究了口服雌四醇治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的作用。從第22天直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第42天)，每日一次用載體(20％重量/體積的羥基丙基-β-環(huán)糊精水溶液)治療動(dòng)物作為陰性對(duì)照，或者每日一次給藥四種不同劑量的雌四醇(3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg和0.1mg/kg)。選擇地塞米松(1mg/kg)作為陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)樗潜怀浞盅芯康钠べ|(zhì)甾體，它能減少腫脹和發(fā)炎，并應(yīng)用于多種疾病如皮膚病(銀屑病、蕁麻疹)、過(guò)敏癥、呼吸困難、癌癥、血液病(貧血)、消化問(wèn)題、眼病，以及用于治療關(guān)節(jié)炎。盡管作為抗炎藥有效，還已知地塞米松能誘發(fā)多種副作用，其中包括在人類(lèi)中誘發(fā)骨質(zhì)疏松、降低腎上腺功能、頭暈、惡心、消化不良、食欲增加、由于水潴留增加引起的體重增加、虛弱和/或睡眠障礙。另外，嚙齒類(lèi)動(dòng)物中全身性的地塞米松治療導(dǎo)致易于通過(guò)體重減輕而觀察到的強(qiáng)烈的分解代謝作用(Orzechowski等2002，″Rats with aglucocorticoid-induced catabolic state show symptoms of oxidative stress andspleen atrophythe effects of age and recovery″.J Vet Med A Physiol PatholClin Med；49256-63)。
在實(shí)驗(yàn)中使用的所有組都由13只小鼠組成。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)小鼠稱(chēng)重，并監(jiān)控關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀。根據(jù)Joosten等人1997(J.Immunol.，1594094-4102)和Joosten等人1999(J.Immunol.，1635049-55)記載的打分系統(tǒng)，對(duì)疾病嚴(yán)重性進(jìn)行打分(臨床關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù))。
如下進(jìn)行基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)所有治療組之間主要臨床結(jié)果參數(shù)上的差異的顯著性。每個(gè)顯著的ANOVA都隨后進(jìn)行事后杜凱氏檢驗(yàn)(Tukey tests)，以確定每個(gè)治療組和對(duì)照組之間的差異的顯著性。而且，使用線(xiàn)性回歸分析研究雌四醇治療效果的劑量依賴(lài)性。使用Windows下的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。
在第21天用II型膠原第2次免疫后不久，載體治療的動(dòng)物(對(duì)照)都發(fā)展成關(guān)節(jié)炎。載體治療的小鼠的平均發(fā)病日為25.4±0.64天，在第28天達(dá)到100％的發(fā)病率(圖6)。第21天加強(qiáng)之后，地塞米松治療的動(dòng)物(陽(yáng)性對(duì)照)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前都沒(méi)有發(fā)展成關(guān)節(jié)炎。治療組中，直到第42天，發(fā)病率仍是0％(圖6)。0.1、0.3、1.0和3.0mg/kg雌四醇治療組中，雌四醇能劑量依賴(lài)性地將平均疾病發(fā)作日延遲至第25.8、26.0、28.2和30.7天。該作用也見(jiàn)于圖6，其中與載體治療的動(dòng)物對(duì)照組相比，1.0mg和3.0mg/kg雌四醇組明顯地延遲了疾病的發(fā)病率的增加。
圖6雌四醇治療對(duì)小鼠CIA發(fā)病率的影響，顯示了所有受試治療組的發(fā)病率對(duì)時(shí)間的關(guān)系，“疾病”定義為宏觀關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)大于0在載體治療的小鼠中，宏觀關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間而穩(wěn)步增加，在第42天平均分?jǐn)?shù)達(dá)到5.90±0.38(圖7)。在整個(gè)監(jiān)控階段(第21-42天)，載體治療的小鼠的平均累積關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)是31.4±1.73(圖8)。因?yàn)榈厝姿芍委煹男∈鬀](méi)有發(fā)展成疾病，直到第42天其宏觀關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)仍然保持為0(圖7)。因此，地塞米松治療的小鼠的平均累積關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)(第21-42天)也是0(圖8)。進(jìn)一步與關(guān)節(jié)炎發(fā)病的延遲相一致，接受雌四醇的小鼠的宏觀關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)的發(fā)展也呈劑量依賴(lài)性地減少(圖7)。類(lèi)似地，雌四醇治療的動(dòng)物的平均累積關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)(第21-42天)也呈劑量依賴(lài)性地減少，并且與載體治療的動(dòng)物相比顯著不同(圖8A和8B)。
圖7雌四醇治療小鼠CIA對(duì)宏觀關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)的影響。每個(gè)點(diǎn)都代表組平均值(n＝13) 圖8A和8B雌四醇治療小鼠CIA對(duì)累積關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)的影響。對(duì)每只小鼠，通過(guò)合計(jì)在10個(gè)時(shí)間點(diǎn)每次得到的分?jǐn)?shù)計(jì)算出累積分?jǐn)?shù)。圖A組數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±SEM(n＝13)。圖B雌四醇劑量對(duì)累積關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)的線(xiàn)性回歸。#代表根據(jù)ANOVA和杜凱氏事后檢驗(yàn)相對(duì)于對(duì)照組p＜0.001。
每周測(cè)定體重，以它作為疾病嚴(yán)重性和/或藥物誘導(dǎo)的副作用的另外一個(gè)臨床終點(diǎn)。在第28、35和42天，用載體治療的動(dòng)物(陰性對(duì)照)的體重分別減少至它們起始重量(第21天)的94.2％、85.7％和87.9％(圖9)。用地塞米松治療后，小鼠的體重在第28、35和42天也分別減少至它們起始重量(第21天)的91.5％、91.4％和94.0％(圖9)。對(duì)于更低的三個(gè)劑量(0.1、0.3和1.0mg/kg)，用雌四醇口服治療的小鼠的體重減少與陰性和陽(yáng)性對(duì)照動(dòng)物組相當(dāng)。但是，最高的雌四醇劑量(3.0mg/kg)保護(hù)了小鼠免于體重減少該組小鼠的體重在第28、35和42天僅分別減少至它們起始重量(第21天)的99.3％、96.7％和97.9％(圖9)，這表明關(guān)節(jié)炎和藥物誘導(dǎo)的副作用(例如使用地塞米松所見(jiàn)到的)都沒(méi)有對(duì)用3.0mg/kg劑量治療的動(dòng)物造成不良影響。
圖9用雌四醇治療對(duì)CIA小鼠體重的影響。在第21、28、35和42天稱(chēng)量每組小鼠的體重。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，雌四醇以能有效地改變內(nèi)分泌參數(shù)(例如陰道角質(zhì)化)的量口服給藥能令人驚奇地抑制CIA中關(guān)節(jié)炎的發(fā)展和關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性。這樣，雌四醇可以用作關(guān)節(jié)治療炎的不會(huì)表現(xiàn)出如見(jiàn)于目前已有藥物(例如地塞米松)的副作用的治療藥征(modality)。
實(shí)施例9在發(fā)展出用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的切除卵巢的小鼠中進(jìn)一步評(píng)價(jià)雌四醇(E4)減輕免疫介導(dǎo)的疾病的癥狀和嚴(yán)重性的能力。
在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，將8-12周齡的雌性DBA-1小鼠分成12只小鼠的治療組。在誘導(dǎo)CIA疾病前3天，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉劑混合物麻醉動(dòng)物并切除卵巢。貫穿后背皮膚切開(kāi)單一切口，貫穿腹膜切開(kāi)雙邊側(cè)腹切口，然后取出卵巢。
根據(jù)Wooley等人(J.Exp.Med.154688-700，1981)所述的方法分離和純化牛II型膠原(CII)。在使用前先將CII以2mg/ml濃度于0.1M乙酸，然后以1∶1的比例與含有結(jié)核桿菌H.sub.37 Ra(4mg/ml)的完全弗氏佐劑(CFA)乳化，或者與不完全弗氏佐劑(IFA)1∶1乳化以加強(qiáng)免疫。
為了誘導(dǎo)CIA，在尾根部用在CFA中制備的0.1ml乳濁液免疫小鼠。21天后，小鼠接受在IFA中制備的0.1ml乳濁液加強(qiáng)注射。從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始直到首次免疫后第60天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每天觀察小鼠的CIA臨床癥狀。如Wooley等人(J.Exp.Med.154688-700，1981)所述，使用0-3的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每只足掌的CIA臨床癥狀打分0無(wú)關(guān)節(jié)炎；1發(fā)紅且掌或趾部腫脹；2嚴(yán)重腫脹，或足掌畸形；和3關(guān)節(jié)強(qiáng)直。通過(guò)總計(jì)所有足掌的分?jǐn)?shù)得到每只小鼠的關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)。對(duì)于每只小鼠，通過(guò)關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)測(cè)量的可能的嚴(yán)重性的范圍為0-12。
采用預(yù)防/治療組合方案，其中從實(shí)驗(yàn)的第1天(首次CII-免疫的那天)開(kāi)始直到且包括第60天向小鼠給藥各種量的E4。每日一次用E4(0.1、0.3、1.0或3.0mg/kg/天)口服治療4組小鼠，一組小鼠每日接受一次口服載體治療(羥基丙基-β-環(huán)糊精20％重量/體積)作為陰性對(duì)照。類(lèi)似地，實(shí)驗(yàn)還包括，每日一次用E4(0.1、0.3、1.0或3.0mg/kg/天)皮下治療的4組小鼠，以及每日接受一次皮下載體治療(羥基丙基-β-環(huán)糊精20％重量/體積)的一組小鼠作為陰性對(duì)照。
口服和皮下的載體治療都不能有效地預(yù)防CII免疫小鼠的CIA疾病的發(fā)展。在評(píng)價(jià)階段，載體治療的動(dòng)物通常疾病癥狀發(fā)作迅速，且發(fā)展出更多的CIA跡象。在第60天，大多數(shù)動(dòng)物患有嚴(yán)重的CIA(通常為等級(jí)為4或更高)。令人感興趣的是，在60天的評(píng)價(jià)階段中，在延遲CIA癥狀的發(fā)作和預(yù)防逐漸加重發(fā)展成更嚴(yán)重型的關(guān)節(jié)破損方面，皮下和口服E4治療表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性效果。治療組和對(duì)照組的比較顯示，在E4治療的小鼠中，患病動(dòng)物的數(shù)量和/或CIA癥狀的嚴(yán)重性呈劑量依賴(lài)性減少。
用未去勢(shì)雌性DBA-1單獨(dú)地重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，再次證明了E4在每日皮下和/或口服給藥后的劑量依賴(lài)性減輕CIA癥狀和嚴(yán)重性的能力。
實(shí)施例10制備100粒膠囊，每粒膠囊含有2mg雌四醇和2mg地塞米松將200mg雌四醇、200mg地塞米松(作為磷酸氫二鈉鹽)和75mg二氧化硅膠體(Aerosil200V)一起混合。將得到的粉末混合物轉(zhuǎn)移到帶有體積標(biāo)記的燒杯中。用微晶纖維素(AvicelPH102)調(diào)節(jié)體積至37ml。隨后，將粉末混合物裝入100粒兩片式硬明膠膠囊(Capsugel2)。
實(shí)施例11制備100粒膠囊，每粒膠囊含有2mg雌四醇和3mg甲氨蝶呤將200mg雌四醇、300mg甲氨蝶呤(作為二鈉鹽)和75mg二氧化硅膠體(Aerosil200V)一起混合。將得到的粉末混合物轉(zhuǎn)移到帶有體積標(biāo)記的燒杯中。用微晶纖維素(AvicelPH102)調(diào)節(jié)體積至37ml。將得到的粉末混合物裝入100粒兩片式硬明膠膠囊(Capsugel2)。
權(quán)利要求
1.雌激素成分在制備藥物組合物中的應(yīng)用，所述的雌激素成分選自下式代表的物質(zhì)， 其中，R1、R2、R3、R4獨(dú)立地為氫原子、羥基或含有1-5個(gè)碳原子的烷氧基；R5、R6、R7各自是羥基；且R1、R2、R3、R4中的不超過(guò)3個(gè)為氫原子；當(dāng)在本方法中使用時(shí)能夠釋放出如上式所示的物質(zhì)的前體；以及一種或多種前述物質(zhì)和/或前體的混合物；所述的藥物組合物用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中免疫介導(dǎo)的疾病的方法中，所述的方法包括向所述的哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的雌激素成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中R3代表羥基或烷氧基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中R1、R2、R3和R4中至少3個(gè)代表氫原子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的前體是所述雌激素物質(zhì)的衍生物，其中至少一個(gè)羥基的氫原子已經(jīng)被以下基團(tuán)取代含有1-25個(gè)碳原子的羧酸、磺酸或氨基磺酸的?；?；四氫呋喃基；四氫吡喃基；或每個(gè)殘基含有1-20個(gè)糖苷單元的直鏈的或支鏈的糖苷殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的方法包括在一段為期至少5天、優(yōu)選為至少30天的時(shí)間內(nèi)不間斷地給藥所述雌激素成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的方法包括口服或皮下給藥所述雌激素成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述的方法包括口服給藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述雌激素成分以至少為1μg/kg體重/天，優(yōu)選為至少5μg/kg體重/天的量給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的免疫介導(dǎo)的疾病是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病和/或慢性炎性疾病。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的免疫介導(dǎo)的疾病選自自身免疫疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴(lài)性糖尿病(I型糖尿病)、全身性紅斑狼瘡、銀屑病，由感染物、病毒感染或細(xì)菌感染誘導(dǎo)的免疾病理，結(jié)核病、瘤型麻風(fēng)，移植排斥、移植物對(duì)抗宿主疾病、特異反應(yīng)性病癥、嗜酸粒細(xì)胞增多、結(jié)膜炎和腎小球腎炎。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述的免疫介導(dǎo)的疾病是Th1介導(dǎo)的疾病。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的免疫介導(dǎo)的疾病選自多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴(lài)性糖尿病(I型糖尿病)、全身性紅斑狼瘡和銀屑病。
13.一種藥物組合物，其包含在權(quán)利要求1中定義的雌激素成分、免疫治療劑和藥物學(xué)可接受的賦形劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其中該組合物包含至少10μg的所述雌激素成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的藥物組合物，其中該組合物包含至少1μg的所述免疫治療劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中的任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述的免疫治療劑選自以下組中抗炎藥、D-青霉胺、4-氨基喹啉藥、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、環(huán)孢霉素，T淋巴細(xì)胞、粘著分子、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的單克隆抗體，腫瘤壞死因子受體(TNFR)-IgG、IL-1受體拮抗劑、ICE抑制劑、β酶蛋白，維生素D、1α，25-二羥基維生素D3和1α，25-二羥基維生素D2，特異性結(jié)合選自T細(xì)胞受體、抗原或HLA分子的分子的藥劑，有機(jī)金衍生物如硫代蘋(píng)果酸鈉金、金硫葡糖或金諾芬，血管生成抑制劑。
17.口服單位劑型，其包含根據(jù)權(quán)利要求13-16中的任一項(xiàng)的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中免疫介導(dǎo)的疾病的方法，所述的方法包括向所述的哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的雌激素成分，其中雌激素成分選自以下組中式(I)代表的物質(zhì)，其中，R
文檔編號(hào)A61P25/28GK1691947SQ03818849
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者埃弗特·約翰內(nèi)斯·布恩舍滕, 赫爾曼·揚(yáng)·蒂杰門(mén)·科林格本寧克, 克里斯琴·弗朗茲·霍林卡 申請(qǐng)人:潘塔希生物科學(xué)股份有限公司