專利名稱：顯示cd59表面表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性介導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌性疾病的診斷和治療，尤其涉及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性 的介導(dǎo)；最尤其涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)作為起始細(xì)胞毒性反應(yīng) 的手段的用途，所述CDMAB任選地與一種或者多種化療劑聯(lián)用。本發(fā) 明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合分析。
背景技術(shù)：
CD59是18-20 kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的膜糖蛋白。它最初 分離自人紅細(xì)胞表面，作為補(bǔ)體激活的抑制劑。隨后發(fā)現(xiàn)數(shù)種抗體以 CD59作為靶標(biāo)，所述抗體被制備用于增強(qiáng)補(bǔ)體-介導(dǎo)的裂解。它們各自 獨(dú)立的制備導(dǎo)致CD59的多種名稱，包括MEM-43抗原、反應(yīng)性裂解的 膜抑制劑(MIRL)、 H19、膜攻擊復(fù)合物-抑制因子(MACIF)、分子量20,000 的同源限制因子(HRF20)和保護(hù)素(Walsh， Tone " fl/.， 1992)。
已經(jīng)通過氨基酸分析和NMR對(duì)CD59抗原進(jìn)4亍了充分表征。它由 128個(gè)氨基酸組成，其中前25個(gè)包括信號(hào)序列。存在10個(gè)半胱氨酸殘基， 這造成緊密折疊的分子。已知18位的天門冬酰胺殘基是N-糖基化的，而 77位的天門冬酰胺殘基與GPI錨定蛋白連接。C端殘基表現(xiàn)出GPI-錨定 蛋白的特點(diǎn)(Davies和Lachma皿1993)。
最初在人紅細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了 CD59,但CD59是廣泛表達(dá)的分子。從 流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)和Northern印跡分析收集的關(guān)于細(xì)胞分布的 大量資料顯示在許多類型的細(xì)胞和組織中的表達(dá)，包括造血細(xì)胞，例如， 血小板，白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，以及紅細(xì)胞(Meri， Waldmann " a/., 1991)。 在遍及身體的血管和導(dǎo)管內(nèi)皮中CD59是豐富的，尤其在腎，支氣管， 胰腺，皮膚表皮以及膽腺和唾液腺中(Meri， Waldmann"a/.， 1991)。肺， 肝，胎盤，曱狀腺和精子中已經(jīng)顯示有表達(dá)(Davies和Lachmann 1993)。 在唾液，尿液，淚，汗，腦脊液，母乳，羊水和精液漿中已經(jīng)檢測(cè)到CD59
的可溶形式(Davies和Lachmann 1993)。可溶性CD59的起源還有待于確 定；它是否是分泌的、是否通過磷脂酶切割或者通過其他方式從細(xì)胞脫 落仍然是未知的(Davies和Lachma皿1993)?？雌饋碓谠S多B細(xì)胞株，CNS 組織，肝實(shí)質(zhì)和朗格漢斯胰島中都沒有CD59(Meri, Waldmann & a/., 1991)。
盡管CD59在正常細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，它還在惡性腫瘤中廣泛 表達(dá)。有證據(jù)表明與正常組織相比，在某些類型的癌癥中CD59的表達(dá) 增加，并且表達(dá)水平與腫瘤的分化階段有關(guān)。在曱狀腺，前列腺，乳房， 卵巢，肺，結(jié)腸直腸，胰腺，胃，腎和皮膚癌以及惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，白 血病和淋巴瘤中已經(jīng)報(bào)道了中等到高水平的CD59表達(dá)(Fishelson， Donin &《2003)。
已知CD59抑制補(bǔ)體激活后的膜攻擊復(fù)合物(MAC)形成。MAC形成 是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的最終事件之一，在細(xì)胞膜上形成小孔，這最終導(dǎo)致細(xì)月包的 破壞。CD59結(jié)合C5b-8，干擾C9分子的后續(xù)聚合和MAC形成。其他補(bǔ) 體抑制蛋白例如1型補(bǔ)體受體(CR1; CD35)，膜輔助因子蛋白(MCP; CD46) 和衰變加速因子(DAF; CD55)在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的更早期起作用。補(bǔ)體激活導(dǎo) 致耙細(xì)胞的破壞或者細(xì)胞活化，其募集白細(xì)胞、收縮周圍平滑肌并增加 血管可滲透性。補(bǔ)體激活還在抗體-依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)和補(bǔ) 體-依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(CDCC)中起作用。補(bǔ)體激活導(dǎo)致炎性反應(yīng)， 如果調(diào)節(jié)不好可能損害靶組織。CD59和其他補(bǔ)體抑制蛋白防止補(bǔ)體級(jí)聯(lián) 活化導(dǎo)致的自體組織損傷。已有假說認(rèn)為補(bǔ)體抑制蛋白例如CD59的過 表達(dá)可能有助于增強(qiáng)對(duì)惡性腫瘤經(jīng)常獲得的補(bǔ)體激活的抗性(Jarvis， Li " a/.， 1997)。如果是這種情況，用針對(duì)補(bǔ)體抑制蛋白的單克隆抗體治療可以 克服這種抗性，使腫瘤對(duì)免疫治療或者其他治療方法更具應(yīng)答性。
陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)是罕見的影響造血干細(xì)胞的遺傳性 癥狀，產(chǎn)生對(duì)補(bǔ)體攻擊異常敏感的細(xì)胞(Davies和Lachmann 1993)。癥狀 包括慢性溶血，貧血和血栓形成(Sugita和Masuho 1995)。受PNH影響的 細(xì)胞缺乏GPI-錨定蛋白，所述細(xì)胞包括紅細(xì)胞，粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，血 小板以及有時(shí)包括淋巴細(xì)胞，(Davies和Lachmann 1993)。受影響的細(xì)月包 缺少乙酰膽堿酯酶，LFA-3, HUPAR和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD35、 CD46、 CD55
和CD59 (Davies和Lachmann 1993)。只有單個(gè)完全缺失CD59的表達(dá)4旦 不缺失其他補(bǔ)體調(diào)節(jié)GPI-錨定蛋白的表達(dá)的個(gè)體的報(bào)告病例。該缺陷與 PNH-樣癥狀例如溶血性貧血和血栓形成有關(guān)(Davies和Lachmann 1993)。 盡管存在與CD59功能缺失有關(guān)的不良作用，但該個(gè)體證明完全喪失是 非致死性的。當(dāng)面臨治療癌癥的艱巨任務(wù)時(shí)，溶血副作用是可以接受的 待克服的障礙。
CD59基因之一被敲除的小鼠模型也證明CD59缺陷在體內(nèi)是非致死 性的。小鼠表達(dá)兩種形式的CD59，即CD59a和CD59b。 CD59a廣泛地 表達(dá)于多種小鼠組織，包括血細(xì)胞，而只在睪丸中鑒定出CD59b的表達(dá)。 Miwa a/.制備了 CD59a-缺陷小鼠以便評(píng)價(jià)體內(nèi)CD59保護(hù)紅細(xì)胞免受 自發(fā)補(bǔ)體攻擊的作用。他們報(bào)道說敲除小鼠發(fā)育和生長正常，沒有任何 溶血性貧血的跡象，并且血紅蛋白水平?jīng)]有顯著升高。盡管紅細(xì)胞對(duì)通 過注射眼鏡蛇毒因子(CVF)誘導(dǎo)的補(bǔ)體攻擊更敏感，但與野生型相比，自 發(fā)補(bǔ)體攻擊導(dǎo)致的紅細(xì)胞清除沒有顯著升高(Miwa, Zhou W a/., 2002)。
在大鼠中已經(jīng)鑒定出稱為大鼠抑制蛋白(RIP)的21-kDa膜糖蛋白。 RIP在C5b-8期或者之后抑制MAC組裝，通過磷脂酰肌醇-特異性-疇脂 酶C從大鼠紅細(xì)胞釋放。這些因子，連同N末端序列，提示RIP是人CD59 的大鼠同源物。將6D1的F(ab')2片段，即針對(duì)大鼠RIP的小鼠單克隆抗 體，向一組雄性Wistar大鼠給藥。在同一研究中，還給藥5I2的片段， 即針對(duì)不同的大鼠膜-結(jié)合的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的抗體。注射6D1片段后未7見 察到心率或者血壓的變化。在肺、心和肝中檢測(cè)到片段結(jié)合。唯一觀察 到的效果是白細(xì)胞計(jì)數(shù)的小量增加和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的下降；血小板數(shù)目沒 有變化。相反，注射512片段導(dǎo)致血壓的快速增加，白細(xì)胞和血小;f反的 快速減少，以及注射后多達(dá)2小時(shí)的紅細(xì)胞的連續(xù)增加(Matsuo, Ichida d a/" 1994)。
嵌合單克隆抗體利妥昔單抗(Rituximab)(美羅華(Rituxan)， Genentech, San Francisco, CA)針對(duì)CD20抗原，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)的治療。許多CD20+的患者對(duì)治療無反應(yīng)，有反應(yīng)的大部分患者最 終對(duì)治療產(chǎn)生抗性。為了克服這種抗性，已經(jīng)對(duì)使用抗CD59抗體來增 加CDCC進(jìn)行了研究。體外在補(bǔ)體存在的條件下對(duì)美羅華治療有抗性的
NHL和MM細(xì)胞系表達(dá)CD59，而對(duì)相同處理敏感的NHL和MM細(xì)胞 系不表達(dá)CD59。將一種抗性細(xì)胞系與抗CD59抗體(YTH53.1)預(yù)孵育使 所述細(xì)胞對(duì)利妥昔單抗和人補(bǔ)體的治療敏感。在分離自患者的腫瘤中顯 示CD59的高表達(dá)水平，所述患者是CD20+的但用利妥昔單抗治療后仍 有疾病ii^XTreon， Emmanouilides 2005》
已經(jīng)利用三維微型腫瘤球(MTS)對(duì)乳腺癌(T47D)和卵巢畸胎癌(PA-1) 中的體外CD59抗體YTH53.1活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。MTS是在培養(yǎng)物中生長 的多細(xì)胞聚集物，代表比單層或者懸浮培養(yǎng)物更接近于體內(nèi)觀察到的才莫 型。該小組先前的工作已經(jīng)顯示生長為MTS的PA-1細(xì)胞比在懸浮液生 長的PA-1細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體裂解更具抗性。為了評(píng)價(jià)這種抗性是否可以被克月艮， 通過鉻釋放分析測(cè)量細(xì)胞毒性，在用生物素化的YTH53.1預(yù)處理MTS 后利用攝取碘化丙啶(PI)顯示細(xì)胞損壞。生物素化后所述抗體保留其對(duì) CD59的親和力，但失去活化經(jīng)典補(bǔ)體途徑的能力?？谷橄侔┘?xì)胞的兔抗 人多克隆抗體(S2)用于活化所述經(jīng)典途徑。與YTH53.1的過夜孵育導(dǎo)致 所述MTS的完全浸潤，鉻釋放分析顯示在YTH53.1、 S2和人補(bǔ)體存在 的條件下，1小時(shí)到2小時(shí)停滯期后33%的細(xì)胞被殺傷。電子顯微鏡才企查 顯示用YTH53.1、 S2和人補(bǔ)體孵育后，平均T47D腫瘤體積減小28%。 PI孵育后的熒光顯孩"竟檢查顯示YTH53.1、 S2和人補(bǔ)體孵育后T47D和 PA-1 MTS上數(shù)層細(xì)胞死亡。這些結(jié)果結(jié)合在一起表明抗CD59抗體可以 在體外增加補(bǔ)體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解(Hakulinen和Meri 1998)。
另一個(gè)小組發(fā)現(xiàn)在體外用CD59抗體YTH53.1處理可以克服對(duì)補(bǔ)體 介導(dǎo)的人轉(zhuǎn)移性前列腺腺癌細(xì)胞系DU145和PC3裂解的抗性。鉻釋放分 析用于測(cè)量YTH53.1和生物素化的YTH53.1存在或者不存在的條件下的 細(xì)胞死亡。沒有CD59抗體，兩種細(xì)胞系對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解具有完全抗 性。用YTH53.1處理部分克服了這種抗性，殺傷56%的PC3細(xì)胞和34% 的DU145細(xì)胞。用生物素化的YTH53.1處理克服抗性的程度要低一些； 47%的PC3和20%的DU145細(xì)胞被殺傷。相對(duì)于DU145, PC3增加的靈 壽丈度可能歸因于PC3增加的CD59表達(dá)。天然和生物素化抗體的差異作 用證明補(bǔ)體經(jīng)典途徑的活化和CD59中和的結(jié)合的作用，因?yàn)樯锼鼗?的抗體可能不活化經(jīng)典途徑(jarvis, LiWa/.， 1997)?？贵w的大部分活性可
能歸因于補(bǔ)體抑制的阻斷(CD59的中和)，因?yàn)橥ㄟ^經(jīng)典途徑增強(qiáng)補(bǔ)體活 化只增加少量的活性(例如，對(duì)PC3細(xì)胞，生物素化的YTH53.1是47%， 相對(duì)地YTH53.1是56。/。)(Jarvis， Li e"/., 1997)。迄今為止， 一直沒有抗 CD59抗體YTH53.1的體內(nèi)分析。沒有任何關(guān)于任意抗CD59抗體在臨床 前癌癥模型中顯示體內(nèi)治療功效的報(bào)告。
用作癌癥療法的單克隆抗體每個(gè)顯示癌癥的個(gè)體都是獨(dú)特的，就 像人的身份不同一樣其癌癥也不同于其他癌癥。盡管這樣，現(xiàn)有療法在 相同階^R用相同方式治療患有相同類型癌癥的所有患者。這些患者中的 至少30%在一線治療中失敗，從而導(dǎo)致額外的療程以及治療失敗、轉(zhuǎn)移 和最終死亡的可能性增加。優(yōu)良的治療方法應(yīng)該是對(duì)于特定個(gè)體的個(gè)體 化療法?，F(xiàn)有唯一的個(gè)體化療法是手術(shù)?；熀头暖煙o法針對(duì)患者量體 裁衣，而手術(shù)本身在大部分情況下不足以產(chǎn)生療效。
隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，開發(fā)個(gè)體化療法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)， 因?yàn)槊糠N抗體可以針對(duì)單一表位。此外，有可能制備抗體的組合，所述 組合針對(duì)表位的集合，所述集合唯一地限定出特定個(gè)體的腫瘤。
在意識(shí)到癌性細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差異是癌性細(xì)胞包含對(duì)轉(zhuǎn) 化細(xì)胞特異的抗原后，科學(xué)界長期以來認(rèn)為可以將單克隆抗體設(shè)計(jì)為通 過特異結(jié)合這些癌癥抗原特異的靶向轉(zhuǎn)化細(xì)胞；因此相信單克隆抗體可 以用作消滅癌細(xì)胞的"魔力子彈"。但是，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛意識(shí)到?jīng)]有單一 的單克隆抗體可以在癌癥的所有情況下起作用，并且單克隆抗體作為類 可以被用作靶向癌癥治療。根據(jù)即將公開的本發(fā)明的教導(dǎo)而分離的單克 隆抗體已經(jīng)顯示以有益于患者的方式調(diào)節(jié)癌性疾病過程，例如通過減輕 胂瘤負(fù)荷，所述分離的單克隆抗體在本文將多樣地稱為癌性疾病調(diào)節(jié)抗 體(CDMAB)或者"抗癌癥"抗體。
目前，通常供癌癥患者選擇的治療方法^:少。癌癥療法的組合方法 改善了全世界的存活和患病率。但是，對(duì)于特定個(gè)體，這些改善的統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)不一定和他們個(gè)人狀況的改善必然相關(guān)。
因此，如果有方法學(xué)能夠使醫(yī)師獨(dú)立于相同群組中的其他患者來治 療每種腫瘤，那么將允許用僅僅針對(duì)那個(gè)人療法的獨(dú)特方法。理論上這 種療法過程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的結(jié)果，從而滿足長期感受到的需200780006609.8
說明書第6/41頁要。
過去，多克隆抗體已經(jīng)被用于人類癌癥的治療，但只取得了有限的 成功。已經(jīng)用人血漿來治療淋巴瘤和白血病，但很少獲得持久的癥狀緩 解或者應(yīng)答。此外，與化療相比，缺乏重現(xiàn)性，也沒有額外的益處。諸 如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌的實(shí)體瘤也已經(jīng)用人血液、黑猩猩血清、 人血漿和馬血清進(jìn)行治療，但是相應(yīng)的結(jié)果是不可預(yù)見和無效的。
對(duì)于實(shí)體瘤有很多單克隆抗體的臨床試驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代，利 用抗特異抗原或者基于組織選擇性的抗體對(duì)人乳腺癌進(jìn)行了至少4次臨 床試驗(yàn)，在至少47例患者中只產(chǎn)生了 l例應(yīng)答者。直至1998年，才有 成功的臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)聯(lián)用了人源化抗Her2/neu抗體(赫賽汀 (Herceptii^))和順鉑。在這次試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了 37例患者的應(yīng)答，其中大 約1/4具有部分應(yīng)答率(partial response rate),另外1/4具有輕微或者穩(wěn)定 的疾病逸艮。應(yīng)答者中的中位進(jìn)展時(shí)間(median time to progression)為8.4 個(gè)月，中位應(yīng)^#續(xù)時(shí)間(median response duration )為5.3個(gè)月。
1998年赫賽汀被批準(zhǔn)與泰素(Taxof)—線聯(lián)用。臨床研究結(jié)果顯示， 與只接受泰素(3個(gè)月)的組相比，接受抗體療法加泰素(6.9個(gè)月)的患者的 中位疾病進(jìn)展時(shí)間增加。中位存活時(shí)間也有輕微的增加；赫賽汀加泰素 治療方式為22個(gè)月，泰素單獨(dú)治療方式為18個(gè)月。此外，所述抗體加 泰素聯(lián)合組與單獨(dú)的泰素相比，完全(8%對(duì)2%)和部分應(yīng)答者(34 %對(duì)15%) 的數(shù)目均有所增加。但是，用赫賽汀和泰素治療相對(duì)于單用泰素治療導(dǎo) 致更高的心臟毒發(fā)病率(分別為13%對(duì)1%)。并且，赫賽汀療法只對(duì)過表 達(dá)(通過免疫組織化學(xué)(IHC)分析來測(cè)定)人表皮生長因子受體2(Her2/neu) 的患者和大約25%的患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者有效，所述人表皮生長因 子受體2是目前還沒有已知功能或者生物上重要配體的受體。因此，對(duì) 于患有乳腺癌的患者來說仍然存在遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到滿足的需要。甚至那些 從赫賽汀治療獲益的患者依然需要化療，因此仍然(至少在一定程度上) 不得不面對(duì)這種治療的副作用。
研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)涉及同時(shí)抗糖蛋白和糖脂靶的抗體。對(duì) 腺癌具有一定特異性諸如17-1A的抗體，已經(jīng)進(jìn)行了超過60例患者的2 期臨床試驗(yàn)，其中僅有1例患者有部分應(yīng)答。在其他試驗(yàn)中，在使用另外的環(huán)磷酰胺的實(shí)—瞼步驟的52例患者中，使用17-lA僅產(chǎn)生1例完全應(yīng) 答和2例輕微應(yīng)答。迄今為止，17-lA的III期臨床試驗(yàn)沒有證明其作為 III期結(jié)腸癌輔助療法的改善功效。使用最初批準(zhǔn)用于成像的人源化鼠單 克隆抗體也沒有產(chǎn)生腫瘤消退。
近期才在使用單克隆抗體的結(jié)腸直腸癌臨床研究中得到一些陽性結(jié) 果。2004年，愛必妥(ERBHTD^)被批準(zhǔn)用于表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直 腸癌患者的二線治療，所述患者對(duì)基于依立替康(irinotecan)的化療是耐受 的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明，愛必妥與依立替康聯(lián)用 的應(yīng)答率分別為23%和15%，中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別為4.1個(gè)月和6.5個(gè) 月。相同雙臂II期臨床研究和另一單臂研究的結(jié)果表明，單用愛必妥治 療的應(yīng)答率分別為11%和9%,中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別為1.5個(gè)月和4.2 個(gè)月。
因此，愛必妥與依立替康聯(lián)合治療在瑞士和美國，以及愛必妥單獨(dú) 治療在美國，都已經(jīng)被批準(zhǔn)作為依立替康一線療法失敗的結(jié)腸癌患者的 二線治療。因此，類似赫賽汀，在瑞士的治療只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體 和化療的聯(lián)用。此外，在瑞士和美國的治療只是^皮批準(zhǔn)作為患者的二線 療法。2004年，阿瓦斯丁(AVASTH^)也被批準(zhǔn)與靜脈內(nèi)基于5-氟尿嘧啶 的化療聯(lián)用作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果證明， 用阿瓦斯丁加5-氟尿嘧啶治療的患者比單獨(dú)用5-氟尿嘧啶治療的患者的 中位存活時(shí)間延長(分別為20個(gè)月對(duì)16個(gè)月)。但是，還是和赫賽汀和愛 必妥一樣，治療只被批準(zhǔn)作為與單克隆抗體和化療的聯(lián)用。
對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌也繼續(xù)存在差 的結(jié)果。近期對(duì)于非小細(xì)胞肺癌最有希望的的結(jié)果來自II期臨床試-驗(yàn)， 其中治療涉及偶聯(lián)到細(xì)胞殺傷藥物阿霉素的單克隆抗體(SGN-15; dox-BR96，抗-Sialyl-LeX)與化療劑泰素帝(Taxotere)聯(lián)用。泰素帝是唯一 經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于肺癌二線治療的化療劑。原始數(shù)據(jù)顯示相對(duì)于單用泰素 帝，總體存活率提高。該研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15與泰 素帝聯(lián)用，而剩余的1/3接受單獨(dú)的泰素帝。對(duì)于接受SGN-15與泰素帝 聯(lián)用的患者，中位總體存活時(shí)間為7.3個(gè)月，與之相對(duì)，接受單獨(dú)的泰素 帝的患者為5.9個(gè)月。接受SNG-15加泰素帝的患者在1年和18個(gè)月時(shí)
的總體存活率分別為29%和18%，與之相比，接受單獨(dú)的泰素帝的患者 分別為24%和8%。已計(jì)劃進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。
臨床前，對(duì)于黑素瘤使用單克隆抗體只獲得某種有限的成功。這些 抗體中幾乎沒有進(jìn)行到臨床試驗(yàn)階段，到目前為止沒有一個(gè)被批準(zhǔn)或者 在III期臨床試驗(yàn)中被證明為有利結(jié)果。
缺乏對(duì)明確促進(jìn)疾病發(fā)病機(jī)理的30,000種已知基因的產(chǎn)物中的相關(guān)
靶標(biāo)的鑒定，阻礙了用于治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)。在腫瘤學(xué)研究中，潛
在的藥物靶標(biāo)經(jīng)常被選出，就因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤細(xì)胞中過表達(dá)。然后，篩
選如此鑒定的靶標(biāo)與大量化合物的相互作用。對(duì)于可能的抗體療法，這
些候選化合物一般衍生自單克隆抗體生成的傳統(tǒng)方法，所述方法如
Kohler和Milstein規(guī)定的基本原則(1975， Nature, 256， 495-497, Kohler和
Milstein)所述。從用抗原(例如全細(xì)胞，細(xì)胞部分，純化抗原)免疫的小鼠
收集脾細(xì)胞，并與永生化雜交瘤伴侶融合。對(duì)所獲雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，
選取分泌與所述靶標(biāo)結(jié)合最緊密的抗體的雜交瘤。利用這些方法制備并
根據(jù)針對(duì)癌細(xì)胞的治療性和診斷性抗體的親和力選擇到了許多所述抗
體，包括赫賽汀和利妥昔單抗。這種策略的缺點(diǎn)是雙重的。首先，關(guān)于
組織特異性致癌過程知識(shí)的匱乏和所獲過分簡單化的方法，限制了對(duì)于
治療性或者診斷性抗體結(jié)合的合適靶標(biāo)的選擇，所述方法例如利用過表
達(dá)選擇，借此來鑒定這些靶標(biāo)。其次，以下假設(shè)不一定總是正確的，即 通常與受體以最大親和力結(jié)合的藥物分子起始或者抑制信號(hào)的可能性最高。
盡管在乳腺癌和結(jié)腸癌的治療中取得了 一些進(jìn)展，但對(duì)作為單一 藥 劑或者協(xié)同治療的有效抗體療法的鑒定和開發(fā)已經(jīng)不足以應(yīng)對(duì)所有類型 的癌癥。
現(xiàn)有專利
美國第5,750,102號(hào)專利公開了方法，其中用MHC基因轉(zhuǎn)染患者的 胂瘤細(xì)胞，該基因可從患者的組織或細(xì)胞中克隆。然后用這些轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞免疫患者。
美國專利4,861,581公開了方法，其包括以下步驟獲取單克隆抗體，
該抗體對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分是特異的，對(duì)細(xì)胞
外成分沒有特異性；標(biāo)記單克隆抗體；將該標(biāo)記的抗體與哺乳動(dòng)物的組 織接觸，該哺乳動(dòng)物已接受殺傷腫瘤細(xì)胞的治療；及，通過測(cè)量該標(biāo)記 抗體與退化的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分的結(jié)合來確定治療的有效性。在制 備針對(duì)人類細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體時(shí)，專利權(quán)所有人認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞是這類 抗原的方便來源。
美國專利5,171,665提供了新型抗體及其制備方法。具體的，該專利 教導(dǎo)單克隆抗體的制備，該抗體與人類腫瘤(例如腸和肺的腫瘤)相關(guān)的蛋 白抗原強(qiáng)烈結(jié)合，而與正常細(xì)胞的結(jié)合弱得多。
美國專利5,484,596提供了癌癥治療的方法，其包括手術(shù)切除人癌 癥患者的腫瘤；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細(xì)胞；照射腫瘤細(xì)胞，使其能 成活但不致瘤；用這些細(xì)胞來制備抑制原發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)，同時(shí)抑制腫瘤 轉(zhuǎn)移的患者疫苗。該專利教導(dǎo)可與腫瘤細(xì)胞表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體 的開發(fā)。如在第4欄，第45行等處提到的，專利權(quán)所有人在研發(fā)單克隆 抗體中應(yīng)用了自體腫瘤細(xì)胞，該單克隆抗體對(duì)人類腫瘤表現(xiàn)出活性特異 的免疫治療。
美國專利5,693,763教導(dǎo)人類癌細(xì)胞的糖蛋白抗原特性且不依賴于來 源的上皮組織。
美國專利5,783,186涉及誘導(dǎo)表達(dá)Her2的細(xì)胞凋亡的抗-Her2抗體， 產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系，用該抗體治療癌癥的方法和包括所述抗體 在內(nèi)的藥物組合。
美國專利5,849,876描述了產(chǎn)生單克隆抗體的新的雜交瘤細(xì)胞系，該 抗體是針對(duì)乂人腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞來源純化的粘液素抗原。
美國專利5,869,268公開了生成產(chǎn)生特異針對(duì)所需抗原的人類淋巴 細(xì)胞的方法，制備單克隆抗體的方法及該方法制備的單抗。該專利特別 涉及用于癌癥診斷和治療的抗-HD人類單克隆抗體的制備。
美國專利5,869,045涉及與人類癌細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體 偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的作用機(jī)制是雙重的，因?yàn)樵摲肿涌?與人類癌細(xì)胞表面的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，而且該抗體可進(jìn)一步內(nèi)化入癌細(xì) 胞內(nèi)，隨后是結(jié)合，這對(duì)形成抗體-藥物，抗體-毒素的偶聯(lián)物尤其有用。
未經(jīng)修飾的抗體在特定濃度下，也表現(xiàn)出細(xì)胞毒性質(zhì)。
美國專利5,780,033公開了用于腫瘤治療和預(yù)防的自身抗體的使用。 不過，這種抗體是來自老年哺乳動(dòng)物的抗核自身抗體。這里，自身抗體 是指一種存在于免疫系統(tǒng)的天然抗體。因?yàn)樽陨砜贵w來自"老年哺乳動(dòng) 物"，所以就不要求自身抗體必須來自受治患者。除此之外，該專利公開 了來自成年哺乳動(dòng)物的天然單克隆抗核自身抗體及產(chǎn)生單克隆抗核自身 抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
美國專利申請(qǐng)20050032128A1 /^開了抗糖基化CD59抗體在糖尿病 治療中的用途。
發(fā)明概述
本發(fā)明人此前已被授予了 "個(gè)體化患者特異性抗癌抗體，，的美國專 利6，180，357，該專利涉及選擇個(gè)體化定制抗癌抗體的方法，所述抗體可 用于治療癌性疾病。本領(lǐng)域公知可以改變多肽中的某些氨基酸序列而不 會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生顯著的影響。在抗體的分子重排中，對(duì)骨 架區(qū)域的核酸或氨基酸序列的修飾通常是可以耐受的。這些修飾包括但 不限于取代(優(yōu)選地是保守取代)、刪除或添加。此外，將標(biāo)準(zhǔn)的化療模式， 例如放射性核素，與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)，從而集中所述化療劑的應(yīng) 用，在本發(fā)明的范圍內(nèi)。CDMAB還可以與毒素、細(xì)胞毒性部分、酶(例 如生物素偶聯(lián)酶)或者造血細(xì)胞偶聯(lián)，從而形成抗體偶聯(lián)物。
本申請(qǐng)使用6,180,357專利中教導(dǎo)的制備患者特異性抗癌抗體的方 法，以分離雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系編碼癌性疾病調(diào)節(jié)單克隆抗體。 這些抗體可以被制備為特異性地針對(duì)一種腫瘤，由此使得癌癥療法的個(gè) 體化成為可能。在本申請(qǐng)上下文中，具有細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒性的)或細(xì)胞生 長抑制(抑制細(xì)胞生長的)性質(zhì)的抗癌抗體在下文將被稱作細(xì)胞毒性的。這 些抗體可用于幫助癌癥的分期和診斷，并且可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。還可 以通過預(yù)防性治療利用這些抗體預(yù)防癌癥。與如傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)^L范產(chǎn)生 的抗體不同，利用這種方式產(chǎn)生的抗體可以靶向于之前未顯示參與惡性
組織的生長和/或存活的分子和通路。此外，這些抗體的結(jié)合親和力滿足 細(xì)胞毒性事件起始的要求，所述事件不一定需要更強(qiáng)的親和力相互作用。
個(gè)體化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來改變。可能出現(xiàn)的 臨床情景是在腫瘤出現(xiàn)時(shí)獲取并保存腫瘤樣品。通過這個(gè)樣品，可以用 一組已經(jīng)存在的癌性疾病調(diào)節(jié)抗體檢測(cè)腫瘤的類型?；颊邔?huì)按常規(guī)分 期但是提供的抗體可以用于對(duì)患者進(jìn)一步的分期?？梢杂么嬖诘目贵w立 即對(duì)患者進(jìn)行治療，可以使用本文概述的方法或通過使用結(jié)合本文公開 的篩選方法的噬菌體展示文庫制備對(duì)腫瘤具有特異性的抗體組。將生成 的所有抗體加入抗癌抗體文庫，因?yàn)槠渌[瘤可能與正在接受治療的腫 瘤具有一些相同的表位。如本方法產(chǎn)生的抗體可用于治療任意數(shù)量患者 的癌性疾病，所述患者具有結(jié)合這些抗體的癌癥。
除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的療法作為多模式治 療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對(duì)非癌性細(xì)胞是相對(duì)無毒的事 實(shí)使高劑量的待用抗體的組合成為可能，所述組合或者單獨(dú)使用，或者 與常規(guī)療法聯(lián)用。高治療指數(shù)還允許按短時(shí)量程重復(fù)治療，這將降^f氐治 療抗性細(xì)胞出現(xiàn)的可能性。
如果患者耐受治療的初始階段或發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)產(chǎn)生腫瘤特異 性抗體的過程用于再治療。此外，可以將抗癌抗體與從該患者獲得的紅 血細(xì)胞偶聯(lián)并回輸用于轉(zhuǎn)移的治療。對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥很少有有效的治療且 轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡的不良結(jié)果。但是，轉(zhuǎn)移性癌癥常常是充分血 管化的且紅血細(xì)胞對(duì)抗癌抗體的遞送具有在腫瘤部位聚集抗體的作用。 甚至在轉(zhuǎn)移前，大部分癌細(xì)胞的存活依賴于宿主的血液供應(yīng)，與血紅細(xì) 胞偶聯(lián)的抗癌抗體對(duì)原位腫瘤也是有效的?？蛇x擇地，抗體可以與其它 造血細(xì)胞偶聯(lián)，所述細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺 傷細(xì)胞等等。
有5類抗體且各類抗體與由其重鏈賦予的功能關(guān)聯(lián)。 一般認(rèn)為由棵 抗體殺傷癌細(xì)胞是由抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性 介導(dǎo)的。例如鼠IgM以及IgG2a抗體可以通過與補(bǔ)體系統(tǒng)中的C-l成分 結(jié)合激活人的補(bǔ)體，由此激活補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑，該途徑可導(dǎo)致腫瘤 裂解。對(duì)于人抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體一般為IgM和IgGl。鼠lgG2a 和IgG3同種型抗體有效募集具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，由此造成單 核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷。人的IgGl和IgG3
同種型抗體均介導(dǎo)ADCC。
抗體介導(dǎo)的癌癥殺傷的另一個(gè)可能機(jī)制可能通過抗體的使用，所述 抗體能夠催化細(xì)胞膜及其結(jié)合的糖蛋白或糖脂中的多種化學(xué)鍵的水解， 即所謂的催化抗體。
有另外三種抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷機(jī)制。第一種機(jī)制是將抗體用作 疫苗以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)駐留于癌細(xì)胞的推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種 機(jī)制是將抗體用于靶向生長受體并干擾它們的功能或者下調(diào)該受體以有 效地使其功能喪失。第三種機(jī)制是這類抗體對(duì)細(xì)胞表面部分直接結(jié)合的 作用，這可以導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡，例如死亡受體的結(jié)合，所述死亡受 體例如TRAIL Rl或者TRAIL R2,或是與諸如3等的整合素分子結(jié) 合。
癌癥藥物的臨床應(yīng)用基于該藥物在可接受的風(fēng)險(xiǎn)范圍下對(duì)患者的有 益效果。在癌癥治療中，存活率通常是最重要的獲益目標(biāo)，但是除了延 長生命外，還存在大量其他公認(rèn)的益處。治療對(duì)存活率沒有負(fù)面影響的 這些其他益處包括癥狀的減輕、防止負(fù)面事件、延長復(fù)發(fā)或者無疾病存 活的時(shí)間和延長進(jìn)展時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)被普遍接受，像美國食品藥品管理 局(RD.A.)等管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物(Hirschfeld W a/., Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)外，還充 分意識(shí)到還有其他指標(biāo)可以預(yù)示這些類型的益處。部分地，美國F.D.A. 授予的快速審批程序確認(rèn)了存在很可能預(yù)測(cè)患者獲益的替代指標(biāo)。到 2003年末，有16種藥物被這種程序批準(zhǔn)，其中4種已經(jīng)進(jìn)入全面審批， 即，后續(xù)研究已證明如替代指標(biāo)所預(yù)示的直接患者獲益。確定對(duì)實(shí)體瘤 的藥物作用的 一個(gè)重要指標(biāo)是通過測(cè)量對(duì)治療的反應(yīng)來評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷 (Therasse & a/" Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。這種評(píng)價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已經(jīng)由實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 工作組(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)公布, 所述工作組由國際癌癥專家組成。正如RECIST標(biāo)準(zhǔn)的客觀療效顯示的， 與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比，對(duì)腫瘤負(fù)荷有確切作用的藥物易于最終對(duì)患者產(chǎn) 生直接的益處。通常，能夠更直接地評(píng)價(jià)和記錄臨床前設(shè)置的腫瘤負(fù)荷。 因?yàn)榕R床前研究可以轉(zhuǎn)化成臨床設(shè)置，所以在臨床前模型中延長患者存 活率的藥物應(yīng)該有最大的預(yù)期臨床效用。與臨床治療產(chǎn)生的積極作用相 似，在臨床前設(shè)置中減輕腫瘤負(fù)擔(dān)的藥物也對(duì)疾病有明顯的直接影響。 盡管延長生存時(shí)間是癌癥藥物治療結(jié)果中最關(guān)注的臨床結(jié)果，但仍有其 他有臨床作用的益處，顯然，降低腫瘤負(fù)荷也能導(dǎo)致直接的益處，并具 有臨床作用，其與疾病進(jìn)展的延遲、生存時(shí)間的延長或兩者都有關(guān)系
(Eckhardt ef a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(發(fā)展的治療學(xué)耙化合物的 臨床試-瞼設(shè)計(jì)的成功與失敗)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003， pages 209-219)?；旧侠肬S 6,180,357的方法，并且如 美國專利6,794,494, S.N. 10/994,664, S.N. 11/067,366和臨時(shí)S.N. 60/548,667所公開(其中每個(gè)的內(nèi)容通過引用并入本文)，用來自人結(jié)腸 (10A304.7)或者前列腺(AR36A36.11.1)腫瘤組織的細(xì)胞免疫小鼠后獲得小 鼠單克隆抗體10A304.7和AR36A36.1U。 10A304.7和AR36A36.11.1抗 原在來自不同組織起源的廣泛人細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)。在體外乳腺癌 細(xì)胞系MDA-MB-231 (MB-231)和MCF-7，結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116,前列 腺癌細(xì)胞系PC-3和卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3對(duì)10A304.7的細(xì)胞毒作用敏 感。在體外前列腺癌細(xì)胞系LnCap對(duì)AR36A36.il.1的細(xì)胞毒作用敏感。
通過證明10A304.7細(xì)胞毒體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)一步擴(kuò)展了其體外抗乳 腺癌細(xì)胞的結(jié)果(如S.N. 10/994,664所公開)。在人乳腺癌的體內(nèi)模型中 10A304.7預(yù)防腫瘤生長并P爭(zhēng)低腫瘤負(fù)荷。移植后第56天，即最后一次治 療給藥后6天，10A304.7治療組的平均腫瘤體積是同種型對(duì)照治療組腫 瘤體積的l%(p=0.0003, t-檢驗(yàn))。在整個(gè)研究中沒有毒性的臨床跡象。每 周測(cè)量的體重是健康的替代指標(biāo)。在治療期末的各組之間的體重沒有顯 著差異(p二0.3512, t-檢驗(yàn))。因此在人乳腺癌異種移植模型中10A304.7是 良好耐受的并降低腫瘤負(fù)荷。
通過證明AR36A36.il.1細(xì)胞毒體內(nèi)抗胂瘤進(jìn)一步擴(kuò)展其體外抗前列 腺癌細(xì)胞的結(jié)果(如S.N. 11/067,366所公開)。在人前列腺癌的體內(nèi)預(yù)防模 型中AR36A36.il.1預(yù)防胂瘤生長并降低肺瘤負(fù)荷。移才直后第41天，即 最后一次治療給藥后5天，AR36A36.il.1治療組的平均胂瘤體積是緩沖 液對(duì)照治療組腫瘤體積的14%(p=0.0009， t-檢驗(yàn))。在PC-3前列腺癌異種
移植模型中，體重可用作疾病進(jìn)展的替代指標(biāo)(Wang & a/., Int J Cancer, 2003)。研究結(jié)束時(shí)(第41天)，對(duì)照動(dòng)物顯示體重相對(duì)于研究開始時(shí)降低 27%。相反，用AR36A36.il.1治療的組比對(duì)照組具有明顯更高的體重 (p=0.017)。總的說來，AR36A36.il.1治療組只丟失其體重的6%,比緩 沖液對(duì)照組丟失的27%少4艮多。因此，在人前列腺癌異種移植沖莫型中， AR36A36.11.1是良好耐受的并降低腫瘤負(fù)荷和惡病質(zhì)。
除了 AR36A36.il.1抗前列腺癌作用之外，在體內(nèi)預(yù)防腫瘤模型中 AR36A36.il.1顯示抗SW1116結(jié)腸癌細(xì)l包的抗腫瘤活性(如S.N. 11/067,366所公開)。移植后第55天，即最后一次治療給藥后5天， AR36A36.1554.51治療組的平均腫瘤體積是緩沖液對(duì)照治療組腫瘤體積 的51%(p=0.0055， t-檢驗(yàn))。在整個(gè)研究中沒有毒性的臨床跡象。每周測(cè) 量的體重是健康和生長遲緩的替代指標(biāo)。在治療期末的各組之間的體重 沒有顯著差異( =0.4409, t-檢驗(yàn))。因此，在人結(jié)腸癌異種移植模型中， AR36A36.il.1是良好耐受的并降低腫瘤負(fù)荷。
此外，在體內(nèi)預(yù)防腫瘤模型中AR36A36.il.1顯示抗MDA-MB-231 (MB-231)乳腺癌的抗腫瘤活性(如S.N. 11/067,366所公開)。AR36A36.il. 1 完全預(yù)防腫瘤生長并降低腫瘤負(fù)荷。移植后第56天，即最后一次治療給 藥后6天，AR36A36.il.1治療組的平均肺瘤體積是同種型對(duì)照治療組肺 瘤體積的0%(p=0.0002， t-檢驗(yàn))。在整個(gè)研究中沒有毒性的臨床跡象。每 周測(cè)量的體重是健康和生長遲緩的替代指標(biāo)。在治療期末的各組之間的 體重沒有顯著差異( =0.0676, t-檢驗(yàn))。因此，在人乳腺癌異種移植模型 中，AR36A36.11.1是良好耐受的并降低腫瘤負(fù)荷。
此外，在建立的體內(nèi)腫瘤才莫型中，AR36A36.il.1顯示抗MB-231乳 腺癌的抗胂瘤活性(如S.N. 11/067,366所公開)。在這種建立的人乳腺癌體 內(nèi)模型中，AR36A36.il.1預(yù)防腫瘤生長并降低腫瘤負(fù)荷。移植后第83 天，即最后一次治療給藥后2天，AR36A36.il.1治療組的平均腫瘤體積 是緩沖液對(duì)照治療組肺瘤體積的46%(p=0.0038, t-檢驗(yàn))。這相當(dāng)于32% 的平均T/C。在整個(gè)研究中沒有毒性的臨床跡象。每周測(cè)量的體重是健康 和生長遲緩的替代指標(biāo)。在治療期末的各組之間的體重沒有顯著差異 (p=0.6493， t-檢驗(yàn))。
總體來說，該數(shù)據(jù)證明10A304.7和AR36A36.il.1抗原是癌癥相關(guān) 抗原并在人癌細(xì)胞中表達(dá)，是一種病理相關(guān)的癌癥靶標(biāo)。
本發(fā)明描述了 10A304.7和AR36A36.il. 1的開發(fā)和使用，其通過專 利US6，180，357描述的方法而開發(fā)并通過細(xì)胞毒性分析中其對(duì)動(dòng)物才莫型 中非建立的和建立的腫瘤生長的作用而鑒定。本發(fā)明代表了癌癥治療領(lǐng) 域的進(jìn)展，因?yàn)樗谝淮蚊枋隽伺c靶分子CD59上存在的一個(gè)或多個(gè)表 位特異結(jié)合的試劑，所述試劑具有抗惡性腫瘤細(xì)胞而不是抗正常細(xì)胞的 體外細(xì)胞毒性質(zhì)，其在人類癌癥的體內(nèi)模型中還直接介導(dǎo)腫瘤生長的抑 制。這是涉及任意其他先前描述的抗CD59抗體的進(jìn)展，因?yàn)闆]有一種 顯示具有相似的性質(zhì)。另一個(gè)進(jìn)展是在抗癌癥抗體文庫中包含這些抗體， 這將提高通過確定不同抗癌抗體的合適組合，靶向表達(dá)不同抗原標(biāo)志物 的腫瘤的可能性，以找到最有效的靶向和抑制所述腫瘤的生長發(fā)育。
總而言之，本發(fā)明教導(dǎo)了 10A304.7和AR36A36.il.1抗原作為治療 劑靶標(biāo)的用途，當(dāng)其被給藥時(shí)能夠降低哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的 腫瘤負(fù)荷，還能夠?qū)е卤恢委煵溉閯?dòng)物的存活延長。本發(fā)明還教導(dǎo)了 CDMAB(10A304.7和AR36A36.il.l)和它們的衍生物，其配體，例如其細(xì) 胞的細(xì)胞毒誘導(dǎo)配體，和其抗原結(jié)合片段的用途，來靶向它們的抗原以 預(yù)防和降低哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，并延長具有表達(dá) 該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的存活。此外，本發(fā)明還教導(dǎo)了在癌性細(xì)胞中 檢測(cè)10A304.7和AR36A36.il.1抗原的用途，其可用于診斷、療法預(yù)測(cè) 和具有表達(dá)該抗原的肺瘤的哺乳動(dòng)物的預(yù)后。
因此，本發(fā)明的目的是利用產(chǎn)生抗癌性細(xì)胞的癌性疾病調(diào)節(jié)抗體 (CDMAB)的方法來分離雜交瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的由所述雜交瘤細(xì)胞系編碼 的分離的單克隆抗體和其抗原結(jié)合片段，所述癌性細(xì)胞來自特定個(gè)體或 者一種或者多種特定癌細(xì)胞系，CDMAB對(duì)癌細(xì)胞是細(xì)胞毒性的但同時(shí) 對(duì)非癌性細(xì)胞相對(duì)無毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是教導(dǎo)癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其配體和其抗原結(jié) 合片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性通過抗 體依賴的細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性通過補(bǔ) 體依賴的細(xì)胞毒性介導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性是它們 催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解的能力的功能。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其可用于癌癥診斷、 預(yù)后和監(jiān)視的結(jié)合分析中。
本發(fā)明其他的目的和優(yōu)點(diǎn)通過本發(fā)明下述的說明、舉例和一些實(shí)施 方式的描述將變得明顯。
附圖簡述
圖l是細(xì)胞毒性分析中10A304.7對(duì)陽性和陰性對(duì)照的比較。
圖2.用AR36A36.1U(欄A)和10A304.7(欄B)作為探針的 MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。分子量標(biāo)志物標(biāo)在左側(cè)。
圖3.用10A304.7(欄A)、 AR36A36.11.1(欄B)、 IgG2a同種型對(duì)照 (8A304.7，欄C)和IgG2b同種型對(duì)照(8BlB.1,欄D)作為探針的Western 印跡。道1至4是用10A304.7(道1)、 AR36A36.il.l(道2)、 IgG2a同種型 對(duì)照(8A304.7，道3)和IgG2b同種型對(duì)照(8B1B.1 ，道4)免疫沉淀的 MDA-MB-231膜。道5是MDA-MB-231膜蛋白，道6是去糖基化的 MDA-MB-231膜蛋白，其利用PNGaseF、唾液酸酶A、 o-聚糖酶、/3(1-4) 半乳糖香酶和j3-N-乙酰葡糖胺糖苷酶去糖基化。分子量標(biāo)志物標(biāo)在左側(cè)。
圖4.用AR36A36.il.l(道l)和IgG2a同種型對(duì)照(道2)免疫沉淀的 MDA-MB-231膜的膠體藍(lán)染色(欄A)和Western印跡(欄B)。分子量標(biāo)志 物標(biāo)在左側(cè)。
圖5.用10A304.7(欄A)、 AR36A36.1U(欄B)、小鼠抗人 CD59(MEM-43,欄C)和IgG2a同種型對(duì)照(8A3B.6,欄D)作為探針，用 小鼠抗人CD59(MEM-43,道1)、 AR36A36.11.1(道2)和IgG2a同種型對(duì)照 (8A3B.6,道3)免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。分子量 標(biāo)志物標(biāo)在左側(cè)。
圖6A-圖6C是人正常組織微陣列中10A304.7和AR36A36.11.1對(duì)陽 性和陰性對(duì)照的比較。
圖7.代表性微觀圖，所述圖顯示從正常人組織微陣列獲得的正常人 子宮內(nèi)膜/分泌組織中與10A304.7(A)或者AR36A36.11.1(B)或者抗肌動(dòng)蛋 白(C)或者陰性同種型對(duì)照(D)的結(jié)合模式。10A304.7顯示陰性染色而 AR36A36.il.1顯示對(duì)血管內(nèi)皮的弱陽性染色(參見箭頭)。放大率是200x。
圖8A-圖8C是人多種腫瘤組織微陣列中10A304.7和AR36A36.1L1 對(duì)陽性和陰性對(duì)照的比較。
圖9.代表性微觀圖，所述圖顯示從人多種腫瘤組織微陣列獲得的肝 膽管癌組織中與10A304.7 (A)或者AR36A36.1U (B)或者抗肌動(dòng)蛋白(C) 或者陰性同種型對(duì)照(D)的結(jié)合模式。10A304.7和AR36A36.il.1顯示對(duì) 腫瘤細(xì)胞的陽性染色。放大率是200x。


圖10是10A304.7在人肝腫瘤和正常組織微陣列中的結(jié)合概述。
圖11.代表性微觀圖，所述圖顯示/AA組織微陣列獲得的肝細(xì)胞癌 組織中與10A304.7(A)或者同種型對(duì)照抗體(B)和非腫瘤肝組織中與 10A304.7(C)或者同種型對(duì)照抗體(D)的結(jié)合模式。10A304.7顯示對(duì)腫瘤 細(xì)胞的強(qiáng)陽性染色和對(duì)正常組織的陰性染色。放大率是200x。
發(fā)明詳述
下面用于概述、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求書中的字詞或短語通常都 有其指定的含義。
術(shù)語"抗體"使用其最廣泛的涵義，且特別包括，例如單克隆抗體(包 括激動(dòng)劑、拮抗劑和中和抗體，脫免疫的、鼠科的、嵌合的或人源化的 抗體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的免疫偶聯(lián) 物和抗體片段(見下文)。
本文4吏用的術(shù)語"單克隆抗體"指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得 的抗體，也就是說，包括這群抗體的單個(gè)抗體是相同的，除了可以少量 存在的可能的自然變異。單克隆抗體針對(duì)單一抗原部位是高度特異性的。 而且，與包含針對(duì)不同決定基(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相比， 每一種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一的決定基。除了特異性之外，單克 隆抗體在合成方面也是有優(yōu)勢(shì)的，其合成可以不受其他抗體的污染。修 飾語"單克隆的，，指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體的特征，而不能
20解釋為需要通過任何特定方法的抗體產(chǎn)生。例如，本文使用的單克隆抗
體可以通過由Kohler & a/.， A^Mre, 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤(鼠 或人)方法制備或由重組DNA方法制備(參見，例如，美國專利第4,816,567 號(hào))。"單克隆抗體"也可以從噬菌體抗體文庫中分離，使用的技術(shù)在例如 Clackson " a/., A^fwe, 352:624- 628 (1991)和Marks & a/， Mo/.所o/, 222:581-597 (1991)中描述過。
"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)域或 其可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括非全長的抗體、Fab、 Fab'、 F(ab'》和Fv 片段；微型雙功能抗體(diabodies);線形抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體， 單結(jié)構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性 抗體。
"完整"抗體指不但包含輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域
CH1、 Ch2、 Ch3，還包含結(jié)合抗原的可變區(qū)的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是 天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其tt酸序列的 變體。優(yōu)選地，完整抗體有一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)功能。
依據(jù)完整抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以分為 不同的"種類"。主要有五類完整的抗體IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM, 其中幾種可進(jìn)一步分成"亞類，，(同種型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。與不同種類抗體對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別被稱為"S, e， 7和P。 不同種類的免疫球蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)和亞結(jié)構(gòu)是公知的。
抗體"效應(yīng)功能"指那些由抗體Fc區(qū)引起的(天然序列的Fc區(qū)或氨 基酸序列變體的Fc區(qū))的生物活性?？贵w效應(yīng)功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合； 補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 性作用(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體；BCR) 等。
"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用"和"ADCC"指細(xì)胞介導(dǎo)的 反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性的細(xì)胞毒細(xì)胞(例如天然殺傷 (NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后導(dǎo) 致該靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)Fc7RHI， 而單核細(xì)胞表達(dá)Fc7RI，F(xiàn)c7RH和FctRIII。關(guān)于造血細(xì)胞FcR表達(dá)的總
結(jié)見Ravetch and Kinet， 及ev. 7mmw"o/ 9:457-92 (1991)464頁的表3。 為了測(cè)定目標(biāo)分子的ADCC活性，可以進(jìn)^f亍例如美國專利5,500,362或 5,821,337描述的體外ADCC活性分析。用于這類分析的效應(yīng)細(xì)胞包括外 周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?？蛇x擇地或附加地，目標(biāo)分 子的ADCC活性可以在體內(nèi)評(píng)價(jià)，例如在諸如Clynes W a/. /WJS (USA) 95:652-656 (1998)中公開的動(dòng)物模型中。
"效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR、執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。優(yōu) 選地，這些細(xì)胞至少表達(dá)Fc7Rin，并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC 的人類白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、 單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效 應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源中分離，例如從本文中描述的血液或PBMC中 分離。
術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合于抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的 FcR是天然序列的人類FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合于IgG抗體(7受 體)的受體，并包括FcryRI、 Fc7RII和FcryRin亞類的受體，其包括這些 受體的等位基因變體和可選擇的剪接形式。Fc)RII受體包括Fc7RIIA ("激活性受體")和F(ryRIIB("抑制性受體")，兩者的M酸序列相似， 主要不同在于其胞漿結(jié)構(gòu)域。激活性受體FcryRIIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域含有 基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受體FcryRIIB在其胞漿 結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見綜述M. in Dagron， /附mwwo/. 15:203-234 (1997)。 FcR綜述于Ravetch and
Kinet, ^w亂i ev. 7m,wo/ 9:457-92(1991); Capel & a/" /m,wome^油 4:25-34 (1994)和de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。本發(fā) 明中的術(shù)語"FcR"包括將來要被鑒定的FcR在內(nèi)的其他FcR。該術(shù)語 也包括負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyere,a/.， 丄TmmwAzo/. 1 17:587 (1976)牙口 Kim ^ a/"五w: Tmmwwo/. 24:2429 (1994》。
"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用"或"CDC"指分子在補(bǔ)體存在下，裂 解耙細(xì)胞的能力。補(bǔ)體激活途徑通過補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與交聯(lián)了 關(guān)聯(lián)抗原的分子(比如，抗體)的結(jié)合而起始。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)
4亍如Gazzano-Santoro W a/"丄7mm頭o/. M^Aoc^ 202:163 (1996)中描述的 CDC分析。
術(shù)語"可變的"指可變結(jié)構(gòu)域某些部分的序列在抗體間高度不同， 并用于每一種特定抗體與其特定抗原的結(jié)合及其特異性。然而，變化并 不是均勻分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)， 變化集中在所謂的高度可變區(qū)的三個(gè)區(qū)域內(nèi)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域內(nèi)更加高度保 守的部分被稱為骨架區(qū)(FR)。每個(gè)天然的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含 主要采用^-片層構(gòu)型的四個(gè)FR，其由三個(gè)高度可變區(qū)連接在一起，形成 環(huán)狀連接，在一些情況下形成部分>片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的高度可變區(qū)由FR 以密切靠近的方式結(jié)合一起，并與其他鏈的高度可變區(qū)一起，有助于抗 體的抗原結(jié)合部位的形成(參見Kabat " Se^ewces o/尸ratoVw o/ T/wwM"o/og/ca/ /"temy/(06瘦夢(mèng)《^尹f ^的#/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. (1991 ))。恒定結(jié)構(gòu)域并 不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，而是呈現(xiàn)各種效應(yīng)功能，例如參與抗體 在抗體依賴性的細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)中的作用。
本文使用的術(shù)語"高度可變區(qū)"指抗體上負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的氨基酸 殘基。高度可變區(qū)通常包括"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例 如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及 重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3); Kabat a/， o//VotoVw o/7m附imo/og7.ca/ /"&ms^(^;^夢(mèng)《標(biāo)蛋力的y^
/力,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和/或"高變環(huán)"區(qū)的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基 2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk乂 Mo/.所o/. 196:901-917 (1987))。 "骨架區(qū)"或"FR"殘基指除了本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變 區(qū)的殘基。木瓜蛋白酶水解抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同的被稱為"Fab"片段的 抗原結(jié)合片段和一個(gè)殘余的"Fc"片段，每個(gè)"Fab"片段都有單一的抗 原結(jié)合部位，"Fc"片段的名稱反映了其易結(jié)晶的能力。抗體經(jīng)胃蛋白酶 處理后，產(chǎn)生F(ab')2片段，其有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，仍能夠與抗原交聯(lián)。
"Fv"是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。此區(qū)
域由以非共價(jià)鍵的方式緊密結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二 聚體構(gòu)成。以這種每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用的構(gòu)型決定
VH-VL 二聚體表面的抗原結(jié)合部位。六個(gè)高變區(qū)域共同賦予了抗體的抗原 結(jié)合特異性。然而，即^_單一的可變結(jié)構(gòu)域(或只含有三個(gè)抗原特異性高 變區(qū)的一半的Fv)仍能夠識(shí)別和結(jié)合抗原，雖然比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和性 低。Fab片段也含有輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab' 片段與Fab片段的不同在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多了幾個(gè)氨基酸 殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH在本文中指 代Fab'，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基至少攜帶一個(gè)游離的硫基。最 初的F(ab')2抗體片段以Fab'片段對(duì)產(chǎn)生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。其他 的抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)也是公知的。
來自任一脊推動(dòng)物的抗體的"輕鏈"都可以歸于兩種截然不同的所 謂k和入鏈中的一種，k和入鏈的分類基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。 "單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域，其中 這些結(jié)構(gòu)域存在于單一的多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含VH和VL 結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接子，使scFv形成適于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv 的綜述參見Pliickthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(單克 隆抗體藥理學(xué))，vol. 113, Rosenburg and Moore eds.， Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。
術(shù)語"雙功能抗體(Diabodies)"指帶有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體 片段，其在相同多肽鏈上(VH-VO含有與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VO結(jié)合的重鏈 可變結(jié)構(gòu)域(VH)。使用連接子，該連接子過短不能在同一條鏈上使兩個(gè)結(jié) 構(gòu)域成對(duì)，這些結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此產(chǎn)生 了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如在EP 404,097; WO 93/11161;和Hollinger " a/.，尸rac. A^/Jcad 90:6444-6448 (1993)中對(duì)于雙功能抗體作了
更詳細(xì)的描述。
"分離"抗體是指從其天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或恢復(fù)的抗 體。其天然環(huán)境下的污染成分是指干擾抗體診斷或治療性用途的物質(zhì)， 可能包括酶、激素和其它的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。因?yàn)榭贵w的天然環(huán) 境中的至少 一種組分將不存在，所以分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)部的原位
抗體。但是，通常分離抗體會(huì)經(jīng)過至少一步的純化步驟來制備。
"結(jié)合"目的抗原(例如，CD59抗原)的抗體是指能夠?qū)υ摽乖谐?分親和力的抗體，以致該抗體在靶向表達(dá)該抗原的細(xì)^^時(shí)，可以作為治 療或診斷試劑。如果抗體是結(jié)合CD59的抗體，那么它通常會(huì)優(yōu)先結(jié)合 CD59,而不是其它受體，這不包括偶然的結(jié)合，諸如非特異性的Fc接 觸或與其他抗原共有的翻譯后修飾成分結(jié)合，該抗體不會(huì)與其他蛋白有 明顯的相互作用。檢測(cè)與目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知 的，可包括但并不局限于諸如FACS、細(xì)胞ELISA和Western印跡等分 析。
如本文使用的，"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"的表述可以交替 使用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由于人為的或非人為 的突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相同。在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi) 篩選的有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代包括在內(nèi)。在上下文中，將 清楚地有意使用不同的指代。
"治療"既指治療性處理，也指預(yù)防性或防止的措施，其目的就是 預(yù)防或減緩(減輕)靶向的病理狀態(tài)或病癥。需要治療的個(gè)體不僅包括那些 將發(fā)展為該病癥的或欲對(duì)其病癥進(jìn)行預(yù)防的個(gè)體，還包括那些已經(jīng)存在 所述病癥的個(gè)體。因此，本文中欲被治療的哺乳動(dòng)物可已經(jīng)祐 珍斷為患 有該病癥或可傾向于或易感于該病癥。
術(shù)語"癌癥"和"癌性"是指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)，其典型特 征是細(xì)胞生長或死亡不受調(diào)控。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、 胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或、淋巴惡性腫瘤。這些腫瘤更多具體的實(shí)例包 括鱗狀細(xì)胞癌(例如鱗狀上皮細(xì)胞癌)，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、 肺的腺癌和肺的鱗狀癌的肺癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，包括胃腸道癌的胃 癌，胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌癥，膀胱癌，肝 細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌， 唾液腺胂瘤，腎癌，前列腺癌，外陰腫瘤，曱狀腺癌，肝癌，肛癌，陰 莖癌，還有頭頸部癌。
"化療劑"是可用于癌癥治療的化合物。化療劑的實(shí)例包括諸如 p塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化劑；例如白消安(busulfan)、英丙
舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯類；如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替旅(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa)的氮丙 啶類；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基石舞酰胺、 三亞乙基硫代磷酰胺和三曱基奧羅蜜胺(trimethylolomelamine)在內(nèi)的乙 烯亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamine);如瘤可寧 (chlorambucil),萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、 苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀(uracil mustard) 等氮芥類藥物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、 雷莫司汀等硝脲類(nitrosureas);如阿克拉霉素類、放線菌素、安曲霉素、 重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加里剎霉素、洋紅霉素、碳霉素 (carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托咪定、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依達(dá)比星、 麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、灰霉素、 potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、 殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星類的抗生素；曱氨碟呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)類抗代謝類藥；如二曱葉酸、氨甲喋呤、蝶羅呤、三甲 曲沙等葉酸擬似物；如氟達(dá)拉濱、6-巰噪呤、硫米噤呤、硫鳥噪呤類噤呤 類似物；如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫 氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；如卡魯 睪酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯酮等男性激素類藥 物；如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物；如亞葉酸等葉 酸補(bǔ)充物；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苦；氨基乙酰丙酸；安吖啶； bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟烏 氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥；吡 柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；鍺螺 胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地 辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖香("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素，
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)和多西他賽(泰素帝， Aventis， Rhone-Poulenc Rorer， Antony, Fmnce)等紫杉烷類；苯丁酸氮芥； 吉西他濱；6-硫鳥噤呤；巰嘌呤；曱氨蝶呤；如順鉑和卡鉑等鉑類似物； 長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌； 長春新堿；長春瑞濱；去曱長春堿；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；柔 紅霉素；氨蝶呤鈉；希羅達(dá)；伊班膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟曱基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；espemmicins;卡培他濱；以及 上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì) 腫瘤作用的抗激素類藥物也包括在本定義內(nèi)，像抗雌激素藥物，例如， 包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、 曲沃昔芬、雷諾昔芬、LY117018、奧那司酮、托瑞米芬(法樂通)；抗雄激 素物質(zhì)，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；以 及上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"指任何一種可歸于哺乳類的動(dòng)物，包 括人類、小鼠、免疫缺陷鼠或棵鼠或品系小鼠、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物及動(dòng)物 園內(nèi)的動(dòng)物、體育動(dòng)物或?qū)櫸?，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選 地，本文的哺乳動(dòng)物指人類。
"寡核苷酸"指短長度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核苷酸，其可利用已 知的方法化學(xué)合成(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學(xué)，利用例如 發(fā)表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相技術(shù)；或利用Froehler a a/, Wwc/.爿c/A i es.， 14:5399-5407, 1986描述的脫氧核苷H-磷酸鹽中間 物)，然后用聚丙烯酰胺凝膠純化。
除非另外指出，當(dāng)在本文使用時(shí)，術(shù)語"CD59"是指哺乳動(dòng)物糖基 磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的膜糖蛋白，其還稱為MEM-43抗原，反應(yīng)性裂解 的膜抑制劑(MIRL), H19,膜攻擊復(fù)合物-抑制因子(MACIF),分子量 20,000的同源限制因子(HRF20)和保護(hù)素(Walsh， Tone " a/. 1992)。
"嵌合"抗體指免疫球蛋白，其部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定種 屬或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)鏈上 余下序列與來源于另一種屬或?qū)儆诹硪环N類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列相 同或同源，此外還指這些抗體的片段，只要這些片段能夠表現(xiàn)出所需的
生物活性(美國專利4,816,567和Morrison e a/,A^/.C/&4， 81 :6851 -6855 (1984》。
非人類(例如鼠科)抗體的"人源化，，形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv, Fab, Fab', F(ab)2或抗體的其他抗原結(jié)合 序列)，其包含來源自非人免疫球蛋白的最小序列。在絕大多數(shù)情況下， 人源化抗體是人的免疫球蛋白(受者抗體)，其中，所述受者抗體的互補(bǔ)決 定區(qū)(CDR)的殘基^C諸如具有所需的特異性、親和力、能力的小鼠、大鼠 或兔等的非人類抗體(供者抗體)的CDR的殘基所替代。在一些情況下， 人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類FR殘基所替代。 此夕卜，人源化抗體可以包括既不在受者抗體也不在引入的CDR或FR序 列的殘基。這些修飾進(jìn)一步改善和優(yōu)化了抗體的性能。通常，人源化抗 體包括至少一個(gè)，通常是兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部，其中全部或基本上 全部的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，且全部或基本上全部 的FR殘基是人類免疫球蛋白共有序列的FR殘基。人源化抗體也最適宜 包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人類免疫球蛋白的恒定 區(qū)。
"脫免疫化"抗體是對(duì)給定的物種沒有免疫原性或免疫原性較差的 免疫球蛋白。通過改造抗體的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)脫免疫化。任何本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的脫免疫化技術(shù)都可以使用。例如，在發(fā)表于2000年6月15 日的WO 00/34317中，描述了 一項(xiàng)使抗體脫免疫原性的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。
"同源性"被定義為比對(duì)序列和必要時(shí)引入間隔，以實(shí)現(xiàn)最大百分 比同源性后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分比。用于比對(duì)的方法和 計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域公知的。
本說明書自始至終，將雜交瘤細(xì)胞系以及從其產(chǎn)生的分離的單克隆 抗體，通過其內(nèi)部命名而分別稱作10A304.7或AR36A36.il.1，或者通過 保藏命名，分別稱作ATCC PTA-5065或IDAC 280104-02。
本文使用的"配體，，包含對(duì)靶抗原顯示結(jié)合特異性的部分，其可以 是完整的抗體分子和至少具有抗原結(jié)合區(qū)或者其部分(即，抗體分子的可 變部分)的任意分子，例如，F(xiàn)v分子，F(xiàn)ab分子，F(xiàn)ab'分子，F(xiàn)(ab'》分子， 雙特異抗體，融合蛋白，或者任意遺傳工程化分子，所述分子特異識(shí)別
并結(jié)合與分離的單克隆抗體結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體由命名為ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02 (ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02 抗原)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
本文使用的"抗原結(jié)合區(qū)"表示識(shí)別靶抗原的分子的部分。 本文使用的"竟?fàn)幮砸种?表示能夠識(shí)別并結(jié)合決定簇位點(diǎn)，在常 規(guī)抗體相互竟?fàn)幏治鲋?，由命名為ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02 的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗體)4十對(duì)所述決定蔟位點(diǎn)(Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973)， Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟?fàn)幒蛫A心法的甲胎蛋白的酶聯(lián)免疫測(cè)定). Clinica Chimica Acta 48, 15)。
本文使用的"靶抗原，，是ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗 原或者其部分。
如本文所用，"免疫偶聯(lián)物，，指以化學(xué)或生物學(xué)方式與細(xì)胞毒素、放 射性試劑、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療劑結(jié)合的諸如抗體的任何分子或 配體。該抗體可以在所述分子的任一部位與細(xì)胞毒素、》文射性試劑、抗 腫瘤藥或治療劑連接，只要它能夠與其靶標(biāo)結(jié)合。免疫偶聯(lián)物的實(shí)例包 括抗體毒素化學(xué)偶聯(lián)物和抗體-毒素融合蛋白。
如本文所用，"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其中，抗原結(jié)合區(qū)與例 如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。
為了更充分理解本文中描述的發(fā)明，進(jìn)行下述說明。
本發(fā)明提供配體(即，ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02配體)， 其特異識(shí)別并結(jié)合ATCC PTA- 5065或者IDAC 280104-02抗原。
本發(fā)明的配體可以采用任何形式，只要它具有抗原結(jié)合區(qū)，所述抗 原結(jié)合區(qū)竟?fàn)幮砸种齐s交瘤ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02產(chǎn)生 的單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異結(jié)合。因此，與ATCC PTA-5065或 者IDAC 280104-02抗體具有相同結(jié)合特異性的任意重組蛋白(例如，融合 蛋白，其中所述抗體與諸如淋巴因子或者腫瘤抑制生長因子的另一蛋白 結(jié)合)也屬于本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述配體是ATCC PTA-5065或者IDAC280104-02抗體。
在其他實(shí)施方案中，所述配體是抗原結(jié)合片段，其可以是具有ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗體的抗原-結(jié)合區(qū)的Fv分子(例如單鏈 Fv分子)，F(xiàn)ab分子，F(xiàn)ab'分子，F(xiàn)(ab')2分子，融合蛋白，雙特異抗體，異種抗 體或者任意重組分子。本發(fā)明的配體針對(duì)ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02單克隆抗體針對(duì)的表位。
本發(fā)明的配體可以被修飾，即，通過分子內(nèi)的氨基酸修飾，從而產(chǎn) 生衍生物分子?；瘜W(xué)修飾也是可能的。
衍生物分子將保留所述多肽的功能性性質(zhì)，即，具有這類取代的分 子將仍然允許所述多肽與ATCC PTA-5065或者IDAC 280104-02抗原或 者其部分結(jié)合。
這些氨基酸取代包括在本領(lǐng)域中公知的"保守"氨基酸取代，但并 不局限于此。
舉例來說，某些被稱為"保守氨基酸取代"的氨基酸取代能夠在蛋 白中經(jīng)常出現(xiàn)，但并不改變?cè)摰鞍椎臉?gòu)象或功能，這是蛋白質(zhì)化學(xué)中已 建立的法則。
這些改變包括任一異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)取代任何其他 的疏水氨基酸；天門冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q) 取代天冬酰胺(N),反之亦然；以及絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T),反之亦然。 其他的取代也可被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境和其在蛋 白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可經(jīng)?；Q，丙氨 酸和纈氨酸(V)也是。相對(duì)疏水的曱硫氨酸(M)可經(jīng)常與亮氨酸和異亮氨 酸互換，有時(shí)與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)?；Q，其發(fā)生部 位氨基酸殘基的明顯特征是其帶電，這兩種氨基酸殘基的不同pK的差別 并不明顯。在特定情境下，仍有其他的一些變化可以凈皮認(rèn)為是"保守的"。
給定一種抗體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以生成竟?fàn)幮砸种婆潴w，例 如竟?fàn)幮钥贵w，其可識(shí)別相同的表位(Belanger W a/., 1973)。 一種方法是 用表達(dá)該抗體識(shí)別抗原的免疫原產(chǎn)生免疫。該樣品可以包括組織、分離 的蛋白或細(xì)胞系，但并不局限于這些?？梢杂镁?fàn)幮苑治龊Y選產(chǎn)生的雜 交瘤，該分析能鑒定抑制所檢測(cè)抗體結(jié)合的抗體，所述分析例如ELISA、
FACS或免疫沉淀。另一種方法可以利用噬菌體展示文庫，淘選識(shí)別所述 抗原的抗體(Rubinstein^a/., 2003)。在任一情況下，雜交瘤的選擇都是基 于它們的竟?fàn)庍^原抗體與其靶抗原的結(jié)合的能力。因此，這些雜交瘤的 特征是識(shí)別與所述原抗體相同的抗原，并且這些雜交瘤將更為特異地識(shí) 別同樣的表位。
實(shí)施例1
體外細(xì)胞毒性
通過在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville, ON)中培養(yǎng)雜交瘤來產(chǎn) 生10A304.7單克隆抗體，每周兩次收集和再接種。然后是利用蛋白G瓊 月旨并唐凝月交4速力充(Protein G Sepharose 4 Fast Flow)(Amersham Biosciences, Baied'Urft，QC)的標(biāo)準(zhǔn)抗體純化操作。利用人源化、嵌合或者鼠的單克隆 抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
細(xì)胞毒性分析中，10A304.7與大量陽性(抗-EGFR抗體(C225, IgGl, k， 5微克/mL， Cedarlane， Homby， ON;抗-FAS， IgM， k, 10微克/mL, eBiosciences, San Diego, CA)、放線菌酮(CHX, 0.5微摩爾，Sigma， Oakville， ON)和NaN3 (0.1%， Sigma, Oakville, ON))對(duì)照，和陰性同種型對(duì)照 8B1B.1(抗藍(lán)舌病病毒，內(nèi)部純化)，以及緩沖液稀釋對(duì)照進(jìn)行比較(圖1)。 在兩種胰腺癌細(xì)胞系(BxPC-3,PL45)中評(píng)定1(H敖克/mL的10A304.7和同 種型對(duì)照抗體。兩種細(xì)胞系均獲自ATCC (Manassas, VA)。鈣黃綠素AM 獲自Molecular Probes (Eugene, OR)。 4安照下面列出的變化根據(jù)制造商的 說明書進(jìn)行分析。所述分析前將細(xì)胞以預(yù)定的合適密度進(jìn)行接種。2天后， 將100微升純化的抗體或者對(duì)照稀釋進(jìn)培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移到所述細(xì)胞板， 在5%032培養(yǎng)箱中孵育5天。然后將板翻轉(zhuǎn)倒空，吸干。通過多通道擠 瓶將室溫下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每個(gè)孔中，敲3次，翻轉(zhuǎn)倒 空，然后吸干。將用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的50微升熒光4丐 黃綠素染料添加到每個(gè)孔中，在5% C02培養(yǎng)箱中37°C孵育30分鐘。 Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板機(jī)讀板，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析， 結(jié)果列表于圖1。每種抗體得到5至50的分?jǐn)?shù)，其基于按一式三份測(cè)試 的4個(gè)實(shí)驗(yàn)所觀察到的平均細(xì)胞毒性，以及得到25至100的分?jǐn)?shù)，其基
于分析間所觀察到的可變性。這兩種分?jǐn)?shù)(細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù))的總和顯示于圖
1。大于或者等于55的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)被認(rèn)為對(duì)所測(cè)試細(xì)胞系是陽性的。 如美國專利6，794，494先前公開的，10A304.7對(duì)BxPC-3細(xì)胞系沒有細(xì)胞 毒作用。發(fā)現(xiàn)10A304.7抗體對(duì)胰腺PL45細(xì)胞系具有特異的細(xì)胞毒性， 超過緩沖液和同種型陰性對(duì)照。緩沖液顯示沒有可測(cè)量的細(xì)胞毒性。在 該特定實(shí)驗(yàn)中，8B1B.1同種型對(duì)照顯示比正常更高的抗PL45細(xì)胞系的 細(xì)胞毒性，這可能是生物分析固有的可變性的函數(shù)。盡管所述同種型對(duì) 照的作用高，但在各實(shí)驗(yàn)中10A304.7獲得的結(jié)果始終更高。這些結(jié)果證 明10A304.7具有功能特異性，可以靶向于源自人胰腺癌的癌細(xì)胞。
實(shí)施例2
通過Western印跡對(duì)結(jié)合蛋白的鑒定
為了鑒定抗體10A304.7和AR36A36.11.1識(shí)別的抗原，將表達(dá)該抗 原的細(xì)胞膜進(jìn)行凝月交電泳并利用Western印跡轉(zhuǎn)移到膜上以確定這些抗 體結(jié)合的蛋白。 1.膜制備
先前的工作證明10A304.7和AR36A36.il.1均顯示抗乳腺癌的效果， 如在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠中作為異種移植物生長的細(xì)胞系 MDA-MB-231 (MB-231)所例證。因此，MB-231膜制品用于抗原鑒定。 從MB-231細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物制備總細(xì)胞膜。從細(xì)胞團(tuán)去除培養(yǎng)基，并 用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗所述細(xì)胞。在平臺(tái)振蕩器上用解離緩沖液 (Gibco-BRL， Grand Island, NY)37。C解離細(xì)胞20分鐘。收集細(xì)胞，并在4。C 900 g離心10分鐘。離心后，用PBS重懸細(xì)胞沉淀，在4。C用900 g再 離心10分鐘以清洗。倒出上清，沉淀保存于-80。C。細(xì)胞沉淀以每克細(xì) 胞3 mL緩沖液的比例重懸于勻漿緩沖液中，所述緩沖液包含每50 mL 1 片的完全蛋白酶抑制劑雞尾酒混合物(Roche, Laval QC)。在水上利用 polytron勻漿器對(duì)所述細(xì)胞懸液進(jìn)行勻漿以^更裂解細(xì)胞。細(xì)胞勻漿在4。C 15,000 g離心10分鐘以去除核微粒。收集上清，分到各管中，然后在4。C 75,600 g離心90分鐘。從所述管小心去除上清，每一膜沉淀重懸于大約 5 mL勻漿緩沖液中。將來自所有管的重懸沉淀合并到1個(gè)管中，然后在
4。C 75,600 g離心90分鐘。小心從管中去除上清，稱重沉淀。向所述沉 淀中添加包含1% Triton X-100的增溶緩沖液，比例為每克膜沉淀3 mL 緩沖液。通過在冰上用平臺(tái)振蕩器在300rpm振動(dòng)1小時(shí)來溶解膜。將所 述膜溶液在75,600 g離心以沉淀不溶性物質(zhì)。從管中小心去除包含溶解 膜蛋白的上清，分析其蛋白含量，并于-80。C保存。 2. Western印跡
通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜蛋白。20微克MB-231膜蛋白 與非還原SDS-PAGE樣品緩沖液混合， 一式兩份上樣于4%-20%梯度 SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad， Mississauga, ON)的泳道中。在參照泳道跑未染 色分子量標(biāo)志物的樣品(Invitrogen, Burlington, ON)。電泳在100 V進(jìn)行10 分鐘，然后在150 V進(jìn)行直到樣品緩沖液的染料前沿跑出凝膠。通過在 40 V電印跡16小時(shí)將蛋白從所述凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore, Billerica, MA)。轉(zhuǎn)移后，在用溶于包含0.5%吐溫-20的Tris-緩沖鹽水(TBST)中的 5%脫脂乳將膜封閉1小時(shí)。用TBST清洗膜3次，然后與稀釋在含有5% 脫脂乳的TBST中的5微克/mL 10A304.7或者5微克/mL AR36A36.il.1 孵育2小時(shí)。用TBST清洗3次后，將膜與來自Jackson Immunologicals(West Grove PA)的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗小 鼠IgG(Fc)孵育。該孵育后用TBST清洗3次，隨后與ECL Plus western 檢測(cè)試劑(Amersham Biosciences, Baie d'Urf6， QC)孵育。將印跡暴露于化 學(xué)發(fā)光膠片(Kodak， Cedex, France),利用X射線醫(yī)療處理機(jī)顯影。
圖2顯示AR36A36.11.1(欄A)和10A304.7(欄B)在膜的較低區(qū)域強(qiáng)烈 結(jié)合蛋白。與分子量標(biāo)準(zhǔn)相比，所述抗體結(jié)合大約20kDa的蛋白。兩種 抗體以類似的模式結(jié)合MB-231膜。
實(shí)施例3
與AR36A36.il.1和10A304.7結(jié)合的抗原的交叉免疫沉淀和去糖基化
為了確定與10A304.7和AR36A36.il.1結(jié)合的抗原是否相同，將 MB-231膜與兩種抗體進(jìn)行交叉免疫沉淀。包括合適的同種型對(duì)照(對(duì)于 IgGh是8A3B.6, AR36A36.il.1的同種型，以及對(duì)于IgG2b是8B1B.1, 10A304.7的同種型)以確保任意反應(yīng)性對(duì)功能性抗體均是特異的。
1. 免疫沉淀
用0.1 M磷酸鈉，pH 6.0將200微克的每種抗體稀釋到1 mL。用1 mL 0.1 M， pH 6.0磷酸鈉清洗每種抗體的100微升蛋白G瓊脂糖凝膠珠 (Amersham Biosciences, Baie d'Urft, QC)3次。向等份試樣的珠添加稀釋的 抗體，在室溫下通過旋轉(zhuǎn)混合孵育1小時(shí)。通過在微量離心機(jī)以14,000 rpm旋轉(zhuǎn)20秒，然后吸出上清，來去除未結(jié)合的抗體。用lmL0.1M磷 酸鈉，pH 7.4清洗抗體包被的珠3次，然后用1 mL 0.2 M三乙醇胺，pH 8.2清洗2次。用lmL0.2M三乙醇胺，pH 8.2重懸所述抗體結(jié)合的珠， 然后通過添加5.2mg二曱基庚二亞胺(Sigma, Oakville， ON)并通過旋轉(zhuǎn) 混合孵育1小時(shí)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。用1.5 mL 50 mM Tris, pH 7.5洗滌抗體 交聯(lián)的珠一次，然后在室溫下與1 mL 50 mM Tris， pH 7.5通過旋轉(zhuǎn)混合 孵育30分鐘。用PBS清洗所述珠3次，然后重懸于100微升包含0.02% 疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液中，并于4°C保存。
利用如上所述的偶聯(lián)珠，使用4種抗體中的每一種用于和MB-231 膜進(jìn)行免疫沉淀，所述4種抗體即AR36A36.il.1、 10A304.7、 8A3B.6和 8B1B丄對(duì)于每種抗體，用普通裂解緩沖液(50mMTris,pH7.4， 150mM 氯化鈉，2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 50 mM氟化鈉，2 mM原釩酸鈉和 lx蛋白酶抑制劑雞尾酒混合物)將200微克MB-231膜制品稀釋到1 mL。 對(duì)于每種抗體，向稀釋的MB-231膜中添加50微克抗體-偶聯(lián)珠，通過旋 轉(zhuǎn)翻滾在4。C孵育2小時(shí)。免疫復(fù)合物結(jié)合的珠用普通裂解緩沖液清洗3 次，用PBS清洗1次。用磷酸鹽緩沖液重懸免疫復(fù)合物結(jié)合的珠，并保 存于4。C以備隨時(shí)使用。
2. 去糖基化
為了測(cè)試石友水化合物基團(tuán)對(duì)AR36A36.il.1和10A304.7的抗原結(jié)合 的作用，MB-231膜被去糖基化。按照制造商的說明書，100微克MB-231 膜與來自GLYKO酶消化試劑盒(ProZyme， San Leandro, CA)的PNGase F、 唾液酸酶A、 o-聚糖酶、/3(l-4)半乳糖苷酶和/3-N-乙酰葡糖胺糖苷酶在非 還原條件下孵育。另外100微克等份試樣的MB-231膜只與去糖基化緩 沖液孵育，以作為糖基化對(duì)照反應(yīng)。
3. Western印跡
10A304.7、 AR36A36.il.1、 IgG2a同種型和IgG2b同種型免疫沉淀的 MB-231膜以及糖基化和去糖基化的MB-231膜，與非還原性SDS-PAGE 樣品緩沖液合并，并上樣于一式四份的12% SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad, Mississauga, ON)。未染色的分子量標(biāo)志物上樣于參照泳道。膜通過 SDS-PAGE分離，然后是如實(shí)施例2所述的Western印跡。圖3顯示 10A304.7(欄A)、 AR36A36.11.1(欄B)、 IgGh同種型對(duì)照(欄C)和IgG2b 同種型對(duì)照(欄D)與用10304.7免疫沉淀的MB-231膜(道1)、用 AR36A36.il.1免疫沉淀的MB-231膜(道2)、用IgG2a同種型對(duì)照免疫沉 淀的MB-231膜(道3)、用IgG2b同種型對(duì)照免疫沉淀的MB-231膜(道4)、 MB-231糖基化膜(道5)和MB-231去糖基化膜(道6)的結(jié)合。在所有泳道 欄A和欄B具有相同的結(jié)合，表明AR36A36.il.1和10A304.7識(shí)別相同 的抗原。只有在利用10A304.7和AR36A36.il.l作為探針的時(shí)候(分別為 欄A和欄B)，用10A304.7和AR36A36.11.1免疫沉淀的MB-231膜20 kDa 區(qū)域(分別為道1和道2)才出現(xiàn)大的彌散，而利用同種型對(duì)照作為探針時(shí) (欄C和欄D)不出現(xiàn)，表明該區(qū)域的結(jié)合對(duì)功能性抗體是特異的。當(dāng) MB-231膜與同種型對(duì)照免疫沉淀時(shí)(道3和道4)，在所述20kDa區(qū)域沒 有反應(yīng)性，進(jìn)一步說明功能性抗體對(duì)抗原的特異性。10A304.7和 AR36A36.il.1均在糖基化MB-231膜的20 kDa區(qū)域結(jié)合雙條帶(道5)。 當(dāng)所述膜被去糖基化時(shí)(道6)，存在反應(yīng)性的改變，表明所述抗原是糖基 化的，但所述碳水化合物基團(tuán)不是抗原結(jié)合必需的。
實(shí)施例4
10A304.7和AR36A36.il.1結(jié)合抗原的鑒定 1.免疫沉淀
通過免疫沉淀從MB-231細(xì)胞分離AR36A36.il.1結(jié)合的抗原。根據(jù) 實(shí)施例3公開的相同操作，相應(yīng)地放大比例，將l mL蛋白G瓊脂糖凝 月交(Amersham Bioscience, Baie d'Urft， QC)與2 mg 4元體進(jìn)4亍交聯(lián)。 AR36A36.11.1和8A3B.6均進(jìn)4亍交聯(lián)。
用RIPA緩沖液(50 mM Tris-HCl， pH 7.4， 150 mM NaCl， 1% NP-40, 0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS, 2 mM原釩酸鈉和lx蛋白酶抑制劑雞尾酒
混合物)將10 mg等份試樣的MB-231稀釋到10 mL。添加3 mL瓊脂糖凝 膠4B(Sigma， Oakville, ON)，在4。C通過旋轉(zhuǎn)翻滾孵育2小時(shí)。60微升的 兩種抗體-偶聯(lián)珠與稀釋在0.1 M NaH2P04, pH 7.4的0.5 mg/mL BSA在 4°C通過旋轉(zhuǎn)翻滾共孵育2小時(shí)。用RIPA緩沖液清洗抗體-偶聯(lián)的珠兩次， 然后排出。對(duì)于免疫沉淀，將預(yù)澄清的MB-231膜從瓊脂糖凝膠4B珠去 除并添加到8A3B.6-偶聯(lián)珠，在4。C通過旋轉(zhuǎn)翻滾孵育2小時(shí)。與同種型 對(duì)照孵育后，稀釋的膜制品與AR36A36.11.1-偶聯(lián)珠在4。C通過旋轉(zhuǎn)翻滾 孵育2小時(shí)。然后兩等份試樣的珠用RIPA緩沖液清洗兩次，用PBS清 洗一次。
2. SDS-PAGE
免疫沉淀的珠重懸于30微升SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸3分鐘， 然后冷卻到室溫。將21微升所述樣品上樣于12% SDS-PAGE凝膠 (Bio-Rad， Mississauga， ON)的一個(gè)泳道。剩余的7微升上樣于另 一泳道。 凝膠中還包括蛋白標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)染的分子量標(biāo)志物(Invitrogen, Burlington, 0N)。凝膠在100 V跑10分鐘，然后在150 V進(jìn)行直到先導(dǎo)染料前沿跑 出凝膠。凝膠沿著上樣預(yù)染分子量標(biāo)志物的泳道進(jìn)行切割。上樣21微升 的凝膠部分用膠體藍(lán)染色，凝膠另一部分轉(zhuǎn)移到PVDF膜用于和 AR36A36.il.1的Western印跡，所述印跡按照實(shí)施例2 7>開的|乘作。
按照制造商的說明書制備膠體藍(lán)染色劑(Invitrogen, Burlington, 0N)， 將所述凝膠在室溫下于所述染料中振搖孵育過夜。將凝膠在水中孵育2 小時(shí)以去除背景染色。圖4顯示與AR36A36.11.1(道l)和8A3B.6 IgG2a 同種型對(duì)照(道2)免疫沉淀的MB-231膜。染色凝膠20kDa處的弱雙條帶 (欄A，道l)對(duì)應(yīng)于Western印跡(欄B，道l)中觀察到的反應(yīng)性。利用無 菌玻璃巴斯德移液管從染色凝膠提取這兩條帶，以及在凝膠上來自道2 的相應(yīng)區(qū)域和用于背景對(duì)照而沒有上樣蛋白的區(qū)域。
3. 質(zhì)譜分析
利用凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化試劑盒(Pierce， Rockford, IL)消化提取的凝 膠塊。每種樣品的一部分點(diǎn)樣于利用CHCA基質(zhì)的H4蛋白芯片陣列 (Ciphergen， Freemont， CA)。利用蛋白芯片軟件(Ciphergen)在Ciphergen SELDI/MS上分析所述陣列芯片。來自AR36A36.il.1免疫沉淀物的雙條
帶的底部條帶的獨(dú)特肽峰值是1540.6 Da、 1649.6 Da、 1741.6 Da、 1778.1 Da和2015.2 Da。利用ProFound肽圖數(shù)據(jù)庫(Rockefeller University), CD59 被鑒定為這些肽的來源，其可能性為1.00,估算的Z值為1.92。 CD59包 含肽1539。6Da、 1648.6 Da和2014.1 Da。 4.確認(rèn)
為了證實(shí)AR36A36.il.1和10A304.7識(shí)別的抗原是CD59,將MB-231 膜與商業(yè)研究的抗CD59抗體進(jìn)行交叉免疫沉淀。按照實(shí)施例3的描述， 50微克小鼠抗人CD59克隆MEM-43(IgG2a)(Serotec， Raleigh, NC)與25微 升蛋白G瓊脂糖凝膠珠進(jìn)行交聯(lián)。按照實(shí)施例3的描述，3個(gè)150微克 等份試樣的MB-231膜與25微升偶聯(lián)抗CD59、 AR36A36.11.1或者8A3B.6 IgG^同種型對(duì)照的珠進(jìn)行免疫沉淀。將所述珠重懸于45微升PBS,然后 添加15微升SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸樣品3分鐘。冷卻到室溫后， 將樣品以每孔15孩i:升上樣至4%-20% SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad, Mississauga, ON)中。如上所述進(jìn)行電泳和Western印跡。將所述膜與稀 釋于5%脫脂乳的3.33微克/mL抗CD59(MEM-43) 、 5微克/mL AR36A36.il.1 、 5微克/mL 10A304.7或者5微克/mL 8A3B.6 IgG2a同種型 對(duì)照孵育2小時(shí)。圖5顯示用10A304.7(欄A)、 AR36A36,1U(欄B)、小 鼠抗人CD59(MEM-43，欄C)和IgG2a同種型對(duì)照(8A3B.6，欄D)作為探 針，與小鼠抗人CD59(MEM-43,道1)、 AR36A36.1U(道2)和IgG2a同種 型對(duì)照(8A3B.6，道3)免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。 當(dāng)所述膜用同種型對(duì)照作為探針時(shí)(欄D)在更高的分子量區(qū)域出現(xiàn)反應(yīng) 性，因此被認(rèn)為是背景。與10A304.7(欄A)、 AR36A36.1U(欄B)和抗 CD59(欄C)孵育的印跡在所有3條泳道中均具有相同的染色；小分子量 條帶特異地與用AR36A36.il.1和抗CD59免疫沉淀的膜反應(yīng)。這證實(shí)了 10A304.7和AR36A36.il.1識(shí)別的抗原是CD59。
實(shí)施例5
正常人組織染色
進(jìn)行IHC研究以表征10A304.7和AR36A36.11.1抗原在人的分布。 此前進(jìn)行IHC優(yōu)化研究以便確定進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的條件。 組織切片在58°C烘箱中干燥1小時(shí)脫蠟，通過將組織切片5次浸泡 于染色缸中的二曱苯進(jìn)行脫蠟，每次4分鐘。經(jīng)過一系列梯度乙醇清洗 (100%-75%)處理后，切片在水中重新水合。將載玻片浸泡于pH 6的10 mM檸檬酸鹽緩沖液(Dako， Toronto, Ontario)中，隨后用高、中、低能 量設(shè)置的微波分別照射載玻片5分鐘并最終將其浸沒在冷的PBS中。隨 后將載玻片浸沒在3 %的過氧化氫溶液中6分鐘，用PBS清洗3次，每 次5分鐘，干燥，并在室溫將載玻片用通用封閉液(Dako， Toronto, Ontario) 孵育5分鐘。用抗體稀釋緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)將10A304.7、 AR36A36.1U、單克隆小鼠抗波形蛋白(Dako， Toronto, Ontario)或同種 型對(duì)照抗體(把向黑曲霉(Aspergillus Niger)葡萄糖氧化酶，該酶在哺乳動(dòng) 物組織中不存在或無法誘導(dǎo)；Dako， Toronto, Ontario)稀釋至工作濃度(每 種抗體5 /xg/ml)并在室溫孵育1小時(shí)。用PBS清洗所述載玻片3次，每 次5分鐘。通過與提供的HRP偶聯(lián)二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)在室溫下30分鐘觀察/顯現(xiàn)一抗的免疫反應(yīng)性。在該步驟之后， 用PBS清洗所述載玻片3次，每次5分鐘，隨后加入DAB(3, 3，-二氨基 聯(lián)苯胺四鹽酸鹽，Dako, Toronto, Ontario)生色團(tuán)底物溶液以在室溫免疫 過氧化物酶染色10分鐘進(jìn)行顏色反應(yīng)。用自來水清洗所述載玻片以終止 生色反應(yīng)。用Meyer蘇木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)復(fù)染后， 將所述載玻片用梯度乙醇(75%-100%)脫水并用二甲苯清洗。用固定劑 (Dako Faramount, Toronto, Ontario)在所述載玻片上蓋上蓋玻片。使用 Axiovert 200(Ziess Canada, Toronto, ON)對(duì)載玻片進(jìn)行顯微檢查，使用 Northern Eclipse成像軟件(Mississauga， ON)獲取并存儲(chǔ)數(shù)字圖像。由組 織病理學(xué)家對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取、評(píng)分和解釋。
利用人正常器官組織陣列(Imgenex, San Diego， CA)對(duì)59個(gè)正常人組 織進(jìn)行抗體的結(jié)合。圖6顯示正常人組織陣列的10A304.7和 AR36A36.1U染色的結(jié)果概述。AR36A36.1U抗體大部分地結(jié)合上皮組 織(多種器官的血管內(nèi)皮，皮膚和扁桃體的鱗狀上皮，乳房導(dǎo)管上皮，鼻 粘膜上皮，唾液腺的腺泡和導(dǎo)管上皮，肝膽管上皮，胰腺的腺泡上皮和 朗格爾漢斯小島，膀胱粘膜上皮和前列腺的腺上皮)。10A304.7抗體顯示 結(jié)合脾淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，外周神經(jīng)纖維，血管平滑肌纖維，睪丸
的間質(zhì)(萊迪希)細(xì)胞和胎盤的滋養(yǎng)層組織。細(xì)胞定位是細(xì)胞質(zhì)和膜的，且 具有彌散染色模式。抗體大部分地結(jié)合上皮組織(皮膚的皮脂腺，乳房導(dǎo) 管上皮，鼻粘膜，唾液腺的腺泡和導(dǎo)管上皮，血管內(nèi)皮，膀胱粘膜上皮 以及前列腺的腺和肌上皮)。所述抗體還顯示結(jié)合平滑肌纖維和滋養(yǎng)層胎
盤組織。10A304.7結(jié)合人正常組織的子集，所述組織顯示與AR36A36.il.1 的結(jié)合(圖7)。已經(jīng)證明10A304.7和AR36A36.il. 1抗體結(jié)合人組織，這 與先前關(guān)于抗CD59抗體的報(bào)告一致。因此，10A304.7和AR36A36.il.1 抗體可適用于人。
實(shí)施例6
人肺瘤組織染色
為了確定10A304.7或者36A36.11.1抗原是否在人腫瘤組織中表達(dá)， 在多種人腫瘤組織陣列(Imgenex, San Diego， CA)上個(gè)體地測(cè)試所述抗體。 為每位患者提供下列信息年齡，性別，器官和診斷。使用的染色操作 與實(shí)施例5中公開的相同。使用與人正常組織陣列中所述相同的陽性和 陰性對(duì)照抗體。所有抗體在5微克/mL的工作濃度下使用。
如圖8所公開，AR36A36.11.1抗體與17/54(32%)的所測(cè)試肺瘤結(jié)合。 所述抗體與2/17的腫瘤強(qiáng)烈結(jié)合，與2/17中度結(jié)合，與4/17弱結(jié)合，以 及與9/17疑似結(jié)合。所述組織特異性是對(duì)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)血管。細(xì)胞定 位是膜細(xì)胞質(zhì)的，且具有彌散的染色模式。10A304.7抗體與9/54(17%) 的所測(cè)試腫瘤結(jié)合。所述抗體與4/54中度結(jié)合，與2/54弱結(jié)合，與3/54 疑似結(jié)合，與任意一種所測(cè)試腫瘤都不存在強(qiáng)烈結(jié)合。所述組織特異性 是對(duì)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)血管。細(xì)胞定位是膜細(xì)胞質(zhì)的，且具有彌散的染色 模式。就像和正常人組織那樣，10A304.7抗體與AR36A36.il.1結(jié)合的腫 瘤的子集結(jié)合。
因此，已經(jīng)證明10A304.7和AR36A36.il.1抗原位于多種腫瘤類型 的膜上。這些結(jié)果表明10A304.7和AR36A36.il.1抗體具有作為廣泛的 多種癌癥的治療性藥物的潛能，所述癌癥包括但不限于皮膚、肝(圖9)和 胰腺的癌癥。
實(shí)施例7
人肝腫瘤組織染色
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)10A304.7與人肝腫瘤組織的結(jié)合，在肝腫瘤組織陣 列(Imgenex, San Diego， CA)上測(cè)試抗體。為每位患者提供下列信息年齡， 性別，器官和診斷。使用的染色操作與實(shí)施例5中公開的相同。使用與 人正常組織陣列中所述相同的陰性對(duì)照抗體。使用的陽性對(duì)照抗體是抗 AFP(cd胎蛋白；克隆AFP-ll Abeam, Cambridge, MA)。所有抗體在5微: 克/mL的工作濃度使用，除了抗AFP在10微克/mL的工作濃度使用。
如圖IO所公開，10A304.7顯示與10/49(20%)肝癌切片的陽性結(jié)合， 且大部分地結(jié)合原發(fā)性肝細(xì)胞癌。原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性膽管癌均顯示與所述 抗體的50%結(jié)合。所述組織特異性是對(duì)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮。在所述抗 體的結(jié)合和腫瘤階段之間沒有關(guān)系。所述抗體顯示與1/9非腫瘤肝組織切 片的弱結(jié)合，且限于小血管的內(nèi)皮(圖11)。 10A304.7抗原看起來在肝腫 瘤組織中特異表達(dá)。10A304.7因此具有作為用于肝癌治療的治療性藥物 的潛能。
優(yōu)勢(shì)證據(jù)表明10A304.7和AR36A36.11.1通過CD59上呈現(xiàn)的表4立 的結(jié)合介導(dǎo)抗癌作用。在實(shí)施例2至4中已經(jīng)顯示，10A304.7和 AR36A36.il.1抗體可用于免疫沉淀來自諸如MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá) 細(xì)胞的關(guān)聯(lián)抗原。利用通過但不限于FACS、細(xì)胞ELISA或者IHC所說 明的技術(shù)，還可以顯示10A304.7和AR36A36.1U抗體可用于表達(dá)CD59 抗原部分的細(xì)胞和/或組織的檢測(cè)，所述抗原部分特異結(jié)合該抗體。
因此，利用FACS、細(xì)胞ELISA或者IHC分析，可以顯示免疫沉;定 的10A304.7和AR36A36.11.1抗原可以抑制任一抗體與這類細(xì)胞或者^L 織的結(jié)合。此外，就像和10A304.7和AR36A36.il.1抗體那樣，其他抗 CD59抗體可用于免疫沉淀和分離其他形式的CD59抗原，所述抗原也可 用于抑制這些抗體與表達(dá)該抗原的細(xì)胞或者組織的結(jié)合，其利用相同類 型的分析。
技術(shù)人員的水平。所有專利和公開出版物通過引用的方式并入本文，其 虧1用程度如同每個(gè)出版物被特別單獨(dú)地指明以引用的方式并入本文。
應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明以某種形式被說明，但這不是要將本發(fā)明限 定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易 見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可做出多種變化，本發(fā)明并 不局限于本說明書中所顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易看 出使本發(fā)明良好地適合實(shí)現(xiàn)所描述的目的并獲得最終結(jié)果和益處，以及 其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)化 合物、方法、操作和技術(shù)都是優(yōu)選實(shí)施方案中有代表性的，其目的在于 示例，并不是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠想到包括在本 發(fā)明精神的范疇內(nèi)的變化和其它用途，并由所附權(quán)利要求書的范圍所限 定。盡管借助特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所要求保 護(hù)的本發(fā)明并不僅僅局限于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，所描述的實(shí) 施本發(fā)明的 一些方式的的各種變化，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易 見的，均在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
ATCC
為專禾iJ禾呈序的微生物^f呆藏耳又^f尋國際7"P:i人的布達(dá)f風(fēng)斯條約
國P示表
才辰t居第7.3條發(fā)布的微生物〗呆藏"i正明"乂及 豐艮J居第10.2條發(fā)布的微生物存活聲明
(譯文)
致(保藏人或代理人名稱及地址)
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代理人Fort皿ata McConkey
55 York Street, Suite 1600
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(加拿大多倫多) 代表Arius Research Inc.(阿里烏斯研究公司)而保藏 保藏人標(biāo)識(shí)號(hào)
小鼠雜交瘤細(xì)胞系10A304.7
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在自保藏日起至少30年內(nèi)，或者在最近的樣品請(qǐng)求之后5年內(nèi)，該菌種將被維持， 所述時(shí)間以較K:者為準(zhǔn)。美國和其他很多國家都是布達(dá)佩斯條約成員國。
于2003年3月26閂檢測(cè)以上所引用培養(yǎng)物的存活。在當(dāng)天，所述培養(yǎng)物是存活的。
國際保藏機(jī)構(gòu)American Type Culture Collection(美國典型微生物保藏中心)， Manassas, VA20110-2209USA(美國弗吉尼亞) ATCC授權(quán)代表簽字
_ 日期2003年4月21日
Ferris Lander先生 巻號(hào)2056.000019
專利保藏指定 PTA-5065加拿大國際保藏機(jī)構(gòu)
加拿大衛(wèi)生部國立微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
馬尼托巴省溫尼伯市阿林頓街1015 R3E 3R2 加拿大_
國P示IDAC/BP/4表
微生物保藏證明(譯文)
(豐艮J居布達(dá)f風(fēng)斯條約第7.1條發(fā)布)
所附文件為原始保藏合同與活存聲明的副本
1、 國際保藏機(jī)構(gòu)接受了以下具體描述的微生物
保藏人姓名ARIUS Research Inc.(阿里烏斯研究公司)的Valerie Harris (哈里斯'瓦 萊麗)
地址55 York St.. 16th floor, Toronto, ONM5J 1R7(加拿大多倫多) 提交日期2004年1月28日
2、 保藏的標(biāo)識(shí)
保藏人對(duì)培養(yǎng)物指定的名稱和符號(hào)
AR36A36.11.1
由該國際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào): 280104-02
以上標(biāo)識(shí)的保藏附有
□科學(xué)性描述
□建議的分類指定
3、國際保藏機(jī)構(gòu)IDAC授權(quán)代表簽^ 日期2004年1月28日
電話(204)789-2070 傳真(204)789-2097
微生物保藏存活證明譯文
(根據(jù)布達(dá)佩斯條約第10.2條發(fā)布)
姓名Ferris Lander先生
地址2855 PGA Boulevard. Palm Beach Gardens. Florida, USA 33410
(美國佛羅里達(dá))
1. 保藏人
姓名ARIUS Research Inc.(阿里烏斯研究公司)的Valerie Harris (哈里斯'瓦萊麗) 地址55 York St., Toronto, ON M5J 1R7(加拿大多倫多)
2. 保藏標(biāo)識(shí)
由國際保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)280104-02 保藏日期(或最近相關(guān)日期)2004年1月28日
3. 存活檢測(cè)
于2004年2月23日對(duì)以上標(biāo)識(shí)的微生物進(jìn)行存活檢測(cè)， 在以上指出的日期，所述微生物
0存活
□不再存活
進(jìn)行存活檢測(cè)的條件(在巳請(qǐng)求該信息且檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)填寫)
4.國際保藏機(jī)構(gòu)授權(quán)代表簽字:
日期2004年2月23日
權(quán)利要求
1. 能夠特異結(jié)合人CD59的單克隆抗體或者配體，其中所述單克隆抗體或者其配體與和分離的單克隆抗體相同的人CD59的一個(gè)或多個(gè)表位反應(yīng)，所述分離的單克隆抗體獲自具有ATCC登錄號(hào)PTA-5065的雜交瘤細(xì)胞系10A304.7；所述單克隆抗體或者配體的特征在于具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗體與其人CD59靶抗原結(jié)合的能力。
2. 能夠特異結(jié)合人CD59的單克隆抗體或者配體，其中所述單克隆 抗體或者其配體與和分離的單克隆抗體相同的人CD59的一個(gè)或多個(gè)表 位反應(yīng)，所述分離的單克隆抗體獲自具有IDAC登錄號(hào)280104-02的雜交 瘤細(xì)胞系A(chǔ)R36A36.il.1;所述單克隆抗體或者配體的特征在于具有竟?fàn)?性抑制所述分離的單克隆抗體與其人CD59靶抗原結(jié)合的能力。
3. 識(shí)別與分離的單克隆抗體識(shí)別的表位相同的表位的單克隆抗體或 者配體，所述分離的單克隆抗體由選自具有ATCC登錄號(hào)PTA-5065的雜 交瘤細(xì)胞系10A304.7和具有IDAC登錄號(hào)280104-02的雜交瘤細(xì)月包系 AR36A36.il.1的雜交瘤產(chǎn)生；所述單克隆抗體或者配體的特征在于具有 竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其人CD59靶抗原結(jié)合的能力。
4. 治療表iiACD59抗原的人癌性腫瘤的方法，所述方法包括 對(duì)患有所述人癌癥的個(gè)體進(jìn)行至少一種單克隆抗體或者配體的給藥，所述單克隆抗體或者配體識(shí)別與分離的單克隆抗體識(shí)別的表位相同 的一個(gè)或多個(gè)表位，所述分離的單克隆抗體由選自具有ATCC登錄號(hào) PTA-5065的雜交瘤細(xì)胞系10A304.7和具有IDAC登錄號(hào)280104-02的雜 交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R36A36.il.1的雜交瘤產(chǎn)生；其中所述表位的結(jié)合可以有效降低腫瘤負(fù)荷。
5. 治療表itACD59抗原的人癌性腫瘤的方法，所述方法包括與至少 一種化療劑聯(lián)用；對(duì)患有所述人癌癥的個(gè)體進(jìn)行至少 一種單 克隆抗體或者配體的給藥，所述單克隆抗體或者配體識(shí)別與分離的單克 隆抗體識(shí)別的表位相同的 一個(gè)或多個(gè)表位，所述分離的單克隆抗體由選自具有ATCC登錄號(hào)PTA-5065的雜交瘤細(xì)胞系10A304.7和具有ID AC 登錄號(hào)280104-02的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R36A36.il.1的雜交瘤產(chǎn)生； 其中所述給藥可以有效P爭(zhēng)低腫瘤負(fù)荷。
6.確定選自人腫瘤的組織樣品中表達(dá)CD59表位的癌性細(xì)胞存在的 結(jié)合分析，所述分析包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供至少一種單克隆抗體或者配體，所述單克隆抗體或者配體識(shí)別 與分離的單克隆抗體識(shí)別的表位相同的 一個(gè)或多個(gè)表位，所述分離的單 克隆抗體由選自具有ATCC登錄號(hào)PTA-5065的雜交瘤細(xì)胞系10A304.7 和具有IDAC登錄號(hào)280104-02的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R36A36.il.1的雜交瘤 產(chǎn)生；將所述至少一種單克隆抗體或者其配體與所述組織樣品接觸；和確定所述至少一種單克隆抗體或者其配體與所述組織樣品的結(jié)合；從而指示所述癌性細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌性疾病的診斷和治療，尤其涉及顯示CD59表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的介導(dǎo)；最尤其涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)作為起始細(xì)胞毒性反應(yīng)的手段的用途，所述CDMAB任選地與一種或者多種化療劑聯(lián)用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合分析。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101389658SQ200780006609
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2007年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者利薩·M·切凱托, 戴維·S·F·揚(yáng), 海倫·P·芬德利, 蘇姍·E·哈恩, 路易斯·A·G·唐克魯茲 申請(qǐng)人:阿里烏斯研究公司