專利名稱：表達法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及生物醫(yī)學中心血管病學與轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種表達FPPS的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建，以及表達FPPS的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應用。
背景技術(shù)：
法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)是類異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶(圖1)，它催化異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)形成中間產(chǎn)物櫳牛兒基焦磷酸(GPP)和終產(chǎn)物法尼基焦磷酸(FPP)。FPP是膽固醇和固醇形成的重要中間物，另外，F(xiàn)PP也是櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸(GGPP)合成的底物。FPP和GGPP在蛋白質(zhì)法尼基化和櫳牛兒櫳牛兒基化過程中起重要作用，包括小G蛋白，如I^hoA，Ras等。法尼基化和櫳牛兒櫳牛兒基化是小G 蛋白活化的必要環(huán)節(jié)。最近有報道，F(xiàn)PPS表達在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的多種組織中顯著升高，包括心臟組織中(Li等，2008; Ye等，2010)。Xe等Q009，2010)發(fā)現(xiàn)在心肌細胞及心肌組織中抑制FPPS酶可以防止血管緊張素II導致的心肌肥厚。也有研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓大鼠中長期抑制FPPS酶可以減輕心室的肥厚和纖維化(Li等，2010)，也可以提高內(nèi)皮的功能(Chen等，2010)。這些研究表明FPPS在心臟和血管重塑的過程中發(fā)揮了重要的作用。另有一些研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PPS基因在肝癌和其它實體瘤中過表達(Sung等，2003; Caruso 等，2005; Jiang 等，2001; Notarnicola 等，2004)，這表明，它可能成為一個實體腫瘤的輔助診斷指標和治療靶點。另外，據(jù)Eckert等Q009)報道，F(xiàn)PPS基因在男性阿爾茨海默病患者中過表達，這導致FPP和GGPP水平增加，而FPP和GGPP可引起蛋白質(zhì)異戊二烯化，從而增加阿爾茨海默病的神經(jīng)病理改變。然而，F(xiàn)PPS過表達導致的FPP和GGPP合成增加是否會引起轉(zhuǎn)基因小鼠的心室血管重塑，F(xiàn)PPS過表達是否會導致實體瘤和神經(jīng)退行性疾病，這都需要進一步的實驗證實。而FPPS基因敲除小鼠有可能導致胚胎致死，因為FPPS基因在胚胎期高表達(Su 等，2008)。目前也沒有相關(guān)的FPPS轉(zhuǎn)基因過表達小鼠的研究報道，因此，為了方便從整體動物水平研究FPPS的功能，我們建立了高表達FPPS的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。轉(zhuǎn)基因處理可以導致一種蛋白質(zhì)過表達，產(chǎn)生用于研究蛋白質(zhì)功能和生理活性的轉(zhuǎn)基因動物模型。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物模型的方法是將一種外源DNA微注射或轉(zhuǎn)基因入受精卵的原核中。導入的DNA表現(xiàn)為隨機整合入染色體中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種表達FPPS的轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建方法，通過以下步驟實現(xiàn)
(1)重組表達載體pJG-mFPPS 在真核表達質(zhì)粒PJG/a_MHC的酶切位點Mil和HindIII 插入編碼FPPS蛋白的DNA片段產(chǎn)生，該片段從上游到下游依次包含(i )SalI酶切位點，(ii) Kozak序列，(iii)FPPS基因，(iv) HindIII酶切位點；通過常規(guī)的RT-PCR法獲得FPPS基因片度，PCR使用的引物是P1 5，-ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG -3’ 和 P2 5，-ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC-3，。在質(zhì)粒 pE-mFPPS 中用以下引物P 35，-ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG-3，和 P45，-CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGA TCTTG-3’ 擴增出 FPPS cDNA 片段；
提供一線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’端到3’端依次包含(a) a-MHC啟動子， (b) FPPS 編碼序列，(c) HGH PolyA 序列；
(3)步驟(2)中轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物是在酶切位點BamHI線性化的；
(4)用顯微注射的方法將步驟(2)中線性化的構(gòu)建物引入非人哺乳動物的的受精卵；
(5)將(4)中的受精卵移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管；
(6)產(chǎn)生的非哺乳動物的基因組中整合有FPPS表達盒，表達盒依次含有(a)a-MHC啟動子，(b) FPPS編碼序列，(c) HGH PolyA序列；
(7)對步驟(6)獲得的轉(zhuǎn)基因動物使用普通PCR法進行鑒定；使用引物(P5:5’ -ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG -3，； P6: 5’ - GCCTGGAATCCCAACAAC -3，)進行 PCR 反應；
(8)通過Real-timePCR法和Western blotting法分析轉(zhuǎn)基因小鼠中的轉(zhuǎn)基因的表達譜；Real-time PCR 反應 β -actin 引物為 P7: 5，-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3，，P8: 5’ -CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’，F(xiàn)PPS 引物為，P9 5-GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC-3’’ PlO 5’-AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC -3’ ；
(9)陽性轉(zhuǎn)基因動物與正常動物雜交，以獲得子代；轉(zhuǎn)基因小鼠子代與親代同樣程度地過表達FPPS。在本發(fā)明建立過表達FPPS的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，F(xiàn)PPS cDNA來自小鼠，編碼353 個氨基酸。本發(fā)明中采用了心臟特異表達的α-肌球蛋白重鏈啟動子，使其心肌細胞特異性表達，啟動子來源于小鼠。將cDNA導入非人動物受精卵的原核中，待小鼠出生后用PCR 鑒定FPPS是否整合入其基因組，從而獲得轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的另一目的是提供表達法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型在篩選治療心臟肥大和心衰的藥物中的應用，所述心臟肥大和心衰是因FPPS過表達所致。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠模型不僅可用于研究FPPS體內(nèi)生物學功能，同時可用于篩選治療心臟肥大和心衰的藥物，所述心臟肥大和心衰是因FPPS過表達所致。該方法包括將所述藥物導入包含過表達FPPS細胞的轉(zhuǎn)基因動物中，并通過任何適當方式監(jiān)測所述動物中FPPS生物活性抑制情況。監(jiān)測包括將野生型動物與轉(zhuǎn)基因動物相對比。本發(fā)明的有益之處是FPPS通過催化IPP和DMAPP生成FPP。FPP是膽固醇和固醇形成的重要中間物，另外，F(xiàn)PP也是GGPP合成的底物。FPP和GGPP對小G蛋白活化起重要作用。而小G蛋白活化在心臟疾病，如心肌肥厚、心衰中發(fā)揮重要作用。因此特異地在小鼠心臟中過表達FPPS，在FPP層面上影響小G蛋白的活化，進一步理解心肌肥厚和心衰的發(fā)病機制。本發(fā)明提供的模型可有效篩選抑制FPPS功能的藥物。


圖1.甲羥戊酸通路。圖2.表達質(zhì)粒pJG-mFPPS的結(jié)構(gòu)，包括a_MHC啟動子，F(xiàn)PPS基因和HGH PolyA序列。圖3.通過PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒pJG-mFPPS的電泳圖；泳道1 分子量標記物 (lkb DNA ladder Fermentas SMl 163)；泳道 2-4 :pJG_mFPPS 質(zhì)粒經(jīng) SalI 及 HindIII 酶切后的片段。圖4.轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定結(jié)果，泳道7 分子量標記物；泳道6 非轉(zhuǎn)基因小鼠； 泳道1-5，8-11 首建轉(zhuǎn)基因小鼠；泳道12 陽性對照(pJG-mFPPS);泳道13 陰性對照(正常小鼠)；泳道14:水。圖5. Real-Time PCR分析轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織的FPPS基因表達，NTG心非轉(zhuǎn)基因小鼠心臟；TG心轉(zhuǎn)基因小鼠心臟，< 0. 001。圖6. Western blotting分析轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織FPPS的表達，NTG:非轉(zhuǎn)基因小鼠；TG 轉(zhuǎn)基因小鼠。圖7. Real-Time PCR分析轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心臟組織肥厚相關(guān)基因表達，NTG 非轉(zhuǎn)基因小鼠；TG 轉(zhuǎn)基因小鼠，**p < 0. 01。圖8.轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心臟組織病理學分析，NTG:非轉(zhuǎn)基因小鼠；TG 轉(zhuǎn)基因小鼠°圖9.轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心臟組織活性MioA比較，NTG:非轉(zhuǎn)基因小鼠；TG 轉(zhuǎn)基因小鼠，**p < 0. 01。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。實施例1 重組表達載體pJG-mFPPS的構(gòu)建
以C57BL/6小鼠腦組織總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過常規(guī)的RT-PCR法獲得 FPPS 基因片度，PCR 使用的引物是P1 5，-ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAAC CAGAAATTGG -3，和 P2 5，-ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC-3，。PCR 產(chǎn)物經(jīng) NheI 和 BamHI酶切后，插入經(jīng)NheI和BamHI酶切的質(zhì)粒pEGFP-Cl，產(chǎn)生新的質(zhì)粒pE-mFPPS (FPPS 基因cDNA序列取代pEGFP-Cl中的EGFP序列，mouse FPPS基因cDNA序列atgaatggga accagaaattggatgcttataaccaagaaaagcagaatttcatccagcacttctcccagatcgtcaaggtgctgact gagaaggagctgggacacccagagataggggatgctattgcccggctcaaggaggtcctagagtacaatgccttagg aggcaagtacaaccggggtttgaccgtggtacaagccttccaggagctggtggagccgaagaaacaggatgctgaga gtcttcagcgggccctgacagtgggctggtgtgtagaactgctccaggctttcttccttgtgtcagatgacatcatg gactcttccctcactcgccggggacagatctgctggtatcagaagccaggcataggcttggatgccatcaacgacgc tctgcttctggaagcctccatctatcgtttgctgaagttctactgcagggagcagccctactacctgaacctgctgg agctctttctgcagagttcctatcagacagagatcgggcagactctagacctcatgacagcaccccagggccatgtg gatcttggtagatacactgaaaagaggtacaaatcgattgtcaagtacaagacggctttctactctttctacctgcc tattgcggccgccatgtacatggcaggcattgatggggagaaggaacacgccaatgccctgaagatcctgatggaga tgggcgagttcttccaggtccaggacgactaccttgatctctttggagaccccagtgtgacgggaaaggtcggcact gacatccaggacaacaaatgcagctggctggtggttcagtgtctgctacgagcctctcctcaacagcgccagatctt agaggagaattatgggcagaaggacccagaaaaagtggctcgggtgaaagcactgtatgaggcgctggatctgcagt ctgctttcttcaagtatgaggaagacagttacaaccgcctcaagagtctcatagagcagtgctctgcgcccctgcccccatccatcttcatggaacttgcaaacaagatctacaaacggagaaagtga) ￠:^14 pE-mFPPS ΦΜ ^ ^^Ι 物P3:5，-ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG-3，和 P4:5，-CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTG TAGATCTTG-3'擴增出FPPS cDNA片段，經(jīng)Sail及HindIII酶切插入pJG/a-MHC質(zhì)粒中， 重組成新的表達載體pJG/mFPPS。參見圖2，顯示了重組表達載體pJG-mFPPS的結(jié)構(gòu)，包括 a-MHC啟動子，F(xiàn)PPS基因和hGHpolyA序列。參見圖3，顯示了酶切鑒定重組質(zhì)粒pJG_mFPPS 的電泳結(jié)果。經(jīng)限制性內(nèi)切酶法和DNA測序法鑒定重組質(zhì)粒，表明FPPS片段插入得完全正確。實施例2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和鑒定
pJG-mFPPS質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI酶切線性化后，電泳，使用凝膠回收試劑盒 (Qiagen, CA)割膠純化回收7. Ikb的片段，用TE溶解，調(diào)整終濃度至2ng/ μ 1，顯微注射， 將注射后的卵細胞移植到假孕小鼠的輸卵管，小鼠懷孕約20后分娩。PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因首建小鼠(GO)剪取10天大的小鼠的尾巴，抽提基因組DNA，使用引物(P5: 5，- ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG -3，； P6: 5，- GCCTGGMTCCCAACAAC -3’)，進行PCR反應，陽性小鼠可產(chǎn)生約1. 4kb的片段(圖4)。為了研究轉(zhuǎn)基因小鼠中的轉(zhuǎn)基因的傳代，我們將轉(zhuǎn)基因首建小鼠與正常C57BL/6 小鼠雜交產(chǎn)生第一代轉(zhuǎn)基因小鼠(Fl )，F(xiàn)l與正常C57BL/6小鼠雜交產(chǎn)生第二代轉(zhuǎn)基因小鼠 (F2)，鑒定第一代和第二代轉(zhuǎn)基因小鼠的方法與鑒定首建鼠的方法相同。參見圖4，顯示了 FPPS轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的鑒定。轉(zhuǎn)基因陽性出現(xiàn)1.41Λ帶，而野生型或者陰性小鼠無特異性擴增。以質(zhì)粒DNA作為陽性對照。結(jié)果，共獲得轉(zhuǎn)基因陽性首建鼠15只，這些小鼠經(jīng)交配繁殖建系，共建立了 6個轉(zhuǎn)基因小鼠系。實施例3轉(zhuǎn)基因在小鼠中的表達
按照試劑盒說明書，使用RNAiso試劑(TaKaRa，DL)抽提正常和轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中的總RNA，DNaseI (TaKaRa)消化后，逆轉(zhuǎn)錄(TaKaRa)產(chǎn)生第一條鏈cDNA。對此cDNA 進行 real-time PCR 反應，內(nèi)參 β -actin 引物為 P7: 5，-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3，， P8: 5' -CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’，F(xiàn)PPS 引物為，P9 5-GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC-3’， PlO 5，-AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC -3，。PCR 反應條件為95° C 預變性 2min, 95 度 IOs 60度40s，40個循環(huán)。按照說明書(Santa Cruz Biotechnology，Inc. CA)，制備組織的蛋白質(zhì)樣品，進行Wfestern blotting。每個樣品上樣30 μ g, 12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%的脫脂奶粉(TBST)封閉1小時，TBST稀釋的抗FPPS抗體(1 1500，Clontech)和抗β-actin抗體 (1:2000，GenScript) 4°C孵育過夜，TBST洗膜三次，再用HRP標記的抗兔抗體(1 :5000)室溫孵育1小時，化學發(fā)光法顯色。參見圖5，6，顯示了 Realtime-PCR和Western blotting 在心臟組織中FPPS基因表達，結(jié)果表明，F(xiàn)PPS基因在心臟中表達明顯增強。實施例4正常和轉(zhuǎn)基因小鼠肥厚相關(guān)基因表達情況
按照試劑盒說明書，使用RNAiso試劑(TaKaRa，DL)抽提正常和轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中的總RNA，DNaseI (TaKaRa)消化后，逆轉(zhuǎn)錄(TaKaRa)產(chǎn)生第一條鏈cDNA。對此 cDNA 進行 real-time PCR 反應，內(nèi)參引物為 P7 5，-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3，， P8: 5’ -CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3，， ANP 引物為，Pll5-AGCGGACTGGGCTGTAACAG-3，， P12 5，-GCCCAGCCCTGCTTGTC-3， BNP 引物為 P135-AGACCCAGGCAGAGTCAGAA-3， ， P145’-AGCGGACTGGGCTGTAACAG-3’ ， β -MHC P15:5- TCGATTTGGGAAATTCATCC-3， ， P16 5’-CGCATAATCGTAGGGGTTGT -3，。PCR 反應條件為95° C 預變性 2min, 95 度 IOs 60 度 40s, 40個循環(huán)。如圖7所示在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中心肌肥厚相關(guān)基因表達明顯增高。實施例5轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心臟體重比
在6周齡和4月齡對正常和轉(zhuǎn)基因小鼠測定體重和心臟重量。將存活小鼠在正常實驗室刻度稱重，心臟重量是在解剖心臟后獲得的。參見表1，是轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心臟體重比， WT:野生型小鼠；TG 轉(zhuǎn)基因小鼠。表1顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠中可見心臟與體重比明顯增加。表 1
實施例6正常和轉(zhuǎn)基因小鼠的病理學分析
取約5月齡轉(zhuǎn)基因和正常動物小鼠心臟組織，10%福爾馬林固定，4°C過夜，脫水，包埋于固體石蠟中并切片。將組織切片使用標準方法在蘇木精/伊紅中染色。顯微鏡觀察，拍照。如圖8所示在檢測的5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中明顯心肌肥厚。實施例7正常和轉(zhuǎn)基因小鼠心功能比較
在4月齡和9月齡對正常和轉(zhuǎn)基因小鼠測定心超和心室壓力。小鼠心臟超聲在超聲儀上測定，小鼠心室壓力通過右頸動脈插入Millar導管測定。參見表2，3，顯示轉(zhuǎn)基因小鼠在 9月齡時心功能較之正常小鼠明顯下降。表2 轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心超結(jié)果。 表3 轉(zhuǎn)基因和正常小鼠心室壓力比較
權(quán)利要求
1.一種表達法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，通過以下步驟實現(xiàn)(1)重組表達載體pJG-mFPPS在真核表達質(zhì)粒PJG/a_MHC的酶切位點Mil和HindIII 插入編碼FPPS蛋白的DNA片段產(chǎn)生，該片段從上游到下游依次包含(i )SalI酶切位點，(ii) Kozak序列，(iii)FPPS基因，(iv) HindIII酶切位點；通過常規(guī)的RT-PCR法獲得FPPS基因片度，PCR使用的引物是P1 5，-ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG -3， P25，-ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC-3，在質(zhì)粒 pE-mFPPS 中用以下引物P3 5，-ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG-3，P4 5 ，-CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGATCTTG-3，，擴增出 FPPS cDNA 片段；(2)提供一線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’端到3’端依次包含(a)a-MHC啟動子，(b) FPPS編碼序列，(c) HGH PolyA序列，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物是在酶切位點BamHI線性化；(3)用顯微注射的方法將步驟(2)中線性化的構(gòu)建物引入非人哺乳動物的的受精卵；(4)將(3)中的受精卵移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管；(5)產(chǎn)生的非哺乳動物的基因組中整合有FPPS表達盒，表達盒依次含有(a)a-MHC啟動子，(b) FPPS編碼序列，(c) HGH PolyA序列；(6)對步驟(5)獲得的轉(zhuǎn)基因動物使用普通PCR法進行鑒定；使用引物是P5:5’ -ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG _3，，P6: 5’ - GCCTGGAATCCCAACAAC -3，；(7)通過Real-timePCR法和^festern blotting法分析轉(zhuǎn)基因小鼠中的轉(zhuǎn)基因的表達譜，Real-time PCR 反應 β-actin 引物為 P7 5，-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3，，P8: 5’ -CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’，F(xiàn)PPS 引物為，P9 5-GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC-3’，PlO 5’-AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC -3’ ；(8)陽性轉(zhuǎn)基因動物與正常動物雜交，以獲得子代，轉(zhuǎn)基因小鼠子代與親代同樣程度地過表達FPPS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，F(xiàn)PPS cDNA來自小鼠，編碼353個氨基酸，采用心臟特異表達的α -肌球蛋白重鏈啟動子，啟動子來源于小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的一種表達法尼基焦磷酸合成酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型在篩選治療心臟肥大和心衰的藥物中的應用，所述心臟肥大和心衰是因FPPS過表達所致。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達FPPS的轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建方法，通過在真核表達質(zhì)粒PJG/a-MHC的酶切位點SalI和HindIII插入編碼FPPS蛋白的DNA片段重組表達載體pJG-mFPPS，提供線性化的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，從5’端到3’端依次包含a-MHC啟動子、FPPS編碼序列、HGHPolyA序列，將線性化的構(gòu)建物引入非人哺乳動物的的受精卵，再移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管，分析轉(zhuǎn)基因的表達譜，陽性轉(zhuǎn)基因動物與正常動物雜交，以獲得子代，子代與親代同程度地過表達FPPS。本發(fā)明的模型特異地在小鼠心臟中過表達FPPS，在FPP層面上影響小G蛋白的活化，可在效篩選抑制FPPS功能的藥物中應用。
文檔編號A61K49/00GK102399822SQ20111043860
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月25日
發(fā)明者楊劍, 胡申江 申請人:浙江大學