一種液泡質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用，涉及分子生物學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明克隆小麥TAVP基因，并在擬南芥中進行功能鑒定，發(fā)掘小麥自身的抗旱抗鹽基因，為得到良好的小麥新品系奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明對了解植物抗逆機制具有重大意義，還可為未來分子組裝改良作物抗逆，提高作物產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)。
【專利說明】一種液泡質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種液泡質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱是一個世界性問題。全世界有I / 3的耕地處于干旱半干旱狀態(tài)，有40多個國家缺水。干旱嚴(yán)重影響植物生長及作物種植，給作物的產(chǎn)量造成很大的損失。此外，土壤的鹽潰化也是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題。隨著人口的增加和耕地面積的減少，如何利用大面積的干旱地區(qū)土地和鹽堿地發(fā)展農(nóng)業(yè)，培育出既抗旱又抗鹽的作物，已經(jīng)成為國際上和生物科學(xué)技術(shù)迫切需要解決的重大課題。
[0003]H+轉(zhuǎn)運無機焦憐酸酶(H+-pyrophosphatase, H+-PPase)是一種區(qū)別于 H+-ATPase的H+轉(zhuǎn)運酶，廣泛存在于植物和少數(shù)藻類、原生動物、細(xì)菌以及原始細(xì)菌中。在液泡膜上，H+-PPase能夠把無機焦磷酸水解產(chǎn)生的自由能和H+跨膜轉(zhuǎn)運相耦聯(lián)，在將PPi水解為2個Pi的同時，將細(xì)胞質(zhì)中的H+經(jīng)液泡膜進入液泡內(nèi)，起質(zhì)子泵的作用，與液泡膜H+-ATPase —起形成H+跨液泡膜電化學(xué)梯度，為各種溶質(zhì)(如陽離子、陰離子、氨基酸和糖類等)分子跨液泡膜的次級主動運輸提供驅(qū)動力。通過Na+在液泡中的區(qū)隔化，不僅使細(xì)胞避免離子毒害.還有助于細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)。另一方面，當(dāng)Na+被區(qū)隔在液泡內(nèi)時，植物為了維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡，在它們的細(xì)胞質(zhì)和其它細(xì)胞器中就會積累大量的K和有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，增強植株的保水性，同時，液泡膜H+-PPase表達(dá)的變化會影響與生長素分布有關(guān)的2種蛋白(三磷酸腺苷酶和生長素外流介體PIN1)的分布和數(shù)量。因此，液泡膜H+-PPase基因(vacuolar H+-pyrophosphatase, VP)作用的結(jié)果是生長素外流變得更為容易，從而促進根系發(fā)育和植株地上部分的生長。
[0004]1992年，Sarafian等構(gòu)建擬南芥的cDNA文庫，第1次篩選克隆出完整的H+-PPasecDNA 序列，命名為 AVPl (Arabidopsis vacuolar H+_pyrophosphatase gene)。此后，人們相繼從大麥、甜菜、煙草、水稻、南瓜、綠豆、野大麥中克隆出H+-PPase的cDNA。
[0005]2001年，Gaxiola報道擬南芥液泡膜H+-PPase基因AVPl具有抗旱和抗鹽的作用。接著，Park等將AVPl轉(zhuǎn)入商業(yè)番茄中獲得的了抗旱和耐鹽的轉(zhuǎn)基因番茄，為改善作物抗旱提供了新思路。轉(zhuǎn)基因番茄擁有龐大的根系，因而具有較強的保水能力和抗旱能力。轉(zhuǎn)液泡膜H+-PPase基因的植株生長素運輸活躍，植物生長快，根系龐大。Guo等將來自鹽地堿蓬的H+-PPase基因在擬南芥中過表達(dá)也提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性。Gao等從鹽芥中克隆了 H+-PPase基因，將該基因分別在煙草和小麥中異源表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株耐旱耐鹽能力都得到了明顯增強。Li等將鹽芥的液泡膜H+-PPase基因轉(zhuǎn)入小麥增強了小麥的抗旱性。Li等將擬南芥AVPl基因進行異源轉(zhuǎn)化，獲得了抗鹽抗旱的翦股穎。包愛科等將AVPl基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出良好的抗逆性。
[0006]小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，也是世界主要的商品糧之一。我國是世界上小麥年產(chǎn)量唯一過億噸的最大生產(chǎn)國，同時也是世界上小麥第一大進口國。但是，我國的小麥生產(chǎn)嚴(yán)重受到干旱、鹽堿等環(huán)境脅迫的影響。解決環(huán)境脅迫對小麥生產(chǎn)的影響，培育優(yōu)質(zhì)抗旱抗鹽小麥新品種是當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]一種液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì):
[0010](I)所述氨基酸殘基序列為:
[0011 ] MAILGELGTEILIPVCGVVGIVFAIAQWFIVSKVKVTPGAAAAGGSKNGY⑶YLIEEEEGLNDHNVWKCAEIQTAISEGATSFLFTMYQYVGMFMVVFAAVIFVFLGSIEGFSTKGQPCTYSTGTCKPALYTALFSTASFLLGAITSLVSGFLGMKIATYANARTT LEARKGVGKAFITAFRSGAVMGFLLSSSGLVVLYITINVFKMYYGDDWEGLFESITGYGLGGSSMALFGRVGGGIYTKAADVGADLVGKVERNIPEDDPRNPAVIADNV⑶NV⑶IAGMGSDLFGSYAESSCAALVVASISSFGINHDFTAMCYPLLVSSVGIIVCLLTTLFATDFFEIKAASEIEPALKKQLIISTALMTIGVAVISWLALPAKFTIFNFGAQKDVSNWGLFFCVAVGLWAGLIIGFVTEYYTSNAYSPVQDVADSCRTGAATNVIFGLALGYKSVIIPIFAIAVSIYVSFSIAAMYGIAMAALGMLSTMATGLAIDAYGPISDNAGGIAEMAGMSHRIRERTDALDAAGNTTAAIGKGFAIGSAALVSLALFGAFVSRAGVKVVDVLSPKVFIGLlVGAMLPYffFSAMTMKSVGSAALKMVEEVRRQFNTIPGLMEGTAKPDYATCVKISTDASIKEMIPPGALVMLTPLIVGTLFGVETLSGVLAGALVSGVQIAISASNTGGAWDNAKKYIEAGNSEHARSLGPKGSDCHKAAVI⑶TI⑶PLKDTSGPSLNILIKLMAVESLVFAPFFATYGGVLFm-；
[0012](2)將氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶活性和/或植物抗旱\抗鹽相關(guān)功能的蛋白質(zhì)。
[0013]所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶，一個或數(shù)幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014]所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的編碼基因，是SEQ ID N0.2，其序列為:
[0015]ATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAGGCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGTAATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCCTGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCCTACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGGTTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACGGCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGTGACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGCTGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGTGCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGCCATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTCCGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCTCCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCTCTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCCAACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCCCCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATCGGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCCGTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGAGTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGCGTGCTGTTCAGGTACATCTAG,或是與 SEQ IDN0.2序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0016]所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶應(yīng)用在培育提高抗逆性的植物中。
[0017]所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的編碼基因的應(yīng)用在培育提高抗逆性的植物中。
[0018]本發(fā)明的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因可提高植物抗逆性水平，在植物抗逆育種中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1 為表達(dá)載體 pCambial380-35S-TAVP-GFP 的 T-DNA 區(qū)結(jié)構(gòu)簡圖。
[0020]圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥TAVP基因表達(dá)分析。
[0021]圖3為不同脅迫處理下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥萌發(fā)率統(tǒng)計。
[0022]圖4為不同脅迫處理下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥綠苗率統(tǒng)計。
[0023]圖5為不同脅迫處理下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥生長狀況。
[0024]圖6為轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥幼苗脯氨酸含量分析。
[0025]圖7為NaCl脅迫條件下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥生長狀況。
[0026]圖8為NaCl脅迫條件下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥脯氨酸含量分析。
[0027]圖9為干旱脅迫下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥生長狀況。
[0028]圖10為干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥脯氨酸含量分析。
[0029]圖11為不同脅迫條件下轉(zhuǎn)TAVP基因和野生型擬南芥電導(dǎo)率測定。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合具體實 施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0031]實施例1液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶(TAVP)的獲得
[0032]一、用3' -RACE法獲得液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶(TAVP) 3'未端序列[0033]根據(jù)已報道的大麥、玉米、水稻的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因(VP)保守區(qū)設(shè)計引物:TAVP3RACE-S:5/ GCYGAYCTTGTYGGCAARGTT3'(兼并引物,其中，R 和 Y 是兼并堿基符號；R 表示 G 或 A ;Y 表示 T 或 C)和 TAVP3RACE-A:5/ GCAGTGGTAACAACGCAGAGT3'。
[0034]所用小麥抗逆品系為洛旱2號(來自河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院抗旱經(jīng)濟作物所)。幼苗培養(yǎng)到兩葉一心時期，20% PEG6000處理Ih取全植株，采用TRIZOL (賽百盛公司)法提取小麥總RNA。取I μ g總RNA，采用MMLV(promega公司)制備cDNA，整個操作均按照試劑盒推薦的條件進行，反轉(zhuǎn)錄引物RACERT:AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC (T) 3(|。以獲得的小麥的cDNA為模板，使用引物TAVP3RACE-S和TAVP3RACE-A進行PCR擴增。
[0035]PCR 反應(yīng)條件為:98 °C 30sec 預(yù)變性，98 °C IOsec 變性，50 °C 30sec 復(fù)性，72°C lmin20sec 延伸，15 個循環(huán)。98°C IOsec 變性，55°C 30sec 復(fù)性，72°C lmin20sec 延伸，20個循環(huán)。72°C IOmin延伸。PCR反應(yīng)體系為:去離子無菌水11.2 μ L，5XReactionBuffer4 μ L, IOmM dNTPsl.5 μ L, 5U / ul Tag 酶 0.3 μ L, cDNAl μ L, Sense Primerl μ L,Antisense Primerl μ L,總體系 20 μ L0
[0036]結(jié)果擴增得到約ISOObp的片段，將該產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明擴增得到小麥含有VP保守區(qū)域的3'端序列(SEQ ID N0.1)。
[0037]SEQ ID N0.1 序列為:
[0038]IgctgatcttgttggcaaagttI gaaaggaacattcctgaagatgacccaaggaacccagct
GTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGA
ATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACC`CACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAG
GCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGT
AATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCC
TGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCC
TACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGG
TTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACG
GCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGT
GACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGC
TGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGT
GCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGC
CATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTC
CGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCT
CCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCT
CTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCC
AACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCC
CCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATCGGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCC
GTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGAGTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGC
GTGCTGTTCAGGTACATCTAG
[0039]方框中是3' -RACE法獲得的VP基因的保守區(qū)。
[0040]二、用5' -RACE法獲得液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因5'未端序列[0041] 5' -RACE包含了有3個連續(xù)的酶反應(yīng)步驟，即反轉(zhuǎn)錄、去磷酸化處理、去帽子反應(yīng)。上述擴增操作均按照試劑盒推薦的條件進行。去磷酸化主要是利用堿性磷酸酶(如牛小腸堿性磷酸酶，CIP)處理，防止載體自身環(huán)化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。去帽子反應(yīng)主要是應(yīng)用TAP可以去掉mRNA的5帽子結(jié)構(gòu)，使用T4RNA Ligase將5RACE Adaptor連接到mRNA的Y端后。
[0042]5' -RACE接頭連接反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟如下所述:以cDNA為模板，使用上游外側(cè)特異性引物 GSPI: TAVP-5-0UT (5 ' GCTTCTTCAGAGCAGGTTCA3 ')和 5 ' RACE 外側(cè)弓 I 物(5' CATGGCTACATGCTGACAGCCTA3')進行第一輪 PCR，第一輪 PCR 產(chǎn)物較弱。將第一輪 PCR產(chǎn)物進行50倍稀釋，再使用上游內(nèi)側(cè)引物GSP2:TAVP-5-1N (5' GCAMGAGCGTGGTGAGCAA3'
)和 5' RACE 內(nèi)側(cè)引物(5' CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3/ )進行第二輪 PCR反應(yīng)。擴增得出PCR片段大小為1053bP。
[0043]第一輪PCR的反應(yīng)條件為98°C 30S預(yù)變性，98°C IOsee變性，55°C 30sec復(fù)性，72°C Imin 延伸，35 個循環(huán)。72°C IOmin 延伸。
[0044]第二輪PCR的反應(yīng)條件為98°C 30S預(yù)變性，98°C IOsee變性，60°C 30sec復(fù)性，72°C Imin 延伸，35 個循環(huán)。72°C IOmin 延伸。
[0045]上述擴增其余操作均按照試劑盒推薦的條件進行。
[0046]PCR產(chǎn)物直接測序，測序結(jié)果如下。此結(jié)果用于后面的序列拼接分析。
[0047]CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGC
[0048]三、全長液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因(VP)的cDNA序列獲得
[0049]通過分析所述步驟一和步驟二的PCR獲得的3 '和5 '端TAVP序列，利用DNAMAN version5.2.2軟件，拼連TAVP基因的全長cDNA，進行生物信息學(xué)分析，確定該基因的讀碼框。合成相應(yīng)引物擴增出全長cDNA。引物序列如下所述:TAVPQC-S:5' CGGGATCCATGGCGATCCTCGGGGAG3' ；TAVPQC-A:5/ CCCAAGCTTCTAGATGTACCTGAACAGCACGC3' ο
[0050]以小麥cDNA 為模板，利用高保真 SuperStar High-Fidelity 酶(GenStar 公司),以VPQC-S和VPQC-A為引物，PCR擴增液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因的全長cDNA。[0051]擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性98°C 30S ；98°C 10S，68°C 30S，72°C lmin40S，35 個循環(huán)，最后 72°C IOmin0
[0052]PCR擴增得到的產(chǎn)物大小為2286bp (SEQ ID N0.2)。將PCR產(chǎn)物克隆到T-EASY載體(購自promega公司)進行測序。測序結(jié)果用primer5軟件翻譯成氨基酸序列。將該氨基酸序列在NCBI生物數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，結(jié)果表明該序列與與大麥中VP基因的氨基酸序列同源性分別達(dá)86% (AB032839.1)和98% (D13472.2);與水稻中VP基因的氨基酸序列同源性分別達(dá)達(dá) 85% (D45384.1),92% (D45384.1),89% (AB126350.1)和 87%(AB126351.1);與小麥已知VP基因的氨基酸序列同源性分別達(dá)85% (EU255237.1)和98%(AY296911.1)。因此，我們初步推斷克隆獲得小麥VP基因編碼一新的未曾報道過的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶。將SEQ ID N0.2翻譯成氨基酸序列進行分析，結(jié)果表明，自翻譯成的該氨基酸序列的氨基端第248位至258位為液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的保守區(qū)。因此，該蛋白可能具有水解焦磷酸的活性。[0053]SEQ ID N0.2 的序列為:
[0054]ATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAGGCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGTAATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCCTGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCCTACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGGTTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACGGCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGTGACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGCTGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGTGCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGCCATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTCCGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCTCCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCTCTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCCAACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGT
ACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCCCCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATC
GGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCCGTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGA
GTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGCGTGCTGTTCAGGTACATCTAG
[0055]由SEQ ID N0.2翻譯成的氨基酸序列為:
[0056]MAILGELGTEILIPVCGVVGIVFAIAQWFIVSKVKVTPGAAAAGGSKNGYGDYLIEEEEGLNDHNVVVKCAEIQTAISEGATSFLFTMYQYVGMFMVVFAAVIFVFLGSIEGFSTKGQPCTYSTGTCKPALYTALFSTASFLLGAITSLVSGFLGMKIATYANARTTLEARKGVGKAFITAFRSGAVMGFLLSSSGLVVLYITINVFKMYYGDDWEGLFESITGYGLGGSSMALFGRVGGGIYTKAADVGADLVGKVERNIPEDDPRNPAVIADNVGDNVGDIAGMGSDLFGSYAESSCAALVVASISSFGINHDFTAMCYPLLVSSVGIIVCLLTTLFATDFFEIKAASEIEPALKKQLIISTALMTIGVAVISWLALPAKFTIFNFGAQKDVSNWGLFFCVAVGLWAGLIIGFVTEYYTSNAYSPVQDVADSCRTGAATNVIFGLALGYKSVIIPIFAIAVSIYVSFSIAAMYGIAMAALGMLSTMATGLAIDAYGPISDNAGGIAEMAGMSHRIRERTDALDAAGNTTAAIGKGFAIGSAALVSLALFGAFVSRAGVKVVDVLSPKVFIGLIVGAMLPYWFSAMTMKSVGSAALKMVEEVRRQFNTIPGLMEGTAKPDYATCVKISTDASIKEMIPPGALVMLTPLIVGTLFGVETLSGVLAGALVSGVQIAISASNTGGAWDNAKKYIEAGNSEHARSLGPKGSDCHKAAVI⑶TI⑶PLKDTSGPSLNILIKLMAVESLVFAPFFATYGGVLFRY1-
[0057]該氨基酸序列全長761個氨基酸，下劃線部位為焦磷酸酶的保守區(qū)。
[0058]實施例2本發(fā)明的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因的功能驗證
[0059]一、液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因(TAVP)的表達(dá)載體構(gòu)建
[0060]用PCR擴增pCambial380的35S啟動子，所用的引物為5' -CCGAATTCCCCAACATGG`TGGAGC-3'和 5' -CG GGATCC GCGAAAGCTCGAGAGAG-3'，擴增出的35S啟動子長度為0.8kb。將該片段用EcoR I和BamH I酶切后插入到pCambial380載體(購自Cambia)的EcoR I和BamH I酶切位點之間得到重組載體，將重組載體命名為pCambial380_35S。
[0061]將TAVP用BamH I和Hind III雙酶切后，回收TAVP片段，將其以正向方式插入載體pCambial380-35S的BamH I和Hind III酶切位點之間，得到重組載體，將該重組載體進行酶切和測序鑒定，將鑒定表明正確的含有TAVP的重組表達(dá)載體命名為pCambial380-35S-TAVPo用Hind III和Bgl II切割已經(jīng)構(gòu)建的GFP-T載體(GFP擴增自常規(guī)載體PEGPF-N2，帶Hind III和Bgl II酶切位點擴增后連接T載體得到)，將切下的GFP連接到 pCambial380-35S-TAVP 上，最終構(gòu)建成 pCambial380-35S-TAVP_GFP 載體。載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示。
[0062]pCambial380-35S-TAVP-GFP的T-DNA結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示，該載體中含有的植物表達(dá)載體抗性選擇標(biāo)記為抗潮霉素基因(Hygromycin)抗性，TAVP基因由35S啟動子驅(qū)動。圖1中，RB(right border) LB(left border)分別代表T-DNA區(qū)的右邊界和左邊界；Hyg(R)是編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，能使受體細(xì)胞獲得對潮霉素抗性；CaMV35s是來源于花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)的啟動子,在雙子葉植物中具有很強的活性；Nos來源于根癌農(nóng)桿菌終止子；TAVP為實施例1所述獲得的小麥液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因的cDNA。
[0063]二、液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的編碼基因(VP)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株獲得
[0064]VP基因及其編碼蛋白在單子葉植物(水稻、大麥、玉米)抗逆中具有良好的應(yīng)用前景。本例以轉(zhuǎn)化受體擬南芥作為示例，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將帶有pCambial380-35S-TAVP-GFP載體的農(nóng)桿菌導(dǎo)入擬南芥中，經(jīng)過篩選，獲得轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFP 植株，通過鑒定該轉(zhuǎn) pCambial380-35S-TAVP_GFP 植株的抗逆性能即可確定本發(fā)明的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶及其編碼基因的提高植物抗逆性的功能。轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFP植株具體獲得過程如下:
[0065]1、含有 pCambial380-35S-TAVP_GFP 的農(nóng)桿菌的獲得
[0066]將pCambial380-35S-TAVP_GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，將得到的重組菌進行PCR(以質(zhì)粒為模板)及酶切鑒定，將鑒定正確的含有pCambial380-35S-TAVP-GFPP的重組工程菌命名為 GV-pCambial380-35S-TAVP-GFP。
[0067]2、擬南芥的培養(yǎng)
[0068]將Columbia型擬南芥的種子放入EP管中春化3-5天。用75%的乙醇消毒Imin,3%的NaClO消毒5min,最后無菌水洗漆種子3_5次后鋪種。播種后的擬南芥放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度day / night21°C / 18°C，光周期為16h光照/ 8h黑暗，相對濕度70%。
[0069]2-4片真葉時移栽(播種10-12天)。移栽前先對營養(yǎng)土進行濕熱滅菌。移栽后，用塑料罩來保濕。擬南芥小苗長出6片葉子后就可以移去塑料罩。
[0070]3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
[0071]移栽后的擬南芥大約2周后開始進入花期，待主薹抽薹至10-15cm時可作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的材料?；罨r(nóng)桿菌，擴培至菌液密度為0D_值1.0左右，5000g離心20min收集菌體。用轉(zhuǎn)化介質(zhì)懸浮菌體至密度0D_為0.8左右。
[0072]去掉擬南芥主薹和側(cè)薹上的角果、花蕾后將擬南芥整個植株完全浸泡在轉(zhuǎn)化介質(zhì)中，5min后取出植株側(cè)臥在干凈的托盤中，用黑色塑料袋覆蓋避光恢復(fù)培養(yǎng)。24h后棄去塑料袋，將擬南芥扶正，正常培養(yǎng)。2-3周之后，少澆水，加速其衰老，收獲種子。
[0073]4、轉(zhuǎn)pCambial380-35S_TAVP植株的鑒定與純合體的獲得
[0074]潮霉素(hygromycin)為鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素,抗潮霉素基因表達(dá)產(chǎn)物是一個蛋白激酶，通過磷酸化潮霉素B使其喪失活性，由于在真核和原核生物中潮霉素篩選假陽性率低，重復(fù)性好，現(xiàn)在通過潮霉素B對轉(zhuǎn)基因生物進行篩選已經(jīng)在實驗室被廣泛選用。本實施例所構(gòu)建的表達(dá)載體pCambial380-35S-TAVP-GFP的選擇標(biāo)記為抗潮霉素基因，不僅有利于選擇培養(yǎng)時進行篩選，而且可以賦予轉(zhuǎn)基因植株抗潮霉素B特性。因此轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFP植株能表現(xiàn)出對潮霉素B的抗性。本實施例用潮霉素對轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFP植株進行鑒定，獲得陽性植株。具體方法如下所述:
[0075]農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后當(dāng)代植株隊代)所收獲的種子即為T1代。將其鋪于含有25-30 μ g/mL潮霉素抗性的MS平板中，置于光照周期為8h黑暗、16h光照的光照培養(yǎng)箱中(20_22°C )培養(yǎng)。由于農(nóng)桿菌所轉(zhuǎn)的植物表達(dá)載體中具有潮霉素的抗性，因而只有基因轉(zhuǎn)化成功的幼苗才會在含有潮霉素抗性的平板中生長。未轉(zhuǎn)入基因的幼苗在含有潮霉素的MS平板上表現(xiàn)為種子萌發(fā)長出兩片子葉后不能再繼續(xù)長出真葉，主根很短且無側(cè)根，子葉一般不展開并隨即漸漸枯黃、變白直至死亡。而真正的轉(zhuǎn)入基因幼苗在含有潮霉素抗性的MS平板中生長完全正常。待陽性的轉(zhuǎn)基因幼苗生長IOd左右后將其移栽入營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，單株收獲種子(此為T2代)。繼續(xù)將收獲的種子分別鋪于含有潮霉素的MS平板中，此時的T2代植株發(fā)生潮霉素抗性的性狀分離，我們選取抗性與不抗的性狀分離比為3:1的植株進行移栽，共需要選擇至少10株左右滿足此比例的株系，每個平板(株系)移栽20棵幼苗，待成熟后分別單株收獲其種子(T3代)。將單株收獲的種子每個株系挑10株種子繼續(xù)鋪于含有潮霉素抗性的MS培養(yǎng)基中，無性狀分離的即為純合體(T3代植株)，此編號的種子及其后代即可用于后續(xù)生理實驗。
[0076]5、轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP_GFP擬南芥植株基因表達(dá)的鑒定
[0077]I)挑選6個純合體株系和野生型擬南芥，正常培養(yǎng)。以葉片為材料采用TRIZOL法各自提取總RNA，取2 μ g總RNA，采用MMLV (promega)制備cDNA，整個操作均按照試劑盒推薦的條件進行。以獲得的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFPT3代純合體植株的cDNA為模板，進行半定量PCR擴增。
[0078]2)根據(jù)已報道的擬南芥actin序列設(shè)計內(nèi)參引物，正向引物(ACTIN-S:5' AGGCACCTCTTAACCCTAAAGC3')，反向引物(ACTIN-A:5' GGACAACGGAATCTCTCAGC3')，PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s ;30個循環(huán)；72°C 延伸 5min。
[0079]3)將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，電泳得到430bp的片段即為擬南芥actin的片段。調(diào)節(jié)cDNA模板濃度，使野生型擬南芥和轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFPT3代植株擴增片段亮度一致。
[0080]4)根據(jù)步驟3)確定的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP_GFPT3代植株cDNA模板濃度，進行TAVP基因的PCR擴增。
[0081]根據(jù)我們克隆測序得到的TAVP序列設(shè)計內(nèi)參引物，正向引物(BDL-S:5' GAGCCACAGAATCCGTGAGA3')，反向引物(BDL-A: 5' CACCAGCCAGAACACCAGA3' )，PCR 反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min` ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s ；28個循環(huán)；72°C延伸5min。
[0082]將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，電泳得到461bp的片段即為TAVP基因。電泳圖結(jié)果如圖2所示，圖中1-6為轉(zhuǎn)pCambial380-35S-TAVP-GFPT3代植株(分別為株系9、14、15、16、20、24)，結(jié)果表明TAVP基因在擬南芥中得到了表達(dá)。
[0083]6、轉(zhuǎn) pCambial380-35S_TAVP 植株功能驗證實驗
[0084]I)萌發(fā)實驗與綠苗率統(tǒng)計
[0085]將野生型和5所述經(jīng)過表達(dá)鑒定的6個純合體株系的種子，消毒后播種于含有不同脅迫物質(zhì)(甘露醇300mM、NaCl 125mM、NaCl 150mM、NaCl 175mM)的MS培養(yǎng)基上，每皿不少于50粒種子，3個重復(fù)。4天后統(tǒng)計萌發(fā)率，6天后統(tǒng)計綠苗率。結(jié)果如下圖3、圖4、圖5所示。
[0086]由圖3、圖4可以看出，野生型擬南芥在脅迫狀況下其萌發(fā)率與綠苗率均低于轉(zhuǎn)基因擬南芥，由圖5可以看出，相同脅迫狀況下，野生型的生長狀態(tài)明顯不如轉(zhuǎn)基因株系。
[0087]2)幼苗脯氨酸含量測定
[0088]用培養(yǎng)基中添加甘露醇模擬干旱脅迫，添加NaCl模擬鹽脅迫。在I XMS瓊脂糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Tp9、Τρ14、Τρ15和野生型擬南芥。7d后轉(zhuǎn)移到含有300mM甘露醇和125mM NaCl、150mM NaCl、175mM NaCl的I XMS瓊脂糖固體培養(yǎng)基上，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)8d。以水楊酸結(jié)合法測定轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗脯氨酸含量。結(jié)果如下圖6所示。[0089]由圖6可以看出，無論在干旱脅迫還是在NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的脯氨酸含量均高于野生型。隨著NaCl濃度的升高，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的脯氨酸的含量均呈增高的趨勢，而在相同脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量高于野生型，說明轉(zhuǎn)基因植株具有更強的抗逆能力。
[0090]3)成苗脯氨酸含量測定
[0091]分別將MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)IOd的轉(zhuǎn)基因植株(Tp9、Tpl4、Tpl5、Tpl6、Tp20和Τρ24)以及野生型幼苗移植到裝有定量營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，每個株系3缽，每缽移植4株，在室溫下緩苗7d，分組進行脅迫處理。對鹽脅迫處理組用300mmOl PNaCl水溶液澆灌營養(yǎng)土，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)至第12天，測定脯氨酸含量；對干旱處理組的控水措施是停止?jié)菜囵B(yǎng)14d，然后測定脯氨酸含量。
[0092]由圖7看出，NaCl脅迫12天后，野生型擬南芥生長狀態(tài)明顯差于轉(zhuǎn)基因株系，個別植株出現(xiàn)死亡。而轉(zhuǎn)基因株系相對生長快速，植株較野生型更壯。脯氨酸含量分析結(jié)果(圖8)顯示轉(zhuǎn)基因株系含有更高的脯氨酸含量，其抗鹽性優(yōu)于野生型擬南芥。
[0093]由圖9看出，干旱脅迫14天后，野生型擬南芥干枯，葉片發(fā)黃，有死亡植株出現(xiàn)。而轉(zhuǎn)基因株系雖然出現(xiàn)葉片邊緣發(fā)黃，但是均存活且生長狀況較佳。脯氨酸含量分析結(jié)果(圖10)顯示轉(zhuǎn)基因株系含有更高的脯氨酸含量，其抗旱性優(yōu)于野生型擬南芥。
[0094]4)成苗電導(dǎo)率測定
[0095]分別將MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)IOd的轉(zhuǎn)基因植株(Tp9、Tpl4、Tpl5、Tpl6、Tp20和Τρ24)以及野生型幼苗移植到裝有定量營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，每個株系3缽，每缽移植4株，在室溫下緩苗7d，分組進行脅迫處理。對鹽脅迫處理組用300mmOl PNaCl水溶液澆灌營養(yǎng)土，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)至第12天，測定電導(dǎo)率；對干旱處理組的控水措施是停止?jié)菜囵B(yǎng)14d，然后測定電導(dǎo)率。`
[0096]由圖11可知，脅迫條件下無論野生型還是轉(zhuǎn)基因擬南芥的電導(dǎo)率均增大，說明其細(xì)胞膜遭受不同程度的破壞。而在相同脅迫條件下，野生型電導(dǎo)率高于轉(zhuǎn)基因株系，其細(xì)胞膜破壞程度更高，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥具有優(yōu)于野生型的抗逆性。
[0097]應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶，其特征是，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì): (1)所述氨基酸殘基序列為:
MAILGELGTEILIPVCGVVGIVFAIAQWFIVSKVKVTPGAAAAGGSKNGYGDYLIEEEEGLNDHNVVVKCAEIQTAISEGATSFLFTMYQYVGMFMVVFAAVIFVFLGSIEGFSTKGQPCTYSTGTCKPALYTALFSTASFLLGAITSLVSGFLGMKIATYANARTTLEARKGVGKAFITAFRSGAVMGFLLSSSGLVVLYITINVFKMYYGDDffEGLFESITGYGLGGSSMALFGRVGGGIYTKAADVGADLVGKVERNIPEDDPRNPAVIADNVGDNVGDIAGMGSDLFGSYAESSCAALVVASISSFGINHDFTAMCYPLLVSSVGIIVCLLTTLFATDFFEIKAASEIEPALKKQLIISTALMTIGVAVISWLALPAKFTIFNFGAQKDVSNWGLFFCVAVGLWAGLIIGFVTEYYTSNAYSPVQDVADSCRTGAATNVIFGLALGYKSVIIPIFAIAVSIYVSFSIAAMYGIAMAALGMLSTMATGLAIDAYGPISDNAGGIAEMAGMSHRIRERTDALDAAGNTTAAIGKGFAIGSAALVSLALFGAFVSRAGVKVVDVLSPKVFIGLIVGAMLPYWFSAMTMKSVGSAALKMVEEVRRQFNTIPGLMEGTAKPDYATCVKISTDASIKEMIPPGALVMLTPLIVGTLFGVETLSGVLAGALVSGVQIAISASNTGGAWDNAKKYIEAGNSEHARSLGPKGSDCHKAAVI⑶TI⑶PLKDTSGPSLNILIKLMAVESLVFAPFFATYGGVLFRY1-: (2)將氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶活性和/或植物抗旱\抗鹽相關(guān)功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶，其特征是，一個或數(shù)幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的編碼基因，其特征是，該編碼基因是SEQ ID N0.2，其序列為:
ATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAGGCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGTAATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCCTGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCCTACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGGTTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACGGCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGTGACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGCTGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGTGCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGCCATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTCCGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCTCCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCTCTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCCAACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCCCCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATCGGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCCGTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGAGTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGCGTGCTGTTCAGGTACATCTAG,或是與 SEQ ID N0.2序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的應(yīng)用，其特征是，應(yīng)用在培育提高抗逆性的植物中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶的編碼基因的應(yīng)用，其特征是，應(yīng)用在培育提高抗逆性的植物中。
【文檔編號】C12N15/55GK103602644SQ201310544893
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】朱昀, 李朝煒, 劉穎, 魏景芳, 李冬杰 申請人:朱昀