專利名稱：一種基于膽固醇修飾的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及作為藥物遞送載體的一種基于膽固醇修飾衍生物制備的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體及其治療用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤一直是困擾人類的重要疾病，目前尚無治愈癌癥的方法。常用的化學(xué)藥物療法，由于其選擇性差，毒副作用大，在應(yīng)用上受到極大的限制。因此，開發(fā)一種能將化療藥物選擇性地濃集在腫瘤組織，并且將其高效地載入腫瘤細(xì)胞的具有腫瘤靶向性的載體就具有十分重要的意義。脂質(zhì)體因具有良好的生物相容性，對被包載的藥物具有保護(hù)作用以及良好的藥動學(xué)特征被認(rèn)為是非常有前途的腫瘤靶向載體。通常脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向可以通過兩種方式被動靶向和主動靶向。在脂質(zhì)體表面引入PEG后可以延長其循環(huán)時間，有利于其充分利用Era效應(yīng)蓄積在腫瘤組織，可實(shí)現(xiàn)被動靶向；在脂質(zhì)體表面連接配體或抗體，可以使脂質(zhì)體獲得主動靶向性。脂質(zhì)體要實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤靶向傳遞需在體內(nèi)需要經(jīng)歷以下過程脂質(zhì)體在腫瘤組織蓄積一脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞一進(jìn)入細(xì)胞后的傳遞過程。傳統(tǒng)的長循環(huán)材料PEG又像一道屏障，會妨礙脂質(zhì)體與細(xì)胞的直接作用，降低其進(jìn)入細(xì)胞的能力。所以PEG是一把雙刃劍， 能夠增大脂質(zhì)體在腫瘤組織的蓄積，賦予脂質(zhì)體被動靶向性，但卻不利于其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。 而一般修飾了配體的主動靶向脂質(zhì)體，在血液循環(huán)中，難以避免非特異性結(jié)合，配體的暴露常常導(dǎo)致脂質(zhì)體同血漿中的調(diào)理素結(jié)合，并最終被RES系統(tǒng)識別和清除。故一般的主動或被動靶向載體都存在一定的缺陷?，F(xiàn)有技術(shù)中，對于脂質(zhì)體的表面修飾是在磷脂上進(jìn)行的，如D0PE、DSPE等。由于磷脂大多帶負(fù)電荷，會導(dǎo)致其與血漿中的蛋白結(jié)合，從而降低長循環(huán)效果。而相比于磷脂，作為脂質(zhì)體另一主要材料的膽固醇具有其獨(dú)有的優(yōu)勢，膽固醇是電中性，可以避免這一問題。 同時，磷脂的化學(xué)穩(wěn)定性較膽固醇差，可能在循環(huán)過程中氧化或降解。最重要的是，磷脂的價格如DSPE的價格是膽固醇的100倍。因此，相對于磷脂修飾，對膽固醇進(jìn)行修飾之后制備靶向脂質(zhì)體是非常具有優(yōu)勢的。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述背景，為了克服一般被動或主動靶向脂質(zhì)體的不足，本發(fā)明提供了一種基于膽固醇修飾衍生物制得的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體。本發(fā)明所述的脂質(zhì)體既能夠充分利用聚乙二醇延長脂質(zhì)體循環(huán)時間和配體促進(jìn)脂質(zhì)體識別和進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢，又能夠克服配體的非特異性結(jié)合和聚乙二醇妨礙入胞的缺點(diǎn)。本發(fā)明的目的之一，提供一種基于膽固醇修飾衍生物的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體，主要由磷脂、膽固醇、膽固醇衍生物制成；進(jìn)一步優(yōu)選地主要由磷脂、膽固醇、修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物(Cho-PEG-X)和具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物(Cho-S-S-PEG)制得，其中基于總脂質(zhì)的摩爾百分比計(jì)，磷脂10% 90%、膽固醇 10% 90%、Cho-PEG-X 0. 1% 10% 和 Cho-S-S_PEG2% 20%。在某一實(shí)施方案中，優(yōu)選地，其中基于總脂質(zhì)的摩爾百分比計(jì)，磷脂30% 70%、膽固醇 10% 35%、Cho-PEG-X 0. 1% 5% 和 Cho-S-S-PEG 5% 10%。本發(fā)明所述的磷脂包括中性磷脂及帶電荷磷脂。所述中性磷脂及帶電荷磷脂，包括但不限于磷脂酰膽堿(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺 (腦磷脂)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂優(yōu)選卵磷脂。本發(fā)明的目的之一，提供一種基于膽固醇修飾衍生物的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體組合物，包含磷脂、膽固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性劑，其中基于總脂質(zhì)的摩爾百分比計(jì)，磷脂 10% 90%、膽固醇 10% 90%、Cho-PEG-X 0. 1% 10% 和 Cho-S-S_PEG2% 20%，如本領(lǐng)域所知的，活性劑的劑量可以依據(jù)包含在載體中的活性劑來調(diào)整。任何活性劑都可以包括在本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物中，例如，治療劑和/或顯像劑。本發(fā)明的活性劑可以是抗腫瘤劑。適合的抗腫瘤劑的例子包括但不限于，烷化劑、 抗代謝物、抗腫瘤抗生素、蒽環(huán)類抗生素、植物生物堿、紫杉醇的衍生物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、單克隆抗體、光敏劑、激酶抑制劑和含鉬化合物。本發(fā)明所述的Cho-PEG-X是修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物，該嵌合物是通過在膽固醇的3位羥基衍生一個游離的氨基后，利用該氨基與具有雙功能基團(tuán)的 PEG鏈一端的活性酯基團(tuán)反應(yīng)生成酰胺鍵，再將配體X連接在PEG鏈另一端的馬來酰亞胺基團(tuán)上制備而成的。其中，PEG分子量為約200-約50000，優(yōu)選為約1000、約2000、約5000等。其中，配體X包括TAT (人免疫缺陷病毒TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽)、R8 (八聚精氨酸)、R9 (九聚精氨酸)，LHRHa (促黃體激素釋放激素激動劑)，整合素配體RGD肽及其類似物、氨肽酶配體NGR肽及其類似物、T7、Tf (轉(zhuǎn)鐵蛋白)、Lf (乳鐵蛋白)、R)lic acid (葉酸)、抗HER2 等單克隆抗體。本發(fā)明所述的Cho-S-S-PEG是具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物，該嵌合物是通過在膽固醇的3位羥基衍生一個游離的氨基后，利用該氨基同交聯(lián)劑 3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)形成含二硫鍵的中間產(chǎn)物，再加入 PEG-SH發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)制備而成的。研究表明，腫瘤可以提供還原性的微環(huán)境。至少包括以下三種途徑(1)腫瘤死細(xì)胞釋放的谷胱苷肽(GSH) ； (2)分泌于腫瘤微環(huán)境中的硫氧還蛋白還原酶；(3)許多腫瘤過表達(dá)的氧化還原酶，谷氧還蛋白，硫氧還蛋白及其相應(yīng)的還原酶。此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的還原性水平可比正常細(xì)胞高100倍。在還原性條件下Cho-S-S-PEG中的PEG鏈可以從脂質(zhì)體表面斷裂脫離，克服了傳統(tǒng)PEG鏈修飾阻礙脂質(zhì)體入胞的缺陷，并且可以充分暴露出特異性或非特異性配體，介導(dǎo)脂質(zhì)體高效的進(jìn)入細(xì)胞。為了進(jìn)一步提高其還原性條件，也可以在給予本發(fā)明的脂質(zhì)體之后，再外源性給予還原性物質(zhì)(L-半胱氨酸(L-cys)、二硫蘇糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH))的刺激，促使 Cho-S-S-PEG中的PEG鏈可以從脂質(zhì)體表面斷裂脫離。Cho-S-S-PEG上-S_S_表示二硫鍵，該二硫鍵是通過交聯(lián)劑3_(2_吡啶二巰基) 丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)引入，再通過與PEG-SH發(fā)生的二硫鍵交換反應(yīng)得到的。 修飾于膽固醇上的聚乙二醇，其分子量在200-50000之間，且Cho-S-S-PEG中的PEG鏈比 Cho-PEG-X 中的長。本發(fā)明的目的之一，提供了一種對脂質(zhì)體的組成成分之一膽固醇進(jìn)行衍生化的方法，制備出一系列功能化的脂質(zhì)材料，包括修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物/ Cho-PEG-X和具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物/Cho-S-S-PEG。本發(fā)明的目的之一，提供了一種制備修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物/Cho-PEG-X的方法，包括通過在膽固醇的3位羥基衍生一個游離的氨基后，利用該氨基與具有雙功能基團(tuán)的PEG鏈一端的活性酯基團(tuán)反應(yīng)生成酰胺鍵，再將配體X連接在PEG鏈另一端的馬來酰亞胺基團(tuán)上制備而成的。優(yōu)選的具體方法步驟如下。1.膽固醇對甲苯磺酸酯的制備
在一密閉容器中，氬氣保護(hù)下，對甲苯磺酰氯、膽固醇以摩爾比例為1-2的投料量在無水吡啶中室溫反應(yīng)6-M小時，得到膽固醇對甲苯磺酸酯初產(chǎn)物，初產(chǎn)物經(jīng)減壓除去反應(yīng)溶劑后，加入水終止反應(yīng)，以氯仿萃取三次，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后，石油醚重結(jié)晶得到白色晶狀固體。2.膽固醇-醚鍵-二甘醇的制備
于密閉容器中，氬氣保護(hù)下，二甘醇、膽固醇對甲苯磺酸酯以摩爾比例為1-10的投料量在干燥1，4_二氧六環(huán)中，加熱回流反應(yīng)6- 小時，得到膽固醇-醚鍵-二甘醇初產(chǎn)物，初產(chǎn)物減壓除去反應(yīng)溶劑后，加入二氯甲烷溶解，飽和氯化鈉洗3次，5-10%碳酸氫鈉洗3次， 分離有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干后過硅膠柱純化后得淺黃色油狀物。3.膽固醇-醚鍵-二甘醇-鄰苯二甲酰亞胺的制備
于密閉容器中，氬氣保護(hù)下，以干燥的N，N- 二甲酰亞胺為溶劑，依次加入膽固醇-醚鍵-二甘醇、鄰苯二甲酰亞胺、三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯，且摩爾比例為1:5:5:5，室溫下反應(yīng)2-6小時，生成膽固醇-醚鍵-二甘醇-鄰苯二甲酰亞胺初產(chǎn)物，加入水終止反應(yīng)， 氯仿萃取3次，飽和食鹽水洗3次，5-10%碳酸氫鈉洗3次，分離有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后過硅膠柱純化得到白色晶體狀固體。4.膽固醇-醚鍵-二甘醇胺的制備
于密閉容器中，氬氣保護(hù)下，膽固醇-醚鍵-二甘醇-鄰苯二甲酰亞胺、一水合胼以摩爾比例為0. 2-1的投料量在吡啶中室溫反應(yīng)6-M小時，得到膽固醇-醚鍵-二甘醇胺初產(chǎn)物，用氯仿-水萃取分液，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后過硅膠柱純化得到淺黃色油狀固體。5.膽固醇-聚乙二醇-馬來酰亞胺/ Cho-PEG-MAL的制備
于密閉容器中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，膽固醇-醚鍵-二甘醇胺、馬來酰亞胺聚乙二醇乙酸琥珀酰亞胺NHS酯/NHS-PEG-MAL以摩爾比例為1_3的投料量在干燥二氯甲烷中，室溫避光反應(yīng) 6-24小時，得到膽固醇-聚乙二醇-馬來酰亞胺初產(chǎn)物，過濾后減壓旋干，乙腈沉淀，濾液旋干后得到無色油狀物。6. Cho-PEG-X 的制備
于密閉容器中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，膽固醇-聚乙二醇-馬來酰亞胺、配體X以摩爾比例為 0. 2-1的投料量在氯仿-甲醇(2:1)混合溶劑中，室溫下避光反應(yīng)2天，得到修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體初產(chǎn)物，過濾后減壓旋干，加入氯仿溶解后過濾，再減壓旋干得到無色油狀物。本發(fā)明的目的之一是提供了一種制備具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物/Cho-S-S-PEG的方法，包括通過在膽固醇的3位羥基衍生一個游離的氨基后，利用該氨基同交聯(lián)劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)形成含二硫鍵的中間產(chǎn)物，再加入巰基化的聚乙二醇(PEG-SH)發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)制備而成的。優(yōu)選的具體方法步驟如下。1.中間產(chǎn)物膽固醇-醚鍵-二甘醇胺的制備
其具體制備方法參照膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物制備方法1-4。2. Cho-S-S-PEG 的制備
于密閉容器中，氬氣保護(hù)下，膽固醇-醚鍵-二甘醇胺、交聯(lián)劑SPDP以摩爾比例為1-3 的投料量在氯仿中，室溫下反應(yīng)2-6小時，再加入PEG-SH，其與SPDP的摩爾比例為0. 2-1, 室溫下繼續(xù)反應(yīng)3天，得到具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇初產(chǎn)物，過硅膠柱純化得到白色粉末狀固體。上述這些材料制備出的脂質(zhì)體在血液循環(huán)中，能通過鏈長較長的Cho-S-S-PEG將特異性或非特異性配體充分屏蔽，保證其長循環(huán)效果，充分利用Era效應(yīng)蓄積于腫瘤組織之后，通過適當(dāng)?shù)倪€原性刺激，Cho-S-S-PEG中的PEG鏈從脂質(zhì)體表面斷裂脫離，暴露出配體，介導(dǎo)脂質(zhì)體高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。該系統(tǒng)是將聚乙二醇和配體修飾于脂質(zhì)體材料之一的膽固醇上，制備的一種穩(wěn)定性好，成本低，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的具有腫瘤靶向性的新型脂質(zhì)體。本發(fā)明的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體可以包含一種或多種活性劑。本發(fā)明使用的 “活性劑”包括期望被遞送到受試者的腫瘤部位的任何化合物。任何活性劑都可以用于實(shí)施本發(fā)明。抗腫瘤劑可以用作本發(fā)明脂質(zhì)體中的活性劑，適合的例子包括
烷化劑，例如，氮芥類(例如，苯丁酸氮芥、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥)，亞硝基脲類(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、鏈脲佐菌素)，含鉬化合物(例如， 卡鉬、順鉬、奧沙利鉬、BBR3464)，白消安，達(dá)卡巴嗪，雙氯乙基甲胺(Mechlorethamine)，甲基芐胼，替莫唑胺，塞替派和尿嘧啶氮芥；
抗代謝物，以例如，葉酸(例如氨基蝶呤、氨甲蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞)，嘌呤代謝 (例如克拉屈濱、氯法拉濱、氟達(dá)拉濱、巰基嘌呤、噴司他丁、硫鳥嘌呤)，嘧啶代謝(例如卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱)為靶點(diǎn)；
紡錘體毒素植物生物堿，例如，紫杉烷(例如多烯紫衫醇、紫杉醇)和長春花(例如長春花堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞賓)；
細(xì)胞毒性/抗腫瘤抗生素，例如，蒽環(huán)類抗生素(例如柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、米托蒽醌、戊柔比星、洋紅霉素、nacetyladriamycin、柔紅霉素苯腙、5-亞氨基柔紅霉素(5-imidodaunomycin)、N30乙酰柔紅霉素(acetyldaunomycin)和表柔比星)，博來霉素，絲裂霉素和放線菌素；
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，例如，喜樹堿類(例如喜樹堿、拓?fù)涮婵?、伊立替?，鬼白(例如依托泊苷、替尼泊苷)；
單克隆抗體或其片段，例如阿侖單抗(Alemtuzumab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、吉妥單抗(Gemtuzumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、利妥昔單抗 (Rituximab)、托西莫單抗(Tositumomab)禾口曲妥珠單抗(Trastuzumab)； 光敏劑，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、嚇吩姆鈉和維替泊芬； 激酶抑制劑，例如達(dá)沙替尼(Dasatinib)、埃羅替尼(Erlotinib)、吉非替尼 (Gefitinib)、伊馬替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)和凡德他尼(Vandetanib)； 酶，例如天冬酰胺酶、培門冬酶，和酶抑制劑，如羥基脲； 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，例如三氧化二砷、萬珂(Velcade)和奧利默森鈉(Genasense)； 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，例如地尼白介素(Denileukin Diftitox)；
抗激素，例如醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬(Tamoxiifen)、托瑞米芬、氟維司群、睪內(nèi)酯、阿那曲唑、依西美坦和來曲唑；以及類視黃醇，如9-順-視黃酸和全-反-視黃酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含多于一種的抗腫瘤劑，其中每種脂質(zhì)體包含不同的活性劑，例如不同的抗腫瘤劑。本發(fā)明的目的之一，提供一種還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體的組合物，包含磷脂、 膽固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性劑，其中，按重量百分比計(jì)算，活性劑占總脂質(zhì)的 1% 50%。在某一實(shí)施方案中，優(yōu)選地，提供一種還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體的組合物，包含磷脂、膽固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性劑，其中基于總脂質(zhì)摩爾百分比計(jì)，磷脂 30% 70%、膽固醇 10% 35%、Cho-PEG-X 0. 1% 5% 和 Cho-S-S-PEG 5% 10% ；其中，按重量百分比計(jì)算，活性劑占總脂質(zhì)的1% 50%。本發(fā)明的目的之一是提供了一種制備基于膽固醇修飾衍生物的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體組合物的方法，包括薄膜分散-超聲/過膜法，膠束插入法。本發(fā)明優(yōu)選地具體步驟如下。( 1)薄膜分散-超聲/過膜法制備空白脂質(zhì)體
使用磷脂、膽固醇、Cho-PEG-X和Cho-S-S-PEG為制備脂質(zhì)體的原料，將上述材料置于茄形瓶中，加入有機(jī)溶劑溶解后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將有機(jī)溶劑抽干，再將茄形瓶放在真空干燥器中1-6小時，充分除去有機(jī)溶劑，向茄形瓶中加入磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、硫酸銨溶液等水化液，在37飛0°C下，于搖床上水化1小時，用擠壓過膜或者超聲等方法將脂質(zhì)體粒徑控制在IOOnm左右，得空白脂質(zhì)體；
或者(1)膠束插入法制備空白脂質(zhì)體
使用磷脂、膽固醇、Cho-S-S-PEG為制備脂質(zhì)體的原料，將上述材料置于茄形瓶中，加入有機(jī)溶劑溶解后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將有機(jī)溶劑抽干，再將茄形瓶放在真空干燥器中1-6 小時，充分除去有機(jī)溶劑，向茄形瓶中加入磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、硫酸銨溶液等水化液，在37飛0°C下，于搖床上水化1小時，用擠壓過膜或者超聲等方法將脂質(zhì)體粒徑控制在IOOnm 左右，得到母脂質(zhì)體。再將Cho-PEG-X制備成膠束后插入到母脂質(zhì)體中孵育即得。(2)空白的脂質(zhì)體的載藥
若為包載紫杉醇等脂溶性藥物，則需將藥物和脂質(zhì)材料一同置于茄形瓶中，其余步驟同空白脂質(zhì)體的制備，或者；
若為包載鹽酸阿霉素等水溶性藥物，則應(yīng)在水化過程中，加入10(T500mM的硫酸銨水化液水化脂質(zhì)體，得到空白或母脂質(zhì)體后，過G50葡聚糖凝膠柱，收集空白脂質(zhì)體懸液，再同含藥物的水溶液孵育即得。本發(fā)明所述的脂質(zhì)體可制備成口服給藥、透皮給藥、粘膜給藥、皮下注射、肌肉注射及靜脈注射的藥物制劑形式。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以使用任何適當(dāng)?shù)耐緩较蚴茉囌呓o藥，例如，靜脈內(nèi)給藥、動脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、側(cè)腦室內(nèi)給藥、鼻腔噴霧、肺吸入，口服給藥以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它適合的給藥途徑?？梢岳帽景l(fā)明的方法治療的組織包括但不限于，鼻、肺、肝、腎、骨骼、軟組織、肌肉、腎上腺組織和乳房?？梢员恢委煹慕M織包括癌組織、其它患病或受損組織(compromised tissue)，以及如果需要健康組織也可以被治療。也可以在給予本發(fā)明脂質(zhì)體治療劑6-7 之后，再外源性給予還原性物質(zhì)(L-半胱氨酸(L-cys)、二硫蘇糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH))的刺激。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定利用本發(fā)明的脂質(zhì)體向受試者給予活性劑的劑量，并且該劑量適于在延長的時間周期內(nèi)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥，例如在大約1分鐘至幾小時，例如，2、3、 4、6、M或更多小時。本發(fā)明所使用的“大約”表示當(dāng)其用于修飾數(shù)值時有10%的變化量。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案。圖1本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1-為Cho-S-S-PEG，2-為Cho_PEG_X。圖2本發(fā)明的產(chǎn)品到達(dá)腫瘤組織后，在還原性條件下，Cho-S-S-PEG中的二硫鍵斷裂，PEG從脂質(zhì)體表面脫落后的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3小鼠結(jié)腸癌以6細(xì)胞對各處方脂質(zhì)體的攝取情況比較
圖 3 中 1-為 Blank 組，2-為 L-LIP 組，3-為 NC-LIP 組，4-為 CL-LIP (-)組，5-為小鼠結(jié)腸癌 CL-LIP+10 mM L-cys 組，6-為 CL-LIP+10 mM DTT 組。圖4各處方脂質(zhì)體在荷瘤小鼠中的腫瘤分布情況比較。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1. Cho-S-S-PEGmnn的具體制備實(shí)施。1.膽固醇對甲苯磺酸酯的制備
在500ml的圓底燒瓶中，加入350ml無水吡啶，再分別加入對甲苯磺酰氯 35. 0g(184mmol)、膽固醇38. Og (98mmol)，氬氣保護(hù)下，室溫反應(yīng)16小時，得到膽固醇對甲苯磺酸酯初產(chǎn)物，初產(chǎn)物經(jīng)減壓除去反應(yīng)溶劑后，加入IOOml水終止反應(yīng)，以氯仿萃取三次，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后，石油醚重結(jié)晶得到42. 5g(79. 9%)標(biāo)題化合物， 為白色晶狀固體。2.膽固醇-醚鍵-二甘醇的制備
在500ml的圓底燒瓶中，加入200ml的干燥1，4-二氧六環(huán)，再分別加入膽固醇對甲苯磺酸酯42. 5g (78. 7mmol)、二甘醇60ml (632. 4mmol)，氬氣保護(hù)下，加熱回流反應(yīng)M小時，得到膽固醇-醚鍵-二甘醇初產(chǎn)物，初產(chǎn)物減壓除去反應(yīng)溶劑后，加入二氯甲烷溶解，飽和氯化鈉洗3次，5%碳酸氫鈉洗3次，分離有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓抽干后過硅膠柱純化后得到標(biāo)題化合物30. 9g(75. 0%)，為淺黃色油狀物。3.膽固醇-醚鍵-二甘醇-鄰苯二甲酰亞胺的制備
在500ml的圓底燒瓶中，加入220ml的干燥N，N- 二甲酰亞胺，再分別加入膽固醇-醚鍵-二甘醇8. 3g(17. 4mmol)、鄰苯二甲酰亞胺12. 8g(87. Immo 1)、三苯基磷 22. 8g(86. 9mmol)、偶氮二甲酸二乙酯13. 7g(86. 9mmol)，氬氣保護(hù)下，室溫反應(yīng)4小時，生成膽固醇-醚鍵-二甘醇-鄰苯二甲酰亞胺初產(chǎn)物，加入水終止反應(yīng)，氯仿萃取3次，飽和食鹽水洗3次，5%碳酸氫鈉洗3次，分離有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后過硅膠柱純化得到標(biāo)題化合物9. Sg(90. 6%),為白色晶體狀固體。4.膽固醇-醚鍵-二甘醇胺的制備
在IOOml的圓底燒瓶中，加入40ml的吡啶，再分別加入膽固醇-醚鍵-二甘醇-鄰苯二甲酰亞胺1. 4g(l. 9mmol)、一水合胼460ul (9. 5mmol)，氬氣保護(hù)下，室溫反應(yīng)M小時，得到膽固醇-醚鍵-二甘醇胺初產(chǎn)物，用氯仿-水萃取分液，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后過硅膠柱純化得到標(biāo)題化合物0. 79g(85. 0%)，為淺黃色油狀固體。5. Cho-S-S-PEG5000 的制備
在25ml圓底燒瓶中，加入12ml氯仿，再分別加入膽固醇-醚鍵-二甘醇胺 47. 3mg(0. lmmol)、三乙胺 109ul (0. 65mmol)、交聯(lián)劑 SPDP 25mg(0. 07mmol)，氬氣保護(hù)下，室溫反應(yīng)6小時后，加入PEG5_-SH 165mg(0. 03mmol)，室溫下繼續(xù)反應(yīng)3天，得到 Cho-S-S-PEG5000初產(chǎn)物，過硅膠柱純化得到標(biāo)題化合物114. 9mg(63. 9%)，為白色粉末狀固體。(TOF MS ES+(m/z) :5772. 0)
類似方法制得，Cho-S-S-PEG2000, Cho-S-S-PEG300O > Cho-S-S-PEG40000實(shí)施例2. Cho-PEG-X的具體制備實(shí)例
1.膽固醇-醚鍵-二甘醇胺的制備具體制備過程同實(shí)施例1
2.Cho-PE(i2_-MAL 的制備
在25ml圓底燒瓶中，加入5ml 二氯甲烷，再分別加入膽固醇-醚鍵-二甘醇胺 28. 4mg(0. 06mmol)、干燥三乙胺 65ul (0. 39mmol),NHS-PEG2000-MAl 80mg(0. 04mmol,)氬氣保護(hù)下，避光室溫反應(yīng)M小時，得到Cho-PEG2cicitl-MAL初產(chǎn)物，過濾后減壓旋干，乙腈沉淀，濾液旋干后得到標(biāo)題化合物86. 3mg(87. 5%)，為無色油狀物。3. Cho-PEG2000-R8 的制備
在25ml圓底燒瓶中，加入^il氯仿，再加入Cho-PE(i2_-MAL 20. Omg (7. lumol)、干燥三乙胺6ulC35.8mm0l)，再將R8 14. 7mg(10. 7umol)溶解于^il甲醇后加入圓底燒瓶中，室溫下避光反應(yīng)2天，得到Cho-PE(i2_-I 8初產(chǎn)物，過濾后減壓旋干，加入氯仿溶解后過濾，再減壓旋干得到標(biāo)題化合(94.6%)。為無色油狀物。(TOF MS ES+(m/z) :4170. 0)
基于實(shí)施例2的相同方法，PEG選自200-50000時，當(dāng)X選自TAT、RGD等時，類似制得以下實(shí)施例所用的各個具體的Cho-PEG-X。實(shí)施例3 . TAT修飾的還原敏感性脂質(zhì)體的制備
以磷脂、膽固醇、修飾了細(xì)胞穿膜肽TAT的膽固醇-聚乙二醇/Cho-PEGicicitl-TAT, Cho-S-S-PEG5_為材料，制備腫瘤靶向脂質(zhì)體。分別稱取磷酯1. 5mg、膽固醇0. 3mg, Cho-PEG1000-TAT 0. lmg、Cho-S-S-PEG5ticitl 1. Img 溶于適量二氯甲烷，37°C水浴下，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出二氯甲烷，形成均勻脂質(zhì)膜，加入ImlPBS緩沖液水化1小時，探頭超聲(10s，10s, 15 次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得TAT修飾的還原敏感性脂質(zhì)體。實(shí)施例4. R0修飾的還原敏感性脂質(zhì)體的制備
以磷脂、膽固醇、修飾了細(xì)胞穿膜肽&的膽固醇-聚乙二醇/Cho-PEG2cicitl-R8, Cho-S-S-PEG5cicitl為材料，制備腫瘤靶向脂質(zhì)體。分別稱取磷酯1. 7mg、膽固醇0. 34mg、 Cho-PEG2000-R8 0. 15mg、Cho-S-S-PEG5000 1. 6mg溶于適量二氯甲烷，水浴下，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去二氯甲烷，形成均勻脂質(zhì)膜，加入ImlPBS緩沖液水化1小時，探頭超聲(10s，10s, 15 次)。再依次擠壓通過400nm，200nm和IOOnm聚碳脂膜，得&修飾的還原敏感性脂質(zhì)體。實(shí)施例5. RGD修飾的還原敏感性脂質(zhì)體的制備
以磷脂、膽固醇、修飾了 RGD的膽固醇-聚乙二醇/Ch0-PE(i2(1(1(1-RGD，Ch0-S-S-PE(;5(1(1(1為材料，制備腫瘤靶向脂質(zhì)體。分別稱取磷酯1. 5mg、膽固醇0. 3mg, Cho-PEG2000-RGD 0. 4mg, Cho-S-S-PEG5_ 1.6mg溶于適量二氯甲烷，水浴下，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去二氯甲烷，形成均勻脂質(zhì)膜，加入ImlPBS緩沖液水化1小時，探頭超聲(10s，10s, 15次)。再依次擠壓通過 400nm, 200nm和IOOnm聚碳脂膜，得RGD修飾的還原敏感性脂質(zhì)體。實(shí)施例6. Tf修飾的還原敏感性脂質(zhì)體的制備
以磷脂、膽固醇、修飾了 Tf的膽固醇-聚乙二醇/Ch0-PE(i2(1(1(1-Tf，Ch0-S-S-PE(;5(1(1(1為材料，制備腫瘤靶向脂質(zhì)體。分別稱取磷酯3. %ig、膽固醇0. 7mg, Cho-S-S-PEG5000 3 . 2mg溶于適量二氯甲烷，水浴下，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去二氯甲烷，形成均勻脂質(zhì)膜，加入ImlPBS緩沖液水化1小時，探頭超聲(10s，10s, 15次)得到脂質(zhì)體A。Cho-PEG2000-Tf 5. 26mg溶于適量二氯甲烷，水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，形成均勻脂質(zhì)膜，加入ImlPBS緩沖液于37°C 水化1小時得到膠束B。將膠束B與脂質(zhì)體A混合，60°C下孵育30分鐘，即得Tf修飾的還原敏感性脂質(zhì)體。實(shí)施例7.包載水溶性抗癌藥物鹽酸阿霉素的脂質(zhì)體的制備及小鼠結(jié)腸癌以6細(xì)胞攝取
表1脂質(zhì)體處方
權(quán)利要求
1.一種基于膽固醇修飾衍生物的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體，其特征在于主要由磷脂、膽固醇、膽固醇衍生物制成；進(jìn)一步優(yōu)選地主要由磷脂、膽固醇、修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物(Ch0-PEG-X)和具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物(Cho-S-S-PEG)制得，其中基于總脂質(zhì)的摩爾百分比計(jì)，磷脂10% 90%、膽固醇10% 90%、Cho-PEG-X 0. 1% 10% 和 Cho-S-S_PEG2% 20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，其中基于總脂質(zhì)的摩爾百分比計(jì)，磷脂 30% 70%、膽固醇 10% 35%、Cho-PEG-X 0. 1% 5% 和 Cho-S-S-PEG 5% 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述磷脂選自中性磷脂及帶電荷磷脂，包括但不限于磷脂酰膽堿(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；所述磷脂優(yōu)選卵磷脂。
4.一種Cho-PEG-X化合物，其特征在于其是修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物，該嵌合物是通過在膽固醇的3位羥基衍生一個游離的氨基后，利用該氨基與具有雙功能基團(tuán)的PEG鏈一端的活性酯基團(tuán)反應(yīng)生成酰胺鍵，再將配體X連接在PEG鏈另一端的馬來酰亞胺基團(tuán)上制備而成的。
5.一種Cho-S-S-PEG化合物，其特征在于其是具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物，該嵌合物是通過在膽固醇的3位羥基衍生一個游離的氨基后，利用該氨基同交聯(lián)劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)形成含二硫鍵的中間產(chǎn)物， 再加入PEG-SH發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)制備而成的。
6.一種基于膽固醇修飾衍生物的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體和活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體組合物，其特征在于所述活性劑可以是抗腫瘤劑；包括但不限于，烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、蒽環(huán)類抗生素、植物生物堿、紫杉醇的衍生物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、單克隆抗體、光敏劑、激酶抑制劑和含鉬化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的脂質(zhì)體的組合物，其特征在于，包含磷脂、膽固醇、 Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性劑，其中基于總脂質(zhì)摩爾百分比計(jì)，磷脂30% 70%、膽固醇 10% ；35%、Cho-PEG-X 0. 1% 5%和Cho-S-S-PEG 5% 10% ；其中，按重量百分比計(jì)算，活性劑占總脂質(zhì)的1% 50%。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體組合物，進(jìn)一步包含外源性的還原性物質(zhì)如L-半胱氨酸(L-cys)、二硫蘇糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH))，促使Cho-S-S-PEG中的PEG鏈可以從脂質(zhì)體表面斷裂脫離。
10.一種制備權(quán)利要求6所述的基于膽固醇修飾衍生物的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體組合物的方法，包括薄膜分散-超聲/過膜法，膠束插入法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于膽固醇修飾的還原敏感性腫瘤靶向脂質(zhì)體，所述的脂質(zhì)體由磷脂、膽固醇、膽固醇衍生物(包括修飾有配體的膽固醇-聚乙二醇-配體嵌合物/Cho-PEG-X和具有二硫鍵的還原敏感性膽固醇-聚乙二醇嵌合物/Cho-S-S-PEG)組成，該脂質(zhì)體既能夠充分利用聚乙二醇延長脂質(zhì)體循環(huán)時間和配體促進(jìn)脂質(zhì)體識別和進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢，又能夠克服配體的非特異性結(jié)合和聚乙二醇妨礙入胞的缺點(diǎn)，是一種有很有潛力的用于腫瘤靶向治療的載體。并且與在磷脂上進(jìn)行修飾所得的脂質(zhì)體相比，具有穩(wěn)定性更好，成本更低，更易于產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K47/34GK102266288SQ20111019732
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者何勤, 唐潔, 覃瑤 申請人:四川大學(xué)