專利名稱：一種車前子多糖提取物的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥車前子多糖提取物的制備方法和該車前子多糖提取物通過 免疫抑制活性，用于治療與免疫炎性損傷相關(guān)的疾病腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水 腫、以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
^Ι Γ^^^Ι Γ^Ι^ Ι Plantago asiatica L. ^^F^lif Plantago depressa ffilld.的干燥成熟種子。性味甘、寒，入腎、膀胱經(jīng)，具有利水、清熱、明目，祛痰的功效，用于 小便不通，淋濁帶下，尿血，暑濕瀉痢，咳嗽多痰，濕痹，目赤障翳等病，臨床上應(yīng)用廣泛?，F(xiàn) 在化學(xué)研究普遍認(rèn)為，車前子含多量黏液質(zhì)、車前子酸、車前子甙、車前烯醇酸、琥珀酸、腺 嘌呤、膽堿、梓醇、蛋白質(zhì)及各種脂肪酸等成分，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的小分子化學(xué)成分很難解釋車 前子的臨床效能，車前子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還不明確。本發(fā)明通過深入的化學(xué)、藥理、藥效學(xué) 研究，發(fā)明了一種制備車前子多糖的新方法，該方法操作簡單，經(jīng)濟(jì)節(jié)能，并且能得到較高 純度和較大含量的車前子多糖；同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)車前子多糖具有免疫抑制活性，可用于治療 與免疫炎性損傷相關(guān)的各種疾病，包括腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫，以及眼葡萄 膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病，車前子多糖應(yīng)為車前子的重要藥效物質(zhì) 基礎(chǔ)，這是一直以來被研究者所忽視的，車前子多糖的效能可以解釋車前子的傳統(tǒng)藥效和 應(yīng)用。目前，雖有關(guān)于車前子多糖抗氧化、清除自由基的發(fā)明報(bào)道，但與本專利在多糖的制 備、精制工藝上，尤其是藥效作用機(jī)制上、用途上均有較大不同；另外，車前子多糖用于補(bǔ)充 膳食纖維的發(fā)明也與本發(fā)明截然不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種具有確切的免疫抑制活性，無毒副作用的車前子多糖 提取物的制備方法。本發(fā)明目的之二是將上述車前子多糖提取物制成各種劑型的免疫抑制劑或作為 制備其他免疫抑制藥物的原料藥，用于治療與免疫炎性損傷相關(guān)的疾病腎炎、膀胱炎、前 列腺炎、尿道炎、水腫、以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病的醫(yī)藥 用途。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種車前子多糖提取物的制備方法，其特征在于車前子原料藥材脫脂后，再經(jīng)過 水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分 子化學(xué)成分，制成較高純度的車前子多糖提取物。一種車前子多糖提取物的制備方法，其包括以下具體步驟(1)將車前子用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質(zhì)；(2)殘?jiān)铀亓魈崛。瑸V液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀；
(3)沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(4)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，透析；(5)透析液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀；(6)沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(7)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，采用弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂串聯(lián)法脫去 多糖中的色素和蛋白質(zhì)，即得車前子多糖提取物。為了達(dá)到更好的提取效果，優(yōu)選的，步驟(1)中將車前子用6 12倍重量的80 95%乙醇回流脫脂2 3次，每次回流2 池；步驟⑵中將殘?jiān)? 12倍重量的蒸 餾水回流提取2 3次，每次回流提取2 3h，將濾液濃縮至藥材0. 2 1. 0體積，加入 80 95%乙醇醇沉，離心得沉淀；步驟C3)、(6)中將沉淀依次用2 4倍重量的無水乙 醇，丙酮分別洗滌；步驟中的沉淀以0.5 2倍重量的蒸餾水復(fù)溶，以分子量大小為 3. OXlO3-L 2 X IO4的透析袋透析24 72h。將從車前子中分離出的多糖依次采用DEAE-kpharose F. F和DEAE-52離子交換 色譜柱(洗脫相為0. Ι-lmol/L的NaCl溶液)，收集液可以選擇但不限于如下瓊脂糖凝膠柱 色譜做進(jìn)一步純化分離S印hadex G50、S印hacryl S100、S印hacryl 200、S印hacryl S300 *kphaCrylS400(洗脫相為0. 1-lmol/L NaCl溶液)。本發(fā)明車前子多糖提取物中總多糖 的含量占提取物重量百分比的72 %以上，進(jìn)一步純化甚至可以得到車前子單體多糖。本發(fā)明中所述的車前子包括車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前 Plantago depressa Willd.的干燥成熟種子。所述的車前子多糖提取物，具有免疫抑制活性對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能呈 抑制作用，提示具有非特異性免疫抑制功能；降低綿羊紅細(xì)胞所致實(shí)驗(yàn)大鼠溶血素生成的 含量，表示具有體液免疫抑制功能。車前子多糖提取物通過免疫抑制機(jī)制，可用于治療與免 疫炎性損傷相關(guān)的疾病腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫、以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì) 炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病的醫(yī)藥用途。車前子多糖提取物可以用作制備各種劑型的免疫抑制劑或作為制備其他免疫抑 制藥物的原料藥，該藥物組合物由有效量的車前子多糖提取物與藥學(xué)上可接受的載體、賦 型劑或稀釋劑配合而成，以常規(guī)的中藥制劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑，例如可 以是注射劑、口服制劑等。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1取車前子藥材約^ig, 90%乙醇回流提取3次，每次2h，過濾，將濾渣晾干，殘?jiān)?蒸餾水12倍量，回流提取3次，每次池，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至藥材1倍體積，用 95%乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉淀依次用4倍量無水乙醇、 丙酮洗滌，得總多糖。取總多糖加水溶解，上清液用分子量為3500的透析袋透析48h，透析液減壓濃縮至藥材1體積，加入95%乙醇調(diào)含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心， 沉淀用4倍量無水乙醇、丙酮依次洗滌，蒸餾水復(fù)溶，進(jìn)行弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂 (Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脫去總多糖中色素和蛋白質(zhì)，冷凍干燥，得精制車 前多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm處，紫外分光光度法測定總多糖含量，以葡萄糖C6H12O6 計(jì)為75%。實(shí)施例2取車前子藥材約3kg，80%醇回流提取2次，每次池，過濾，將濾渣晾干，殘?jiān)诱?餾水10倍量，回流提取2次，每次3h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至藥材1倍體積，用 95%乙醇調(diào)至醇含量為85%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉淀依次用4倍量無水乙醇、丙 酮洗滌，得總多糖。取總多糖加水溶解，上清液用分子量為7000的透析袋透析48h，透析液 減壓濃縮至藥材1體積，加入95%乙醇調(diào)含醇量為85%，靜止過夜，2000rpm/min離心，沉 淀用4倍重量無水乙醇、丙酮依次洗滌，蒸餾水復(fù)溶，進(jìn)行弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂 (Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脫去總多糖中色素和蛋白質(zhì)冷凍干燥，得精制車 前子多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm處，紫外分光光度法測定總多糖含量，以葡萄糖C6H12O6 計(jì)為72%。實(shí)施例3制成輸液劑將總多糖經(jīng)過瓊脂糖凝膠柱kphacryl S300,Sephadex G50色譜做進(jìn)一步純化分 離得到98%純度以上的車前子多糖提取物，加入適量增溶劑，研磨，再加入少量注射用水 進(jìn)行稀釋，混勻，然后加入氯化鈉適量，溶解后再加注射用水至規(guī)定量，濾過，灌封，滅菌，即得。實(shí)施例4制成片劑取車前子多糖提取物適量，加入稀釋劑、崩解劑等輔料適量，混勻，制成顆粒，干 燥，壓制成片，包衣或噴薄膜衣即得。實(shí)驗(yàn)例1車前子多糖對小鼠溶血素抗體生成(比色法)的影響試驗(yàn)取昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，即空白對照組、模型對照組、多糖低劑量 組和多糖高劑量組，每組10只。每日腹腔注射多糖1次，連續(xù)14天。除空白對照組外，其余 各組每只小鼠給8次藥后腹腔注射綿羊紅細(xì)胞懸液0. 2ml/只(約4億個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行免疫， 用生理鹽水將血清按1 300比例稀釋，將稀釋后的小鼠血清1.0ml，綿羊紅細(xì)胞0.5ml，加 入試管中，再加入經(jīng)生理鹽水1 10稀釋的豚鼠血清1.0ml，空白對照以等體積生理鹽水代 替小鼠血清，置試管于37度水浴lOmin，取出試管置于冰水浴中，以終止反應(yīng)，冷卻后離心。 將離心后上清液1. Oml，都氏液3. Oml加入試管中，混勻后靜止lOmin，在MOnm處測定吸收 度值。另在試管中加入0. 25ml綿羊紅細(xì)胞和都氏液3. 75ml測定綿羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)的 吸收度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1 車前子多糖對小鼠溶血素抗體生成的影響(X±S，n = 10)
權(quán)利要求
1.一種車前子多糖提取物的制備方法，其特征在于所述車前子多糖提取物中總多糖 的含量占提取物重量百分比的72 %以上。
2.一種車前子多糖提取物的制備方法，其特征在于車前子原料藥材脫脂后，再經(jīng)過 水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化 學(xué)成分，制成較高純度的車前子多糖提取物。
3.—種權(quán)利要求1、2所述的車前子多糖提取物的制備方法，包括以下步驟(1)將車前子用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質(zhì)；(2)殘?jiān)铀亓魈崛?，濾液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀；(3)沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(4)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，透析；(5)透析液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得多糖沉淀；(6)多糖沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(7)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，采用弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂串聯(lián)法脫去多糖 中的色素和蛋白質(zhì)，即得車前子多糖提取物。
4.按照權(quán)利要求2、3所述的方法，其特征在于步驟(1)中將車前子用6 12倍重量 的80 95%乙醇回流脫脂2 3次，每次回流2 池；步驟O)中將殘?jiān)? 12倍重 量的蒸餾水回流提取2 3次，每次回流提取2 池，將濾液濃縮至藥材0. 2 1. 0體積， 加入80 95%乙醇醇沉，離心得沉淀；步驟C3)、(6)中將沉淀依次用2 4倍重量的無水 乙醇，丙酮分別洗滌；步驟中的沉淀以0. 5 2倍重量的蒸餾水復(fù)溶，以分子量大小為 3. OXlO3-L 2X IO4的透析袋透析24 72h。
5.按照權(quán)利要求1、2、3所述的車前子多糖提取物，具有免疫抑制活性，可以用作制備 各種劑型的免疫抑制劑或作為制備其他免疫抑制藥物的原料藥，用于治療與免疫炎性損傷 相關(guān)的疾病腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫、以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移 植排異反應(yīng)等眼部疾病的醫(yī)藥用途。
6.按照權(quán)利要求1、2、5所述的車前子多糖提取物，其特征在于，所述的車前子包括車 前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥成熟種 子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種車前子多糖提取物的制備方法和醫(yī)藥用途。制備方法包括原料脫脂后，再經(jīng)過水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學(xué)成分，制成較高純度的車前子多糖提取物。本發(fā)明提取物中車前子多糖的含量以葡萄糖計(jì)，所述多糖的含量占車前子提取物重量百分比72％以上。本發(fā)明通過大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，車前子多糖提取物具有免疫抑制活性，可以用作制備各種劑型的免疫抑制劑或作為制備其他免疫抑制藥物的原料藥，用于治療與免疫炎性損傷相關(guān)的疾病腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水腫，以及眼葡萄膜炎、角膜基質(zhì)炎、角膜移植排異反應(yīng)等眼部疾病的醫(yī)藥用途。
文檔編號(hào)A61K36/68GK102138981SQ201110081719
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者匡海學(xué), 夏永剛, 楊炳友, 王秋紅, 舒尊鵬, 薛娟 申請人:匡海學(xué)