專利名稱：：一種獼猴桃根多糖提取物的制備方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種獼猴桃根多糖提取物(包括獼猴桃根粗多糖與獼猴桃根精制多糖)的制備方法。(二)
背景技術(shù)：
：獼猴t兆根(RadixActinidiaChinensis)，為中華獼猴申兆(ActindiachinensisPlanch)的根，又名藤梨根，收載于《中國藥典》(1977年版)，具有清熱、利尿、活血、消腫等作用，臨床上主要用于治療胃腸道腫瘤及乳腺癌，瘡癤，瘰疬結(jié)核，肝炎等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃根中的多糖成分-中華獼猴桃根多糖(ActindiaChinensisPlanchPolysaccharide,ACPS)具有抗腫瘤、增強免疫機能、消除活性氧自由基等作用，且無副作用。近年來，對于獼猴桃根多糖的藥理研究已有文獻報道，閻家麒等發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃根提取物對超氧自由基的去除能力與SOD相同，對氫自由基的去除能力比VC略強。張菊明、林佩芳等研究表明獼猴桃根多糖復合物可以抑制小鼠腫瘤的增長以及增強細胞天然殺傷功能，并且對于宿主具有保護作用，機體特異抗菌抗體的水平，激活巨噬細胞的吞噬功能。目前，獼猴桃根多糖提取物的制備主要采用以下兩種方法方法1:獼猴桃根藥材加20倍的水加熱提取，每次0.5h，提取2次，水提液加入乙醇使含醇量達80%(v/v)，靜置過夜，抽濾，得沉淀。這種方法制備的獼猴桃根多糖提取物提取率低，純度低，藥效活性低，顏色深、質(zhì)量差，能耗大，成本高。方法2:是本專利發(fā)明人申請(并授權(quán))的專利，專利公告號CN1067258C，具體方法獼猴桃根藥材加28倍量2050%(v/v)的乙醇浸漬13次，每次1830小時，靜置，取上清液，合并，加乙醇調(diào)至含乙醇量為6095%(v/v)，靜置24小時，離心，沉淀物再加27倍量5080%乙醇(v/v)、無水乙醇各洗一次，棄去洗液，沉淀物再加24倍量乙醚洗滌一次，棄去乙醚液，沉淀物室溫減壓干燥。它的缺點是獼猴桃根多糖提取率、純度與藥效活性較低，能耗大，操作繁瑣，耗時長，成本高，而且由于使用了乙醚，增加了安全隱患。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種工藝簡便，提取率高，純度高，藥效活性高，能耗小、成本低的獼猴桃根多糖提取物的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種獼猴桃根多糖提取物的制備方法，所述的方法包括取干燥獼猴桃根(RadixActinidiaChinensis)(含飲片)以水加熱回流提取，提取液高速離心(轉(zhuǎn)速500025000r/min，時間530min)除去不溶物，上清液先用截留分子量為3000000Da的膜超濾除去蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)；超濾液再用截留分子量為5000Da的膜超濾除去無機鹽、氨基酸、小分子色素等小分子雜質(zhì)，同時除去濾液中的部分水份，濃縮至所得濃縮液中藥材含量為0.15g/mL，濃縮液加入乙醇至乙醇濃度為5090%(v/3v)，靜置醇沉，離心，取沉淀洗滌后干燥，即得所述獼猴桃根(粗)多糖。獼猴桃根粗多糖，還可進一步采用以下純化步驟(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配制成水溶液，水溶液采用聚酰胺或活性炭或硅藻土等脫色劑脫色，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱(可除去蛋白質(zhì)，多肽，核酸等雜質(zhì))或DEAE纖維素柱(可除去多糖中的蛋白質(zhì)，多肽，核酸等雜質(zhì))，以NaCl溶液洗脫，洗脫液采用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽并濃縮，得濃縮液；(3)濃縮液干燥即得獼猴桃根多糖。上述步驟(2)中的大孔吸附樹脂柱和DEAE纖維素柱純化技術(shù)可以單獨使用，也可以兩項聯(lián)用，即步驟(2)可重復進行，通常先用大孔吸附樹脂純化，再用DEAE纖維素柱純化。以上所述大孔吸附樹脂的型號可以是AB-8型，MG-1型，LSA-5B型，X-5型，H107型，S-8型，D900型，HPSIP1300型，SIP1400型，NKA-9型，DM130型或D3520型等，所述DEAE纖維素可以是DEAE-32或DEAE-52。具體的，優(yōu)選的，所述的方法按如下步驟進行取干燥獼猴桃根，加入質(zhì)量為獼猴桃根質(zhì)量630倍的水，加熱回流提取13次、每次13小時，合并提取液，500025000r/min離心10min30min，除去不溶物，上清液過0.20.8iim孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量5000Da的膜超濾，濃縮至所得濃縮液中生藥材含量為0.22g/mL，濃縮液在2545。C下加入8595%乙醇至乙醇體積濃度為6080%，靜置672小時，500025000r/min離心10min20min，取沉淀以無水乙醇洗滌13次，洗滌后的沉淀6080°C真空干燥，得到所述獼猴桃根粗多糖。獼猴桃根粗多糖純化步驟如下(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配制成水溶液，水溶液按藥脂比5070mg:lg加入聚酰胺吸附脫色，調(diào)pH至56，在室溫下振搖5060min，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液采用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽并濃縮，得濃縮液1;所述大孔樹脂的型號為下列之一AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；(3)步驟(1)濾液或步驟(2)濃縮液1上DEAE纖維素柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液采用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽并濃縮，得濃縮液2;(4)濃縮液1或濃縮液2干燥即得獼猴桃根多糖。本發(fā)明主要采用高速離心結(jié)合超濾、柱層析等分離、純化技術(shù)，對獼猴桃根多糖的制備方法進行了改進。本發(fā)明集成了超濾法與柱層析等技術(shù)的優(yōu)點，以藥效作用為指標，最大限度的除去無機鹽、氨基酸、小分子色素等小分子雜質(zhì)，與蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)。該方法是一個純物理過程，條件溫和，節(jié)能環(huán)保，適合工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明方法將獼猴桃根水提液離心、微濾后，濾液先用截留分子量為3000000Da的超濾膜除去蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，再用截留分子量為5000Da的超濾膜除去無機鹽、氨基酸、小分子色素等小分子雜質(zhì)，同時除去濾液中的水份濃縮，再醇沉制備獼猴桃根多糖，與現(xiàn)有技術(shù)相比，最大限度的分離除去了小分子與大分子雜質(zhì)、顯著提高了獼猴桃根多糖的得率與純度，藥效明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)制備的獼猴桃根多糖；(2)采用本發(fā)明制備獼猴桃根多糖，大大節(jié)約了乙醇用量，降低了成本；(3)采用本發(fā)明制備獼猴桃根多糖，大大減少了乙醇用量、且不需要使用乙醚，提高了生產(chǎn)安全性。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1:猴桃根粗多糖提取物活性部位的確定取干燥獼猴桃根飲片5000g，加10倍質(zhì)量水，加熱回流提取3次、每次2小時，合并提取液，高速離心(15000r/min，20min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液依次采用截留分子量為300萬，100萬，10萬，3萬，5千的超濾膜，進行超濾分級，得到A(5000以下)，B(5000-3萬)，C(3萬-10萬)，D(10萬-100萬)，E(100萬-300萬)，F(xiàn)(300萬以上)等6個部位。各部位分別濃縮、干燥，并分別測定其多糖含量，計算其占總提取物(多糖)的百分比例。各部位獼猴桃根提取物以注射給藥進行抗小鼠H22肝癌藥效實驗選擇體重(20±1.0)g，雄性ICR小鼠140只，隨機分成7組模型對照組(生理鹽水)，A組(5000以下)，B組(5000-3萬)，C組(3萬-10萬)，D組(10萬-100萬)，E組(100萬-300萬)，F(xiàn)組(300萬以上)。按法造模，各組于皮下瘤液接種的第2天開始給藥(80mg/kg日)，連續(xù)8天。停藥一天后，分離腫瘤組織，并稱取瘤重，得各組抑瘤率，結(jié)果見表1:表1獼猴桃根提取物各部位含多糖比例及抑瘤率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由以上數(shù)據(jù)可知A(5000以下)及F(300萬以上)部位含多糖量低、藥效活性低，獼猴桃根提取物中有效部位主要是B、C、D與E。因此，本發(fā)明確定分子量5000DA至3000000DA部分為有效多糖部位，選用截留分子量5000DA的超濾膜除去小分子雜質(zhì)，截留分子量3000000DA的超濾膜，除去大分子物質(zhì)，以有效保留藥性活性多糖，然后進行醇沉、離心、干燥等操作制備獼猴桃根多糖。實施例2:本發(fā)明工藝與現(xiàn)有工藝的比較取同批獼猴桃根，按文獻工藝、專利工藝及本發(fā)明工藝等方法分別提取獼猴桃根多糖，進行比較(每種方法5個批次)文獻工藝(即
背景技術(shù)：
部分的方法1):干燥獼猴桃根飲片1000g，加20倍質(zhì)量的水加熱提取，每次O.5h，提取2次，水提液加入乙醇使含醇量達80X(v/v)，靜置過夜，抽濾，但A口《守廣口口o專利工藝(即
背景技術(shù)：
部分的方法2):干燥獼猴桃根飲片1000g，加5倍質(zhì)量30X(v/v)的乙醇浸漬2次，每次24小時，靜置，取上清液，合并，加乙醇調(diào)至含乙醇量為72%(v/V)，靜置24小時，離心，沉淀物再加5倍量72%乙醇(v/v)、無水乙醇各洗一次，棄去洗液，沉淀物再加3倍量乙醚洗滌一次，棄去乙醚液，沉淀物室溫減壓干燥。本發(fā)明工藝取干燥獼猴桃根飲片1000g，加10倍量水，加熱回流提取3次、每次2小時，合并提取液，高速離心(15000r/min，20min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至1000毫升，濃縮液加入乙醇至乙醇體積濃度為70%(v/v，下同)，靜置12小時，高速離心(15000r/min，20min)，取沉淀以無水乙醇洗滌3次，干燥，即得到所述獼猴桃根粗多糖。制備的獼猴桃根粗多糖稱重，采用硫酸_苯酚法測定含糖量、計算其純度及得率，結(jié)果見表2、表3:表2:3種工藝獼猴桃根多糖提取率與純度比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>ACPS純度(%)=ACPS中總多糖量(mg)/ACPS質(zhì)量(mg)X100%ACPS得率(％)=ACPS質(zhì)量(g)/藥材(飲片)質(zhì)量(g)X100%表3本發(fā)明與現(xiàn)有工藝以lkg藥材投料計運行成本比較(單位元)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3:獼猴桃根多糖的制備取干燥獼猴桃根飲片500g，加6倍質(zhì)量的水，加熱回流1小時，提取3次，合并提取液，高速離心(10000r/min，20min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液以截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至500ml，濃縮液加入乙醇調(diào)醇濃度至55%(v/v)，靜置60小時，高速離心(10000r/min，20min)，沉淀以無水乙醇洗1次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖得率為2.07%、純度為55.81%。取上述獼猴桃根粗多糖加蒸餾水配制濃度為10mg/ml的水溶液，按藥脂比20mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至5，在室溫下振搖30min，濾過，濾液上AB-8型大孔樹脂柱，采用0.lmol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.01mol/LNaCl洗脫至顯色(硫酸-苯酚法，下同)無色，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根精制多糖，經(jīng)測定其純度為83.10%，得率0.91%。實施例4:取干燥獼猴桃根800g，加8倍質(zhì)量水，加熱回流2小時，提取3次，合并提取液，高速離心(20000r/min，10min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為300000Da的膜超濾，超濾液以截留分子量為5000Da的超濾膜超濾、濃縮至1600ml，加入乙醇調(diào)醇濃度至90%(v/v)，靜置6小時，高速離心(20000r/min，10min)，沉淀以無水乙醇洗2次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根多糖純度為58.97%、得率為2.47%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配制水溶液，按藥脂比40mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至6，在室溫下振搖60min，濾過，濾液上MG-1型大孔樹脂柱，采用0.2mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根精制多糖，經(jīng)測定其純度為78.23%，得率1.34%。實施例5:取干燥獼猴桃根1000g，加10倍質(zhì)量水，加熱回流3小時，提取2次，合并提取液，離心(5000r/min，30min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液以截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至5000毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至85%(v/v)，靜置8小時，離心(5000r/min，30min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根多糖純度為60.11%，提取率為2.39%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水200ml配制水溶液，按藥脂比60mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至7，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上DEAE-32纖維素柱，以0.02mol/LNaCl7洗脫至顯色無色，洗脫液采用2000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為79.89%，得率1.37%。實施例6:取干燥獼猴桃根1500g，加12倍質(zhì)量水，加熱回流4小時，提取2次，合并提取液，高速離心(12000r/min，20min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，微濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至750毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至60%(v/v)，靜置48小時，高速離心(12000r/min，20min)，沉淀以無水乙醇洗1次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度為55.10%，提取率為2.41%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水200ml配制水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至8，在室溫下振搖100min，濾過，濾液上LSA-5B型大孔樹脂柱，采用0.5mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮；濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.06mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用5000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為83.10%，得率1.18%。實施例7:取干燥獼猴桃根飲片2000g，加12倍質(zhì)量水，加熱回流1小時，提取3次，合并提取液，高速離心(7500r/min，25min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至1000毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至70%(v/v)，靜置48小時，高速離心(7500r/min，25min)，沉淀以無水乙醇洗2次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度為56.13%，得率為2.56%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水50ml配制水溶液，按藥脂比100mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至4，在室溫下振搖30min，濾過，濾液上D3520型大孔樹脂柱，采用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.07mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為83.97%，得率0.89%。實施例8:取干燥獼猴桃根飲片3000g，加30倍質(zhì)量水，加熱回流2小時，提取液高速離心(15000r/min，20min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至600毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至80%(v/v)，靜置24小時，離心(10000r/min，20min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，其純度為59.10%，得率為2.87%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水80ml配制水溶液，按藥脂比20mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至5，在室溫下振搖40min，濾過，濾液上S-8型大孔樹脂柱，采用0.7mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為78.58%，得率1.51%。實施例9:取干燥獼猴桃根500g，加20倍質(zhì)量水，加熱回流2小時，提取2次，合并提取液，高速離心(20000r/min，10min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至500毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至50%(v/v)，靜置60小時，離心(20000r/min，5min)，沉淀以無水乙醇洗1次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度58.67%，得率2.16%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水100ml配制水溶液，按藥脂比40mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至6，在室溫下振搖50min，濾過，濾液上H107型大孔樹脂柱，采用0.8mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用2000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮；濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.08mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用2000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為82.31%，得率1.07%。實施例10:取干燥獼猴桃根800g，加25倍質(zhì)量水，加熱回流提取3小時，提取液，高速離心(22000r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至800毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至70%(v/v)，靜置36小時，離心(22000r/min，5min)，沉淀以無水乙醇洗2次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度56.78%，得率2.81%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配制水溶液，按藥脂比60mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至7，在室溫下振搖60min，濾過，濾液上HPSIP1300型大孔樹脂柱，采用0.9mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮。濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.09mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為83.49%，得率1.28%。實施例11:取干燥獼猴桃根1000g，加25倍質(zhì)量水，加熱回流提取6小時，提取液高速離心(25000r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至2000毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至80%(v/v)，靜置時間48小時，離心(25000r/min，5min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度59.78%，得率3.01%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水180ml配制水溶液，按藥脂比70mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至8，在室溫下振搖70min，過濾收集濾液，濾液上NKA-9型大孔樹脂柱，采用1.Omol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.lmol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為85.10%，得率1.24%。實施例12:取干燥獼猴桃根1500g，加8倍質(zhì)量水，加熱回流1.5小時，提取3次，合并提取液，高速離心(20000r/min，8min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至15000毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至70%(v/v)，靜置48小時，離心(20000r/min，8min)，沉淀以無水乙醇洗2次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度60.21%，得率2.13%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水200ml配制水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至4，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上LSA-5B型大孔樹脂柱，采用0.lmo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為83.03%，得率1.31%。實施例13:稱取干燥獼猴桃根2000g，加10倍質(zhì)量水，加熱回流2.5小時/次，提取2次，合并提取液，高速離心(22500r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至2000毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至80%(v/v)，靜置時間54小時，離心(22500r/min，5min)，沉淀以無水乙醇洗2次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度56.79%，得率2.94%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水50ml配制水溶液，按藥脂比90mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至5，在室溫下振搖90min，濾過，濾液上LSA-5B型H107型大孔樹脂柱，采用0.3mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液上DEAE-52纖維素柱，以0.07mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為77.79%，得率1.03%。實施例14:取干燥獼猴桃根飲片3000g，加12倍質(zhì)量水，加熱回流1小時，提取3次，合并提取液，高速離心(25000r/min，5min)，上清液過0.22ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至1000毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至60%(v/v)，靜置60小時，離心(20000r/min，5min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度58.25%，得率2.55%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水70ml配制水溶液，按藥脂比100mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至6，在室溫下振搖100min，濾過，濾液上H107型大孔樹脂柱，采用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用5000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮；濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用2000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為82.67%，得率1.17%。實施例15:取干燥獼猴桃根500g，加14倍質(zhì)量水，加熱回流2小時，提取2次，提取液高速離心(15000r/min，15min)，上清液過0.45ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為1000Da的膜超濾，濃縮至1500毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至70%(v/v)，靜置66小時，離心(15000r/min，15min)，沉淀以無水乙醇洗2次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，其純度為60.05%，得率2.47%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水90ml配制水溶液，按藥脂比20mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至7，在室溫下振搖30min，濾過，濾液上HPSIP1300型大孔樹脂柱，采用0.4mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.03mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為81.85%，得率0.91%。實施例16:取干燥獼猴桃根1000g，加16倍質(zhì)量水，加熱回流2小時，提取2次，合并提取液，高速離心(10000r/min，25min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至1250毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至80%(v/v)，靜置72小時，離心(10000r/min，25min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度57.9%，得率2.93%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水100ml配制水溶液，按藥脂比50mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至8，在室溫下振搖60min，濾過，濾液上HPSIP1300型大孔樹脂柱，采用0.6mol/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾3次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為76.53%，得率1.17%。實施例17:取干燥獼猴桃根飲片500g，加10倍質(zhì)量水，加熱回流提取3次、每次2小時，合并提取液，高速離心(9000r/min，20min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾、濃縮至250毫升，濃縮液加入乙醇至乙醇體積濃度為70%(v/v)，靜置12小時，高速離心(9000r/min，20min)，取沉淀以無水乙醇洗滌3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度60.12%，得率3.18%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水120ml配制水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至5，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上SIP1400型大孔樹脂柱，采用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-32纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為82.50%，得率1.36%。實施例18:稱取干燥獼猴桃根1000g，加10倍質(zhì)量水，加熱回流3小時，提取3次，合并提取液，高速離心(12500r/min，15min)，上清液過0.65ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至800毫升，加入乙醇調(diào)醇濃度至70%(v/v)，靜置24小時，離心(12500r/min，15min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度55.8%，得率2.74%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配制水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至5，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上SIP1400型大孔樹脂柱，采用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并濃縮，干燥即得獼猴桃根精制多糖，經(jīng)測定其純度為84.90%，得率1.25%。實施例19:稱取干燥獼猴桃根20kg，加10倍質(zhì)量水，加熱回流2.5小時，提取2次，合并提取液，高速離心(10000r/min，20min)，上清液過0.8ym孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量為5000Da的膜超濾，濃縮至10升，加入乙醇調(diào)醇濃度至70%(v/v)，靜置24小時，離心(10000r/min，20min)，沉淀以無水乙醇洗3次，干燥即得獼猴桃根粗多糖，經(jīng)測定、計算，獼猴桃根粗多糖純度55.8%，得率1.95%。所得獼猴桃根粗多糖每克加蒸餾水150ml配制水溶液，按藥脂比80mg:lg加入聚酰胺，調(diào)pH至5，在室溫下振搖80min，濾過，濾液上SIP1400型大孔樹脂柱，采用0.6mo1/LNaCl溶液洗脫，洗脫液采用1000Da的超濾膜洗濾2次，除鹽并濃縮，濃縮液上DEAE-52纖維素柱，以0.05mol/LNaCl洗脫至顯色無色，洗脫液采用3000Da的超濾膜洗濾1次，除鹽并11濃縮，干燥即得獼猴桃根(精制)多糖，經(jīng)測定其純度為80.90%，得率1.01%。實施例20:藥效學實驗用按上述實施實例19中提供的方法制備得到的獼猴桃根粗多糖與精制多糖，注射給藥進行藥效學實驗—、抗小鼠H22肝癌實驗(—)材料與方法1、動物模型的建立1.l制備腫瘤細胞懸液在無菌條件下從H22瘤株腹腔抽取含腫瘤細胞的半透明、未溶血、未感染的腹水(符合要求者呈半透明乳白色，含血細胞者呈淡紅色，已感染者呈黃綠色)，用生理鹽水稀釋10倍、100倍。瑞氏染色，光鏡下計數(shù)每毫升腹水中的瘤細胞數(shù)(光鏡下腫瘤細胞為大而圓的透明亮點)，用生理鹽水稀釋腹水液使細胞終濃度為1X107ml，存活的瘤細胞^95%，并充分混勻。整個操作過程嚴格注意無菌操作，避免污染。1.2接種腫瘤細胞用酒精棉球在小鼠右前腋下進行消毒處理，皮下注射已制備好的腫瘤細胞懸液0.2mL/只。2、分組與給藥2.1分組選擇體重(20±1.0)g，雄性ICR小鼠120只，隨機分成6組模型對照組(生理鹽水注射)，ACPS低、中、高劑量組(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)，獼猴桃根粗多糖組(80mg/kg)，陽性對照組(香菇多糖注射液，市售注射劑)(0.7mg/kg日，相當于人臨床常用量的58倍)。2.2給藥于皮下瘤液接種的第2天開始給藥，連續(xù)8天。3、給藥后動物處理及標本采集3.1用于觀察抑瘤率等指標的各組(10只/組)小鼠于停藥后第1天稱重后，摘眼球取血，每只小鼠取血量0.51.Oml，置1.5ml離心管中，室溫下靜置2_4小時，離心(2000r/min，20min)，分離血清。全程避免交叉污染，分裝后置1.5ml離心管中，冰箱中-2(TC保存，用于檢測血清中腫瘤壞死因子TNFa濃度。3.2脫臼處死摘眼球取血后的動物，分離腫瘤組織，并稱取瘤重，計算抑瘤率。將腫瘤組織標本在中性緩沖福爾馬林(pH=7.4)中固定，12小時后取材制成石蠟切片。3.3用于觀察生命延長期的各組(10只/組)小鼠停藥后正常飼養(yǎng)，記錄生存天數(shù)，計算生命延長期。4、標本檢領[J4.1瘤組織石蠟切片HE染色(蘇木素-伊紅染色)鏡下觀察結(jié)果，主要觀察腫瘤組織的增生，壞死及凋亡情況。4.2TNFaELISAKit試劑盒測定血清中腫瘤壞死因子TNFa濃度。5、數(shù)據(jù)分析SPSS11.0對所得結(jié)果進行處理，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用T檢驗。(二)結(jié)果1、獼猴桃根多糖對小鼠H22肝癌細胞的抑制作用，結(jié)果見表4:表4獼猴桃根多糖注射給藥對H22肝癌小鼠抑瘤率的影響組別齊糧(mg/kg)動物數(shù)平均瘤重(g)抑瘤率(％)模型對照91.217±0.276ACPS(低)2091.051±0.08113.64ACPS(中)4090.681±0.184**44.08ACPS(高)8090.435±0.144**64.28獼猴桃根粗多糖8090.693±0.112**43.09香菇多糖0.790.636±0.141**47.72注"**"表示與模型組比較具有極顯著差異P<0.01(1)與模型組抑瘤率數(shù)據(jù)比較，ACPS注射液對小鼠H22肝癌具有良好的抑制作用，且在20至80mg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關系，中劑量組和高劑量組與模型組比較差異極顯著(P<0.01)，低劑量組抑瘤率較低，與模型組比較無顯著差異。(2)獼猴桃根粗多糖組的抑瘤率低于相同劑量的ACPS注射液組，而與中劑量ACPS注射液組相當。高劑量ACPS注射液組的抑瘤率高于陽性對照組，說明ACPS藥效確切，具有很好的開發(fā)價值。(3)瘤組織切片HE染色鏡下可以見到腫瘤壞死，少數(shù)標本壞死較嚴重；陽性對照組和ACPS注射劑治療組(高、中劑量)多數(shù)腫瘤壞死非常明顯，只剩下周邊少量的腫瘤細胞；ACPS注射劑低劑量組及獼猴桃根粗多糖組腫瘤壞死也較明顯。2、獼猴桃根多糖對荷瘤小鼠生命延長期的影B向，結(jié)果見表5:表5獼猴桃根多糖注射給藥對荷瘤小鼠生命延長期的影響組別劑量(mg/kg)動物數(shù)平均生存天數(shù)生命延長期(％)模型對照92.167±1.169ACPS(低)20102.556±2.06817.95ACPS(中)40103.600±1.64766.15ACPS(高)80103.667±1.87169.23獼猴桃根粗多糖8094.000±2.44984.6213<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由上表可知ACPS具有延長平均生存天數(shù)的作用，且呈現(xiàn)一定的量效關系，中劑量和高劑量組ACPS的生命延長期與香菇多糖相近。3、獼猴桃根多糖注射給藥對荷瘤小鼠血清TNFa的影響，結(jié)果見表6:表6獼猴桃根多糖注射給藥對荷瘤小鼠血清TNFa的影響組別劑量(mg/kg)動物數(shù)TNFa濃度(pg/ml)模型對照9148.03±22.50ACPS(低)209167.13±42.80ACPS(中)409173.58±28.00ACPS(高)809180.18±31.37獼猴桃根粗多糖809164.17±33.92香菇多糖0.79189.46±45.49由上表可知，ACPS低、中、高劑量組、獼猴桃根粗多糖組，及香菇多糖組的TNFa濃度均比模型組高，可見獼猴桃根多糖具有一定的提高血清TNFa濃度的作用。(三)結(jié)論獼猴桃根多糖對小鼠H22肝癌細胞具有抑制作用，并可延長H22肝癌小鼠的生存期，該作用可能與其提高小鼠血清TNFa濃度有關。二、抗小鼠S180荷瘤實驗(—)材料與方法1、動物模型的建立1.l制備腫瘤細胞懸液在無菌條件下從S180瘤株腹腔抽取含腫瘤細胞的半透明、未溶血、未感染的腹水(符合要求者呈半透明乳白色，含血細胞者呈淡紅色，已感染者呈黃綠色)，用生理鹽水稀釋10倍、100倍。瑞氏染色，光鏡下計數(shù)每毫升腹水中的瘤細胞數(shù)(光鏡下腫瘤細胞為大而圓的透明亮點)，用生理鹽水稀釋腹水液使細胞終濃度為1X107ml，存活的瘤細胞^95%，并充分混勻。整個操作過程嚴格注意無菌操作，避免污染。1.2接種腫瘤細胞用酒精棉球在小鼠右前腋下進行消毒處理，皮下注射已制備好的腫瘤細胞懸液0.2mL/只。2、分組與給藥每組10只小鼠，其余同前(抗小鼠H22肝癌實驗)操作。3、各組小鼠于停藥后第1天稱重后，頸椎脫臼處死小鼠，脫臼處死后的動物，分離14腫瘤組織，并稱取瘤重，計算抑瘤率。4、數(shù)據(jù)分析SPSSll.0對所得結(jié)果進行處理，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用T檢驗。(二)結(jié)果獼猴桃根多糖注射給藥對小鼠S180荷瘤細胞的抑制作用，結(jié)果見表7:表7:獼猴桃根多糖注射給藥對S180荷瘤小鼠抑瘤率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注"**"表示與模型組比較具有極顯著差異P<0.01由上表可知與模型組抑瘤率數(shù)據(jù)比較，獼猴桃根多糖對S180荷瘤小鼠具有良好的抑制作用，且在20至80mg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關系；獼猴桃根粗多糖組的抑瘤率低于相同劑量的ACPS組，而與低劑量ACPS組相當，高劑量ACPS組的抑瘤率高于陽性對照組，說明ACPS藥效確切。(三)結(jié)論獼猴桃根多糖對S180荷瘤小鼠具有明確的抑制作用。權(quán)利要求一種獼猴桃根多糖提取物的制備方法，其特征在于所述方法包括取干燥獼猴桃根(RadixActinidiaChinensis)以水加熱回流提取，提取液離心除去不溶物，取上清液過0.2～0.8μm孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量5000Da的膜超濾，濃縮至所得濃縮液中生藥材含量為0.1～5g/mL，濃縮液加入85～95％乙醇至乙醇體積濃度為50～90％，靜置醇沉，離心，取沉淀洗滌后在60～80℃真空干燥，得到獼猴桃根粗多糖。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括獼猴桃根粗多糖純化步驟(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配制成水溶液，水溶液脫色，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱或DEAE纖維素柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液采用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽并濃縮，得濃縮液；(3)濃縮液干燥即得獼猴桃根多糖。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)聯(lián)用大孔吸附樹脂柱和DEAE纖維素柱純化進行獼猴桃根粗多糖的純化。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂的型號為下列之一AB-8型、MG-l型、LSA-5B型、X_5型、H107型、S_8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；所述DEAE纖維素為DEAE-32或DEAE_52。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進行取干燥獼猴桃根，加入質(zhì)量為獼猴桃根質(zhì)量630倍的水，加熱回流提取13次、每次13小時，合并提取液，500025000r/min離心10min30min，除去不溶物，上清液過0.20.8iim孔徑的微孔濾膜，濾液用截留分子量為3000000Da的膜超濾，超濾液用截留分子量5000Da的膜超濾，濃縮至所得濃縮液中生藥材含量為0.22g/mL，濃縮液在2545。C下加入8595%乙醇至乙醇體積濃度為6080%，靜置672小時，500025000r/min離心10min20min，取沉淀以無水乙醇洗滌13次，洗滌后的沉淀608(TC真空干燥，得到所述獼猴桃根粗多糖。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法還包括獼猴桃根粗多糖純化步驟(1)取獼猴桃根粗多糖，每g加蒸餾水50200ml配制成水溶液，水溶液按藥脂比5070mg:lg加入聚酰胺吸附脫色，調(diào)pH至56，在室溫下振搖5060min，過濾，取濾液進行下一步純化操作；(2)步驟(1)濾液上大孔吸附樹脂柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液采用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽并濃縮，得濃縮液1;所述大孔樹脂的型號為下列之一AB-8型、MG-1型、LSA-5B型、X-5型、H107型、S-8型、D900型、HPSIP1300型、SIP1400型、NKA-9型、DM130型或D3520型；(3)步驟(1)濾液或步驟(2)濃縮液1上DEAE纖維素柱，以NaCl溶液洗脫，洗脫液采用截留分子量為10005000Da的超濾膜洗濾13次，除鹽并濃縮，得濃縮液2;(4)濃縮液1或濃縮液2干燥即得獼猴桃根多糖。全文摘要本發(fā)明提供了一種獼猴桃根多糖提取物的制備方法，所述的方法包括取干燥獼猴桃根(RadixActinidiaChinensis)以水加熱回流提取，提取液離心，取上清液過微孔濾膜，濾液超濾，濃縮至生藥材含量為0.1～5g/mL，濃縮液加入85～95％乙醇至乙醇體積濃度為50～90％，靜置醇沉，離心，取沉淀洗滌后在60～80℃真空干燥，得到獼猴桃根粗多糖經(jīng)進一步純化得到獼猴桃根精制多糖；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)采用本發(fā)明方法制備獼猴桃根多糖，達到最大限度的分離、純化作用，獼猴桃根多糖純度高、提取率大，使有效成分得到富集，藥效得以提高；(2)采用本發(fā)明方法，大大節(jié)約了乙醇用量，降低了成本；(3)采用本發(fā)明方法，大大減少了乙醇用量、且不需要使用乙醚，提高了生產(chǎn)安全性。文檔編號C08B37/00GK101704899SQ20091015505公開日2010年5月12日申請日期2009年12月15日優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日發(fā)明者吳瑾瑾,夏聰華,李昌煜,楊悅,王麗麗,石森林,葛衛(wèi)紅申請人:浙江中醫(yī)藥大學