專利名稱：芘攜帶肽穿過血腦屏障的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及穿過血腦屏障(BBB)投遞肽、蛋白質(zhì)和抗體的領(lǐng)域。更 具體而言，本發(fā)明涉及使用芘-制劑偶聯(lián)物(agent conjugate)來穿過BBB投遞肽、蛋白 質(zhì)或抗體的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)病癥的檢測和治療由于內(nèi)源和外源施用的成分對腦的不透性(由于血腦屏 障(BBB))而常常是困難的。BBB有效地將腦與周圍制劑，諸如肽、蛋白質(zhì)、大的大分 子、非肽性分子、離子、和水溶性非電解質(zhì)分開。例如，一般公認帶電荷的或親水性的 分子以及具有大于約700kDa分子量的分子不能穿過BBB。一般還公認肽，諸如約21個 氨基酸殘基的肽不能有效穿過BBB，較長的肽諸如40個殘基的Αβ 40蛋白和42個殘基 的Αβ 42蛋白(兩者均與阿耳茨海默氏病(Alzheimer，s disease)有關(guān))也不能。如此， BBB阻止檢測劑以及治療劑(其在其它方面可用于診斷和治療多種神經(jīng)病學病癥)的投 遞。在將制劑有效轉(zhuǎn)運至腦上的先前嘗試已經(jīng)包括將制劑偶聯(lián)至載體模塊，使用 脂質(zhì)體配制劑、和使用納米顆粒。例示性載體模塊包括天然存在的多胺(美國專利 5,670,477)、載體諸如溶菌酶、血紅蛋白、細胞色素-C和物質(zhì)-P(美國專利5,604,198)、 和糖類(美國專利5,260,308)。在將Αβ蛋白有效轉(zhuǎn)運到腦上的先前嘗試已經(jīng)使用與載 體諸如0X26或腐胺偶聯(lián)的Αβ 40或更小的片段，諸如Αβ 1-30。還已經(jīng)提出高度糖基 化終產(chǎn)物(RAGE)的受體用于介導穿過BBB的轉(zhuǎn)運，特別對于Αβ蛋白。然而，仍需要用于穿過BBB投遞肽制劑(包括肽、蛋白質(zhì)和抗體)的方法、制 劑和試劑盒。發(fā)明概述根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了一種用于穿過血腦屏降投遞肽偶聯(lián)物的方 法，包括對受試者施用偶聯(lián)物，其包含肽制劑和芘。在一些實施方案中，所述肽制劑是 能夠鑒定與神經(jīng)病學病癥有關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)的檢測劑。在另一個實施方案中，所述肽 制劑是可用于治療神經(jīng)病癥的治療劑。在一些實施方案中，所述肽制劑包括與靶蛋白中 經(jīng)歷從α-螺旋構(gòu)象向片層構(gòu)象的構(gòu)象變化的區(qū)域?qū)陌被嵝蛄校遣话ㄋ?述靶蛋白的全長序列。在其它實施方案中，所述肽制劑是對與神經(jīng)病癥有關(guān)的蛋白質(zhì)或 結(jié)構(gòu)特異性的抗體。在一個實施方案中，所述偶聯(lián)物進一步包含可檢測標記物。在另 一個實施方案中，所述偶聯(lián)物包含芘衍生物，諸如烷基化的芘類似物、芘丁酸鹽(酯)、 PEG化的芘、芘-清蛋白類似物、包含游離羧基的芘衍生物和包含游離氨基的芘衍生 物。在一些實施方案中，所述偶聯(lián)物包含兩個或更多個芘模塊(moieties)。
根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)檢測方法，包括對受試者施用包 含肽檢測劑和芘的偶聯(lián)物，并檢測位于受試者的腦中的偶聯(lián)物。在一個實施方案中，所 述檢測劑能夠鑒定與神經(jīng)病癥有關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述偶聯(lián)物包 含兩個或更多個芘模塊。在一些實施方案中，至少一種芘模塊是包含游離羧基的芘衍生 物，而至少一種芘模塊是包含游離氨基的芘衍生物。在一個實施方案中，所述芘至少在 肽的N端或C端，或在肽的N和C端兩者與肽檢測劑偶聯(lián)。在又一個實施方案中，所述 檢測劑能夠鑒定處于自我聚集的特定構(gòu)象或狀態(tài)的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，定位 的偶聯(lián)物的檢測牽涉檢測芘激基締合物(excimers)。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)檢測方法，包括對受試者施用包 含肽檢測劑、芘和可檢測標記物的偶聯(lián)物，并檢測已經(jīng)位于所述受試者的腦中的偶聯(lián) 物。在一些實施方案中，所述標記物是熒光團、MRI造影劑、離子發(fā)射體、和放射性標 志物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療神經(jīng)病癥的方法。該方法包括 對受試者施用治療有效量的偶聯(lián)物，其包含肽治療劑和芘。在一個實施方案中，所述肽 制劑是抗淀粉樣劑(anti-amyloid agent)。附圖簡述

圖1顯示了通過對轉(zhuǎn)基因小鼠鼻內(nèi)施用的媒介物、肽-制劑芘偶聯(lián)物、或芘丁酸 鹽(酯)(pyrene butyrate)每mm2檢測的A β斑數(shù)目。圖2顯示了通過鼻內(nèi)施用的偶聯(lián)物(AD185)熒光(-)對硫黃素S染色(▲)在 皮層中檢測的Αβ斑之間的相關(guān)性。圖3顯示了通過靜脈內(nèi)施用的偶聯(lián)物(AD185)熒光(-)對硫黃素S染色(■) 在皮層(圖3Α)和海馬(圖3Β)中檢測的Αβ斑之間的相關(guān)性。發(fā)明詳述在描述和公開本發(fā)明的具體實施方案前，要理解本文中所描述的具體的材料、 方法和組合物僅作為例子呈現(xiàn)，而并不限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義，本文中所使 用的技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義。本文通過 提及完整收錄列出提及的已知方法的出版物和其它材料，就像全文列出一樣。列出重組DNA技術(shù)的一般原理的標準參考著作包括Sambrook，J.等(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Planview, N.Y ； McPherson, M.J.編(1991) DirectedMutagenesis A Practical Approach, IRL Press, Oxford ； Jones, J. (1992) AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxford Science Publications, Oxford ； Austen, B.M.禾口 Westwood, O.M.R. (1991) Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford?？梢栽趯嵤┍景l(fā)明中利用對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知 的任何合適的材料和/或方法。然而，描述了優(yōu)選的材料和方法。除非另有指明，以下 描述和實施例中提及的材料、試劑等從商業(yè)來源可獲得。如本文中所使用的，除非明確規(guī)定僅指單數(shù)，單數(shù)形式(a，an) “一個”、“一 種”、和“該”，“所述”(the)指單數(shù)和復數(shù)兩者。一般而言，術(shù)語“約”和范圍的使用(無論是否通過術(shù)語約量化)指所理解的 數(shù)字不限于本文中所列的精確數(shù)字，并且意圖指基本上在所引用范圍內(nèi)的范圍，而不偏離本發(fā)明的范圍。如本文中所使用的，“約”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的，并且會根 據(jù)使用其的上下文在一定程度上變化。如果使用該術(shù)語之處本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考上 下文無法清楚其使用，那么“約”會表示具體術(shù)語的多至+/_10%。如本文中所使用的，“受試者”指需要檢測或治療性處理的任何動物，包括人 和馴養(yǎng)動物，諸如貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、兔等?！笆茉囌摺边€包括研究背 景中使用的動物，包括小鼠和其它小的哺乳動物。典型的受試者可以有神經(jīng)病癥、疾病 或病癥的風險或懷疑患有此類狀況，或者可以渴望測定關(guān)于特定狀況的風險或狀態(tài)。如 本文中所使用的，“治療性”處理包括施用治療劑以治療存在的狀況，或預防受試者有 風險或形成的狀況，或者用于健康維持。如本文中所使用的，短語“治療有效量”指在受試者中提供特定藥理學響應的 藥物劑量，對于所述特定的藥理學響應，在需要此類治療的患者中施用藥物。強調(diào)的 是，治療有效量在治療本文中所描述的狀況/疾病中不會總是有效的，即使本領(lǐng)域技術(shù) 人員將此類劑量視為治療有效量。如本文中所使用的，“肽”指經(jīng)由肽鍵連接的兩個或更多個單獨的氨基酸(無論 是否天然存在)的任何聚合物。如本文中所使用的，術(shù)語“肽制劑”包括肽、蛋白質(zhì)、 和抗體。肽包括全長蛋白質(zhì)的片段，其中片段可以包括全長蛋白質(zhì)的至少5個連續(xù)的氨 基酸、至少10個連續(xù)的氨基酸、至少15個連續(xù)的氨基酸、至少20個連續(xù)的氨基酸、或 至少25個連續(xù)的氨基酸。肽還包括合成肽。如本文中所使用的，“構(gòu)象”或“構(gòu)象約束(conformational constraint) ”
指特定蛋白質(zhì)構(gòu)象，例如α-螺旋、平行和反平行β鏈、亮氨酸拉鏈、鋅指等的存 在。另外，構(gòu)象約束可以包括沒有額外結(jié)構(gòu)信息的氨基酸序列信息。作為一個例子， "-C-X-X-C-"是一種構(gòu)象約束，其指明兩個半胱氨酸殘基必須由兩個其它氨基酸殘基 分開，其中每個的身份在此特定約束的語境中是無關(guān)的?！皹?gòu)象變化”是從一種構(gòu)象向 另一種的變化。術(shù)語“Αβ蛋白”在本文中用于指所有形式的Aβ蛋白，包括Aβ 34、Aβ 37、 Aβ 38、Αβ40 和 Αβ42?！爸亟M蛋白或肽”指通過重組DNA技術(shù)生成，即從通過編碼期望蛋白質(zhì)或多肽 的外源重組DNA表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞、微生物或哺乳動物生成的蛋白質(zhì)或肽。大多數(shù) 細菌培養(yǎng)物中表達的蛋白質(zhì)或肽通常會是沒有聚糖的。酵母中表達的蛋白質(zhì)或肽可具有 與哺乳動物細胞中表達的蛋白質(zhì)或肽不同的糖基化樣式。如本文中所使用的，術(shù)語“天然存在的”或“天然的”就肽制劑而言指身體中 存在的或自自然界中存在的來源回收的制劑(例如肽、蛋白質(zhì)和抗體)。天然的肽制劑可 以進行化學或酶促修飾，包括翻譯后修飾，包括但不限于乙?；?、糖基化、磷酸化、脂 質(zhì)偶聯(lián)、?；汪驶?。如本文中所使用的，術(shù)語“合成的”就肽制劑而言規(guī)定制劑不是天然存在的， 但是可以通過其它手段諸如化學合成、生化方法、或重組方法來獲得。術(shù)語“類似物”、“片段”、“衍生物”、和“變體”在本文中提及肽時指此 類肽的類似物、片段、衍生物、和變體，其保留與參照肽基本上類似的功能活性或基本 上相同的生物學功能或活性，如本文中所描述的?！邦愃莆铩卑ǘ嚯脑?，其包含肽的氨基酸序列。“片段”是肽的一部分，其與參照肽相比保留基本上類似的功能活性或基本上 相同的生物學功能或活性，如本文中所公開的體外測定法中所顯示的。“衍生物”包括對本發(fā)明肽的所有修飾，其基本上保留本文中所公開的功能， 而且包括別的結(jié)構(gòu)和附帶功能，例如PEG化的肽或融合有清蛋白質(zhì)的肽。“變體”包括具有與參照肽的氨基酸序列足夠相似的氨基酸序列。術(shù)語“足夠 相似的”指序列具有共同的結(jié)構(gòu)域(例如序列同源性)和/或共同的功能活性。例如， 本文中將包含至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至 少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至 少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少 約98%、至少約99%、或至少約100%相同的共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列定義為足夠相似 的。變體包括由在嚴格條件下與編碼參照多肽的多核苷酸的互補物雜交的多核苷酸編碼 的肽。此類變體一般保留參照肽的功能活性。變體還包括氨基酸序列上由于誘變而所有 不同的肽?！盎旧舷嗨频墓δ芑钚浴焙汀盎旧舷嗤纳飳W功能或活性”各指在通過 相同方法或測定法來測定每種肽的生物學活性時，生物學活性的程度在由參照肽所表明 的生物學活性的約50%至100%內(nèi)或更多，在80%至100%內(nèi)或更多，或約90%至100% 內(nèi)或更多。例如，制劑的類似物或衍生物可以與所指制劑在性質(zhì)上展現(xiàn)出相同的生物學 活性，雖然它可以在數(shù)量上展現(xiàn)出或多或少的活性?？梢酝ㄟ^常規(guī)的篩選方法來證實制 劑的給定類似物或衍生物的適合性以確認類似物或衍生物展現(xiàn)出與所指制劑的活性基本 上相似的感興趣活性。類似物或衍生物可以擁有別的結(jié)構(gòu)特征和/或展現(xiàn)出別的功能特 性，諸如PEG化的制劑，其包含PEG模塊，而且可以展現(xiàn)出更長的體內(nèi)循環(huán)半衰期。通過比較氨基酸序列來測定兩種肽之間的“相似性”。一種多肽的氨基酸與 第二種多肽的對應氨基酸相似，若它是相同或保守的氨基酸替代的話。保守替代包括 JP 些 i己載于 Dayhoff, M.O.編，The Atlas of Protein Sequence andStructure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.(1978)，和 Argos，P. (1989) EMBO J.8 779-785中的。例如，屬于下組之一的氨基酸表示保守變化或替代-Ala、Pro、Gly、Gin、Asn> Ser、Thr ；-Cys> Ser、Tyr、Thr ；-VaL lie、Leu、Met、Ala、Phe ；-Lys、Arg、His ；-Phe、Tyr、Trp、His ；和-Asp、Gluο本發(fā)明的一些方面涉及與蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)狀態(tài)諸如蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象或自我 聚集狀態(tài)有關(guān)的疾病和狀況的診斷和治療。本文通過提及而完整收錄PCT申請PCT/ Us2007/016738(w0 2008/013859)和美國專利申請11/828,953，其披露了相關(guān)的實施 方案。本發(fā)明的一些方面提供了用于體內(nèi)檢測特定結(jié)構(gòu)狀態(tài)的蛋白質(zhì)(包括錯折疊的 蛋白質(zhì)和自我聚集的蛋白質(zhì)，諸如那些與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白質(zhì))的偶聯(lián)物和方法， 及用于治療那些疾病狀態(tài)的偶聯(lián)物和方法。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)與致淀粉樣病(amyloidogenicdisease)有關(guān)。在它們采用特定構(gòu)象或自我聚集狀態(tài)時與人或動物疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域 中已知的。此類疾病的例子包括致淀粉樣病，包括阿耳茨海默氏病(AD)、腦淀粉樣 血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)、和腦血管疾病(CVD)。如本文中所使用 的，“致淀粉樣病”是如下的疾病，其中在身體中形成淀粉樣斑或淀粉樣沉積物。在 多種病癥中找到淀粉狀蛋白形成，諸如糖尿病、AD、癢病(scrapie)、牛海綿樣腦病 (bovine spongiform encephalopathy, BSE)、克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、慢性消耗性疾病(chronic wasting disease，CWD)、相關(guān)的傳染性海綿樣 腦病(transmissible spongiform encephalopathy, TSEs)。多種疾病與蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)形式有關(guān)(例如“錯折疊的蛋白質(zhì)”或自我聚集 的蛋白質(zhì))，而處于不同結(jié)構(gòu)形式的蛋白質(zhì)(例如“正常的蛋白質(zhì)”)是無害的。在許多 情況中，正常的蛋白質(zhì)是可溶的，而錯折疊的蛋白質(zhì)形成不溶性聚集物。此類不溶性蛋 白質(zhì)的例子包括傳染性海綿樣腦病(TSE)中的阮病毒；阿耳茨海默氏病(AD)、腦淀粉樣 血管病(CAA)、和腦血管疾病(CVD)的淀粉樣斑中的A3肽；帕金森氏病(Parkinson，s disease)的Lewy小體中的a-突觸核蛋白沉積物、額顳癡呆(frontal temporal dementia) 和皮克氏病(Pick’ sdisease)中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau;肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化 (amylotrophiclateral sclerosis)中的超氧化物歧化酶；和亨延頓氏病(Huntington，s disease)中的亨延頓蛋白。參見例如Glenner等，J.Neurol.Sci.94 1-28，1989 ； Haan等， Clin.Neurol.Neurosurg.92 (4) 305-310，1990。這些不溶性蛋白質(zhì)常常形成聚集物，其由具有折疊片構(gòu)象的共同特征的非 分支原纖維構(gòu)成。在CNS中，淀粉狀蛋白可以存在于腦和腦膜血管中(腦血管沉積物) 和腦實質(zhì)中(斑)。人和動物模型中的神經(jīng)病理學研究指明接近淀粉樣沉積物的細胞在其 正常功能上是擾亂的。參見例如Mandybur，ActaNeuropathol.78 329-331，1989 ； Kawai 等，Brain Res.623 142-146，1993 ； Martin 等，Am.J.Pathol.145 1348-1381，1994 ； Kalaria 等，Neuroreport 6 477-80，1995 ； Masliah 等，J.Neurosci.16 5795-5811，
1996。另外，其它研究指明淀粉樣原纖維實際上可能啟動神經(jīng)變性。參見例如Lendon 等，J.Am.Med.Assoc.277 825-831，1997 ； Yankner, Nat.Med.2 850-852，1996 ； Selkoe, J.Biol.Chem.271 18295-18298，1996 ； Hardy, Trends Neurosci.20 154-159，
1997。雖然導致蛋白質(zhì)錯折疊的潛在分子機制沒有得到充分了解，但是所有上文所提 及的神經(jīng)病學病癥的共同特征是聚集以形成0片層結(jié)構(gòu)的原纖維的形成。原纖維形成和 隨后與斑沉積物有關(guān)的二級0片層結(jié)構(gòu)的形成經(jīng)由復雜的機制發(fā)生，所述復雜的機制牽 涉成核階段，其中蛋白質(zhì)單體結(jié)合以形成原纖維，接著原纖維在每個末端延伸。如此， 能夠破壞原纖維形成的肽、蛋白質(zhì)或抗體探針會阻止疾病行進，并且如此是治療重要性 的。另外，能夠結(jié)合病態(tài)蛋白質(zhì)的特定自我結(jié)合狀態(tài)的制劑是有用的診斷工具以檢測和 量化錯折疊蛋白質(zhì)的特定形式，以及領(lǐng)會疾病的行進。如此，能夠結(jié)合特定自我聚集狀 態(tài)的特定蛋白質(zhì)的高度選擇性肽制劑可用作檢測劑，也可用于治療應用。A.用于穿過BBB投遞肽制劑的方法申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與芘載體偶聯(lián)的藥學相關(guān)肽制劑(例如肽、蛋白質(zhì)和抗體)顯示在對受試者施用時穿過血腦屏障(BBB)的能力增強。在一個實施方案中，提供了一種用于穿過BBB投遞肽制劑的方法，其包括對受 試者施用偶聯(lián)物，其包含⑴肽制劑和(ii)芘。在一些實施方案中，肽制劑是肽、蛋白 質(zhì)、或抗體。在一些實施方案中，肽制劑是檢測劑或治療劑。在具體的實施方案中，肽 制劑是能夠鑒定與神經(jīng)病癥有關(guān)的靶蛋白或結(jié)構(gòu)(諸如自我聚集的特定構(gòu)象或狀態(tài))的檢 測劑。在其它實施方案中，肽制劑是可用于治療神經(jīng)病癥的治療劑。如本文中所使用 的，“能夠鑒定”指肽制劑選擇性且優(yōu)先地結(jié)合靶蛋白或結(jié)構(gòu)?？梢栽谶m合于對受試者施用的任何組合物(諸如包含偶聯(lián)物和藥學可接受載體 的組合物)中配制偶聯(lián)物。偶聯(lián)物可以通過任何合適的手段施用，包括通過鼻內(nèi)、靜脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口服、含服、或經(jīng)皮施用，并且可以相應地進行 配制。例如，藥學可接受載體可以是液體，使得組合物適宜胃腸外施用，或者可以是為 口服配制的固體，即加有媒介物的膠囊殼、片劑、丸劑等。或者，藥學可接受載體可以 為可噴霧液體或固體形式，使得組合物適宜吸入。藥學可接受載體是本領(lǐng)域中已知的， 并且可以包括但不限于溶解劑或懸浮劑，諸如水或天然存在的植物油，如芝麻、花生、 或棉籽油或合成的脂肪媒介物，如油酸乙酯等。緩沖液、防腐劑、抗氧化劑、粘合劑、 賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑和芳香劑也可以包含在組合物中。在本文中所描述的方法中，可以使用一種或多種包含相同或不同檢測劑、治療 劑、芘模塊和/或標記物的偶聯(lián)物，其中在同一組合物中或在可以通過相同路徑或通過 一種或多種不同路徑同時或序貫施用的一種或多種不同組合物中提供每種偶聯(lián)物。在一些實施方案中，芘偶聯(lián)的肽制劑展現(xiàn)出穿過BBB的通透性，其實質(zhì)上大于 非偶聯(lián)的活性劑的通透性，諸如比非偶聯(lián)的活性劑的通透性大至少3倍、至少5倍、至少 10倍、至少15倍、至少20倍、或更多。穿過BBB的通透性的一種測量是相對于注射量和相對于進入其它組織的量(％ IDI)的進入腦的偶聯(lián)物量。在一些實施方案中，芘-偶聯(lián)物具有1-10之間的辛醇/水分 配系數(shù)。認為一些用于提高肽穿過BBB的通透性的載體還具有提高肽_載體偶聯(lián)物的半 衰期的效果。例如，將顯著量的結(jié)構(gòu)大小添加至肽-載體偶聯(lián)物的載體可以降低肽的降 解或清除率。在外周和腦兩者中降解A04O肽(例如在正常的生理學條件下)。然而， 使用例如腐胺或0X26作為載體的偶聯(lián)物顯著提高A3 40的半衰期。雖然升高的半衰期 可以具有一些優(yōu)點，諸如促成腦中的濃度升高，但是它也可能具有顯著的缺點，諸如腦 中非特異性定位的升高。如果例如非特異性定位的偶聯(lián)物促成降低體內(nèi)成像的靈敏性和 /或選擇性的高背景，那么這可能是一個特別的顧慮。本文中所描述的偶聯(lián)物沒有遭受此缺點。例如，用包含在兩端都用芘標記的 A3肽的偶聯(lián)物進行的實驗顯示了偶聯(lián)物在施用后6小時被清除，如通過腦脊液分析所測 定的，其沒有揭示循環(huán)偶聯(lián)物的證據(jù)?？梢詰{實驗評估偶聯(lián)物的定位和清除或降解速率，例如通過對小鼠施用偶聯(lián) 物，并將它們處死以在施用后不同時間時(諸如在施用后的時間期限，包括2分鐘、10分 鐘、30分鐘、60分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、或更長時)分
析來進行。
可以憑實驗證實偶聯(lián)物的非毒性，例如使用本領(lǐng)域中已知的體外測定法和體內(nèi) 嚙齒類毒性研究來進行。B.肽制劑在包含氨基酸殘基外，肽制劑的性質(zhì)是不受限制的。肽制劑可以是合成的或 天然存在的肽，包括天然存在的肽的變體或衍生物。肽可以是線性肽、環(huán)肽、約束肽 (constrained peptide)、或模擬肽(peptidomimetic)。用于生成環(huán)肽的方法是本領(lǐng)域中公知 的。例如，可以以頭尾方式、側(cè)鏈到N或C端殘基、以及使用接頭的環(huán)化來實現(xiàn)環(huán)化。 環(huán)肽的選擇性和活性取決于環(huán)肽的控制其三維結(jié)構(gòu)的總體環(huán)大小。如此，環(huán)化提供了一 種用于探查疾病狀態(tài)的行進以及靶向病態(tài)蛋白質(zhì)的特定自我聚集狀態(tài)的有力工具。在一些實施方案中，肽制劑特異性結(jié)合與神經(jīng)病癥有關(guān)的靶蛋白或結(jié)構(gòu)。根據(jù) 這些實施方案，本發(fā)明為診斷或治療提供了可用于選擇性靶向與神經(jīng)病癥有關(guān)的靶蛋白 或結(jié)構(gòu)的制劑。在一些實施方案中，肽制劑是一種肽探針，如記載于PCT申請PCT/ Us2007/016738(w0 2008/013859)和美國專利申請11/828,953中的，本文通過提及而完 整收錄其全部內(nèi)容。如其中所描述的，此類肽探針可以用作檢測劑和/或治療劑。PCT 申請PCT/US2007/016738(W() 2008/013859)和美國專利申請11/828,953中所描述的例 示性肽探針包括與靶蛋白中經(jīng)歷從a-螺旋構(gòu)象向片層構(gòu)象的構(gòu)象變化的區(qū)域?qū)?氨基酸序列，并且肽探針自身經(jīng)歷從a-螺旋構(gòu)象向片層構(gòu)象的構(gòu)象變化，但是不包 括靶蛋白的全長序列。例如，肽探針可以由來自靶蛋白序列的至少5個，或約10個至約 25個連續(xù)氨基酸，包括來自靶蛋白序列的至少5個、至少10個、多至約25個和多至約 50個，諸如5至50、10至50、5至25或10至25個連續(xù)氨基酸組成。在一些實施方案 中，在與處于片層構(gòu)象的靶蛋白接觸時，肽探針可以經(jīng)歷構(gòu)象變化。如PCT申請PCT/US2007/016738(W() 2008/013859)和美國專利申請 11/828,953 中所描述的，其中所描述的肽探針可用于在樣品中或在體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)，并可用于檢測 處于特定結(jié)構(gòu)狀態(tài)(例如靶結(jié)構(gòu)狀態(tài))諸如自我聚集的特定構(gòu)象或狀態(tài)的蛋白質(zhì)。例如， 可以將肽探針與芘偶聯(lián)，使得在肽探針是a-螺旋或無規(guī)卷曲構(gòu)象(或可溶性狀態(tài))時它 不形成激基締合物，但是在肽探針處于片層構(gòu)象(或不溶性聚集狀態(tài))時確實形成 激基締合物。靶結(jié)構(gòu)狀態(tài)可以與疾病有關(guān)，而不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)與疾病無關(guān)。靶結(jié)構(gòu)狀態(tài)可 以引起疾病，可以是疾病癥狀中的一個因素，可以由于其它因素而在樣品中或在體內(nèi)出 現(xiàn)，或者可以在其它方面與疾病有關(guān)。在一些實施方案中，肽制劑包含PCT申請PCT/US2007/016738 W02008/013859)和美國專利申請11/828,953的氨基酸序列SEQ ID NO 34。在一些實 施方案中，肽制劑包含PCT申請PCT/US2007/016738 WO 2008/013859)和美國專利申 請 11/828,953 的氨基酸序列 SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO 38、或SEQ ID NO 45，其在檢測和治療AD的背景中是有用的。在一些實施 方案中，肽制劑選自 WO 2008/013859 的 SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO 38、或SEQ ID NO: 45。在其它實施方案中，肽制劑不同于WO 2008/013859 的 SEQ ID NO 34、SEQ IDNO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、 SEQ ID NO 38、或 SEQ ID NO : 45。在一些實施方案中，肽選自 WO 2008/013859 的SEQ ID NO 36或SEQIDNO: 38。在一些實施方案中，肽不同于W0 2008/013859 的 SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO 38，包括選自 W0 2008/013859 的 SEQ ID NO 34、 SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 37、或 SEQ ID NO : 45 的肽或另一種肽。在一些實 施方案中，肽是W0 2008/013859的SEQ ID NO : 36。在一些實施方案中，肽不同于 W02008/013859 的 SEQ ID NO 36,包括選自 WO 2008/013859 的 SEQ ID NO 34、 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO : 37、或 SEQ ID NO : 45 的肽或另一種肽。在一些實施 方案中，肽是W0 2008/013859的SEQ ID NO: 38。在一些實施方案中，肽不同于W0 2008/013859 的 SEQ ID NO 38，包括選自 W0 2008/013859 的 SEQ ID NO 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO 37、或 SEQ ID NO : 45 的肽或另一種肽。SEP ID NO 1 (WO 2008/013859 的 SEO ID NO 34)Val Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val His Lys Leu Asn Thr Lys ProLys Leu Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val LysSEO ID NO 2 (WO 2008/013859 的 SEO ID NO 35)Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly LeuMetSEO ID NO 3 (WO 2008/013859 的 SEO ID NO 36)Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie GlyLeu MetSEO ID NO 4 (WO 2008/013859 的 SEO ID NO 37)Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly LeuMet LysSEO ID NO 5 (WO 2008/013859 的 SEO ID NO 38)Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie GlyLeu Met LysSEO ID NO 6 (WO 2008/013859 的 SEO ID NO 45)Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala在其它實施方案中，肽制劑特異性結(jié)合與其它神經(jīng)病癥，諸如中風、腦血管疾 病、癲癇、傳染性海綿樣腦病(TSE)有關(guān)的靶蛋白或結(jié)構(gòu)；阿耳茨海默氏病(AD)、腦淀 粉樣血管病(CAA)、和腦血管疾病(CVD)的淀粉樣斑中的A3肽；帕金森氏病的Lewy 小體中的a-突觸核蛋白沉積物、額顳癡呆和皮克氏病中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau;肌萎 縮性脊髓側(cè)索硬化中的超氧化物歧化酶；及亨延頓氏病和良性和癌性腦腫瘤諸如成膠質(zhì) 細胞瘤(glioblastoma，s)、垂體瘤(pituitary tumor) > 或腦膜瘤(meningioma)中的亨延頓 蛋白。在一些實施方案中，肽制劑經(jīng)歷與上文所討論的a-螺旋向片層變化不同的 構(gòu)象變化，諸如片層向a-螺旋變化、非結(jié)構(gòu)化(unstructured)向片層變化等。 此類肽制劑在與與神經(jīng)病癥有關(guān)的靶肽或結(jié)構(gòu)相互作用后可以經(jīng)歷此類構(gòu)象變化。在其它實施方案中，肽制劑是特異性結(jié)合與神經(jīng)病癥有關(guān)的靶蛋白或結(jié)構(gòu)，諸 如與致淀粉樣病有關(guān)的靶蛋白或結(jié)構(gòu)(諸如自我聚集的特定構(gòu)象或狀態(tài))的抗體，諸如抗淀粉樣抗體E610和NG8。其它抗淀粉樣抗體是本領(lǐng)域中已知的，特異性結(jié)合與其它神 經(jīng)病癥有關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)的抗體亦然。其它肽檢測劑包括熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)、鏈霉抗生物素蛋白、 酶、酶底物，和本領(lǐng)域中已知的其它肽檢測劑。例示性肽治療劑包括肽大分子和小肽。例如，神經(jīng)營養(yǎng)性蛋白在本文中所描述 的方法的背景中作為肽制劑是有用的。神經(jīng)營養(yǎng)性蛋白包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源 性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白_3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白_4(NT_4)、神經(jīng)營 養(yǎng)蛋白-5(NT_5)、胰島素樣生長因子(IGF-I和IGF-II)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營 養(yǎng)因子(GDNF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、表皮生長因 子(EGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的連接蛋白(GDN)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-ci和TGF-日)、白介 素、血小板源性生長因子(PDGF)和S1OO0蛋白、以及其生物活性衍生物和類似物。神經(jīng)活性肽還包括下丘腦釋放激素、垂體后葉激素、垂體肽、無脊椎動物肽、 胃腸肽、那些在心臟中找到的肽的亞類一諸如心房鈉尿肽，和其它神經(jīng)活性肽。下丘腦釋放激素的亞類包括作為合適例子的促甲狀腺素釋放激素、促性腺激素 釋放激素、促生長素抑制素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和生長激素釋放激素。垂體后葉激素的亞類以諸如加壓素、催產(chǎn)素、和后葉激素運載蛋白等化合物例
7J\ o垂體肽的亞類以促腎上腺皮質(zhì)激素、內(nèi)啡肽、a-促黑色素細胞激素、促乳 素、黃體化激素、生長激素、和促甲狀腺激素例示。合適的無脊椎動物肽以FMRF酰胺、水螅頭激活劑、直腸肽、小的心臟肽、肌 調(diào)蛋白、Buccolin、產(chǎn)卵激素和袋細胞肽(bag cell peptide)例示。胃腸肽包括此類神經(jīng)學活性化合物，諸如血管活性腸肽、縮膽囊素、胃泌素、 神經(jīng)降壓肽、甲硫氨酸腦啡肽、亮氨酸腦啡肽、胰島素和胰島素樣生長因子I和II、胰高 血糖素、肽組氨酸異亮氨酸酰胺、鈴蟾肽，促胃動素和胰泌素。其它神經(jīng)活性肽的例子包括血管緊張肽II、緩激肽、強啡肽、Opiocortin、睡眠 肽(sleep peptide)、降鈣素、CGRP (降鈣素基因相關(guān)肽)、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)肽Yy、甘丙
肽、物質(zhì)K(神經(jīng)激肽)、泡蛙肽、肛褶蛙肽、耳腺蛙肽、章魚唾腺精(eledoisin)和心房 鈉尿肽。肽制劑還包括與突觸囊泡膜有關(guān)的蛋白質(zhì)，諸如鈣結(jié)合蛋白和其它突觸囊泡蛋 白。鈣結(jié)合蛋白的亞類包括細胞骨架相關(guān)蛋白，諸如鈣調(diào)結(jié)合蛋白、膜聯(lián)蛋白、鈣電蛋 白(哺乳動物)、鈣電蛋白(電鰩)、依鈣蛋白I、依鈣蛋白復合物、依鈣蛋白II、內(nèi)聯(lián)蛋 白I、內(nèi)聯(lián)蛋白II、蛋白II、會聯(lián)蛋白I;和酶調(diào)節(jié)物，諸如p65。其它突觸囊泡蛋白包括活動化抑制劑(諸如突觸蛋白Ia，b和突觸蛋白Ila，b)、 可能的融合蛋白諸如突觸泡蛋白、和未知功能的蛋白質(zhì)諸如p29、VAMP-1, 2(小突觸泡 蛋白)、VAT1、rab3A、禾口 rab3B。肽制劑還包括a-、3-禾日￥-干擾素、Epoetin、非格司亭(Fligrastim)、沙格司 亭(Sargramostin)、CSF_GM、人IL、TNF和其它生物技術(shù)藥物。肽制劑還包括使用重組生物技術(shù)方法獲得的肽、蛋白質(zhì)和抗體。肽制劑還包括“抗淀粉樣劑”或“抗致淀粉樣劑”，其直接或間接抑制蛋白質(zhì)聚集和/或形成淀粉樣斑或沉積物和/或促進淀粉樣斑或沉積物的解聚或降低?？沟矸?樣劑還包括一般在本領(lǐng)域中稱為“淀粉樣切除機(buster)”或“斑切除機”的制劑。這 些包括作為模擬肽并與淀粉樣原纖維相互作用以將它們緩慢溶解的藥物?！澳M肽”指 生物分子模擬另一種生物學活性肽分子的活性?！暗矸蹣忧谐龣C”或“斑切除機”還包 括吸收淀粉樣原纖維保持穩(wěn)定所必需的輔助因子的制劑。抗淀粉樣劑包括抗體和肽探針，如記載于PCT申請PCT/US2(K)7/016738(WO 2008/013859)和美國專利申請11/828,953中的，本文通過提及而完整收入其全部內(nèi)容。 如其中所描述的，針對給定靶蛋白的肽探針特異性結(jié)合所述蛋白質(zhì)，而且可以優(yōu)先結(jié)合 靶蛋白的特定結(jié)構(gòu)形式。雖然不想要限于任何理論，認為肽探針結(jié)合靶蛋白會阻止靶蛋 白的高級裝配物的形成，由此預防或治療與靶蛋白有關(guān)的疾病和/或預防疾病的進一步 行進。例如，肽探針對靶蛋白單體的結(jié)合會阻止靶蛋白的自我聚集。類似地，肽探針對 可溶性寡聚體或不溶性聚集物的結(jié)合會阻止進一步聚集和初原纖維和原纖維形成，而肽 探針對初原纖維或原纖維的結(jié)合會阻止該結(jié)構(gòu)的進一步延伸。在阻斷進一步聚集外，這 種結(jié)合還能將平衡移回到更有利于可溶性單體的狀態(tài)，進一步使疾病的行進停止，并減 輕疾病癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可上文描述為例示性檢測劑的肽制劑中許多作為治療劑也 是有用的，并且上文描述為例示性治療劑的肽制劑中許多作為檢測劑也是有用的。如 此，這些描述符決不是限制性的。在一些實施方案中，肽制劑是上文所描述肽制劑的變體，具有一個或多個氨基 酸替代、添加、或缺失，諸如一個或多個保守氨基酸替代、添加、或缺失，和/或一個 或多個氨基酸替代、添加、或缺失，其進一步增強偶聯(lián)物穿過BBB的通透性。例如，產(chǎn) 生更疏水性氨基酸序列的氨基酸替代、添加、或缺失可以進一步增強偶聯(lián)物穿過BBB的 通透性。C.芘芘可以是在與非肽制劑偶聯(lián)時改善制劑穿過BBB的通透性的芘或任何芘衍生物 或類似物。芘由四個融合的苯環(huán)構(gòu)成
權(quán)利要求
1.一種用于穿過血腦屏障投遞肽制劑的方法，包括對受試者施用偶聯(lián)物，其包含肽制劑；和芘。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽制劑是治療劑或檢測劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述肽制劑能夠鑒定與神經(jīng)病癥有關(guān)的靶蛋白。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述肽制劑選擇性結(jié)合與神經(jīng)病癥(neurologicalcondition) 有關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述肽制劑包括與所述靶蛋白中經(jīng)歷從α-螺旋構(gòu)象向 β-片層構(gòu)象的構(gòu)象變化的區(qū)域?qū)陌被嵝蛄?，但是不包括所述靶蛋白的全長序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述檢測劑包含SEQIDNO: 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述肽制劑是對與神經(jīng)病癥有關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)特異性的 抗體。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述肽制劑是可用于治療神經(jīng)病癥的治療劑。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述偶聯(lián)物進一步包含可檢測標記物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述芘是芘的衍生物。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述芘的衍生物選自下組烷基芘、氨基芘、芘羧酸鹽 (酯)(pyrene carboxylate)、芘丁酸鹽(酯)、清蛋白-芘、PEG化的芘、包含游離羧基的 芘衍生物和包含游離氨基的芘衍生物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述偶聯(lián)物包含兩個或更多個芘模塊。
13.權(quán)利要求1的方法，其中與所述肽相比，偶聯(lián)物展現(xiàn)出穿過所述血腦屏障的通透 性增強。
14.一種體內(nèi)檢測方法，包括(a)對受試者施用包含(i)肽檢測劑和(ii)芘的偶聯(lián)物，并(b)檢測位于所述受試者的腦中的偶聯(lián)物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述偶聯(lián)物包含兩個或更多個芘模塊。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述肽檢測劑在選自如下的位置與芘偶聯(lián)所述肽檢 測劑的C端和N端的至少一處。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述肽檢測劑在所述肽檢測劑的C端和N端的每處與 芘模塊偶聯(lián)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中步驟(b)包括檢測芘激基締合物形成。
19.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種芘模塊是包含游離羧基的芘衍生物，而至少一 種芘模塊是包含游離氨基的芘衍生物。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述肽檢測劑能夠鑒定與神經(jīng)病癥有關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求14的方法，其中肽檢測劑能夠鑒定處于自我聚集的特定構(gòu)象或狀態(tài)的蛋 白質(zhì)。
22.權(quán)利要求14的方法，其中所述檢測劑包含SEQIDNO : 2、SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 6。
23.權(quán)利要求14的方法，其中所述偶聯(lián)物進一步包含可檢測標記物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述標記物選自下組熒光團、MRI造影劑、離子發(fā) 射體、和放射性標記物。
25.一種治療神經(jīng)病癥的方法，包括對有所需要的受試者施用治療有效量的偶聯(lián)物， 其包含ω肽治療劑和(ω芘。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述肽治療劑可用于治療神經(jīng)病癥。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述肽治療劑是抗淀粉樣劑。
全文摘要
描述了用于穿過血腦屏障投遞肽制劑的方法，包括對受試者施用包含(i)肽制劑和芘的偶聯(lián)物，和相關(guān)檢測和治療方法。
文檔編號A61P25/28GK102014967SQ200980116666
公開日2011年4月13日 申請日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
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