專利名稱：：聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種PEG修飾的前藥及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：燈盞花乙素(Scutellarin),即4',5,6_三羥基黃酮-7-葡糖醛酸苷，具有清除活性氧，擴(kuò)張血管、增加心臟冠脈流量、增加腦血流量、降低腦血管阻力、提高血腦屏障通透性以及對(duì)抗血小板凝集等作用，故可用于心腦血管疾病，如腦梗塞、中風(fēng)后偏癱，冠心病心絞痛等，療效較好。而且應(yīng)用于臨床20余年來，沒有發(fā)現(xiàn)其嚴(yán)重的副作用。其現(xiàn)有制劑有普通片劑、注射劑和注射用粉針。雖然燈盞花乙素具有重大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，但是它的廣泛應(yīng)用存在著明顯的缺點(diǎn)燈盞花乙素的水中溶解度低(0.056mg/ml)，半衰期較短(3-4分鐘)，口服生物利用度差(0.4%)，同時(shí)，活性也有待進(jìn)一步提高。利用化學(xué)方法修飾燈盞花乙素，克服其缺點(diǎn)并提高其活性是一個(gè)期待解決的問題。前藥的設(shè)計(jì)可有效地解決某些藥物的水溶性和穩(wěn)定性問題，增加藥物的血液存留時(shí)間，改變藥物體內(nèi)分布，提高生物利用度和降低毒副作用。近年來，高分子前藥更是引起了研究者極大的關(guān)注。聚乙二醇以其良好的水溶性、無毒、良好的生物相容性和無免疫原性等其他高分子無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，在前藥的合成和制備中占有重要地位。當(dāng)將聚乙二醇分子偶聯(lián)到藥物分子時(shí)，由于引入了親水基團(tuán)，可改善它們?cè)谒芤褐械娜芙庑?；由于PEG分子很長，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障，可減少藥物的酶解提高半衰期；同時(shí)也可避免在腎臟的代謝中很快消除提高生物利用度。CN101095955、CN101095956分別采用聚天冬氨酸衍生物和羧甲基殼聚糖作為原料合成了一系列燈盞花乙素前藥，得到的燈盞花乙素前藥的溶解度在25。C水中的溶解度分別為6385mg/ml、2345mg/ml，對(duì)溶解度的改善程度較小。四川大學(xué)周慶頌等(中國藥學(xué)雜志，2006，41(5),375)用聚乙二醇(PEG)對(duì)燈盞花乙素的羧基進(jìn)行了修飾，得到不同分子量的燈盞花乙素PEG酯，并進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究。得到的燈盞花乙素PEG酯在25。C水中的溶解度為18.7mg/ml，溶解度改善程度較小，而且合成過程中使用的PEG的量為燈盞花乙素的100倍，分離非常困難，同時(shí)，沒有進(jìn)行藥效研究。中國藥科大學(xué)張燦等(中國天然藥物，2006，4(4)，283)報(bào)道了'j:丁盞花乙素酚羥基用2000分子量的mPEG-SS修飾的化合物，其中燈盞花乙素羧基沒有保護(hù)。作者提供的NMR譜上看不到燈盞花乙素的信號(hào)，琥珀酸的亞甲基信號(hào)也不清楚；質(zhì)譜信號(hào)非常復(fù)雜，沒有明確的單一產(chǎn)物質(zhì)譜圖。因此，產(chǎn)物是否已經(jīng)合成尚有疑問。雖然作者測(cè)定了修飾后產(chǎn)物的溶解度(800mg/mL)，但作者沒有進(jìn)行進(jìn)一步的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究。因此，對(duì)燈盞花乙素的羧基和酚羥基進(jìn)行系統(tǒng)修飾，開發(fā)出水溶性好，藥效高的藥物仍然是一個(gè)沒有解決的問題。本發(fā)明的目的在于提供聚乙二醇修飾的燈盞花乙素前藥及其制備方法，改善燈盞花乙素的水溶性，增強(qiáng)其生物活性。本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到一種聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，如式(IV)所示，
發(fā)明內(nèi)容X為O或NH;R,為的烷基或優(yōu)選為Cl6的烷基或R2為H或0R3或R4分別為C14的烷基;當(dāng)R,為C110的垸基時(shí)R2不為H;n為6200，優(yōu)選為6150，進(jìn)一步優(yōu)選670，換一種說法，即聚乙二醇修飾起始物聚乙二醇(PEG)的分子量范圍為400~10000，優(yōu)選400~8200，進(jìn)一步優(yōu)選400-4000。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，進(jìn)一步優(yōu)選如下式(I)、式(II)或式(III)化合物，燈盞花乙素的羧基與聚乙二醇單甲醚反應(yīng)成的燈盞花乙素-聚乙二醇單甲醚-6"-酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)燈盞花乙素的羧基與甲氧基聚乙二醇胺反應(yīng)成的燈盞花乙素-聚乙二醇(400)單甲醚-6"-酰胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(II)燈盞花乙素垸基酯的酚羥基與聚乙二醇單甲醚琥珀酸單酯反應(yīng)生成的燈盞花乙素-聚乙二醇單甲醚琥珀酸單酯-4'-酉旨<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(III)在式i、n和ni中，各基團(tuán)進(jìn)一步優(yōu)選為R,為C14的烷基，最優(yōu)選為甲基；R3或R4分別為C14的烷基，最優(yōu)選為甲基；n為6150，最優(yōu)選為670。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，以燈盞花乙素為主要原料，先將燈盞花乙素的羧基與聚乙二醇單烷醚反應(yīng)成的酯類燈盞花乙素，或者將燈盞花乙素的羧基與烷氧基聚乙二醇胺反應(yīng)成酰胺類燈盞花乙素，或者將燈盞花乙素的羧基與烷基醇反應(yīng)生成烷基酯類燈盞花乙素；對(duì)于燈盞花乙素的酚羥基，可以在前面已制備的化合物的基礎(chǔ)上，或者直接在燈盞花乙素的基礎(chǔ)上，將酚羥基與聚乙二醇單烷醚琥珀酸單酯反應(yīng)生成酯類燈盞花乙素，幾類典型化合物的制備方法如下A、將聚乙二醇單烷醚與燈盞花乙素在偶聯(lián)體系和溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)式為或者B、將烷氧基聚乙二醇胺與燈盞花乙素在偶聯(lián)體系和溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)式為:OH或者c、將燈盞花乙素脂化后與聚乙二醇單烷醚琥珀酸單酯在偶聯(lián)體系和溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)式為OH0其中偶聯(lián)體系為HOBt和DCC、DMAP禾口DCC、DMAP禾卩EDC、DMAP和DIPC、HOBt禾tlEDC、或HOBt和DIPC，最佳偶聯(lián)體系為HOBt和DCC。溶劑為吡啶、DMF或DMSO,最佳溶劑為DMF。燈盞花乙素或其酯與聚乙二醇類化合物反應(yīng)時(shí)的溫度為10100'C，最佳溫度為40-60°C;反應(yīng)時(shí)間為248小時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為5-10小時(shí)。上述各方法得到的粗產(chǎn)品可以采用硅膠柱色譜分離，如使用CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=10:1:0.1的洗脫劑分離提純等。以下以化合物I、II、III(其中R,、&和R4均為甲基)為例進(jìn)一步說明各化合物的制備方法。(1)化合物I的制備方法將聚乙二醇單甲醚(mPEG)與燈盞花乙素，在HOBt/DCC偶聯(lián)體系和DMF溶劑中反應(yīng)，制得化合物I，不同分子量mPEG與燈盞花乙素反應(yīng)所得化合物以I-PEG分子量命名，如I-PEG400代表以400分子量的mPEG修飾得到的I類化合物。OH(2)化合物II的制備方法A、鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽的制備將氫氧化鉀的甲醇溶液滴加到鄰苯二甲酰亞胺的乙醇溶液中，滴加完畢后反應(yīng)4小時(shí)。B、單甲氧基聚乙二醇對(duì)甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制備將mPEG加適量溶劑溶解，與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)制備。C、甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)的制備將上述步驟B制得的mPEG-OTs溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲?，和步驟A制備的鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，120。C下反應(yīng)4小時(shí)。然后將反應(yīng)所得聚合物與水合肼回流反應(yīng)4小時(shí)，得到端基為胺基的聚乙二醇單甲醚。D、藥物分子的引入將步驟C制得的mPEG-NH2與燈盞花乙素，在溶劑和偶聯(lián)體系下，加熱至40。C反應(yīng)10小時(shí)，制得化合物II，不同分子量PEG與燈盞花乙素反mimit合物以I1-PEG分子量命名，如如II-PEG400代表以400分子量的mPEG修飾得到的II類化合物。在本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例中，選取1-羥基苯并三唑(HOBt)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作為偶聯(lián)體系，干燥的DMF作為溶劑。上述制備方法的合成路線如下所示(3)化合物m的制備方法A、聚乙二醇單甲醚琥珀酸單酯(ss-PEG)的合成將干燥的mPEG溶于氯仿中，加入琥珀酸酐和吡啶，加熱回流反應(yīng)48h制得。B、燈盞花乙素甲酯的合成甲醇的鹽酸溶液的制備在冰鹽浴下，將SOCl2滴加到干燥的甲醇中制得。在冰鹽浴下將甲醇的鹽酸溶液滴加到燈盞花乙素的DMF溶液中，升溫至40。C反應(yīng)制得燈盞花乙素甲酯。其它的酯可用同樣方法制得。C、藥物分子的引入將步驟B制得的燈盞花乙素甲酯與步驟A制得的ss-PEG，在一定的偶聯(lián)體系下反應(yīng)制得化合物(III),不同分子量PEG與燈盞花乙素反應(yīng)所得化合物以III-PEG分子量命名，如111-PEG400代表以400分子量的mPEG修飾得到的III類化合物。在本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例中，選取l-羥基苯并三唑(HOBt)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作為偶聯(lián)體系，干燥的DMF作為溶劑。上述制備方法的合成路線如下所示本發(fā)明的化合物能夠明顯改善燈盞花乙素的水溶性，增強(qiáng)其生物活性，可以應(yīng)用于制備治療腦血栓、腦梗塞、腦中風(fēng)、腦中風(fēng)所致后遺癥、冠心病或心絞痛藥物。溶解度及藥藥實(shí)驗(yàn)溶解度測(cè)試(1)UV吸收波長的選擇化合物(I)、(n)和(in)測(cè)定波長為335nm。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備配置各化合物的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計(jì)在335nm處測(cè)定吸光度，將吸收度與對(duì)照品溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。(3)化合物溶解度測(cè)定配置各化合物的過飽和溶液，用紫外分光光度法測(cè)定吸收度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各化合物在水中的溶解度。藥效實(shí)驗(yàn)采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞(Middlecerebralartery,MCA0)腦缺血再灌注模型，造成腦缺血。于腦缺血后立即給藥1次，以后每2小時(shí)給藥一次，共給藥3次。腦缺血后48小時(shí)觀察神經(jīng)缺陷癥狀，活殺動(dòng)物取腦，測(cè)定腦梗死面積，確定PEG修飾的燈盞花乙素系列物的藥效學(xué)活性。1、受試藥物陽性對(duì)照藥尼莫地平，注射液，規(guī)格10mg/50ml，為市售注射液，25'C以下保存，由于用5%葡萄糖溶液稀釋后有析出，固采用原液注射。對(duì)照藥燈盞花乙素，黃色粉末，4匸保存，臨用前用滅菌的5%葡萄糖溶液(含0.2%NaHC03)配置成所需濃度。PEG修飾物，4'C保存，臨用前用滅菌的5%葡萄糖溶液配置成所需濃度。2、試驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體重250—300g，SPF級(jí)，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(浙)2003—0001。IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(SPF級(jí)，蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司產(chǎn)品)飼養(yǎng)，溫度22—25'C，濕度70±10%，每籠飼養(yǎng)3只，使用SPF級(jí)專用大鼠顆粒飼料，由南京安立默科技有限公司提供，SPF級(jí)消毒墊料，由南京安立默科技有限公司提供。6:00AM-18:00PM12小時(shí)明暗周期，自由進(jìn)食水。所有接觸動(dòng)物的操作器械和材料均經(jīng)紫外消毒滅菌，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作人員經(jīng)專門培訓(xùn)，有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用上崗合格證，試驗(yàn)用液體的配制在醫(yī)用凈化工作臺(tái)中進(jìn)行。動(dòng)物抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始試驗(yàn)。動(dòng)物活殺或處死均在麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行。3、給藥途徑及方法尾靜脈注射給藥，注射體積為4.0ml/kg體重(尼莫地平除外，為2.0ml/kg體重)。將大鼠固定在大鼠尾靜脈注射固定器中，用酒精棉球輕擦尾尖部，使血管擴(kuò)張，待皮膚表面酒精揮發(fā)干凈后用一次性注射器快速注射受試藥物，拔出注射器后，用消毒棉球壓迫注射點(diǎn)防止出血，2—3分鐘后，將動(dòng)物取出，放回飼養(yǎng)籠中。4、劑量組設(shè)置根據(jù)前期燈盞花乙素量效關(guān)系研究結(jié)果，以燈盞花乙素60mg/kg作為藥效篩選劑量，陽性對(duì)照藥選用尼莫地平注射液，文獻(xiàn)報(bào)道大鼠的有效劑量為1.2mg/kg。為確保在同等有效劑量下進(jìn)行比較，不同聚合度PEG修飾的燈盞花乙素，采用與對(duì)照藥燈盞花乙素給藥劑量相同摩爾數(shù)給藥。5、對(duì)照組設(shè)置模型組給大鼠尾靜脈注射等體積的5%葡萄糖溶液溶液。假手術(shù)組:給大鼠尾靜脈注射等體積的5%葡萄糖溶液溶液。除特別強(qiáng)調(diào)外，假手術(shù)組的所有處理與其余各組相同。陽性對(duì)照組莫地平注射液作為陽性對(duì)照,采用文獻(xiàn)報(bào)道的劑量1.2mg/kg,共給藥三;次,單次給藥劑量為0.4mg/kg。燈盞花乙素對(duì)照組根據(jù)前期燈盞花乙素量效關(guān)系研究結(jié)果，以燈盞花乙素60mg/kg作為藥效篩選劑量,共給藥三次，單次給藥劑量為20mg/kg。6、試驗(yàn)程序設(shè)計(jì)按照上述劑量組設(shè)置原則，設(shè)模型組、假手術(shù)組、陽性對(duì)照尼莫地平、對(duì)照燈盞花乙素組、7個(gè)PEG修飾燈盞花乙素組,共11組，每組12只動(dòng)物。在手術(shù)過程中，凡麻醉、手術(shù)等出現(xiàn)異常情況的動(dòng)物均被剔除。制備腦缺血模型后，將動(dòng)物按機(jī)率均等單盲分配至各組。于腦缺血后立即給藥1次，以后每2小時(shí)給藥一次，共給藥3次，于腦缺血后48小時(shí)評(píng)價(jià)神經(jīng)缺陷癥狀，而后處死動(dòng)物，取腦，染色，拍照測(cè)定腦梗死面積。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，每12小時(shí)進(jìn)行1次一般情況觀察，主要內(nèi)容包括死亡、昏迷、呼吸、大小便性狀、毛色、精神狀況、嘔吐及嘔吐物、出血、驚厥、抽搐等。試驗(yàn)程序如下動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)~>腦缺血模型機(jī)率均等單盲分組-+藥物治療—神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)分腦梗死面積測(cè)定、死亡率的統(tǒng)計(jì)一般情況記錄7、腦缺血模型的制備采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞(Middlecerebralartery,MCA0)腦缺血再灌注模型-。動(dòng)物用10%水合三氯乙醛(3.5ml/kg)麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒皮膚，頸部正中切開，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，輕輕剝離迷走神經(jīng)，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈，循頸內(nèi)動(dòng)脈向前，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。夾閉頸總動(dòng)脈近心端，從頸外動(dòng)脈的結(jié)扎線的遠(yuǎn)端作一切口，插入外徑為0.285mm的尼龍線，進(jìn)過頸總動(dòng)脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，然后徐徐插入至有輕微阻力為止(自分叉處約20mm)，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供，用激光多普勒腦血流儀監(jiān)測(cè)腦血流，右側(cè)腦缺血1.5h后，輕輕拔出尼龍線，恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注，縫合頭皮，消毒。假手術(shù)組僅分離血管，不插入尼龍線。整個(gè)手術(shù)使用大鼠加熱板和60W的臺(tái)燈維持大鼠的體溫37.0士0.5'C。8、神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)價(jià)采用改良Bederson5分制法進(jìn)行神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)價(jià)。采用單盲法評(píng)價(jià)腦外傷后大鼠的神經(jīng)缺陷癥狀，即由試驗(yàn)設(shè)計(jì)者將動(dòng)物按組標(biāo)記，對(duì)神經(jīng)缺陷癥狀進(jìn)行評(píng)分的試驗(yàn)者不知道動(dòng)物的分組情況，評(píng)分結(jié)束后，評(píng)分者將各種標(biāo)記的評(píng)分結(jié)果呈交設(shè)計(jì)者，由設(shè)計(jì)者揭盲，獲得各試驗(yàn)組每只動(dòng)物的評(píng)分。神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)分Bederson5分制法0:提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的兩前肢均伸向地板方向，且無其他行為缺陷1:提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的手術(shù)對(duì)(左)側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲、肩內(nèi)旋、肘外展、緊貼胸壁2:將動(dòng)物置于光滑平板上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)阻力降低3:動(dòng)物自由行走時(shí)，向手術(shù)對(duì)側(cè)環(huán)行或轉(zhuǎn)圈4:肢體軟癱，肢體無自發(fā)活動(dòng)9、腦梗死面積的測(cè)定動(dòng)物用10%的水合氯醛麻醉，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，用生理鹽水沖洗大腦表面血跡，吸去表面殘留水跡，于一8(TC放置7min，取出后立即于視線交叉平面垂直向下作冠狀切面，并向后每隔2mm切一片，將腦片置于用0.2mol/LpH7.47.8PBS新鮮配制的20g/LTTC染液中水浴(37'C90min)，正常腦組織染成深紅色，缺血腦組織則呈蒼白色，用生理鹽水沖洗后，迅速將腦片從前向后按順序排成一排，吸干表面殘留水跡，拍照。用圖像分析軟件對(duì)照片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，圈定右側(cè)缺血面積(白色區(qū)域)和右側(cè)總面積，用如下公式計(jì)算腦梗死面積的百分比。梗死面積％=iooxl^fll右側(cè)總面積io、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量資料表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。腦梗死面積、神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)分采用單因素方差分析，Scheffe's檢驗(yàn)測(cè)定兩組間的差異顯著性。動(dòng)物死亡率的組間比較采用X2檢驗(yàn)，將差異P〈0.05定義為差異顯著。各結(jié)果分別見表l，表2和表3。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:燈盞花乙素-聚乙二醇(400傳甲醚-6，，-酯(化合物I-400)的合成將燈盞花乙素9.24g，mPEG(400)12g，HOBt4.05g,DCC6.18g(摩爾比h1.5:1.5:1.5)加入到80mL的DMF中溶解，通氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)體系，加熱至40。C反應(yīng)6小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH40:1:0.2)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出部分固體，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，粘稠狀物質(zhì)粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH40:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體7.65g，產(chǎn)率45.3%。1HNMR(DMSO-d6,300MHz):5H6.81(1H,S,C3-H),7.00(1H，S,C8-H)，7.93(2H,d，J=8.9Hz,C2',6'-H),6.96(2H，d，J=8.9Hz，C3、5'-H)，5.20(1H,d,J=6.8，d"-H)，4.21(1H,d,J=8,9，C5"-H)，3.373.46(3H，2"，3"，5")，3.35(3H,S,a),3.403.68(b，c)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):287.2(糖苷元)，749.4,783.4，837.4,881.4，925.4，969.4，1009.5,1057.3，分子量之間相差44的為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中881.4為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例2:燈盞花乙素-聚乙二醇(600)單甲醚-6"-酯(化合物I-600)的合成將燈盞花乙素13.86g，mPEG(600)27g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到120mL的DMF中溶解，通氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)體系，加熱至45。C反應(yīng)8小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.2)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出部分固體，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀物質(zhì)粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體12.62g，產(chǎn)率40.3%。!HNMR(DMSO-d6,300MHz):SH6.81(1H，S,C3-H)，7，00(1H，S,C8-H)，7.93(2H,d,J=8.9Hz,C2',6'-H),6.96(2H,d,J=8.9Hz，C3',5'-H),5.20(1H,d,J=6.8，d"-H),4.21(1H,d，J=8.9:C5"-H)，3J73.46(3H，2"，3",5")，3.35(3H,S，a)，3.403.68(b，c)ESI-MS:(M+Na)+m/z(°/。)287.0(糖苷元)，724,4，768.6，812.7，856.6，900.3，944.2，988.1，1031.9，1075.8，1119.8。分子量之間相差44為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中103L9為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例3:燈盞花乙素-聚乙二醇(1000)單甲醚-6"-酯(化合物I-1000)的合成將燈盞花乙素9.24g,mPEG(1000)30g，HOBt4.05g,DCC6.18g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到150mL的DMF中溶解，通氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)體系，加熱至50。C反應(yīng)10小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.2)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出部分固體，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=10:1:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體10.54g，產(chǎn)率36.5%。'HNMR(DMSO-d6,300MHz):5H6.82(1H，S,C3-H)，7.03(1H,S,C8-H)，7.94(2H,d,J=8.9Hz，C2，，6，鄰，6.95(2H,d，J=8.9Hz,C3，,5，-H),5.27(1H，d，J=6.8,C1"-H),4.21(1H,d,J=8.9，C5"-H)，3.333.78(3H，2"，3",5"),3.23(3H,S,a),3.363.68(b,c)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(。/。)287.0(糖苷元)，1138，1182，1226，1270，1314，1358，1402，1446，14卯，1534。分子量之間相差44為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1358為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例4:燈盞花乙素-聚乙二醇(2000)單甲醚-6"-酯(化合物I-2000)的合成將燈盞花乙素9.24g，mPEG(2000)60g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入180mL的DMF中溶解，通氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)體系，加熱至55。C反應(yīng)11小時(shí)，TLC檢觀U反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH^0:l:0.2)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出固體，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH40:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體16.64g，產(chǎn)率33.8%。'HNMR(DMSO-d6,300MHz):5H6.80(1H,S，C3-H)，6,99(1H,S,C8-H)，7.93(2H,d，J-8.6Hz,Cr,6'-H),6.94(2H,d,J=8.6Hz,C3'>5'-H),5.26(1H,d，J=6.8，d"-H),4.19(1H,d,J=9.3,C5"-H),3.333.72(3H,2"，3"，5")'3.23(3H,S,a),3.363.72(b,c).ESI-MS:(M+Na)+m/z(。/o):287.0(糖苷元)，2261,2305,2349,2393，2437,2481,2525,2569，2613，2657。分子量之間相差44為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中2437為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例5:燈盞花乙素-聚乙二醇(3000)單甲醚-6"-酯(化合物I-3000)的合成將燈盞花乙素13.86g,mPEG(3000)135g，HOBt6.07g,DCC9.27g(摩爾比h1.5:1.5:L5)加入120mL的DMF中溶解，通氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)體系，加熱至60。C反應(yīng)12小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.2)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出固體，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水,將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體30.53g，產(chǎn)率29.55%。'HNMR(DMSO-d6,300MHz):SH6.80(1H，S，C3-H),6.99(1H,S,C8-H)，7.92(2H,d，J=6.8Hz，C2，，6，-H)，6.94(2H，d，J=8.6Hz,C3，，5，鄰，5.26(1H,d,J=6.8，Cl"-H)，4.19(1H,d,J=8.6，C5，，-H)，3.333.68(3H，2",3"，5")，3.38(3H,S,a),3.363.68(b，c)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(o/o):287.1(糖苷元)，3100，3144，3188，3232，3276，3320，3364,3408，3512。分子量之間相差44為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中3276為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例6:燈盞花乙素-聚乙二醇(400)單甲醚-6"-酰胺(11-400)的合成(1)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽的制備取100g的鄰苯二甲酰亞胺加入到三頸燒瓶中，再向其中加入600mL的無水乙醇，用恒壓滴液漏斗滴入配置好氫氧化鉀的甲醇溶液(80g/L)1200mL,在室溫下滴加完畢繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)完過濾出固體，并用無水乙醇洗滌固體三次，再真空干燥得到白色粉狀產(chǎn)品122g，產(chǎn)率97%。(2)甲氧基聚乙二醇對(duì)甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)的制備稱取mPEG(400)40g，加入200mL二氯甲烷，6毫升吡啶和95g的對(duì)甲苯磺酰氯，在室溫下反應(yīng)24小時(shí)，待反應(yīng)完全，向反應(yīng)物中加入3mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH二34，用二氯甲烷多次萃取洗滌，在真空下減壓旋去溶劑，加無水乙醚沉淀,洗滌固體，再把所得到固體用飽和碳酸氫鈉洗滌，水洗三次，最后濃縮干燥最后得粘稠狀液體47.56，產(chǎn)率86%。'H雨R(300MHz，CDC13):5H3.37(3H,S，a)，3.573.92(36H，b),4.16(2H,t，J=9.6，c)，7.79(2H，Jed=8.2，d),7.34(2H，Jde=7.9，e),2.49(3H,Me)。(3)甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)的制備稱取mPEG400-OTs55g溶于100mL的DMF中，加入鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽57g，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，120。C下反應(yīng)8小時(shí)。減壓除去溶劑，將殘留物溶于200mL的無水乙醇中，再加入10mL的水合肼回流反應(yīng)12小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶于50mL的二氯甲烷，過濾除去不溶物，再將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用無水乙醚沉淀，得白色固體，純化處理，得到產(chǎn)品31.2g，產(chǎn)率78%。^NMR(300MHz，CDC13):SH3.37(3H，S，a),3.503.94(38H,b,c),2.94(2H，S，d)。13C-NMR(CDC13，300MHz):SC58.33(a),69.6372.33(b)，41.05(c)。用類似的方法可制備甲氧基聚乙二醇胺mPEG(400-10000)-NH2(4)化合物II-400的合成將燈盞花乙素9.24g,mPEG400-NH212g，HOBt4.05g,DCC6.18g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入DMF60mL中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)6小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2C12:CH3OH:HCOOH=7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH^0:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體9.67g，產(chǎn)率57.3%。'HNMR(DMS0-d6，300MHz):S6.81(1H,S，C3-H)，6.96(1H,S，Q-H)，7.94(2H,d，J=8.9Hz,C2',6'-H),6.92(2H，d,J=8.9Hz，C3',5'-H)，5.06(1H,d,P7.5，d"-H),3.96(1H，d,J=9.6，C5"-H)，3.383.60(3H,2"，3",5，，)，3.22(3H,S,a)，3.403.60(b,c).ESI-MS:(M+Na)+m/z(o/o):287.2(糖苷元)，704，748,792,836，880,924,968，1012，1056。分子量之間相差44為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中880為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例7:燈盞花乙素-聚乙二醇(600)單甲醚-6"-酰胺(化合物II-600)的合成將燈盞花乙素13.86g，mPEG600-NH227g，HOBt6.07g，DCC9.27g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到70mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?5。C反應(yīng)7小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH30H:HCOOI^7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將減壓后粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體15.06g,產(chǎn)率48.3%。'H畫R(DMSO-d6,300MHz):S6.82(lH,S,C3-H),6.97(1H,S，C8-H)，7.95(2H,d，J-8.6Hz，Cr,6'-H),6.93(2H，d，J=8.6Hz，C3',5'-H)，5.05(1H，d,J=6.88，C,"-H),3.96(1H，d,J=9.29，C5"-H)，3.333.72(3H，2"，3"，5"),3.25(3H,S，a)，3.403.72(b,c).ESI-MS:(M+Na)+m/z(。/。)287.1(糖苷元)，1005.7,1049.7，1093.5，1137.5，1181.5分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1093.5為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例8:燈盞花乙素-聚乙二醇(1000)單甲醚-6"-酰胺(化合物II-1000)的合成將燈盞花乙素13.86g，mPEG1000-NH245g，HOBt6.07g,DCC9.27g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到70mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?5。C反應(yīng)8小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將減壓后粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體19.50g，產(chǎn)率45%。'HNMR(DMSO-d6，300MHz):56.83(1H,S,C3-H),6.96(1H,S,C8-H)，7.94(2H,d，J=8.6Hz，C2',6'-H)，6.93(2H,d，J-8.6Hz,C3',5'-H),5.03(1H，d,J=6.88，Cr'-H),3.96(1H，d,J=9.29，C5"-H),3.33~3.72(3H，2",3",5，，)，3.25(3H，S,a)，3.403.72(b,c).ESI-MS:(M+Na)+m7z(。/。)287.1(糖苷元)，1252，1296，1340，1384，1428，1472分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1384為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例9:燈盞花乙素-聚乙二醇(1300)單甲醚-6"-酰胺(化合物II-1300)的合成將燈盞花乙素13.86g，mPEG1000-NH245g,HOBt6.07g，DCC9.27g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到70mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?5。C反應(yīng)8小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體22.50g，產(chǎn)率43%。'H雨R(DMSO-d6,300MHz):S6.81(1H，S,C3-H)，6,94(1H,S，C8-H),7.93(2H，d，J=8.6Hz，C2',6'-H),6.93(2H,d，J=8.6Hz，C3',5'-H)，5.02(1H,d，J=6.88，C,"-H),3.96(1H,d,J=9.29，C5"-H)，3.333.72(3H，2"，3"，5")，3.25(3H,S,a)，3.403.72(b，c).ESI-MS:(M+Na)+m/z(。/o):287.1(糖苷元)，1472,1516，1560，1604，1648,1692分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1604為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例10:燈盞花乙素-聚乙二醇(2000)單甲醚-6"-酰胺(化合物II-2000)的合成將燈盞花乙素9.24g，mPEG2000-NH260g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到90mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)10小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH30H:HCOOH-7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾艱蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2C12:CH3OH:HCOOH=10:1:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體19.55g，產(chǎn)率40%。'HNMR(DMSO-d6,300MHz):56.83(1H,S,C3-H),6.94(1H,S，C8-H),7.93(2H，d,J=8.6Hz，C2',6'-H),6.93(2H,d,J=8.6Hz,C3',5'-H)，5.02(1H,d，J=6.88,d"-H)，3'98(1H,d,J=9.29,C5"-H),3.33~3.72(3H,2"，3"，5"),3.23(3H,S,a),3.403.69(b，c).ESI-MS:(M+Na)+m/z(。/。)287.1(糖苷元)，2268,2312，2356，2400，2444，2488分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中2400為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例ll:燈盞花乙素-聚乙二醇(3000)單甲醚-6"-酰胺(化合物II-3000)的合成將燈盞花乙素18.48g，mPEG3000-NH2180g，HOBt9.10g，DCC12.36g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到卯mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)10小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-7:l:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=l0:1:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體19.55g，產(chǎn)率40%。NMR(DMSO-d6，300MHz):5H6.82(1H,S,C3-H),6.97(1H,S，C8-H),7.94(2H,d,J=8.9Hz,Cr'6'-H)，6,92(2H,d,J=8.9Hz,C3',5'-H),5.08(1H,d,J=7.5，Cr'-H),3.95(1H，d，J=9.6,C5"-H)，3.383.60(3H，2"，3",5"),3.22(3H,S,a),3.403.60(b，c)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):287.1(糖苷元)，2268，2312，2356，3420，3464，3510分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中3420為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例12:燈盞花乙素-聚乙二醇(400)單甲醚琥珀酸單酯-4，-酯(III-400)的合成(1)聚乙二醇單甲醚400琥珀酸單酯(mPEG400-A)的合成稱取干燥的mPEG400(40g，100mmol)溶于250mL氯仿中，加入丁二酸酐(12.5g，125mmol)和10mL吡啶，加熱至回流反應(yīng)48h，減壓回收溶劑,向殘余物中加入50mL飽和NaHC03溶液溶解,過濾，用30mL乙酸乙酯萃取2次,水相冷卻至O'C，后用2mol/L的鹽酸酸化至pH2左右。用氯仿60mL分3次萃取,合并氯仿層,無水Na2S04干燥過夜。濃縮溶劑，加入200ml無水乙醚沉淀產(chǎn)物，干燥后得白色沉淀45g，產(chǎn)率90%。abcodH3C\^^/01^\^\0(^^""^^T^T0COOH'HNMR(300MHz,CDC13):SH3.30(3H，S，a),3.603.92(40H,b),4.26(2H，J=9.30,t，c),2.63(4H，S,d)。用類似的方法可制備單甲氧基聚乙二醇琥珀酸單酯mPEG(400-10000)-A(2)燈盞花乙素的純化1取50克卯％燈盞花乙素，加水500克。2加飽和的碳酸氫鈉溶液加至全部溶解，此時(shí)pH-78左右。3過濾，濾液在25。C且在機(jī)械攪拌下加入丙酮使之沉淀完全，然后在室溫下讓其靜置18小時(shí)。4過濾，固體用丙酮洗滌三次，再將固體放入2L35。/。丙酮中，直至加入丙酮的量使固體全部溶解為宜。5加入25c/。的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH42左右，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，再靜置12小時(shí)使之沉淀完全。6過濾，所得固體用丙酮洗滌三次，再用水洗滌至pH-7左右，最后用乙醚洗滌三次。7在60。C下真空干燥，經(jīng)NMR和HPLC檢測(cè)，純度在98%以上。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>1HNMR(DMS0-d6，300MHz):56.74(1H,S,C3-H),6.96(1H，S,C8-H)，7.89(2H，d,,J=8.9Hz,C2',6'-H)，6.92(2H,d,J=8.9Hz,C3',5、H)，5.20(1H,d,J=6.8，Cr-H),4.04(1H，d，J=8.9,C5"-H),3.373.46(3H,2"，3",5")13C-NMR(DMS0-d6,300MHz):5C164.19(C2),102.60(C3)，182.42(C4)，149.07(C5)，130.52(C6)，151.03(C7),93.65(C8)，105.93(C9)，146.92(CI0)ESI-MS:(M-H)Tn/z(%):287.2(糖苷元)，461.4(3)燈盞花乙素甲酯的合成甲醇的鹽酸溶液的制備在100mL的圓底燒瓶中加入干燥的甲醇50mL，在冰鹽浴冷卻到-10。C,將13mL的SOCl2緩慢滴加到干燥的甲醇中。并維持在溫度0。C以下，繼續(xù)攪拌IO分鐘,留待后用。將燈盞花乙素4.62g溶于35mL干燥的DMF中，在冰鹽浴下將已經(jīng)制備好的甲醇的鹽酸溶液緩慢滴加到上述溶液中，滴加過程中維持在0。C以下，繼續(xù)攪拌15分鐘，撤去冰浴，升溫至40。C反應(yīng)，高效液相色譜檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)程度達(dá)到99%，停止反應(yīng)，用飽和NaHC03溶液將反應(yīng)液調(diào)至中性，向反應(yīng)液中加水析出沉淀，水洗，真空干燥。產(chǎn)率97%。'HNMR(DMSO-d6，300MHz):5H6.81(1H，S,C3-H),6.99(1H,S，C8-H)，7.89(2H,d，J=7.9Hz，C2',6'-H)，6.92(2H，d,J=7.9Hz,C3',5'-H),S.26(1H，d，J=6.2，C,"-H)，4.20(1H，d,J=8.9,C5"-H),3.363.38(3H，2，，，3，，，5"),3.67(3H,S，C6，，-H).(4)化合物III-400的合成將燈盞花乙素甲酯9.56g，mPEG400-A12g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩爾比h1.2:1.5:1.5)加入到100mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)6.5小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH30H:HCOOH-7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體9.02g，產(chǎn)率47%。'HNMR(DMSO-d6,300MHz):SH6.99(1H,S,C3-H)，7.36(1H,S,C8-H)，8.13(2H，d，J=8.6Hz,C2',6'-H)，6.92(2H，d，J=8.6Hz，C3',5'-H),5.24(1H，d,J=6.2,d"-H),4.16(1H,d,J=5.8，C5"-H)，3.373.46(2"，3"，5")。3.24(3H，S，a),3.283.70(b，c)，2.702.90(4H,d)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):287.0(糖苷元)，878.1,921.9，965.9，1009.7，1053.4，1097.4，1121.4，1165.4。分子量之間相差44為(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1053.4為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例13:燈盞花乙素-聚乙二醇(600)單甲醚琥珀酸單酯-4'-酯(化合物in-600)的合成將燈盞花乙素甲酯19.12g，mPEG600-A28.8g，HOBT8.10g,DCC12.36g(摩爾比l:1.2:1.5:1.5)加入到200mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)6.5小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-7:l:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2CI2:CH3OH:HCOOH=l0:1:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體21.7g，產(chǎn)率43.5%。'HNMR(DMSO-d6，300MHz):5H7.02(1H，S,CrH)，7.35(1H,S,C8-H)，8.12(2H，d，J=8.6Hz,C2',6'-H),7.00(2H，d,J=8.6Hz,C3，，5'-H),5.26(1H，d,J-6.9,Cr'-H)，4.16(1H，d,J=5.8,C5"-H),3.343.66(2"，3",5")。3.24(3H,S,a),3.343.66(b,c)，2.692"0(4H，d)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):286.9(糖苷元)，1207.4,1251.4,1295.4，1339.4，1383.4。分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1295.4為正態(tài)分布最高峰實(shí)施例14:燈盞花乙素-聚乙二醇(1000)單甲醚琥珀酸單酯-4，-酯(化合物111-1000)的合成將燈盞花乙素甲酯9.56g，mPEG1000-A24g，HOBt4.05g,DCC6.18g(摩爾比h1.2:1.5:1.5)加入至ijlOOmL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?5。C反應(yīng)8小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-7:l:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體9.02g,產(chǎn)率47%。'HNMR(DMSO-d6，300MHz):SH6.98(1H,S，C3-H)，7.34(1H,S,Q-H)，8.13(2H，d,J=8.6Hz，C2',6'-H),6.91(2H，d,J=8.6Hz,C3',5'-H),5.23(1H,d,J=6.2,Cr-H),4.16(1H,d，J=5.8，C5"-H),3.373.46(2"，3"，5")。3.24(3H，S,a),3'263.70(b,c),2.702.92(4H,d)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):287.0(糖苷元)，1339,1383，1427，1471，1515，1559，1603，1647。分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1515為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例15:燈盞花乙素-聚乙二醇(1200)單甲醚琥珀酸單酯-4，-酯(化合物III-1200)的合成將燈盞花乙素甲酯9.56g，mPEG1200-A28.8g，HOBt4.05g，DCC6.18g以摩爾比l:1.2:1.5:1.5的比例投料，加入100mL的DMF溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)6.5小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH3OH:HCOOI^7:l:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH^0:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體13.25g，產(chǎn)率38%。'H畫R(DMSO-d6，300MHz):5H6.94(1H,S,C3-H),7.35(1H，S,Q-H),8.12(2H,d，J=8.6Hz,C2',6'-H),6.91(2H,d,J=8.6Hz,C3',5'-H),5.24(1H,d,J=6.2,C「-H),4.16(1H，d，J=5.8,C5"-H)，3.373.46(2"，3"，5")。3.23(3H,S，a)，3.283.70(b，c)，2.702.92(4H，d)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(。/。)287.0(糖苷元)1528，1572，1616，1660，1704，1748，1792。分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中1660為正態(tài)分布最高峰。實(shí)施例16:燈盞花乙素-聚乙二醇(2000)單甲醚琥珀酸單酯-4'-酯(化合物ni-2000)的合成將燈盞花乙素甲酯19.12g，mPEG2000-A96g，HOBt8.10g，DCC12.36g(摩爾比h1.2:1.5:1.5)加入至iJ160mL的DMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)6.5小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cb:CH30H:HCOOH-7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH-10:l:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體36.65g，產(chǎn)率35.8%。'HNMR(DMSO-d6，300MHz):S7.02(1H,S,C3-H)，7.36(1H,S,C8-H)，8.14(2H，d,J=8.6Hz,Cr,6'-H)，7.04(2H，d，J=8.6Hz，C3，,5，-H),5.24(1H,d,J=6.9,d"-H)，4.16(1H,d，J=5.8，C5"-H),3.343.70(2，，，3",5")。3.24(3H,S，a)，3.343.68(b，c)，2.692.90(4H，d)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):286.9(糖苷元),2312,2356'2400，2444,2488。分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中2400為正態(tài)分布最高峰實(shí)施例17:燈盞花乙素-聚乙二醇(3000)單甲醚琥珀酸單酯-4，-酯(化合物ni-3000)的合成將燈盞花乙素甲酯9.56g，mPEG3000-A90g，HOBt4.05g，DCC6.18g(摩爾比l:1.5:1.5:1.5)加入到200mLDMF中溶解，在氮?dú)夥諊录訜嶂?0。C反應(yīng)10小時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(CH2Cl2:CH30H:HCOOH:7:1:0.1)，待反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，過濾出過量的DCC和生成的固體脲，減壓濃縮濾液蒸除DMF和水，將粘稠狀粗產(chǎn)品經(jīng)CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=l0:1:0.1的洗脫劑過硅膠柱三次分離提純，得淺黃色粉狀固體20.45g，產(chǎn)率28.5%。'HNMR(DMSO-d6，300MHz):5H7.02(1H,S，Qj-H),7.36(1H,S,C8-H),8.11(2H，d,J=8.6Hz，C2',6'-H),7.03(2H，d，J=8.6Hz，C3'，5'-H)，5.23(1H，d,J=6.9,d"-H)，4.17(1H，d，J=5.8,C5"-H),3.343.66(2",3"，5")。3.23(3H,S,a),3.343.68(b,c)，2.722.86(4H,d)。ESI-MS:(M+Na)+m/z(%):286.9(糖苷元)，3316，3360,3404，3448，3492，3536，3580。分子量之間相差44的(CH2CH20)n結(jié)構(gòu)單元。其中3448為IH態(tài)分布最高峰發(fā)明的效果1，PEG修飾的燈盞花乙素水溶性如表1所示，本發(fā)明所合成的化合物非常顯著地提高了燈盞花乙素在水中的溶解度。其中，以第II類和第ni類化合物的提高更為顯著。隨PEG分子量的增加，溶解度上升，11-3000的質(zhì)量溶解度達(dá)到了830.3mg/ml比燈盞花乙素提高了14210.4倍，11-1000的質(zhì)量溶解度達(dá)到了554.6mg/ml比燈盞花乙素摩爾溶解度提高了3305.8倍。至此，燈盞花乙素的水溶性問題徹底解決。表1，PEG修飾燈盞花乙素化合物在水中溶解度實(shí)驗(yàn)總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2，PEG修飾的燈盞花乙素藥效如表2所示，PEG修飾的燈盞花乙素與燈盞花乙素相比對(duì)神經(jīng)缺陷癥狀有明顯的改善，如11-2000由燈盞花乙素的2.7降到了1.3。同時(shí)，如表3所示，11-2000的腦梗死面積由燈盞花乙素的27.2%降到了12.2%，活性有顯著的提高。表2，PEG修飾物對(duì)神經(jīng)缺陷癥狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>以上數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明解決了燈盞花乙素水溶性問題的同時(shí)，對(duì)藥效也有顯著的提高。綜合考察，n-2ooo在水溶性，腦梗死面積和神經(jīng)缺陷指數(shù)三方面都表現(xiàn)優(yōu)秀，是一個(gè)在臨床上有應(yīng)用前景候選藥物。權(quán)利要求1、一種聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，如式(IN)所示，其中，X為O或NH；R1為C1～10的烷基或R2為H或且當(dāng)R1為C1～10的烷基時(shí)R2不為H；R3或R4分別為C1～4的烷基；n為6～200。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>Rt為Cl6的烷基或3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，其中n為6150。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，如式(I)、式(II)或式(ni)所示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，R,為C14的烷基，R3或R4分別為C14的烷基，n為6~150。5、根據(jù)權(quán)利要求4述的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物，其中RhR3或R4分別為甲基，n為670。6、一種權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物的制備方法，包括:A、將聚乙二醇單垸醚與燈盞花乙素在偶聯(lián)體系和溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)式為或者B、將垸氧基聚乙二醇胺與燈盞花乙素在偶聯(lián)體系和溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)式為:或者C、將燈盞花乙素脂化后與聚乙二醇單烷醚琥珀酸單酯在偶聯(lián)體系和溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)式為OH07、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)體系為HOBt和DCC、DMAP禾口DCC、DMAP禾卩EDC、DMAP禾卩DIPC、HOBt禾aEDC、或HOBt禾QDIPC。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的溶劑為吡啶、DMF或DMSO。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于燈盞花乙素或其酯與聚乙二醇類化合物反應(yīng)時(shí)的溫度為1010(TC，反應(yīng)時(shí)間為248小時(shí)。10、權(quán)利要求13中任一所述的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物在制備治療腦血栓、腦梗塞、腦中風(fēng)、腦中風(fēng)所致后遺癥、冠心病或心絞痛藥物方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物及其制備方法，聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物如式(IV)所示，本發(fā)明的聚乙二醇修飾的燈盞花乙素化合物可應(yīng)用于制備治療腦血栓、腦梗塞、腦中風(fēng)、腦中風(fēng)所致后遺癥、冠心病或心絞痛藥物。本發(fā)明所得到的燈盞花乙素前藥較之原藥燈盞花乙素的水溶性顯著增加；同時(shí)，小鼠腦缺血再灌注模型藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，與原藥相比，燈盞花乙素前藥的生物活性明顯增強(qiáng)。文檔編號(hào)C07H17/07GK101486744SQ20091002466公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年2月25日優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日發(fā)明者垚華,成昌梅,檀愛民,森王,王義明,胡躍飛,趙興俄,娟路申請(qǐng)人:江蘇先聲藥物研究有限公司