用于檢測腸和血腦屏障通透性的方法及其測試材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的是用于測試與腸和/或血腦屏障通透性相關(guān)的抗原的方法、試驗和裝置。例如，血液、唾液或其他體液可針對以下進行測試：(1)結(jié)合至細菌毒素(優(yōu)選脂多糖)，和(2)結(jié)合至選自(a)腸相關(guān)抗原和(b)血腦屏障相關(guān)抗原中的至少一種的組織抗原。測試結(jié)果的分析可用于協(xié)助檢測和診斷與腸滲漏綜合征相關(guān)的疾病(由于細胞旁途徑或跨細胞途徑，和由于細菌毒素或一些其他原因)和/或用于與過度血腦屏障通透性相關(guān)的疾病，其在本文中考慮為包括神經(jīng)性炎癥和/或神經(jīng)性自身免疫性疾病兩者，和特別是肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默氏病或周圍神經(jīng)病和重性抑郁癥。
【專利說明】用于檢測腸和血腦屏障通透性的方法及其測試材料
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求于2011年I月28日提交的美國臨時申請?zhí)?1/437，244的權(quán)益，其在此通過引用全文并入。
【技術(shù)領域】
[0003]本發(fā)明涉及幫助檢測和診斷腸和血腦屏障通透性的方法、試驗和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0004]與人體中的其他細胞器相比，腸上皮細胞被暴露于巨大數(shù)量的源于攝入食物、酵母、細菌和病毒的抗原。這些細菌抗原中的一些對粘膜免疫系統(tǒng)不產(chǎn)生威脅，而其他可對宿主有害。腸免疫系統(tǒng)通過允許少量分子滲透上皮——在那里，它們與粘膜和全身免疫系統(tǒng)相互作用，以便產(chǎn)生對這些抗原的調(diào)節(jié)的T-細胞功能或耐受一而監(jiān)測腸腔中的這些細菌抗原。然而，腸免疫系統(tǒng)對這些細菌抗原的不恰當或過度暴露可引起該調(diào)節(jié)機制損壞并導致胃腸疾病(I)。因此，抗原攝取的生理學的理解是了解包括炎性和自身免疫反應的疾病的發(fā)病機理的中心(2)。
[0005]本文討論的這些和所有其他外部材料在此通過引用全文并入。在并入的參考文獻中的術(shù)語的定義或使用與本文提供的該術(shù)語的定義不一致或相反的情況下，應用本文提供的該術(shù)語的定義，并不應用在參考文獻中的該術(shù)語的定義。
[0006]增加的腸通透性被認為是先于數(shù)種自身免疫性疾病開始前的早期階段(3-6)。因為該原因，最近已經(jīng)對腸屏障機能障礙在以GI道以及包括神經(jīng)系統(tǒng)的腸外器官為目標的很多病理學條件的發(fā)病機理中的作用興趣增加(7)。作為對炎癥、自身免疫和癌癥的生物學門口(biological doorway)的腸屏障功能的該失調(diào)在Fasano的評論文章(7)中進行討論。在該評論文章以及早期Fasano文章(4)中，F(xiàn)asano強調(diào)胃腸道的主要功能在傳統(tǒng)上已經(jīng)被理解為限于營養(yǎng)物的消化和吸收，以及限于電解質(zhì)類和水穩(wěn)態(tài)。然而，胃腸道的解剖和功能性布置的更吸引人的分析提示該器官的另一個極其重要的功能為它通過屏障機制調(diào)節(jié)環(huán)境和宿主之間大分子運輸?shù)哪芰?。腸上皮屏障和它的細胞間緊密連接，與腸相關(guān)淋巴組織和神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡一起，控制對非自身抗原的耐受和免疫之間的平衡。
[0007]連蛋白/閉合蛋白為細胞旁緊密連接(paracellular tight junction)的生理調(diào)節(jié)器，其涉及大分子運輸并因此涉及免疫應答和耐受之間的平衡(7)。當精確調(diào)整的腸屏障蛋白在那些在遺傳上對環(huán)境因素敏感的個體中失調(diào)時，出現(xiàn)腸疾病諸如腹部疾病、克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎，和腸外自身免疫性疾病諸如關(guān)節(jié)炎、狼瘡、甲狀腺炎、糖尿病和甚至多發(fā)性硬化癥(MS)、惡性腫瘤和重性抑郁癥(8-14)兩者的可能性?？捎兄谀c和腦屏障機能障礙的病理生理學并因此涉及腸和腸外自身免疫的主要的環(huán)境因素之一為細菌脂多糖(LPS)。由于腸小生物群生態(tài)失調(diào)和細菌異位，LPS明顯是造成上皮細胞上toll樣受體活化和首先導致腸屏障并隨后血腦屏障機能障礙的炎性級聯(lián)反應活化的原因(14)。LPS在誘導“腸滲漏(leaky gut)”和“腦滲漏(leaky brain) ”綜合征中的作用顯示在圖1中。[0008]圖1強調(diào)GI道異?？蓳p害腸屏障的完整性并增加未消化的抗原進入循環(huán)，因此攻擊免疫系統(tǒng)。對這些抗原的反應激活免疫和炎性級聯(lián)反應，導致產(chǎn)生促炎性細胞因子、抗體陣列和增加的腸屏障通透性(或“腸滲漏”綜合征)。如果腸屏障機能障礙保持未處理，則結(jié)果可為神經(jīng)性炎癥、神經(jīng)侵染(neuroinvasion)和神經(jīng)變性。
[0009]因此，需要對可攻擊免疫系統(tǒng)，誘導可首先導致打開血腦屏障，然后是之后的神經(jīng)性炎癥和神經(jīng)變性的炎癥(15-25)的大抗原分子的腸通透性進行測量的非侵入的方法、裝置和試驗。這些需要和其他需要由本發(fā)明滿足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的發(fā)明主題提供了裝置、系統(tǒng)、試驗和方法，其中可測試來自人類的樣品，以協(xié)助檢測和診斷腸和/或血腦屏障通透性。
[0011]在本發(fā)明的一些方面中，樣品的一個或多個部分針對以下進行測試:(1)結(jié)合至細菌毒素，和(2)結(jié)合至選自(a)腸相關(guān)抗原和(b)血腦屏障相關(guān)抗原中的至少一種的天然抗原。在一些方面中，細菌毒素可有利地包括脂多糖。
[0012]當測試腸通透性時，天然腸相關(guān)抗原優(yōu)選地選自:(1)腸結(jié)構(gòu)蛋白；(2)緊密連接蛋白；(3)對緊密連接蛋白的結(jié)合受體；和(4)細胞連接蛋白。在本發(fā)明的一些方面的實例中，對肌動蛋白/肌動球蛋白、閉合蛋白和/或連蛋白、腸ZOT受體和基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)中的一個或多個的抗體，進行測試。
[0013]當測試血腦屏障通透性時，血腦屏障相關(guān)抗原優(yōu)選地選自:(1)血腦屏障蛋白；
(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP) ；(3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，(4)腦ZOT結(jié)合蛋白；(5)腦ZOT受體；(6)鈣衛(wèi)蛋白；和(7)髓鞘堿性蛋白。在本發(fā)明的一些方面的實施例中，對
(I)血腦屏障蛋白；(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP);和(3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)中的一個或多個的抗體，進行測試。
[0014]根據(jù)診斷觀點，來自先前描述的方法中的一個或多個的測試結(jié)果的分析可用于協(xié)助與腸滲漏綜合征和/或過度血腦屏障通透性相關(guān)的疾病的檢測和/或診斷。
[0015]在本發(fā)明的一些方面中，可利用免疫測定，包括但不限于ELISA測定、RIA測定、乳膠凝集反應、珠測定、蛋白質(zhì)組測定和其他本領域技術(shù)人員已知的免疫測定實施結(jié)合至各自成分的樣品的檢測。
[0016]在本發(fā)明的一些方面中，也可提供用于進行免疫測定的測試平板和試劑盒，其包括例如改進的測試平板，其具有作為結(jié)合肽的下述:(I)細菌毒素；和(2)包括(a)腸相關(guān)抗原和(b)血液天然腦屏障相關(guān)抗原中的至少一種的天然抗原。
[0017]在用于協(xié)助檢測和診斷或以其他方式鑒定與腸滲漏綜合征有關(guān)的疾病的特別優(yōu)選的測試平板中，腸相關(guān)抗原可有利地選自:(1)腸結(jié)構(gòu)蛋白；(2)緊密連接蛋白；(3)對緊密連接蛋白的結(jié)合受體；和(4)細胞連接蛋白。
[0018]在用于診斷或以其他方式鑒定與過度血腦屏障通透性相關(guān)的疾病的特別優(yōu)選的測試平板中，血腦屏障相關(guān)抗原可有利地選自:(1)血腦屏障蛋白；(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP) ； (3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)；⑷腦ZOT結(jié)合蛋白；(5)腦ZOT受體；(6)鈣衛(wèi)蛋白；和(7)髓鞘堿性蛋白。
[0019]考慮到測試試劑盒可包括共同測試第一組與腸滲漏綜合征相關(guān)的抗原和第二組與過度血腦屏障通透性相關(guān)的抗原兩者的一個或多個平板。
[0020]根據(jù)更普遍的觀點，本文考慮的用于協(xié)助檢測和診斷與解剖學屏障的過度通透性相關(guān)的疾病的方法和裝置，包括:從抗體測試樣板獲得和分析測試結(jié)果，所述樣板從結(jié)合來自患者的樣品至細菌毒素和選自(a)腸相關(guān)抗原和(b)血液天然腦屏障相關(guān)抗原中的至少一種的天然抗原而產(chǎn)生信號。
[0021]在所有這些考慮的方法和裝置中，樣品可包括任何合適的身體樣品，包括例如全血樣品、血清/多血清樣品、唾液樣品或來自其他體液的樣品。
[0022]還要進一步考慮的是本文考慮的方法和裝置可用于協(xié)助鑒別診斷涉及(I)腸道菌群生態(tài)失調(diào)，和(2)腸屏障損壞的疾病。例如，如目前考慮的，當測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和全部IgA、IgM和IgG對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，和IgG對肌動球蛋白的陰性結(jié)果時，將趨向于指示涉及腸道菌群生態(tài)失調(diào)的診斷。
[0023]也考慮通過區(qū)分由于細胞旁途徑(paracellular pathway)和跨細胞途徑的腸屏障損壞而協(xié)助鑒別診斷。
[0024]關(guān)于通過細胞旁途徑的損壞，當測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白或連蛋白的陽性結(jié)果，和IgG對肌動球蛋白的陰性結(jié)果時，將趨向于指示涉及通過細菌抗原造成腸屏障損壞的診斷。相比之下，當測試結(jié)果包括全部IgA、IgM和IgG對脂多糖的細菌毒素的陰性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白或連蛋白的陽性結(jié)果，和IgG對肌動球蛋白的陰性結(jié)果時，將趨向于指示涉及非通過細菌抗原造成腸屏障損壞的診斷。
[0025]關(guān)于通過跨細胞途徑的損壞，當測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和全部IgA、IgM和IgG對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果,和IgG對肌動球蛋白的陽性結(jié)果時，將趨向于指示涉及通過細菌抗原造成腸屏障損壞的診斷。
[0026]也根據(jù)本文討論的發(fā)現(xiàn)，在測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白和連蛋白的陽性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果,和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，將趨向于指示涉及由細菌毒素誘導的腸和血腦屏障完整性兩者損壞的診斷。
[0027]相比之下，在測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的每一個對脂多糖的細菌毒素的陰性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白和連蛋白的陽性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和igA、1拂和igG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，涉及由非細菌毒素的因素誘導的腸和血腦屏障完整性兩者損壞的診斷是可能的。
[0028]還要進一步考慮的是可發(fā)生腸道菌群生態(tài)失調(diào)而不損壞腸屏障完整性，但損壞血腦屏障完整性。例如，在測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的每一個對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果,和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，可趨向于指示涉及在那種情況下腸道菌群生態(tài)失調(diào)的診斷。
[0029]類似地，在測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的每一個對脂多糖的細菌毒素的陰性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的每一個對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，涉及損壞血腦屏障完整性、神經(jīng)性炎癥和神經(jīng)性自身免疫，而不與腸屏障或腸道菌群生態(tài)失調(diào)相關(guān)的診斷是可能的。
[0030]關(guān)于具體的疾病，本文考慮的測試結(jié)果的分析可用于協(xié)助檢測和診斷肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默氏病、或周圍神經(jīng)病和重性抑郁癥。在測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，這樣的病癥被認為是可能的。
[0031]本發(fā)明的發(fā)明主題的多種對象、特征、方面和優(yōu)點將根據(jù)以下優(yōu)選實施方式的詳細描述，連同附圖和表變得更加顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為現(xiàn)有技術(shù)圖，其顯示了 LPS在腸滲漏和腦滲漏綜合征誘導中的目前理解的作用。
[0033]圖2為現(xiàn)有技術(shù)圖，其顯示了在炎性和神經(jīng)免疫性疾病的發(fā)病機理中LPS誘導炎癥和Thl7淋巴細胞活化的目前理解的作用=LPSi誘導炎性應答、產(chǎn)生細胞因子和增加循環(huán)中Thl7陽性細胞的數(shù)量。
[0034]圖3為現(xiàn)有技術(shù)圖，其顯示了腸對腦機能障礙的目前理解的病因?qū)W——如果未處理，粘膜耐受的損失可怎樣引發(fā)誘導腸屏障機能障礙、全身炎癥、神經(jīng)性炎癥、神經(jīng)侵染和神經(jīng)變性的級聯(lián)反應。
[0035]圖4為顯示本發(fā)明提出的方案的圖，其中涉及異常腸通透性和血腦通透性的引發(fā)物和機制可用于腸通透性鑒定(IPI)和/或血腦通透性鑒定(BBPI)的下一代測試。
[0036]圖5為顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的異常腸通透性在自身免疫性疾病的發(fā)病機理中提出的作用的圖。
[0037]圖6為顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的用于進行免疫測定的樣品微量滴定板布局的圖，該微量滴定板具有含12種不同抗原和肽的12個不同排。
[0038]圖7為顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的樣品微量滴定板布局的圖，其中針對來自腸和BBB蛋白以及相關(guān)組織抗原的12種不同的抗原或肽(結(jié)合的抗原和肽是透明的)測量IgG/IgM/IgA。
[0039]圖8為顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的樣品微量滴定板布局的圖，其中為了質(zhì)量控制目的，每周利用陰性和陽性對照測量IgG/IgM/IgA(結(jié)合的抗原和肽是透明的)。
[0040]圖9為顯示IgG、IgM和IgA抵抗健康捐獻者和具有胃部自身免疫的患者的細菌脂多糖和閉合蛋白/連蛋白的比較的圖。抵抗健康捐獻者的細菌脂多糖的IgG、IgM、IgA和IgG+IgM+IgG的升高百分比以左邊圖中的淺色條塊中顯示，和具有高于平均值兩個標準差的胃部自身免疫的患者以左邊圖中的深色條塊顯示。抵抗健康捐獻者中的閉合蛋白/連蛋白的IgG、IgM、IgA和IgG+IgM+IgG的升高百分比以右邊圖中的淺色條塊顯示，和具有高于平均值兩個標準差的胃部自身免疫的患者以右邊圖中的深色條塊顯示。
[0041]表I根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了針對代表第一組的三個健康對象(樣品1-3)的環(huán)境因素(LPS)、腸和BBB蛋白以及相關(guān)抗原的12種不同抗原而測試的IgG、IgM和IgA抗體水平。
[0042]表2根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了針對代表第二組的三個健康對象(樣品4-6)的環(huán)境因素(LPS)、腸和BBB蛋白以及相關(guān)抗原的12種不同抗原而測試的IgG、IgM和IgA抗體水平。
[0043]表3根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了針對代表第三組的三個健康對象(樣品7-9)的環(huán)境因素(LPS)、腸和BBB蛋白以及相關(guān)抗原的12種不同抗原而測試的IgG、IgM和IgA抗體水平。
[0044]表4根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了針對代表具有腹部疾病和腸通透性的三位患者(樣品10-12)的環(huán)境因素(LPS)、腸和BBB蛋白以及相關(guān)抗原的12種不同抗原而測試的IgG、IgM和IgA抗體水平。
[0045]表5根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了針對代表具有谷蛋白共濟失調(diào)(glutenataxia)的三位患者(樣品13-15)的環(huán)境因素(LPS)、腸和BBB蛋白以及相關(guān)抗原的12種不同抗原而測試的IgG、IgM和IgA抗體水平。
[0046]表6根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了針對代表具有多發(fā)性硬化癥(MS)的三位患者(樣品16-18)的環(huán)境因素(LPS)、腸和BBB蛋白以及相關(guān)抗原的12種不同抗原而測試的IgG、IgM和IgA抗體水平。
[0047]表7根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了抵抗血液中LPS、閉合蛋白/連蛋白和肌動球蛋白網(wǎng)絡的一些抗體的臨床說明。
[0048]表8根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了抵抗口液中LPS、閉合蛋白/連蛋白和肌動球蛋白的升高水平的一些抗體的臨床說明。
[0049]表9根據(jù)本發(fā)明的一些方面顯示了抵抗血液中LPS、閉合蛋白/連蛋白、血腦屏障蛋白和神經(jīng)元抗原的升高水平的一些抗體的臨床說明。
[0050]附圖詳述
[0051]抗原攝取增加是疾病發(fā)展的先決條件。已知很多病癥都增加腸的通透性并因此增加抗原攝取。有可能自腔攝取免疫原性分子或抗原可導致免疫介導的活性，在腸內(nèi)以IgA和IgM的形式，和在腸外產(chǎn)生抗原特異性的IgA、IgM、IgG和免疫復合體(26、27)。
[0052]1.細菌毒素和炎性細胞因子對血腦屏障破裂和神經(jīng)性炎癥的誘導的作用
[0053]血腦屏障(BBB)保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)部環(huán)境和穩(wěn)定性。對BBB的結(jié)構(gòu)和功能性的改變可導致自身免疫性疾病，特別是神經(jīng)自身免疫性疾病諸如多發(fā)性硬化癥(28)。
[0054]BBB分離血液白細胞，其正常地響應來自腦實質(zhì)的壞死性傷害，在腦實質(zhì)中，壞死性細胞死亡可響應環(huán)境因素諸如感染、毒素、興奮性中毒或創(chuàng)傷而發(fā)生(23)。BBB由兩層組成。第一層由微脈管內(nèi)皮細胞組成，其具有大量緊密連接，與腸上皮細胞的結(jié)構(gòu)類似(24、28)。第二層為膠質(zhì)界膜，其由膠質(zhì)足突形成(29)。內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞之間的血管周圍間隙由巨噬細胞填充(populate)，其表現(xiàn)得像未成熟的樹突細胞(29)。因此，能夠打開上皮TJ屏障的因素能夠破壞BBB和神經(jīng)元組織兩者(30-33)。這包括細菌內(nèi)毒素，促炎性細胞因子，酶和效應細胞Thl、Thl7，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥是必不可少的(29、34-35)。
[0055]確信由內(nèi)毒素、細胞因子、趨化因子、粘著分子和其他產(chǎn)生的BBB破裂，和自體反應性T-細胞從全身區(qū)室(compartment)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運輸,對MS損害的發(fā)展起到重要作用(36-38)。然而，當在人Thl對Thl7淋巴細胞之間進行比較時，與Thl淋巴細胞相t匕，人Thl7淋巴細胞更快地遷移穿過BBB。確實，大量表達IL-17-和IL-22的CD4+CD45R0+記憶淋巴細胞在它們遷移穿過BBB后，表達了 IL-17+和IL-22+標記，其證實了 Thl 7淋巴細胞在體外和體內(nèi)穿過BBB的能力(35)。BBB內(nèi)皮細胞表達IL-17R和IL-22R，其由Thl7淋巴細胞使用，以浸潤BBB內(nèi)皮細胞(ECS)。當IL-17和IL-22被添加至單層人BBB-ECS時，顯著增強了細胞或抗原諸如牛血清白蛋白(BSA)——一種大分子——穿過BBB的擴散。BBB-ECS的該增強的通透性與閉合蛋白和連蛋白——兩種重要的緊密連接蛋白——表達的降低有相關(guān)性(39)。
[0056]這些結(jié)果強烈提示由LPS和引起血腦屏障內(nèi)皮細胞上IL-17和IL-22受體的Thl7淋巴細胞表達的活化的其他細菌毒素誘導的炎癥導致Thl 7結(jié)合至BBB緊密連接。這破裂了緊密連接，導致Thl 7和自體反應性T細胞穿過BBB的變移，通過Thl 7的粒酶-B的釋放，和通過⑶4細胞的干擾素-Y的釋放，這產(chǎn)生神經(jīng)元細胞破壞，釋放神經(jīng)元細胞抗原和BBB蛋白進入循環(huán)(通過IL-17和IL-22的作用共表達IL_17、IL_22和粒酶B的細胞)在BBB的誘導和破壞以及BBB對循環(huán)的CD4+淋巴細胞和導致CNS炎癥的可溶分子的透化作用中起到重要作用(40-44)。Thl 7淋巴細胞在炎性和神經(jīng)免疫學疾病的發(fā)病機理中的作用顯示在圖2中。基于該作用機制，腸通透性的細菌毒素誘導和BBB蛋白結(jié)構(gòu)的破裂可導致不僅抵抗LPS而且抵抗緊密連接蛋白和BBB蛋白的抗體產(chǎn)生。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面的處理(tackle)神經(jīng)性炎癥的步驟開始于測試LPS、閉合蛋白、密蛋白、BBB蛋白、緊密連接蛋白、酶諸如基質(zhì)金屬蛋白酶和相關(guān)受體抗體，基于其，臨床醫(yī)生可計劃修復胃腸屏障機能障礙，隨后是抑制全身炎癥并以恢復血腦屏障結(jié)束。
[0057]血腦屏障內(nèi)皮細胞上IL-17和IL-22受體的表達導致Thl7細胞結(jié)合至BBB緊密連接。這破裂了緊密連接，導致自體反應性CD4細胞和神經(jīng)變性。Thl7細胞隨后變移通過BBB,使處于通過釋放粒酶B殺死神經(jīng)元的階段。該神經(jīng)細胞抗原的釋放導致神經(jīng)性自身免疫和神經(jīng)變性的惡性循環(huán)。
[0058]基于這里提出的信息，假定腸是很多神經(jīng)變性疾病的起點。它以釋放豐富量的脂多糖(LPS)的不均衡小生物群開始。大量LPS內(nèi)毒素誘導促炎性細胞因子TNF-α和IL-1 β的上調(diào)，導致TJ和它們的蛋白——包括閉合蛋白和連蛋白——的降解或分離。隨后是行進至BBB的血流中的炎癥。該炎癥打開ΒΒΒ，引起神經(jīng)-浸潤、神經(jīng)性炎癥、神經(jīng)性自身免疫和最終神經(jīng)變性。圖3代表了導致神經(jīng)變性的病理生理學；如果不解決人的腸屏障機能障礙，則人隨時間可患神經(jīng)性炎癥和可能的神經(jīng)變性。很多自身免疫性疾病具有多個引發(fā)物(trigger)、癥狀和系統(tǒng)機能障礙。在神經(jīng)性自身免疫的情況下，其中很多個體產(chǎn)生對LPS、TJ和對BBB蛋白的高水平的抗體，包括免疫和神經(jīng)系統(tǒng)。這兩個系統(tǒng)的共同點為GI道，已經(jīng)論述了其重要性(43)。
[0059]因此，在本發(fā)明的一些方面中，抵抗TJ蛋白諸如閉合蛋白、細菌內(nèi)毒素諸如LPS和BBB蛋白的抗體的檢測和測量是最好的方式，其不僅估計GI和腸屏障完整性，而且確定和/或診斷全身炎癥、神經(jīng)性炎癥、神經(jīng)侵染和神經(jīng)變性的根本原因。同時，必須迅速修復腸上皮的任何損害。否則，這將允許膳食蛋白、共生性和病原菌滲透入循環(huán)，驅(qū)動將導致復雜的自身免疫和神經(jīng)免疫性疾病的炎性級聯(lián)反應。
[0060]I1.小糖對大抗原分子的通透性的測暈
[0061 ]目前用于估計腸通透性的方法使用乳酮糖和甘露醇。在過去的40年中，它已經(jīng)成為有用的臨床工具。乳酮糖吸收提示腸屏障的撕裂，和因此提示腸通透性。與普遍的觀念相反，該小分子的吸收實際上指示微小滲漏而不是撕裂。乳酮糖具有相對低的分子大小，和該物質(zhì)通過腸膜的轉(zhuǎn)移不反映食物或其他蛋白的轉(zhuǎn)移，以及針對它們的免疫應答的情況。此夕卜，乳酮糖/甘露醇測試測量了僅小分子轉(zhuǎn)移通過細胞旁途徑而不通過跨細胞途徑。
[0062]因此，大分子腸通透性鑒定(LMIPI)應利用大分子諸如細菌內(nèi)毒素(與食物蛋白的大小相當)進行估計，所述大分子為抗原性的并攻擊免疫系統(tǒng)。此外，關(guān)于BBB通透性，盡管數(shù)個證據(jù)系已經(jīng)顯示BBB通透性的變化是MS和實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)的主要開始因素(45-50)，但目前沒有用于測量BBB通透性的公認的血液測試。然而，在動物模型中，已經(jīng)通過利用連蛋白/閉合蛋白測量屏障損害損傷，證明BBB中的形態(tài)學和功能性變化(7、11、28)。
[0063]如圖4所示，本發(fā)明的方法的重點是具有抗原性的大分子，并且在它們從屏障釋放后，其具有攻擊免疫系統(tǒng)的能力，導致產(chǎn)生抵抗它們的特異性的IgG、IgM和/或IgA抗體，所述抗體在血液、血清和/或唾液樣品中進行檢測。
[0064]對大抗原性分子諸如細菌內(nèi)毒素和膳食蛋白的腸屏障通透性的估計在理解胃腸和自身免疫性疾病的發(fā)病機理中變得重要?？茖W證據(jù)指示很多胃腸和自身免疫性疾病通過增加的來自需氧和厭氧細菌的內(nèi)毒素和其他細菌毒素通過腸壁的異位來完成(7，51-55)。該增加的異位和與它相關(guān)的炎癥可誘導緊密連接蛋白的降解和隨后針對緊密連接蛋白諸如閉合蛋白/連蛋白和細菌內(nèi)毒素諸如LPS的免疫應答。的確地，暴露于細菌毒素或麥醇溶蛋白的大鼠和人上皮細胞分泌顯著量的連蛋白。該連蛋白釋放之后是蛋白ZO-1與緊密連接復合體的脫離，這產(chǎn)生通過細胞旁途徑的腸通透性(7、51)。并且，很多慢性病癥通過抵抗LPS和病原菌的其他抗原的IgA和IgM的血清水平的增加來完成(24、25)。這些病癥引起腸炎癥和粘膜屏障通透性，由此在腸壁細胞之間擴大的間隙和緊密連接蛋白的解離可誘導肌動球蛋白網(wǎng)絡和保護性屏障的損失。該保護性屏障的損失可增加細菌異位并因此提高血清內(nèi)毒素、緊密連接蛋白和肌動球蛋白的濃度。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，抵抗LPS、緊密連接蛋白(閉合蛋白/連蛋白)和肌動球蛋白的增加的血清IgA和IgM指示存在腸屏障通透性和運輸大分子穿過屏障。細菌的內(nèi)毒素可通過用作對T淋巴細胞的超抗原的細菌毒素，或通過被稱為分子擬態(tài)的機制引起自身免疫。很多細菌具有非常類似于人組織抗原——包括神經(jīng)元組織——的抗原性位點。如果腸屏障通透性保持非檢查，則隨后是抗原的炎性級聯(lián)反應和抵抗它們而產(chǎn)生的抗體將進入變成多種組織，并首先引發(fā)炎癥和隨后引發(fā)自身免疫——包括神經(jīng)性自身免疫。因此，如果允許抗原性腸屏障通透性任其發(fā)展，則繼續(xù)變性可引發(fā)全身炎癥，隨后是誘導抗原性的和細胞的血腦屏障通透性，帶來導致神經(jīng)性炎癥、神經(jīng)侵染和神經(jīng)變性的伴隨的額外免疫反應。
[0066]因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，應通過測量抵抗細菌LPS、緊密連接蛋白和肌動球蛋白的IgA、IgG和/或IgM，針對對大抗原性分子的增加的腸通透性的存在，檢查具有慢性炎性和自身免疫性疾病的患者。最終，除了測量抵抗LPS和閉合蛋白/連蛋白的IgA、IgG和/或IgM抗體,這些抗體也應針對具有神經(jīng)免疫性疾病的患者的BBB蛋白、酶、相關(guān)受體和神經(jīng)元抗原進行測量。在圖5中說明了該通過細菌毒素TJ降解和產(chǎn)生抵抗釋放的TJ蛋白、LPS和其他細菌抗原的抗體的多步驟方法，其產(chǎn)生導致組織損害和自身免疫。[0067]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，抵抗TJ蛋白和LPS的口液中的IgA和IgM和血液中IgG、IgM和IgA的檢測和測量將為用于估計腸屏障功能的最好試驗，同時LPS、閉合蛋白/連蛋白和其他緊密連接蛋白，加上血液中的BBB蛋白和神經(jīng)細胞抗體(IgG、IgM和IgA)的檢測和測量將為用于估計腸/BBB通透性和神經(jīng)性自身免疫的最好方法。
[0068]細菌抗原(LPS)誘導緊密連接降解和連蛋白釋放，引起打開緊密連接和閉合蛋白和LPS通過緊密連和隨后遷移入粘膜下層，在那里閉合蛋白和LPS呈遞至巨噬細胞和樹突細胞。巨噬細胞將這些抗原呈遞至T和B細胞；這之后為異常免疫應答,兩者為體液的(抵抗閉合蛋白和LPS的IgA、IgM和IgG抗體)和細胞-介導的。體液的免疫和細胞-介導的免疫之間的該相互作用是最終造成以腸上皮和其他組織抗原為目標的自身免疫過程的原因，導致以自身免疫性疾病為代表的組織損害。
[0069]以下是對于一些測試患者的試驗和它們的使用和分析的示例性描述。盡管類似于或等同于本文描述的這些的其他材料和方法可用于本發(fā)明的實踐或測試，但現(xiàn)在，在試驗的示例性描述中描述優(yōu)選的方法和材料，以進一步根據(jù)一些方面說明本發(fā)明。
[0070]ELISA 測丨定
[0071]A.材料和方法——平板和樣品制備:
[0072]從Sigma-Aldrich, ST.Louis, MO 購買來自大腸桿菌(E.coli) 055:85、大腸桿菌K-235、綠胺假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) >腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium) >肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumonia)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、克氏朽1檬酸桿菌(Citrobacter koseri)的脂多糖,肌動蛋白，肌動球蛋白，髓鞘堿性蛋白和ct-B晶體蛋白。膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)從BoehringerMannheim, Indianapolis, IN購買。同時使用的是連蛋白肽1、2、3、腸ZOT受體、髓鞘堿性蛋白肽87-106、細胞連接蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、在該研究中被命名的SlOO-B的鈣結(jié)合區(qū)、BBB-1 MSELEKAMVA LIDVFHQYSG REGDKHKLKK、BBB_2 SELKELINNE LSHFLEEIKE QEVVDKVMET、BBB-3 LDND⑶GECD FQEFMAFVAM VTTACHEFFE HE、腦 ZOT 結(jié)合蛋白-1、_2、鈣衛(wèi)蛋白(MRP-8)和腦ZOT受體。
[0073]具有大于90%純度的所有HPLC級肽由EZ Biolab of Carmel，IN合成。在該申請中，除非上下文指定相反，則本文說明的所有范圍應被解釋為包括它們的端點，和開放端范圍應被解釋為包括商業(yè)上的實踐值。類似地，所有的數(shù)值列表都應被考慮為包括中間值，除非上下文指示相反。
[0074]將抗原和肽以濃度1.0mg/mL溶解在甲醇中，隨后以1:100在0.1M碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液中稀釋，PH9.5，并且將50 μ I添加至聚苯乙烯平底ELISA平板的每個孔，如圖6所示。
[0075]平板在4°C下溫育過夜，并隨后用含0.05%吐溫20的200 μ I Tris-緩沖鹽水(TBS) (ρΗ7.4)清洗三次。通過在TBS中添加200mL的2%牛血清白蛋白(BSA)防止免疫球蛋白的非特異性結(jié)合，并將其在4°C下溫育過夜。清洗平板并在質(zhì)量中心(QC)后保持在4°C直到使用。
[0076]酶交聯(lián)物包括:親和純化抗體磷酸酶標記的山羊抗-人IgG (JacksonImmunoResearch, Cat# 109-055-008);親和純化抗體憐酸酶標記的山羊抗-人IgA (JacksonImmunoResearch, Cat#109_055_011);和親和純化抗體磷酸酶標記的山羊抗-人IgM(Jackson ImmunoResearch, Cat.#109-055-043)。
[0077]如本文進一步描述的，包括在方法中的其他額外的試劑和材料包括:磷酸鹽-緩沖鹽水粉末(Sigma, Cat#P3813-10PAK)、牛血清白蛋白(Biocell, Cat#3203_00)、疊氮化鈉(Sigma, Cat#S-2002)、吐溫 20 (Sigma, Cat#P1379_1000ML)、甘油(Sigma,Cat#G5516-500ML)、氫氧化鈉(Sigma，Cat#S_5881)、氯化鎂(Sigma，Cat#8266)、二乙醇胺(Sigma, Cat#D-8885)、1.0N 鹽酸溶液(Sigma，Cat#H3162_lGA)、5mg 底物片劑:p_NPP (磷酸對硝基苯酯)(Sigma，Cat#S-0942)和蒸餾水(D.H2O)。
[0078]微孔平板被制備并包被有12種不同的腸-腦-相關(guān)抗原或肽，如圖6所示。校準物(calibrator)和陽性對照以及稀釋的患者樣品被添加至孔，并且識別不同抗原的自身抗體在第一溫育期間結(jié)合。在清洗孔以去除所有的未結(jié)合蛋白后，純化的堿性磷酸酶標記的兔抗-人IgG/IgM/IgA的未結(jié)合交聯(lián)物通過進一步的清洗步驟去除。
[0079]結(jié)合的交聯(lián)物利用磷酸對硝基苯酯(PNPP)底物可視化，其給出了黃色反應產(chǎn)物，其強度與樣品中的自身抗體濃度成比例。氫氧化鈉被添加至每個孔，以停止反應。在405nm下讀出顏色強度。
[0080]川紅(plain red)頂或虎皮紅(red tiger)頂(SST管)用于樣本收集,盡管在一些方面中，對于該試驗考慮其他樣本收集裝置。
[0081]血液樣品利用無菌靜脈穿刺技術(shù)收集，并且血清利用標準程序獲得。在一些方面中，優(yōu)選最少100微升的血清用于試驗，其因此對應于大約Iml或更多的血液。
[0082]B.測試試駘稈序
[0083]現(xiàn)在討論用于抵抗LPS、腸和/或BBB蛋白的IgG、IgM和/或IgA抗體的分析程序。在一些方面中，允許所有試劑在測試試驗開始前達到室溫。測試試驗程序包括制備具有期望數(shù)量和類型的抗原和/或肽的期望數(shù)量的包被孔或平板。一旦制備微量滴定孔，則大約100 μ I的1:100稀釋的對照校準物被添加至微量滴定板的A和B排，如圖7所示，其可利用多通道移液管進行。大約100 μ I的1:100稀釋的患者的測試樣品——這里是血清，被添加至第一臨床樣本C和D排的雙孔，第二臨床樣本E和F排的雙孔和第三臨床樣本G和H排的雙孔，如圖7所示。
[0084]在單獨的平板上，進行類似于一式兩份臨床樣本的周期的(B卩，每周)陰性和陽性對照，如圖8所示。
[0085]平板隨后在室溫下溫育大約60分鐘。在溫育后，孔隨后被倒空，并利用ELISA洗滌器，用PBS清洗4次。大約100 μ I最佳稀釋的堿性磷酸酶標記的山羊抗-人IgA被添加至IgA平板，或大約100 μ I的酶標記的IgG被添加至IgG平板，和抗-1gM以最佳的稀釋被添加至IgM平板。
[0086]各個平板隨后在室溫下溫育大約30至大約60分鐘。在交聯(lián)物-溫育結(jié)束前大約10分鐘，底物溶液通過將大約5mg的磷酸對硝基苯酯片劑與大約5ml的底物緩沖液混合制備，其充分混合，直到片劑完全溶解。重復利用ELISA洗滌器，用PBS清洗4次。隨后，大約100 μ I的底物溶液被添加至每個孔。該平板隨后在室溫下溫育大約30分鐘，避免對直射陽光的任何暴露。通過添加大約50μ I的3Ν NaOH停止反應?？最伾珡姸壤梦⒘康味ò遄x出器在405nm下針對空白孔讀出，記錄校準物、對照和未知樣品的吸光率值。[0087]C.結(jié)果計算
[0088]在平板在405nm下讀出以獲得光密度值(OD4J后，陰性對照的平均0D、陽性對照的平均OD和每個臨床樣本的平均OD除以A和B排上的校準物的平均0D，以獲得每個指數(shù)值(IV)。
[0089]針對12種不同的抗原，通過將每個復制樣品的平均OD除以校準物對照值的平均OD (例如，將孔Cl和Dl的平均OD除以孔Al和BI的平均0D，將孔C2和D2的平均OD除以孔A2和B2的平均OD，將孔C3和D3的平均OD除以孔A3和B3的平均OD等)，計算每個抗體的指數(shù)值(IV)。
[0090]結(jié)果隨后與確立的參考范圍相比較。
[0091]
【權(quán)利要求】
1.測試來自人的樣品的方法，其包括: 測量源于結(jié)合所述樣品的第一部分至細菌毒素的第一信號；和 測量源于結(jié)合所述樣品的第二部分至天然抗原的第二信號，所述天然抗原選自(a)腸相關(guān)抗原和(b)血腦屏障相關(guān)抗原中的至少一種。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細菌毒素包括脂多糖。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述天然腸相關(guān)抗原選自:(1)腸結(jié)構(gòu)蛋白；(2)緊密連接蛋白；(3)對所述緊密連接蛋白的結(jié)合受體；和(4)細胞連接蛋白。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述血腦屏障相關(guān)抗原選自:(1)血腦屏障蛋白；(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP) ；(3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) ； (4)腦ZOT結(jié)合蛋白；(5)腦ZOT受體；(6)鈣衛(wèi)蛋白；和(7)髓鞘堿性蛋白。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述腸結(jié)構(gòu)抗原包括肌動蛋白/肌動球蛋白。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述緊密連接抗原選自閉合蛋白和連蛋白。
7.權(quán)利要求2所述的方法， 其中所述結(jié)合受體包括腸ZOT受體。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白包括基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血腦屏障相關(guān)抗原選自:(1)血腦屏障蛋白；(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP);和(3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。
10.診斷與腸滲漏綜合征相關(guān)的疾病的方法，其包括: 從實驗室定制利用權(quán)利要求1所述方法的測試；和 分析所述測試結(jié)果。
11.診斷與血腦屏障通透性相關(guān)的疾病的方法，其包括: 從實驗室定制利用權(quán)利要求1所述方法的測試；和 分析所述測試結(jié)果。
12.測試平板，其具有作為結(jié)合肽的下述:(I)細菌毒素；和(2)包括(a)腸相關(guān)抗原和(b)血腦屏障相關(guān)抗原中的至少一種的天然抗原。
13.權(quán)利要求12所述的測試平板，其中所述腸相關(guān)抗原選自:(1)腸結(jié)構(gòu)蛋白；(2)緊密連接蛋白；和(3)對所述緊密連接蛋白的結(jié)合受體；和(4)細胞連接蛋白；
14.權(quán)利要求13所述的測試平板，其中所述血腦屏障相關(guān)抗原選自:(1)血腦屏障蛋白；(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP) ；(3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) ； (4)腦ZOT結(jié)合蛋白;(5)腦ZOT受體；(6)鈣衛(wèi)蛋白；和(7)髓鞘堿性蛋白。
15.權(quán)利要求12所述的測試平板，其中所述血腦屏障相關(guān)抗原選自:(1)血腦屏障蛋白；(2)膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP) ；(3)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) ； (4)腦ZOT結(jié)合蛋白;(5)腦ZOT受體；(6)鈣衛(wèi)蛋白；和(7)髓鞘堿性蛋白。
16.協(xié)助診斷與解剖學屏障的過度通透性相關(guān)的疾病的方法，其包括: 從抗體測試樣板獲得測試結(jié)果，所述抗體測試樣板從結(jié)合來自所述患者的樣品至細菌毒素和選自(a)腸相關(guān)抗原和(b)血腦屏障相關(guān)抗原中的至少一個的天然抗原而產(chǎn)生信號；和 分析所述測試結(jié)果。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述樣品為血液樣品。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述樣品為唾液樣品。
19.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和全部IgA、IgM和IgG對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，和IgG對肌動球蛋白的陰性結(jié)果的情況下，認為涉及腸道菌群生態(tài)失調(diào)的診斷是可能的。
20.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白或連蛋白的陽性結(jié)果，和IgG對肌動球蛋白的陰性結(jié)果的情況下，認為涉及由細菌抗原通過細胞旁途徑造成的腸屏障損壞的診斷是可能的。
21.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括全部IgA、IgM和IgG對脂多糖的細菌毒素的陰性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白或連蛋白的陽性結(jié)果，和IgA對肌動球蛋白的陰性結(jié)果的情況下，認為涉及由非細菌抗原通過細胞旁途徑造成的腸屏障損壞的診斷是可能的。
22.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和全部IgA、IgM和IgG對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，和IgA對肌動球蛋白的陽性結(jié)果的情況下，認為涉及由細菌抗原通過跨細胞途徑造成的腸屏障損壞的診斷是可能的。
23.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白和連蛋白的陽性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，認為涉及由所述細菌毒素誘導的腸和血腦屏障完整性損壞的診斷是可能的。
24.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的每一個對脂多糖的細菌毒素的陰性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對閉合蛋白和連蛋白的陽性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和Ig G中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，認為涉及由非所述細菌毒素的因素造成的腸和血腦屏障完整性損壞的診斷是可能的。
25.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對脂多糖的細菌毒素的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的每一個對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，認為涉及腸道菌群生態(tài)失調(diào)而不損壞腸屏障完整性且損壞血腦屏障完整性的診斷是可能的。
26.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的每一個對脂多糖的細菌毒素的陰性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的每一個對閉合蛋白和連蛋白的陰性結(jié)果，IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，認為涉及損壞血腦屏障完整性、神經(jīng)性炎癥和神經(jīng)性自身免疫而不與腸屏障或腸道菌群生態(tài)失調(diào)相關(guān)的診斷是可能的。
27.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析所述測試結(jié)果的步驟包括在所述測試結(jié)果包括IgA、IgM和IgG中的任一個對血腦屏障蛋白的陽性結(jié)果，和IgA、IgM和IgG中的任一個對神經(jīng)元抗原的陽性結(jié)果的情況下，認為肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默氏病 或周圍神經(jīng)病和重性抑郁癥之一的診斷是可能的。
【文檔編號】C07K16/12GK103460044SQ201280015809
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月28日
【發(fā)明者】A·沃佳達尼 申請人:免疫科學實驗室公司