調(diào)節(jié)Swiprosin-1表達(dá)改善血腦屏障通透性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及調(diào)節(jié)Swiprosin-I表達(dá)改善血 腦屏障通透性。
【背景技術(shù)】
[0002] 血腦屏障（blood brain barrier)是指腦毛細(xì)血管阻止某些物質(zhì)（多半是有害 的）由血液進(jìn)入腦組織的結(jié)構(gòu)。血液中多種溶質(zhì)從腦毛細(xì)血管進(jìn)入腦組織，有難有易，有些 很快通過，有些較慢，有些則完全不能通過，這種有選擇性的通透現(xiàn)象使人們設(shè)想可能有限 制溶質(zhì)透過的某種結(jié)構(gòu)存在，這種結(jié)構(gòu)可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損 害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生 物學(xué)意義。
[0003] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病常引起血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的劇烈變化。如新生兒核黃疸和血 管性腦水腫，使腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接開放，屏障的通透性顯著提高以致血漿白 蛋白（分子量為69000)這樣的大分子物質(zhì)都可通過屏障。嚴(yán)重腦損傷導(dǎo)致血腦屏障的嚴(yán) 重破壞，使血清蛋白也可通過屏障進(jìn)入腦組織。隨著腦損傷的修復(fù)，大分子物入腦首先停 止，完全恢復(fù)后小分子物交換加快現(xiàn)象也會(huì)消失，此時(shí)血腦屏障功能已經(jīng)正常。其他中樞神 經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默癥、腦卒中、腦腫瘤、神經(jīng)退行性疾病都可使血腦屏障的通透性增 加。此外，電離輻射、激光和超聲波也會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的通透性增加。
[0004] Swiprosin-I 又稱為EF-hand domain-containing protein D2 (EFHD2)，從秀剛隱 桿線蟲（C. elegans)至人類（H. sapiens)中均保守表達(dá)。Swiprosin-I于2004年首次報(bào)道 發(fā)現(xiàn)，由于蛋白結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)可以與Ca2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（EF-domain)，其功能推測與調(diào)節(jié) 鈣離子相關(guān)，在果蠅中，Swiprosin-I可參與成肌細(xì)胞融合；此后10年內(nèi)，陸續(xù)有報(bào)道指出 Swiprosin-I參與B細(xì)胞受體調(diào)節(jié)、增強(qiáng)BCR引發(fā)的凋亡，在肥大細(xì)胞中參與細(xì)胞因子的調(diào) 節(jié)等，在免疫調(diào)節(jié)方面起作用。同時(shí)，Swiprosin-I在其他方面的作用尚不明確。
[0005] 目前關(guān)于Swiprosin-I與血腦屏障通透性之間的關(guān)系還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供Swiprosin-I及其調(diào)節(jié)劑的新用 途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供了Swiprosin-I及其調(diào)節(jié)劑在制備藥物中的用途，所 述的藥物用于：
[0008] a)調(diào)節(jié)血腦屏障通透性；或
[0009] b)制備血腦屏障通透性增加或降低的動(dòng)物模型。
[0010] 所述的調(diào)節(jié)劑選自抑制劑或增效劑。
[0011] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的增效劑是Swiprosin-I過表達(dá)載體。
[0012] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的抑制劑選自以Swiprosin-I蛋白或其轉(zhuǎn) 錄本為革G序列、且能夠抑制Swiprosin-I蛋白表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的8丨1^^、8111^^、(181^^、微小RNA、長鏈非編碼RNA、反義核酸；或能表達(dá)或形成所述siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、長鏈 非編碼RNA、反義核酸的構(gòu)建物。
[0013] 優(yōu)選地，所述的抑制劑選自下列a)或b)
[0014] 3)811?嫩，所述的811?嫩包含以下序列：
[0028] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的構(gòu)建物為慢病毒載體。
[0029] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0030] 1、實(shí)驗(yàn)證實(shí)Swiprosin-I過表達(dá)小鼠血腦屏障通透性增加，Swiprosin-I基因敲 除小鼠MCAO術(shù)后血腦屏障通透性下降，提示可通過調(diào)節(jié)Swiprosin-I表達(dá)改變血腦屏障通 透性，Swiprosin-I及其調(diào)節(jié)劑可用于血腦屏障通透性相關(guān)疾病的治療，以及構(gòu)建血腦屏障 通透性增加或降低的動(dòng)物模型等。
[0031] 2、設(shè)計(jì)的過表達(dá)載體起到了顯著的提高表達(dá)作用，設(shè)計(jì)的siRNA、shRNA序列起到 了顯著的敲降作用，均顯著優(yōu)于一般的過表達(dá)載體、siRNA或shRNA序列。
【附圖說明】
[0032]圖 I.pcDNA-CAG-EFHD2 質(zhì)粒圖譜。
[0033] 圖2.XhoI，SalI酶切驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒及Sail酶切回收條帶。（M:lkbDNAMarker， FermentasSMl163)。
[0034] 圖3.左圖為Swiprosin-I過表達(dá)小鼠（Swp°E)基因組鑒定，右圖為Swiprosin-I 過表達(dá)小鼠大腦中蛋白水平鑒定。
[0035] 圖4. Swiprosin-I過表達(dá)鼠（Swp°E)與野生型鼠（Swpwt)相比伊文思藍(lán)滲出增加 (熒光圖片檢測）。
[0036] 圖5. Swiprosin-I過表達(dá)鼠與野生型鼠相比伊文思藍(lán)滲出增加（熒光圖片檢測）。 Swiprosin-I過表達(dá)小鼠（Swp° E)大腦皮質(zhì)有紅色點(diǎn)狀滲出，野生型小鼠（SwpWT)紅色點(diǎn)狀 集中于血管內(nèi)分布。
[0037] 圖6.Swiprosin-I過表達(dá)鼠與野生型鼠相比伊文思藍(lán)滲出增加（組織勻漿定量）。
[0038] 圖7.Swiprosin-I過表達(dá)小鼠大腦皮質(zhì)中occludin分布完整性破壞，表達(dá)減少。
[0039] 圖8. Swiprosin-I過表達(dá)小鼠大腦皮質(zhì)中ZO-I分布完整性破壞，表達(dá)減少。
[0040] 圖9. Swiprosin-I過表達(dá)小鼠大腦皮質(zhì)中claudin-5表達(dá)不變。
[0041] 圖10.質(zhì)粒pLVTHM載體圖譜。
[0042] 圖11. Swiprosin-I基因敲除小鼠（Swp z)蛋白水平驗(yàn)證。
[0043] 圖12. Swiprosin-I基因敲除小鼠MCAO術(shù)后伊文思藍(lán)滲出比較圖。上圖為光鏡下 定性比較圖，下圖為兩組小鼠手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)伊文思藍(lán)滲出定量比較。
[0044] 圖13. Swiprosin-I敲除小鼠與野生型小鼠MCAO術(shù)后腦組織切片伊文思藍(lán)熒光顯 色圖片（白色箭頭標(biāo)記處為滲出伊文思藍(lán)的區(qū)域）。
[0045] 圖14. Swiprosin-I敲除小鼠與野生型小鼠MCAO術(shù)后梗死側(cè)緊密連接蛋白 occludin分布變化情況及表達(dá)情況差異（三角形標(biāo)記為滲出的伊文思藍(lán)區(qū)域，星號(hào)標(biāo)記為 MCAO術(shù)后occludin破壞部位，箭頭所示區(qū)域?yàn)榇媪粼谘軆?nèi)的伊文思藍(lán)。）
[0046] 圖15. Swiprosin-I敲除小鼠與野生型小鼠MCAO術(shù)后梗死側(cè)緊密連接蛋白ZO-I 分布變化情況及表達(dá)情況差異。（三角形標(biāo)記為滲出的伊文思藍(lán)區(qū)域，星號(hào)標(biāo)記為MCAO術(shù) 后ZO-I破壞部位，箭頭所示區(qū)域?yàn)榇媪粼谘軆?nèi)的伊文思藍(lán)。）
[0047] 圖16.腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞干擾Swiprosin-I后給予缺糖缺氧（0⑶）刺激可減少緊 密連接蛋白ZO-I表達(dá)下調(diào)。其中，LV-GFP為對(duì)照空載慢病毒，LV-sh-Swp為Swiprosin-I 干擾慢病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0049] 如本文所用，所述的"Swiprosin-1增效劑"包括了激動(dòng)劑、上調(diào)劑、穩(wěn)定劑等，只要 它們能夠上調(diào)Swiprosin-I基因或蛋白的表達(dá)水平，或維持Swiprosin-I的穩(wěn)定性，或增加 Swiprosin-I的有效作用時(shí)間等。它們可以是化合物、化學(xué)小分子、生物分子。所述的生物 分子可以是核酸水平（包括DNA、RNA)的，也可以是上調(diào)Swiprosin-I表達(dá)的病毒產(chǎn)品。
[0050] 所述的Swiprosin-I增效劑是指任何可提高Swiprosin-I的活性、提高 Swiprosin-I的穩(wěn)定性、上調(diào)Swiprosin-I的表達(dá)、增加Swiprosin-I有效作用時(shí)間的物質(zhì)， 這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明。例如，所述的增效劑是：表達(dá)Swiprosin-I的質(zhì)粒/病毒、化學(xué) 合成的小分子化合物。
[0051] 如本文所用，所述的"Swiprosin-1抑制劑"包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑 等，只要它們能