一種可高效快速穿透血腦屏障的納米藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能穿透血腦屏障進而將裝載的藥物高效輸運至中樞神經(jīng)系統(tǒng)并隨后立即快速釋放的納米藥物。該納米藥物中樞靶向性好、載藥量高、釋藥快，可用于治療需緊急給藥的腦部急性疾病及腫瘤，尤其適用于神經(jīng)性毒劑中毒后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的救治。
【背景技術(shù)】
[0002]I血腦屏障的穿透
[0003]腦部為維持中樞的動態(tài)穩(wěn)定，除了一些氨基酸、己糖類、神經(jīng)肽類等通過特殊的載體轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障之外，超過98%的藥物分子不能穿過血腦屏障抵達中樞。
[0004]針對該難題，既往的研究多集中在新型藥物分子的設(shè)計和結(jié)構(gòu)改構(gòu)上面，例如增加分子的親脂性基團、減少分子的正電荷基團、減少分子量等，但由于藥物分子內(nèi)分子電荷、親疏水性、分子空間位阻等一系列固有因素的限制，以及分子結(jié)構(gòu)的細微改變將極大的影響藥物的理化性質(zhì)和藥效，通過分子自身改構(gòu)的研究方案仍不能有效的實現(xiàn)藥物中樞給藥，例如救治神經(jīng)性毒劑中毒的藥物重活化劑，雖然對分子結(jié)構(gòu)進行改造，設(shè)計合成了了大量的新型重活化劑，但依然未能實現(xiàn)對中樞中毒酶的有效重活化。
[0005]2藥物在中樞的釋放
[0006]現(xiàn)有的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為靶向目標的納米藥物中，多數(shù)以治療腦部腫瘤等為治療目標，緩釋型納米結(jié)構(gòu)即可滿足使用要求，即裝載藥物的內(nèi)核外包裹了一層高分子層等修飾層，內(nèi)核藥物需要伴隨著外層高分子層的舒展才能與外界環(huán)境接觸，從而開始緩慢釋放藥物。
[0007]但是以神經(jīng)性毒劑中毒的解毒為代表的腦部急性疾病的治療則與此不同，其需要迅速起效。因為神經(jīng)性毒劑中毒后，可迅速與血液及組織中的乙酰膽堿酯酶結(jié)合，進而導(dǎo)致乙酰膽堿酯酶喪失對乙酰膽堿的催化水解作用，引發(fā)體內(nèi)乙酰膽堿大量蓄積，由于乙酰膽堿是體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，最終會產(chǎn)生以膽堿能系統(tǒng)功能亢進為代表的中毒癥狀表現(xiàn)。中毒者命懸一線，藥物起效快能避免造成多重后遺癥。但是現(xiàn)有的報道中尚沒有提供能穿透血腦屏障后迅速釋藥的納米藥物。
[0008]3中樞中毒救治
[0009]對于神經(jīng)性毒劑中毒救治，最重要的措施之一是重活化，即采用藥物干預(yù)的方法，使與神經(jīng)性毒劑結(jié)合的乙酰膽堿酯酶重新恢復(fù)水解乙酰膽堿的功能。而能夠使中毒酶重新恢復(fù)水解乙酰膽堿酯酶的藥物，稱之為重活化劑。
[0010]以梭曼為例進行說明，梭曼(Soman，化學名:甲氟膦酸特己酯)是神經(jīng)性毒劑一種，也是最為難防難治的神經(jīng)性毒劑。目前臨床普遍應(yīng)用的酶重活化劑如氯解磷定、雙復(fù)磷等，對梭曼中毒酶無良好重活化作用；而以H1-6為代表的雙季胺單肟類重活化劑，盡管對梭曼外周中毒酶有良好重活化作用，但由于其本身分子結(jié)構(gòu)所具有的強親水性、分子帶正電荷等理化性質(zhì)顯著特點，使其難以穿透血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)而進入中樞，因而無法實現(xiàn)對梭曼中樞中毒酶的重活化作用。其結(jié)果導(dǎo)致梭曼中毒后，傷員很快出現(xiàn)驚厥、昏迷為代表的嚴重中樞中毒癥狀表現(xiàn)，進而出現(xiàn)難以抑制的遲發(fā)性腦損傷。
[0011]德國的Franz Worek研究組在該領(lǐng)域進行了相應(yīng)的研究工作,他們將人血清白蛋白制備成為納米顆粒后，利用靜電吸附作用在顆粒表面掛載H1-6藥物后，模擬體外血腦屏障模型，進行生物學藥效評價。從藥效評價上看，藥物穿透血腦屏障的能力有一定的提升，但是效率低、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，依然不能滿足神經(jīng)性毒劑(例如梭曼)中毒救治的需求(MiriamDadparvara, Franz Worek 等，HI_6human serum albumin nanoparticles-Developmentand transport over an in vitro blood - brain barrier model, ToxicologyLetters206 (2011) 60 - 66)。
[0012]綜上可知，目前基于分子改構(gòu)的方法和現(xiàn)有的納米藥物，均未能有效的實現(xiàn)中樞梭曼中毒酶的重活化，目前亟需開發(fā)出可以對梭曼中樞中毒酶有重活化作用的有效藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]為了解決這個問題，我們進行了大量的研究工作，最終開發(fā)出了本發(fā)明的包被有特定蛋白質(zhì)的載藥納米硅球，有效地實現(xiàn)了藥物的血腦屏障穿透和中樞迅速釋放，最終提供了新型的納米藥物用于中樞解毒。
[0014]首先，本發(fā)明在納米材料的選擇上發(fā)現(xiàn)無機納米藥物載體納米多孔硅球可以有效的滿足中樞靶向給藥的各項要求。首先納米多孔硅球載體其多孔結(jié)構(gòu)，在保證能大量吸附藥物分子的同時，也保持了與外界直接的藥物釋放通道，而不需要經(jīng)歷外層修飾層的舒展，就能快速地釋放所裝載的藥物分子。
[0015]另外由于硅材料生物安全性高，滿足使用要求，經(jīng)已有文獻證實，在小鼠模型上其耐受劑量高達2mg/只，且未引起小鼠炎癥、過敏、脫水、脫毛等癥狀，經(jīng)組織切片觀察，硅球進入體內(nèi)后未引起體內(nèi)器官炎癥等，并且多孔硅球在4天后94%將排出體外，進入腦部的硅球在96小時后排出體外。
[0016]為測試該納米藥物能否有效的將藥物輸運至中樞神經(jīng)系統(tǒng)并迅速釋放，本發(fā)明選用該納米藥物裝載重活化劑H1-6重活化梭曼中樞中毒酶的實驗來驗證該納米藥物的中樞靶向有效性。
[0017]本發(fā)明以多孔納米硅球為載體裝載重活化劑H1-6，利用該載體將原本不能進入中樞的H1-6快速輸運至腦部后迅速釋放，立即重活化梭曼中樞中毒酶，達到中樞解毒的救治目的。
[0018]為證明本發(fā)明的先進性，我們重復(fù)了德國的Franz Worek研究組的研究工作，按照該課題組發(fā)表的工作所提供的數(shù)據(jù)合成制備了裝載了 H1-6的人血清白蛋白納米顆粒(HSANP),該課題組報道中僅對該納米藥物進行了初步的體外藥效評價，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上進一步進行在體藥效學評價，與本發(fā)明所涉及藥物納米重活化劑進行對比，證明本發(fā)明藥物效率遠超已報道工作。
[0019]本發(fā)明的目的是提供一種新型中樞靶向能迅速釋藥的納米藥物的結(jié)構(gòu)和制備方法以及相應(yīng)的藥效評價。
[0020]本發(fā)明所提供的新型納米藥物如下:其以內(nèi)部多孔的納米多孔硅球作為載體，在載體孔內(nèi)吸附或者裝載有目標藥物，在載體的表面修飾有蛋白層。
[0021]其中，前述的新型納米藥物上的目標藥物可以是重活化劑，優(yōu)選為雙季胺單肟類重活化劑，進一步優(yōu)選酰胺磷定(H1-6 )、氯解磷定及雙復(fù)磷中的至少一種，更進一步優(yōu)選為H1-6。
[0022]其中，前述的新型納米藥物上修飾的蛋白層是通過化學反應(yīng)鍵合上的一層蛋白層，蛋白層采用的蛋白優(yōu)選對血腦屏障穿透效率高的內(nèi)源性蛋白，其可以輔助實現(xiàn)藥物高效進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。優(yōu)選白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，進一步優(yōu)選轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0023]本發(fā)明所提供的納米藥物的制備方法為:(I)利用stober法制備納米硅球；(2)酸性環(huán)境下回流得到多孔結(jié)構(gòu)的納米硅球；(3)在氮氣保護下，在硅球表面鍵合上硅烷偶聯(lián)劑；(4)在硅球表面鍵合上蛋白；(5)完成目標藥物載藥。
[0024]所述的硅烷偶聯(lián)劑包括并不限于化合物一端為正硅酸酯基團一端通過烷基鏈連接上能與氨基反應(yīng)的活性基團，如APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)，(3-三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐，(3-環(huán)氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷等，優(yōu)選(3-環(huán)氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷，其活性基團環(huán)氧乙基能在室溫環(huán)境及不加任何催化劑條件下與蛋白上氨基結(jié)合，不產(chǎn)生副反應(yīng)產(chǎn)物。
[0025]其中，步驟(I)中所述stober法具體操作是將氫氧化鈉(2mmol/L)和十二烷基溴化銨(CTAB)按照摩爾比(1:3.92 X 15)溶解于水(V水:V NaQH溶液=137:1)后，80°C加熱半小時，加入正硅酸乙酯(TE0S，V水:V teos=120:1)和乙酸乙酯(V水:V&配酷=120:1)，回流1min后，關(guān)閉加熱和攪拌，老化2h，乙醇離心3次，旋干除去溶劑收集產(chǎn)物；
[0026]其中，步驟(2)中所述酸性條件下回流具體操作是將步驟(I)所制樣品分散于甲醇(m桂球:m甲醇=1: 1000 )中，加入濃鹽酸(V濃鹽酸:V甲醇=1:2 )，回流24h后，乙醇離心樣品3次，旋干除去溶劑收集產(chǎn)物。
[0027]其中，在步驟(3)中，硅烷偶聯(lián)劑GMAS ((3_環(huán)氧乙基甲氧基丙基))三甲氧基硅烷通過硅烷的水解作用，在多孔硅納米顆粒外層生成一層超薄硅層，其所含活性基團環(huán)氧乙基與轉(zhuǎn)鐵蛋白中的氨基發(fā)生鍵合反應(yīng)，從而在多孔硅球外層修飾上了一層蛋白層。
[0028]其中，步驟(