專(zhuān)利名稱(chēng)：包含活性成分的明膠海綿、其制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有活性成分層的改進(jìn)的干而柔韌的交聯(lián)明膠海綿及其用途。
背景技術(shù)：
較大表面上的快速失血尤其難以控制，因?yàn)闊o(wú)法用縫線(xiàn)或其他結(jié)扎方法控制。人們已經(jīng)嘗試了開(kāi)發(fā)止血海綿，它提供促進(jìn)傷口或出血部位快速凝血及止血的快速而有效的 組合物。一種此類(lèi)止血海綿組合物為可吸收性明膠海綿。明膠海綿的海綿質(zhì)物理特性能加 速血塊形成，并對(duì)形成的血塊提供結(jié)構(gòu)支持。通過(guò)攪拌明膠溶液使其形成泡沫，并通常通過(guò)凍干法使泡沫干燥來(lái)制備明膠海 綿。與天然不溶于中性水溶液的膠原不同，明膠在30°C以上的溫度，尤其是在37°C的生理 溫度下是可溶的。該特性使得該海綿不適用于體內(nèi)應(yīng)用，因?yàn)楹＞d會(huì)快速溶解，并失去其結(jié) 構(gòu)完整性和多孔結(jié)構(gòu)。因此，為了防止明膠在血液中快速溶解，必須對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)方 法包括用化學(xué)交聯(lián)劑(如甲醛、戊二醛和碳二亞胺(如EDC))處理海綿，或通過(guò)干熱處理干 燥的海綿(100-160°C下若干小時(shí))。盡管還不完全了解其作用方式，但目前認(rèn)為其效用似乎與明膠海綿將多倍于其重 量的血液和其他體液吸收并保持在其空隙內(nèi)的能力有關(guān)。捕獲的血小板與海綿相互作用， 并被活化，從而形成血栓，并停止出血。該血栓與通常在受傷后于身體中形成的天然血栓相 似?；罨难“暹€可引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)的最后在凝血酶的作用下可溶性纖維蛋白 原被轉(zhuǎn)化成不溶性纖維蛋白網(wǎng)。在Ca2+的存在下被凝血酶活化的因子X(jué)III發(fā)生交聯(lián)并使 血塊的纖維蛋白單體穩(wěn)定。GELF0AM 和SURGIF0AM 為止血裝置的例子，它可通過(guò)干燥的或者用無(wú)菌生理
鹽水或凝血酶潤(rùn)濕的形式直接應(yīng)用到受傷部位上，以控制出血。為了提高明膠的天然止血 性能，已開(kāi)發(fā)和制造了結(jié)合明膠海綿、凝血酶和Ca2+的止血特征的產(chǎn)品或套件。例如，通常 在外科手術(shù)中，將明膠海綿從其包裝中取出，浸入經(jīng)稀釋的凝血酶溶液中，用力捏揉，直到 擠出所有空氣。然后第二次浸入凝血酶溶液中，在輕微的壓力下將濕海綿敷到出血器官上。 然而，浸泡海綿耗時(shí)而又繁瑣，包括解凍和預(yù)稀釋濃縮的凝血酶溶液。每個(gè)制備步驟都會(huì)引 入潛在的失誤，這可能對(duì)無(wú)菌制劑產(chǎn)生不利影響并改變海綿的功效。此外，復(fù)雜的步驟還需 要由訓(xùn)練有素的急救人員來(lái)施用海綿。該技術(shù)的另一個(gè)主要缺點(diǎn)是要用大量的液體來(lái)填充 海綿空隙，因此會(huì)導(dǎo)致在海綿與受傷部位之間的界面處凝血酶和Ca2+濃度較低。這樣一來(lái)， 海綿在提供和維持止血方面將是無(wú)效的。為了克服這一問(wèn)題，外科醫(yī)生通常借助于高濃度 的凝血酶，而這會(huì)導(dǎo)致局部血栓形成。以下專(zhuān)利公開(kāi)公開(kāi)了用活性成分的溶液涂覆交聯(lián)的明膠海綿，并干燥該海綿。美國(guó)專(zhuān)利5，643，596和W09512371公開(kāi)了一種止血貼片，它具有基質(zhì)(如可吸收 性明膠海綿)以及僅位于基質(zhì)一面上的有效量的氨基己酸(EACA)。根據(jù)說(shuō)明，可在添 加EACA之前和之后用凝血酶溶液涂覆基質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)噴涂粉末、通過(guò)在基質(zhì)上涂覆溶液、 或通過(guò)完全或部分浸漬施加EACA。優(yōu)選地通過(guò)凍干法干燥潤(rùn)濕的海綿。該專(zhuān)利申請(qǐng)強(qiáng)調(diào)了EACA在貼片中的重要性，但未描述無(wú)EACA的可生物降解的基質(zhì)。W09013320涉及一種止血海綿，它具有生物可吸收性多孔結(jié)構(gòu)、固體材料(如變性的明膠海綿)、凝血酶和一種或多種凝血酶穩(wěn)定劑。這種止血海綿通過(guò)在多個(gè)部位處將凝 血酶水溶液注射到海綿中而制備。在不讓注射的液體滲到海綿材料表面上的情況下進(jìn)行注 射。然后將海綿在30-100°C下風(fēng)干足以使水含量降至50%以下的一段時(shí)間。根據(jù)說(shuō)明，注 射凝血酶溶液可導(dǎo)致海綿結(jié)構(gòu)變形。US 2，558，395公開(kāi)了包含凝血酶的即用型明膠海綿。根據(jù)該專(zhuān)利，將凝血酶加入 明膠水溶液中，轉(zhuǎn)變成泡沫，并在真空和低溫下進(jìn)行干燥。該專(zhuān)利中的明膠在制備過(guò)程中的 任何階段都不進(jìn)行交聯(lián)。因此，與血液接觸后，明膠組分溶解，凝血酶立即釋放，導(dǎo)致纖維蛋 白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，并在傷口上形成纖維蛋白膜。美國(guó)專(zhuān)利4，292，972涉及具有水性膠體組合物的凍干泡沫海綿產(chǎn)品。根據(jù)說(shuō)明， 通過(guò)在凍干工序之前或之后進(jìn)行交聯(lián)可降低凍干泡沫產(chǎn)品的溶解度和吸收性。凍干泡沫產(chǎn) 品由明膠、果膠和羧甲基纖維素鈉的混合物形成。美國(guó)專(zhuān)利4，265，233公開(kāi)了一種傷口愈合材料，其中通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵吸附或 包埋將含或不含凝血酶的因子X(jué)III固定在其上。根據(jù)說(shuō)明，該傷口愈合材料可以為合成 的或天然的聚合物。該專(zhuān)利公開(kāi)了若干種天然蛋白，包括纖維素、粘膠法人造絲、銅銨法人 造絲、乙酸纖維素、羧甲基纖維素、甲基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、支鏈淀粉、果膠、藻酸、甲殼 質(zhì)、多糖(如粘多糖)以及蛋白質(zhì)，如羊毛、絲、膠原、明膠和酪蛋白。實(shí)例公開(kāi)了將尺寸為 5X2.5X0. 5cm的明膠海綿浸入IOmL含或不含凝血酶的因子X(jué)III的水溶液中，然后冷凍干 燥20小時(shí)。EP0277096 公開(kāi)了止血材料，如GELFOAM 、SURGICEL 和AVICEL ，以及可有
效地與穩(wěn)定化凝血酶制劑聯(lián)合使用的膠原。根據(jù)該專(zhuān)利，制劑必須包含多羥基化合物和至 少一種緩沖劑，如醋酸鹽或磷酸鹽緩沖劑。根據(jù)說(shuō)明，優(yōu)選地讓穩(wěn)定化溶液吸收到止血?jiǎng)?上，并以無(wú)菌方式對(duì)該止血貼進(jìn)行冷凍干燥和包裝。W002072128公開(kāi)了具有摻入其中的潤(rùn)濕劑的交聯(lián)明膠組合物。根據(jù)說(shuō)明，可以將 潤(rùn)濕劑涂覆到明膠海綿的表面上。實(shí)例示出了通過(guò)將海綿放入裝有潤(rùn)濕劑與溶劑的溶液的 小瓶中，從而將潤(rùn)濕劑加到海綿的表面上。然后將小瓶倒轉(zhuǎn)，使溶液浸入海綿中。然后取出 涂覆的組合物，倒出多余的液體并風(fēng)干過(guò)夜。根據(jù)說(shuō)明，明膠組合物還可以包含藥物，如凝 血酶、纖維蛋白原、因子X(jué)III和其他凝血因子。EP0568334涉及含膠原的海綿，它具有可吸收性明膠海綿、膠原和活性成分?？梢?通過(guò)將預(yù)定量的膠原溶液轉(zhuǎn)移到明膠海綿的頂部使可吸收性明膠海綿與膠原及活性成分 結(jié)合。實(shí)例公開(kāi)了通過(guò)將0.24或0.4mL含血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)的膠原溶液移液到 Imm明膠片的頂部制備膠原海綿。浸泡之后，優(yōu)選地在室溫下將海綿干燥約1小時(shí)至約5 天。該專(zhuān)利指出，為了提高海綿的柔韌性，可以使用合適的增塑劑。W09306855涉及止血組合物，其包含止血有效量的因子VIIa以及生物相容的載 體，如可生物降解的海綿材料。載體不含凝血酶或任何其他凝血因子。說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了若干 種用于制備止血海綿的材料，如膠原、明膠(如變性的明膠)、甲殼質(zhì)、纖維素、聚乙醇酸和 聚乙酸。可以通過(guò)用FVIIa溶液浸透干燥的海綿，然后進(jìn)行冷凍干燥來(lái)制備海綿。實(shí)例公 開(kāi)了將5mm明膠海綿芯浸入2mL含因子VIIa的無(wú)菌水中。然后將未干燥的濕海綿敷到出血部位上。

發(fā)明內(nèi)容
在多種外科手術(shù)中可使用可吸收性明膠海綿來(lái)幫助止血。當(dāng)前認(rèn)為，海綿的止血 作用與海綿的孔隙度及其吸收血液的能力有關(guān)。此外，由于海綿的孔隙度，可以捕獲血小 板，并激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成止血的不溶性纖維蛋白網(wǎng)。因此，海 綿結(jié)構(gòu)被認(rèn)為對(duì)海綿的作用方式至關(guān)重要。使用時(shí)，可在應(yīng)用于受傷組織之前將明膠海綿 浸入凝血酶溶液中，以增強(qiáng)其止血性能。該步驟耗時(shí)、復(fù)雜，還會(huì)導(dǎo)致傷口接觸表面處的凝 血酶濃度較低。為了便于使用，可以提供干燥形式的含凝血酶的明膠海綿。然而，根據(jù)本發(fā)明，我 們發(fā)現(xiàn)將濕海綿干燥會(huì)導(dǎo)致海綿萎陷和/或海綿材料的原有形狀或結(jié)構(gòu)完整性發(fā)生改變。 此外，根據(jù)本發(fā)明，我們還發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)改變會(huì)降低海綿材料吸收血液的能力和/或海綿 易適形于身體表面形狀的能力。通過(guò)將少量的含活性成分的液體吸收到海綿中，使得只有一小部分海綿被潤(rùn)濕， 而大部分海綿保持干燥，本發(fā)明解決了這些問(wèn)題；因此，在干燥步驟之后，基本上保留了海 綿的原始結(jié)構(gòu)特性(如厚度、紋理和外觀)和柔韌性。此外，在完全浸泡的情況下，凝血酶 會(huì)分散到海綿的空隙中，從而在接觸傷口的海綿表面處形成低濃度的凝血酶。因此，海綿無(wú) 法有效地幫助止血。有利的是，本發(fā)明提供了在海綿的表面包含高濃度凝血酶薄層的海綿?，F(xiàn)已公開(kāi)的技術(shù)未涉及與潤(rùn)濕和干燥后海綿柔韌性或厚度降低有關(guān)的任何問(wèn)題; 也未建議或公開(kāi)施加活性成分過(guò)程中施用給海綿的最佳限度的液體量。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制造包含蛋白質(zhì)或肽活性成分的改進(jìn)的交聯(lián)明膠海綿 的方法，其包括以下步驟a)提供具有至少一個(gè)表面的交聯(lián)明膠海綿；b)將包含蛋白質(zhì)或肽活性成分的液體均勻地施加到所述海綿的所述至少一個(gè)表 面上，其中施加的液體體積等于或小于a)中海綿體積的5% ；以及c)干燥海綿，從而獲得在海綿的至少一個(gè)表面上具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或肽活性成分層的柔韌的 干燥交聯(lián)明膠海綿。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述液體施加步驟以單個(gè)步驟進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述液體不含ε氨基己酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，使用輥進(jìn)行所述液體施加步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述液體施加步驟包括以下步驟a)提供具有外表面的旋轉(zhuǎn)輥，其中所述外表面的至少一部分接觸包含所述液體的 貯存器；b)轉(zhuǎn)動(dòng)輥，用所述液體覆蓋所述外表面；c)使輥的所述外表面與所述海綿的所述至少一個(gè)表面接觸；以及d)相對(duì)于彼此移動(dòng)輥的所述外表面和所述海綿的所述至少一個(gè)表面；從而將所述液體沉積到所述海綿的所述至少一個(gè)表面上。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述外表面包括多個(gè)能夠容納所述液體的空腔。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使用液體分配器執(zhí)行所述液體施加步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)使用Pipejet 技術(shù)進(jìn)行所述液體施加步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，干燥海綿的厚度和柔韌性與原來(lái)的明膠海綿基本上 類(lèi)似。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，保留了原來(lái)的明膠海綿厚度的至少75%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在干燥步驟后，所述層的厚度等于或小于海綿總厚 度的24%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)選自以下的方法進(jìn)行所述干燥步驟真空烘箱、 冷凍干燥和風(fēng)干。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)真空烘箱進(jìn)行所述干燥步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述活性成分包含凝血酶。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例 中，所述液體中的凝血酶活性在約2至約15，000IU/ml的范圍內(nèi)，在約2至約4，000IU/mL 的范圍內(nèi)，或在約4，000至約10，000IU/mL的范圍內(nèi)。在另一方面，本發(fā)明涉及改進(jìn)的干燥交聯(lián)明膠海綿，在所述海綿的至少一個(gè)表面 上具有蛋白質(zhì)或肽活性成分層，所述層的平均厚度不超過(guò)海綿總厚度的約24%，其中該層 是穩(wěn)定的，并基本上均勻地分布在整個(gè)所述表面上；并且海綿的厚度和柔韌性基本上類(lèi)似 于原來(lái)的對(duì)應(yīng)未分層明膠海綿。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述層不含潤(rùn)濕劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，活性成分包含凝血酶。凝血酶活性可以在約1至約 300IU/cm2的范圍內(nèi)，在約10至約40IU/cm2的范圍內(nèi)，或在約20至約40IU/cm2的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的海綿可用于外科手術(shù)中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明 的海綿可用于促進(jìn)凝血。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含根據(jù)本發(fā)明的無(wú)菌交聯(lián)明膠海綿的包裝。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供促進(jìn)凝血的方法，所述方法包括按照或使用根據(jù)本發(fā) 明的包裝將交聯(lián)明膠海綿施用到傷口或出血部位上。根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)明膠海綿可用于促進(jìn)凝血。


參照以下具體實(shí)施方式
、實(shí)例、權(quán)利要求以及附圖，本發(fā)明的特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將
變得更易理解。圖1示出了在干燥工序后部分浸入500 μ 1鹽水的明膠海綿(Α，海綿編號(hào)1)與部 分浸入500 μ 1蒸餾水+0. 1% ΝΡ40的海綿(B，海綿編號(hào)2)相對(duì)比的頂視圖。海綿的側(cè)視 圖以C和D(海綿編號(hào)分別為1和2)示出。圖2分別示出了部分浸入600 μ L L9+鹽水+0. 5%亞甲藍(lán)(MB)和L9+鹽水+0. 01% NP40+0.5%MB中的編號(hào)為6(A)和7 (B)的明膠海綿的頂視圖。海綿的側(cè)視圖以C和D(海 綿編號(hào)分別為6和7)示出。圖3分別示出了部分浸入200或600 μ L L9+鹽水+0. 5% MB中的編號(hào)為3 (A)和 5(B)的明膠海綿的頂視圖。海綿3和5的側(cè)視圖分別示于圖3C和D中。圖 4 示出 了增加 L9(20mM 乙酸鈉、40mM CaCl2UlOmM NaCl、0. 5% w/w 的人蛋白、2% w/w的甘露糖醇；pH 6. 9-7. l)+0. IM NaCl的體積時(shí)，乙醇對(duì)GELITASP0N (商購(gòu)的明膠 海綿)液體吸收的影響。圖5示出了液體通過(guò)毛細(xì)管作用吸入SP0NG0STAN 或自制明膠海綿(在Omrix IL制造)的動(dòng)力學(xué)以及表面活性劑對(duì)海綿吸收液體的影響。圖6示出了根據(jù)干燥前海綿的液體攝入量繪制的真空干燥SP0NG0STAN 明膠海 綿的厚度。圖7示出了根據(jù)真空干燥海綿的厚度繪制的SP0NG0STAN 明膠海綿吸水倍數(shù)。圖8示出了干燥工序后SP0NG0STAN 海綿的厚度與干燥工序前海綿的凈液體攝 入量之間的反比關(guān)系。PV-部分浸泡的海綿，然后真空干燥；PL-部分浸泡的海綿，然后冷凍 干燥。圖9示出了在真空干燥的明膠海綿A，C和冷凍干燥的明膠海綿B，D內(nèi)施加的活性 成分層的厚度。圖10示出了自制海綿的凈液體攝入量與干燥后海綿厚度之間的關(guān)系。圖11示出了從完全浸泡然后進(jìn)行冷凍干燥的SP0NG0STAN 海綿以及部分浸泡 然后真空烘箱干燥的海綿中釋放活性成分的對(duì)比圖。圖12示出了這些實(shí)驗(yàn)中使用的組裝設(shè)備。1-下輥；2-上輥；3-聚丙烯網(wǎng)；4_基板； 5-載體(5a-支承下輥，5b-支承上輥)；6-彈簧；7-螺釘；8-調(diào)節(jié)螺釘；9-調(diào)節(jié)板；10-軸； 11-浴；12-海綿。圖13示出了以開(kāi)放側(cè)A或封閉側(cè)B送入設(shè)備時(shí)，多種操作速度(20-100RPM)下 SP0NG0STAN 海綿的液體攝入量。圖14示出了使用L9緩沖溶液或凝血酶溶液(4000IU/ml)時(shí)海綿的液體攝入量與 輥速度的關(guān)系圖。將海綿以封閉側(cè)向下穿過(guò)設(shè)備(第1次通過(guò))，進(jìn)行真空干燥，然后以開(kāi) 放側(cè)向下再次穿過(guò)(第2次通過(guò))。
具體實(shí)施例方式在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制造改進(jìn)的干燥即用型交聯(lián)明膠海綿的方法，所述海 綿在其表面上具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或肽活性成分層。根據(jù)本發(fā)明獲得的結(jié)果顯示了在海綿的至少一個(gè)表面上具有蛋白質(zhì)或肽活性成 分層的明膠海綿的優(yōu)點(diǎn)，其中所述海綿通過(guò)包括以下步驟的方法獲得a)提供交聯(lián)明膠海 綿；b)將包含蛋白質(zhì)或肽活性成分的液體均勻地施加到海綿的至少一個(gè)表面上，施加的液 體體積等于或小于海綿初始體積的5% ；以及c)干燥海綿。術(shù)語(yǔ)“包含蛋白質(zhì)或肽活性成分的改進(jìn)的明膠海綿”是指在至少一個(gè)表面上具有 穩(wěn)定的蛋白質(zhì)/肽活性成分層的明膠海綿，所述層均勻地分布在海綿的整個(gè)表面上，并且 海綿的厚度和柔韌性基本上類(lèi)似于原來(lái)的對(duì)應(yīng)明膠海綿。術(shù)語(yǔ)“包含凝血酶的改進(jìn)的明膠海綿”是指在至少一個(gè)表面上具有穩(wěn)定的凝血酶 層的明膠海綿，所述層均勻地分布在海綿的整個(gè)表面上，并且海綿的厚度和柔韌性基本上 類(lèi)似于原來(lái)的對(duì)應(yīng)明膠海綿。在整篇說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“厚度”與術(shù)語(yǔ)“高度”是可互換的。
施加到根據(jù)本發(fā)明的海綿上的可接受的液體量計(jì)算如下例如，當(dāng)使用尺寸為 2.5X2. 5X Icm(6. 25cm3)(相當(dāng)于6250 μ L的體積)的海綿時(shí)，吸入海綿的液體應(yīng)等于或小 于312μ 1。當(dāng)在海綿的不只一個(gè)表面上施加液體時(shí)，每個(gè)表面上的液體體積應(yīng)分別等于或 小于海綿體積的5%。術(shù)語(yǔ)“海綿的初始體積”是指液體施加步驟之前的海綿體積。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，干燥潤(rùn)濕的海綿會(huì)導(dǎo)致海綿萎陷，而且增大海綿的液體攝入量 會(huì)顯著影響凍干或真空干燥工序后海綿的總厚度。事實(shí)上，潤(rùn)濕步驟中的液體攝入量與干 燥工序后的海綿厚度成反比。例如，通過(guò)使用表面活性劑增加海綿的液體攝入量會(huì)使干燥 海綿的總厚度減小。術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指有利于潤(rùn)濕海綿或縮短海綿的水化時(shí)間的試劑。合適的 表面活性劑的例子包括但不限于0. 01和0. 的ΝΡ40、20%的乙醇和0. 02%的Tween 20。 術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”與術(shù)語(yǔ)“潤(rùn)濕劑”是可互換的。這種海綿厚度的減小會(huì)導(dǎo)致海綿結(jié)構(gòu)改變，如變形、海綿的完整性/孔隙度損壞， 和/或海綿的機(jī)械特性(如柔韌性)改變。我們還發(fā)現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)改變會(huì)影響海綿吸水的 能力，即，通過(guò)干燥在潤(rùn)濕步驟中吸收了大量液體的海綿而獲得的薄海綿比通過(guò)干燥在潤(rùn) 濕步驟中吸收了少量水的海綿而制備的厚海綿吸收的水要少。值得注意的是，將等于或小于海綿初始體積的5%的液體施加到海綿上使得液體 攝入/吸收量等于或小于海綿初始體積的5%。使用該方法可制備根據(jù)本發(fā)明的海綿，與原來(lái)的對(duì)應(yīng)非分層明膠海綿相比，所述 海綿具有基本上不變的吸收能力。值得注意的是，美國(guó)藥典指出，可吸收性明膠海綿應(yīng)吸收 不小于其重量35倍的水。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，為了符合藥典要求，初始厚度為IOmm的明膠海 綿(如SP0NG0STAN )在潤(rùn)濕和干燥后可保持等于或大于7. 44mm的厚度，以便吸收不小 于其重量35倍的水，即，明膠海綿潤(rùn)濕和干燥后的厚度損失應(yīng)不大于初始高度的26%。例如，當(dāng)明膠海綿的初始厚度為IOmm時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的干燥即用型海綿的總厚度 可以在約7至約9. 8mm的范圍內(nèi)，例如約7. 2,7. 3,7. 44,7. 5、8、8. 2,8. 5、9和9. 5mm,即海 綿在潤(rùn)濕和干燥步驟后可以保留原來(lái)明膠海綿初始厚度的約70至約98%，例如73、74、75、 80、82、85、90 和 95%。此外，根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，為了保留初始厚度的至少約74%，施加到SP0NG0STAN 海綿上的液體體積如上文所述應(yīng)等于或小于液體施加步驟之前海綿體積的5%，如4. 5、4、 3. 5、3、2. 5、2%。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)用2. 5X2. 5X Icm的海綿制備的預(yù)制干燥明膠在涂覆有活性 成分時(shí)吸收少量的液體(如最多約220uL)，即計(jì)算的液體攝入量小于海綿體積的3. 5%，與 原來(lái)的明膠海綿相比，其機(jī)械性能(如柔韌性)和結(jié)構(gòu)特性(如厚度)基本上不會(huì)改變。該 海綿在其面向傷口側(cè)上包含高度濃縮的、薄而干燥的活性成分層，可容易地將該側(cè)與海綿 的非生物側(cè)區(qū)分開(kāi)，因?yàn)榕c海綿的其他未處理表面相比，它在外觀上孔比較少。包含活性成 分的層在儲(chǔ)存時(shí)是穩(wěn)定的，并且在潤(rùn)濕時(shí)，活性成分會(huì)溶解和擴(kuò)散出來(lái)。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”是 指不會(huì)片狀剝落的層，例如，不會(huì)斷裂的層和/或不會(huì)碎成單個(gè)小片的層。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以如下評(píng)估層的穩(wěn)定性切割特定尺寸的干燥即用 型海綿，并測(cè)定其重量。然后將樣本放入硼硅酸鹽玻璃閃爍瓶中，使分層的表面向上，并將 瓶子蓋住。然后將能夠保持塑料管的具有萬(wàn)能夾的支承架放在硬質(zhì)水平表面上。將塑料管垂直插入夾具中，緊固夾具，并將固體硅樹(shù)脂塞子放入塑料管的底部。將塑料塊放在塞子的 下面，以防止塞子在測(cè)量過(guò)程中射出。然后，使裝有樣本的小瓶以頂蓋側(cè)向上從塑料管的頂 部落下，進(jìn)行4次，然后稱(chēng)取樣本的重量。為了排除變化性并確保標(biāo)準(zhǔn)化，所有測(cè)試中落點(diǎn) 都相同。通過(guò)從樣本的墜落前重量中減去樣本的墜落后重量計(jì)算粉末損失，通過(guò)用粉末損 失除以墜落前重量其結(jié)果乘以100計(jì)算樣品的重量減輕百分比。例如，當(dāng)樣本的尺寸為約 1. 7cm，并進(jìn)行上述穩(wěn)定性測(cè)試時(shí)，可取的樣本重量減輕百分比小于5%。根據(jù)本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥或真空干燥工序(兩者都是目前使用的方法并適用 于蛋白質(zhì)/肽成分)會(huì)影響海綿表面上的層的厚度。結(jié)果顯示，潤(rùn)濕步驟中5%的液體攝入 量會(huì)導(dǎo)致真空干燥和冷凍干燥海綿的干燥頂層(或涂覆的活性成分層)分別為海綿總厚度 的5. 8-8. 3%和12. 5-24%。獲得的結(jié)果表明，要獲得具有較薄活性成分層和/或具有緩慢 釋放活性物質(zhì)的能力的海綿，可以使用真空干燥工序。要獲得具有較厚活性成分層的海綿， 可以使用冷凍干燥法?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的不會(huì)使對(duì)熱工序敏感的活性成分降解或變性的任何工序 進(jìn)行干燥，包括但不限于真空干燥、冷凍干燥和風(fēng)干，如室溫干燥。通常，與風(fēng)干和冷凍干燥相比，真空干燥工序可具有若干優(yōu)勢(shì)。室溫干燥會(huì)使含水 量逐漸降低。冷凍干燥可以基本上保持海綿的原有結(jié)構(gòu)，但工藝復(fù)雜而又昂貴。真空干燥 是一種廉價(jià)而且快速的干燥工序，其可以基本上保持海綿的原有多孔結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還表明，當(dāng)將凝血酶用作活性成分時(shí)，與通過(guò)部分浸泡并在真 空烘箱中干燥而制備的海綿(凝血酶逐漸釋放)相比，在通過(guò)完全浸泡然后凍干制備的海 綿中凝血酶釋放得更快。在測(cè)試結(jié)束時(shí)，兩種海綿具有相似的恢復(fù)的活性，這表明在真空烘 箱中干燥的部分浸泡的海綿可以保持凝血酶活性。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是可 以基本上保持即用型海綿中活性成分的活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“部分浸泡，，是指將液體施加到海綿的至少一個(gè)表面上，其中施 加到海綿上的液體體積等于或小于海綿初始體積的5%。術(shù)語(yǔ)“完全浸泡”是指將液體施加 到海綿上，其中施加到海綿上的液體體積大于海綿初始體積的5%。根據(jù)本發(fā)明的海綿的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其柔韌性。柔韌性能夠使海綿易適形于要施加 的身體表面的形狀，相比之下，完全浸泡和干燥的海綿表現(xiàn)為干燥的餅干結(jié)構(gòu)，柔韌性要差 得多?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測(cè)量海綿的柔韌性。例如，通過(guò)使用彎 曲夾具(如GF-54 3點(diǎn)彎曲夾具(LLOYD instruments Ltd.))以及拉壓試驗(yàn)機(jī)(如LF plus 系列，LLOYD instruments Ltd, Hampshire, UK)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。該試驗(yàn)測(cè)量當(dāng)沿著一 條軸施加反向力時(shí)，物體沿著該軸變形的傾向。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)或肽活性成分”包括由氨基酸制備和通過(guò)肽鍵結(jié)合在一起的任何化 合物。該術(shù)語(yǔ)包括寡肽、蛋白片段、類(lèi)似物、融合蛋白等。氨基酸鏈可以包含其他部分，如脂 質(zhì)、低聚糖鏈?；钚猿煞挚梢允翘烊坏幕蚝铣傻摹５鞍踪|(zhì)或肽活性成分的例子包括但不限于 凝血因子，如凝血酶、可從蛇毒獲得的蛋白水解酶、纖維蛋白原、維生素K依賴(lài)性凝血因子、 因子X(jué)III、纖粘蛋白、von Willebrand ；R⑶肽；生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子、軟骨誘 導(dǎo)因子、類(lèi)骨誘導(dǎo)因子、骨骼生長(zhǎng)因子、膠原生長(zhǎng)因子；細(xì)胞因子；干擾素；激素；治療劑，如 抗微生物劑、抗炎劑；抗癌藥；化療劑；止痛藥；白介素；礦物質(zhì)；刺激細(xì)胞遷移、附著和/或增殖的分子；酶；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)；睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，以及它 們的組合。活性成分可以從人類(lèi)或哺乳動(dòng)物血漿中分離，或可以為重組的。海綿上可以涂覆多種蛋白酶，如透明質(zhì)酸酶或膠原酶，或涂覆具體蛋白酶抑制劑 的多種組合，以治療不愈合潰瘍或促進(jìn)皮膚再生。涂覆到海綿上的溶液中的蛋白質(zhì)或肽活性成分的量可以各不相同，從極低到超過(guò) 飽和。當(dāng)然，活性成分的實(shí)際用量將取決于(例如)其預(yù)期目的、其效力、患者的疾病狀況、 年齡和體重。根據(jù)本發(fā)明，可以將膠狀溶液涂覆到海綿的表面上。理想的是，干燥工序后蛋 白質(zhì)或肽活性成分可基本上保留其活性?？梢酝ㄟ^(guò)技術(shù)人員已知的任何方法憑經(jīng)驗(yàn)確定層中活性成分的量和濃度。例如， 可以通過(guò)改進(jìn)的歐洲藥典檢測(cè)分析(0903/1997)程序直接確定凝血酶活性，通過(guò)凝血機(jī)自 動(dòng)計(jì)算凝血時(shí)間，從用合適的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品繪制的校準(zhǔn)曲線(xiàn)內(nèi)插得到活性，和/或通過(guò)測(cè) 量?jī)A斜表面(或墜落試驗(yàn)?zāi)Ｐ?上的遷移長(zhǎng)度間接確定活性，或通過(guò)技術(shù)人員已知的任何 其他方法確定。包含活性成分的液體可以是任何液體載體。術(shù)語(yǔ)“載體”是指與活性成分混合或 調(diào)配以便將其涂覆到海綿表面上的稀釋劑或溶媒。載體可以選自本領(lǐng)域已知的適于施用到 體內(nèi)的任何載體。載體的非限制性例子有水、氯化鈉溶液(如生理鹽水)和有機(jī)溶劑以及 它們的混合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，活性成分為凝血酶。在這樣的實(shí)施例中，凝血酶可由初 始血液組合物制備而得。血液組合物可以是全血或血液成分，即全血制品，如血漿。凝血酶 可以為自體的、人類(lèi)來(lái)源的(包括混合血漿)、或非人類(lèi)來(lái)源的。也可以通過(guò)重組方法制備 凝血酶。凝血酶可以包含作為附加活性成分的氯化鈣。溶液中凝血酶的濃度可以在約2至約15，000IU/ml的范圍內(nèi)，在約2至約 4，000IU/ml的范圍內(nèi)，或在約4，000至約10，000IU/ml的范圍內(nèi)。溶液中氯化鈣的濃度可 以在約2至約6. 2mg/ml的范圍內(nèi)，或在約5. 6至約6. 2mg/ml的范圍內(nèi)，如濃度為5. 88mg/ ml。凝血酶還可以包含賦形劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“賦形劑”是指添加到溶液中的惰性物質(zhì)。 可將賦形劑添加到溶液中，以確保活性成分在儲(chǔ)存后仍保持其化學(xué)穩(wěn)定性和生物活性，或 出于美觀目的(如顏色)。賦形劑的例子包括但不限于人白蛋白、甘露糖醇和醋酸鈉。溶液 中的人白蛋白可以在約2至約8mg/ml的范圍內(nèi)。甘露糖醇的濃度可以在約15至約25mg/ ml的范圍內(nèi)。加入溶液中的乙酸鈉可以在約2至約3mg/ml的范圍內(nèi)。凝血酶還可以包含 載體，如注射用水。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，活性成分為用L9緩沖溶液(20mM乙酸鈉、40mM CaCl2UlOmM NaCl、0. 5% w/w人白蛋白、2% w/w甘露糖醇，pH值為6. 9-7. 1)調(diào)配的凝血酶。如實(shí)例方法中所述，在體內(nèi)大鼠腎出血模型中測(cè)試明膠海綿的止血特性，其中明 膠海綿通過(guò)用凝血酶溶液部分浸泡并用真空烘箱干燥制備而得。結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的 方法制備并在真空烘箱中干燥的海綿在敷到出血表面上時(shí)可有效地防止失血，并且比完全 浸泡并干燥的海綿更柔韌。此外，結(jié)果還顯示，包含凝血酶(作為活性成分)的根據(jù)本發(fā)明的即用型明膠海綿 在體內(nèi)環(huán)境中可非常有效地防止失血。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明用凝血酶制備的海綿在止血效力方面是不含凝血酶的對(duì)照海綿的至少3倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，凝血酶和氯 化鈣為即用型海綿層中唯一的活性成分。術(shù)語(yǔ)“唯一的活性成分”是指指定的活性成分為 產(chǎn)品功能所需的唯一的化學(xué)活性成分。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包含活性成分的層無(wú) ε氨基己酸(EACA)。有利的是，可在單個(gè)步驟中一次性將包含活性成分的液體施加到海綿表面上。該 方法使制程放大變易?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法施加液體，包括但不 限于物理吸附、毛細(xì)力、噴霧、部分浸泡、移液、將海綿壓在被含活性成分的溶液飽和的輥 上、通過(guò)使用具有至少一個(gè)噴嘴的滴注設(shè)備或涂敷器，或通過(guò)使用分配器(如噴霧機(jī))或通 過(guò)使用Pipejet 技術(shù)。在任何情況下，潤(rùn)濕步驟中施加到海綿上的液體體積都不應(yīng)超過(guò)海 綿初始體積的5%，如上文所述。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)被動(dòng)毛細(xì)力施加液體。在 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)將海綿壓在被含活性成分的溶液飽和的輥上施加液體。根 據(jù)本發(fā)明，可以使用具有外表面的任何輥，在其滾動(dòng)面上具有多個(gè)能夠容納液體的空腔。這 樣的表面允許準(zhǔn)確地確定每單位面積輥表面上容納的液體體積。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例 中，將空腔刻在輥的外表面上。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在輥上覆蓋多孔網(wǎng)。空腔可以 具有任何合適的幾何形狀，如菱形、正方形或矩形。網(wǎng)可以是適于與生物溶液一起使用的任 何材料，如聚丙烯、聚酯。所謂“適于”是指不會(huì)與生物溶液相互作用的惰性材料。空腔保持液體的能力會(huì)受到不同的因素影響，例如，溶液的表面張力和粘度以及 輥的材料，即親水或疏水物質(zhì)。通常根據(jù)溶液的性質(zhì)和輥的材料確定待使用的空腔尺寸。也可以使用具有平滑表面的輥，通過(guò)合適的技術(shù)在其周?chē)扛差A(yù)定量的液體，例 如通過(guò)浸泡、浸漬或使用刷子或在輥表面上噴涂液體溶液。與要涂覆的海綿表面接觸的輥外表面的至少一部分應(yīng)接觸包含液體溶液的貯存 器。從輥外表面到海綿表面上的流體轉(zhuǎn)移機(jī)制可以利用驅(qū)動(dòng)力(如重力)，以幫助流體分布 到海綿的整個(gè)表面上?？梢酝ㄟ^(guò)使輥的外表面與要涂覆的海綿的表面接觸，并相對(duì)于彼此 移動(dòng)輥的外表面和海綿表面而將液體轉(zhuǎn)移到海綿表面上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，沿著 要涂覆的海綿表面滾動(dòng)輥。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，海綿緊靠輥的表面移動(dòng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將海綿送入具有兩個(gè)反轉(zhuǎn)輥的設(shè)備中，該設(shè)備包括下 輥和可垂直移動(dòng)的上輥，能夠調(diào)節(jié)上輥與下輥之間的間隙的兩個(gè)升高部分(如兩顆調(diào)整螺 釘)，用于旋轉(zhuǎn)至少一個(gè)輥的裝置(如馬達(dá))，以及用于容納生物溶液的浴，如以下舉例說(shuō) 明。在這樣的實(shí)施例中，下輥包括多個(gè)空腔，并與包含液體溶液的貯存器接觸。下輥可以是 固定的，或者能夠可交換地移動(dòng)。當(dāng)使用以下示例的此類(lèi)設(shè)備時(shí)，液體施加步驟可以如下進(jìn)行使輥之間的間隙與 要涂覆的海綿厚度相匹配。然后，將設(shè)備放在硬質(zhì)水平表面上，用調(diào)平工具調(diào)節(jié)設(shè)備的水平 性。將液體施加到浴中，并運(yùn)行設(shè)備。將速度調(diào)節(jié)至所需的轉(zhuǎn)速(RPM)。一般來(lái)講，應(yīng)將速 度調(diào)節(jié)至可允許施加的液體量等于或小于海綿初始體積的5%。下輥在包含液體組合物的 浴中運(yùn)行，它在輥的灌注結(jié)構(gòu)中填層涂層材料。有利的是，將該步驟進(jìn)行到實(shí)現(xiàn)下輥與浴之 間液體平衡攝入。希望在下輥的表面上具有連續(xù)均勻的液體材料層。這可以通過(guò)使用從輥 表面上去除多余材料的裝置(如刮粉刀組)獲得。這樣，液體可以保留在多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)。然 后，讓海綿在兩個(gè)輥之間通過(guò)，生物溶液通過(guò)毛細(xì)力被動(dòng)地沉積到基底的底面上。在潤(rùn)濕步 驟中，上輥在海綿上施加壓力，從而將海綿從設(shè)備中擠出，并控制海綿的液體攝入能力。在潤(rùn)濕步驟前后稱(chēng)取海綿的重量，通過(guò)從海綿潤(rùn)濕之前的重量中減去潤(rùn)濕步驟后的重量計(jì)算 液體攝入量?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的另一種輥設(shè)備在美國(guó)專(zhuān)利4，522，057中有所公開(kāi)，其內(nèi)容以 引用方式并入本文。結(jié)果表明，使用輥設(shè)備在海綿表面上施加液體是有利的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)該技 術(shù)可以控制施加到海綿上的液體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，使用液體分配器將液體溶液施加到海綿的表面上。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，使用Pipejet 技術(shù)將液體溶液施加到海綿表面上。該技術(shù)是 一種無(wú)閥方法，用于非接觸分配幾納升至最多幾微升的液體。結(jié)果還表明，使用液體分配器 (如Pipejet 技術(shù))能以限定和準(zhǔn)確的方式控制整個(gè)海綿表面上的液體分配量，從而在海 綿表面上基本上均勻地分布含有活性成分的液體。有利的是，不使用會(huì)在海綿上施加機(jī)械壓力的注射或任何其他方法將液體溶液施 加到海綿表面上；因?yàn)橛眠@些方法施加會(huì)導(dǎo)致液體滲入海綿較深，使海綿表面上的活性成 分分布不均勻，和/或使海綿產(chǎn)生相當(dāng)大的變形。在此背景下使用的術(shù)語(yǔ)“均勻的”代表包含活性成分的液體基本上均勻地施加到 海綿的整個(gè)表面上。因此，活性成分以薄層形式均勻地分布在海綿表面上。有利的是，層尺 寸相等的不同區(qū)域具有大致相同的生物活性。合適的交聯(lián)明膠海綿可以是任何可吸收性海綿產(chǎn)品，例如自制的明膠海綿，如實(shí) 例中所述的海綿，或使用多種市售海綿，如SP0NG0STAN 、GELITASP0N。制備根據(jù)本發(fā)明的即用型交聯(lián)明膠海綿時(shí)，可以將潤(rùn)濕劑在發(fā)泡之前摻入明膠溶 液中，在潤(rùn)濕步驟之前施加到交聯(lián)明膠海綿的表面上，或包含在含有活性成分的液體中。然 而，此添加不是必需的。在任何情況下，在潤(rùn)濕步驟中施加到海綿上的液體體積都應(yīng)等于或 小于海綿體積的5%?？梢愿鶕?jù)預(yù)期用途制備和提供多種尺寸和形狀的本發(fā)明的海綿，如正方形、多邊 形、球形、圓錐形、立方體、卵形、矩形或圓柱形。例如，可以用以下海綿尺寸制備本發(fā)明的即 用型交聯(lián)明膠海綿8 X 03cm、IOX IOX IcmUXlX lcm、7X5Xlcm、2. 5X2. 5X Icm0本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及改進(jìn)的干燥即用型交聯(lián)明膠海綿，在海綿的至少一個(gè)表 面上具有蛋白質(zhì)或肽活性成分層。該層的平均厚度不大于即用型海綿總厚度的約24%。層中的活性成分可以是任何適于給予患者并可誘導(dǎo)上述所需效應(yīng)的物質(zhì)。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施例中，活性成分為凝血酶。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，活性成分為凝血酶和 氯化鈣?？梢允褂脗溥x量及濃度的凝血酶和氯化鈣。優(yōu)選地對(duì)包含活性成分的層中的量和 濃度進(jìn)行選擇，以?xún)?yōu)化蛋白質(zhì)的功效和功能。即用型海綿的層中的凝血酶活性可以在約1 至約300IU/cm2的范圍內(nèi)，在約10至約40IU/cm2的范圍內(nèi)，在約20至約40IU/cm2的范圍 內(nèi)，或?yàn)榧s35IU/cm2的凝血酶。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“凝血酶”包括凝血素，它是凝血酶的前體。在使用凝 血素的情況下，它在即用型海綿的層中的濃度可對(duì)應(yīng)于約1至約300IU/cm2的凝血酶活性。層還可以包含上文所述的賦形劑和/或載體。賦形劑的例子包括但不限于人白蛋 白、甘露糖醇和醋酸鈉。在一個(gè)非限制性例子中，液體載體為注射用水。層的特征在于它是穩(wěn)定的，并且大致均勻地分布在海綿的整個(gè)表面上?？捎蒙鲜?穩(wěn)定性測(cè)試或通過(guò)技術(shù)人員已知的任何方法評(píng)估層的穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)樣本的尺寸為約1. 7cm2并進(jìn)行上述穩(wěn)定性測(cè)試時(shí)，樣本的重量損失可小于5%。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，可在不添加潤(rùn)濕劑的水溶液存在下均勻地潤(rùn)濕即用型交聯(lián)明膠 海綿。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，即用型交聯(lián)明膠海綿的層不需要潤(rùn)濕劑，以縮短海 綿的水化時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的海綿的厚度和柔韌性基本上類(lèi)似于原來(lái)的對(duì)應(yīng)未分層明膠 海綿。基本上類(lèi)似的海綿可以是可保留了原來(lái)未分層海綿厚度的至少75%和原來(lái)海綿柔韌 性的至少80%的海綿。本發(fā)明的主題包括含有根據(jù)本發(fā)明的無(wú)菌即用型交聯(lián)明膠海綿的密封包裝，該包 裝能夠在無(wú)污染的情況下取出貼片。該包裝可以采用多種材料，如鋁箔小袋等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的不會(huì)使對(duì)熱工序敏感的生物化合物降解的任何滅菌方法， 包括但不限于電子束照射、Y照射、環(huán)氧乙烷(EtO)滅菌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用 (例如)Y輻射將即用型海綿和包裝材料一起滅菌。根據(jù)本發(fā)明的海綿可以按照包括任何上述海綿的套件形式提供。套件可以包括多 個(gè)即用型海綿?？梢詫⒑＞d裝在密封的無(wú)菌包裝中。此外，套件可以包括經(jīng)滅菌的外科器 械，例如解剖刀、止血?jiǎng)┖?或使用說(shuō)明書(shū)。套件還可以包括無(wú)菌繃帶、無(wú)菌墊、紗布和/或 消毒劑。套件還可以包括無(wú)菌鹽水溶液。根據(jù)本發(fā)明的即用型海綿或套件可有利地用于外科手術(shù)，如神經(jīng)外科；腦外科； 組織重建和美容術(shù)，如軟骨、神經(jīng)和骨骼再生。即用型海綿或套件還可以用于止血、防粘連 和/或用于修復(fù)和/或治療受損組織。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將海綿涂上止血?jiǎng)?。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“止血?jiǎng)?，是?能夠在有效的時(shí)間內(nèi)控制、減少或停止毛細(xì)管、靜脈或小動(dòng)脈出血(包括嚴(yán)重或活躍出血) 的試劑，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。出血可因外科手術(shù)、止血障礙或其他情況而發(fā)生，例如， 在具有凝血障礙或接受肝素或抗凝血?jiǎng)┑幕颊咧邪l(fā)生。如本文所用，“嚴(yán)重或活躍出血”是指大量和快速出血的情況。嚴(yán)重和活躍出血的 例子包括但不限于因以下情況而產(chǎn)生的出血?jiǎng)用}穿刺、肝臟切除、腎臟切除、血友病患者 和接受抗凝血?jiǎng)┧幬镏委煹幕颊叩鹊?。止血?jiǎng)┑睦影ǖ幌抻谀?、凝血酶、纖維蛋白、纖粘蛋白、因子X(jué)fXa、因子 VII/VIIa、因子IX/IXa、因子X(jué)l/XIa、因子X(jué)II/XIIa、因子X(jué)III、因子VIII、玻連蛋白、組織 因子、可從蛇毒獲得的蛋白水解酶(如巴曲酶)、von Willebrand因子、纖溶酶原激活因子 抑制劑、血小板活化劑、具有止血活性的合成肽、上述物質(zhì)的衍生物以及它們的任何組合。將海綿用作止血產(chǎn)品時(shí)，在包含活性成分的層中可包括促進(jìn)血塊形成的附加物 質(zhì)，如氯化鈣。例如，當(dāng)體液不足以提供足夠的海綿水化時(shí)，可以在使用前將即用型海綿浸泡在 無(wú)菌鹽水溶液中。作為另外一種選擇，可在不首先將海綿浸泡在鹽水溶液中的情況下施加 海綿，而通過(guò)體液活化止血?jiǎng)??？蓪⒓从眯秃＞d施加到所需的部位上，并在壓力下保持足夠的時(shí)間，使得在海綿 與施用部位之間的界面處產(chǎn)生凝血，并基本上停止出血。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，活性成分為抗粘連劑。在這樣的實(shí)施例中，即用型海 綿可用于防止粘連。粘連是不希望的副作用，發(fā)生粘連時(shí)，正常情況下分離的身體組織會(huì)長(zhǎng)在一起。這種不希望的副作用可因以下情況而發(fā)生外科手術(shù)或非外科手術(shù)侵襲，如子宮內(nèi) 膜異位、感染、創(chuàng)傷、化療、輻射和癌癥。通常，抗粘連劑是指能夠形成物理屏障(涂層)的 試劑，該物理屏障將手術(shù)部位的相鄰組織分開(kāi)，從而防止和/或減少術(shù)后粘連的形成。海綿還可以包含一種或多種蛋白質(zhì)或肽活性成分，并用作藥物遞送體系。術(shù)語(yǔ)“藥物遞送體系”是指摻入海綿中的活性蛋白或肽的遞送允許在體內(nèi)的具體 組織中受控地遞送蛋白質(zhì)或肽。根據(jù)本發(fā)明制備的海綿具有以下優(yōu)點(diǎn)中的至少一個(gè)保持原有的柔韌性、紋理、多 孔結(jié)構(gòu)的完整性，活性成分在與傷口接觸的界面處作為薄層以高濃度存在，層穩(wěn)定，以及性 能穩(wěn)健。技術(shù)人員能容易地理解在本發(fā)明描述中公開(kāi)的范圍。這表示公開(kāi)了范圍界限之間 的連續(xù)值和數(shù)字，包括具有中間子范圍的所有組合的限制數(shù)字和值。以上或以下引用的專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和出版物的公開(kāi)內(nèi)容在此均以引用方式并入。以下實(shí)例為示例性的，而非限制性的。SM^^冷凍干燥過(guò)程。使用CHRIST，EPSILON 2_8D凍干機(jī)按照下列步驟進(jìn)行凍干過(guò)程 將擱板溫度降至_45°C維持2小時(shí)。接下來(lái)，將溫度降至-50°C再維持30分鐘。然后，將擱 板溫度保持在_50°C維持5小時(shí)。接著在-15°C和0. 14mbar下升華最多24小時(shí)。然后，將 擱板溫度增至+25°C，將壓力降至0. 02mbar，并進(jìn)行第二次干燥，持續(xù)最多24小時(shí)。真空干燥過(guò)程。在0. Ibar或更低的壓力下在設(shè)置為室溫的烘箱(ShelLaB 1430-2E型)中持續(xù)3至4小時(shí)完成真空干燥過(guò)程。明膠海綿(自制海綿)的制備。將30g明膠片(PB明膠；藥用明膠，得自豬皮的A 型，250勃魯姆(Bloom)，8目；目錄號(hào)1154)加入500ml蒸餾水中。將分散體加熱到60°C直 到明膠完全溶解。然后將溶液(6% w/v)冷卻到50°C并轉(zhuǎn)移到攪拌碗(KitchenAid Heavy Duty KSM 150型)中，在速度6下將溶液攪拌約2分鐘，直至形成體積為明膠溶液原體積的 6-8倍的穩(wěn)定泡沫。將泡沫倒進(jìn)金屬模具(21 X30cm，深1.5cm)中。為了使泡沫硬化，將模 具放在4°C下1小時(shí)。之后，將模具轉(zhuǎn)移到隔板預(yù)冷(4°C)的凍干機(jī)中。如上所述進(jìn)行冷 凍干燥過(guò)程。干燥過(guò)程后，將干燥的海綿在160°C和大氣壓下交聯(lián)3小時(shí)。凝血酶從海綿的釋放。將海綿(2. 5X2. 5X 1 (厚度)cm)浸入裝于50ml聚丙烯管 的IOml緩沖液(0. 4%無(wú)水檸檬酸三鈉、154mM氯化鈉和BSA)中。在室溫下將聚丙烯管 置于輥上。通過(guò)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定緩沖液中恢復(fù)的凝血酶活性來(lái)測(cè)量凝血酶從海綿的釋放。 根據(jù)以下改進(jìn)的歐洲藥典檢測(cè)分析(0903/1997)程序測(cè)定凝血酶凝結(jié)活性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將 每種凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液(4、6、8和10IU/ml ；OmrixIL ；按照美國(guó)專(zhuān)利5，143，838和歐洲專(zhuān)利 378，798中所述的方法制備)在30°C下孵育2分鐘。然后從每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中取40 μ 1凝血酶 溶液與 160μ 1 纖維蛋白原溶液(0. 1 %,Enzyme research Laboratories,目錄號(hào) FIB1)混 合，并測(cè)定凝結(jié)時(shí)間(Haemostaisi分析儀Diagnostica Stago ；型號(hào)Start)。繪制凝結(jié)時(shí) 間的對(duì)數(shù)相對(duì)于凝血酶濃度的對(duì)數(shù)的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后，從管中取出0. 3ml樣品，其中40μ 1 用于測(cè)定(回加相同量的緩沖液以補(bǔ)償樣品體積)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的下列時(shí)間點(diǎn)2、5、10、15、30、45和60min—式兩份進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)測(cè)得的凝結(jié)時(shí)間(由凝血機(jī)自動(dòng)計(jì)算，由校準(zhǔn) 曲線(xiàn)內(nèi)插并乘以稀釋因子)確定每個(gè)樣品中的凝血酶活性。大鼠腎出血模型。根據(jù)當(dāng)前的倫理要求，將體重為350_500g的Sprague Dawley 白化大鼠關(guān)在經(jīng)批準(zhǔn)的設(shè)施中。確定每只動(dòng)物的健康狀況，只將明顯健康的動(dòng)物用于試驗(yàn)。 收到動(dòng)物后，使它們接受至少5天的馴化期。為動(dòng)物隨意提供購(gòu)買(mǎi)的嚙齒動(dòng)物飼料，并使它 們可自由飲水。通過(guò)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥(Pental) (30-50mg/kg)將動(dòng)物麻醉。之后，在動(dòng) 物的左側(cè)刮去毛以實(shí)施腰椎旁剖腹術(shù)。用乙醇擦拭刮毛部位。為了維持38-40°C的溫度，將 大鼠放在位于預(yù)熱到40°C的水浴上的塑料蓋板上。將測(cè)溫探針插入動(dòng)物的直腸并監(jiān)測(cè)體 溫。將動(dòng)物橫放，將肝素鈉(2000ILVKg)通過(guò)尾靜脈注入。從左髖到第12肋制作一條左腰 椎旁切口，將左腎暴露并與腎周脂肪分離。重新定位大鼠，使其背臥，并穩(wěn)定5分鐘的時(shí)間， 或直到體溫達(dá)到39°C的極限。在從腹取出的腎和切開(kāi)的腹壁之間，用軟血管夾閉塞腎血管， 將紗布?jí)|塞進(jìn)切口的背側(cè)，以吸收任何從切口或從腎后的腹腔流出的血液或體液。將一片 預(yù)切的透明塑料放到紗布?jí)|頂部以將血流從腎導(dǎo)進(jìn)紗布?jí)|。將另外一片或兩片正方形紗布 放在塑料平臺(tái)的底部，用軟血管夾閉塞腎血管。實(shí)施矢狀半腎切除術(shù)，垂直于腎血管移切除 腎的遠(yuǎn)側(cè)整半。將腎切下部分的切口表面在一張濾紙上印三次以測(cè)量切口的表面積。對(duì)三 個(gè)腎印跡的每一個(gè)進(jìn)行描圖，以幫助測(cè)定表面積。將留下的腎的切口表面吸干。在壓力下 將明膠海綿敷到腎的切口表面上1分鐘，然后釋放腎血管夾。在1小時(shí)內(nèi)觀察腎的出血情 況。當(dāng)血液流出海綿時(shí)，用紗布輕輕蘸吸出血區(qū)域。從出血表面移去明膠海綿導(dǎo)致了再次 出血，表明止血是因采用了明膠海綿而發(fā)生的。通過(guò)對(duì)被血浸濕的紗布?jí)|稱(chēng)重以評(píng)估腎血 損失。通過(guò)CO2窒息對(duì)存活的動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。蛋白質(zhì)層的穩(wěn)定性評(píng)估。穩(wěn)定性評(píng)估測(cè)定海綿的蛋白質(zhì)層的脆性。采用模切機(jī) 從交聯(lián)的即用型明膠海綿上切下約1.7cm的樣品，并測(cè)定其重量。然后將樣品放入硼硅酸 鹽玻璃閃爍瓶(Fisher Scientific ；目錄號(hào)03-337-4)中，使帶涂層的表面向上，將瓶子蓋 上。將能夠保持塑料管(48英寸長(zhǎng)，1.625英寸直徑)的具有萬(wàn)能夾的支承架放在硬質(zhì)水平 表面上。將塑料管垂直插入夾具中，緊固夾具，并將固體硅樹(shù)脂塞子(Fisher Scientific ； 目錄號(hào)09-704-IP)放入塑料管的底部。將塑料塊放在硅樹(shù)脂塞子的下面，以防止塞子在測(cè) 量過(guò)程中彈出。然后，將裝有樣品的瓶以頂蓋向上從塑料管的頂部落下。為了排除變化性并 確保標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行每次下落時(shí)落點(diǎn)相同。樣品落下4次后，將樣品稱(chēng)重。通過(guò)從落下前的樣 品重量減去落下后的樣品重量計(jì)算粉末損失。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品的重量減輕百分比
粉末損失/落前重量*100少于5%的重量減輕被視為不會(huì)從海綿表面剝落的穩(wěn)定層。8000和4000IU/ml凝血酶溶液的制備。1000IU/ml凝血酶溶液(Omrix, IL ；如美國(guó)專(zhuān)利5，143，838和歐洲專(zhuān)利378，798中 所述進(jìn)行制備)的濃縮和滲濾使用IOK Omega 超濾膜圓盤(pán)過(guò)濾器(序列號(hào)39182101)進(jìn) 行，從而獲得8000IU/ml的凝血酶溶液。通過(guò)用L9緩沖溶液稀釋8000IU/ml的溶液(1 1 的比率)以制備4000IU/ml的凝血酶溶液。使用上述指定的過(guò)濾器進(jìn)行L9緩沖溶液的濃 縮和滲濾。
三點(diǎn)彎曲測(cè)試。此測(cè)試提供彈性模量值，彈性模量度量當(dāng)沿著一條軸對(duì)物體施加 力時(shí)，物體沿著該軸向相反方向變形的趨勢(shì)。使用彎曲夾具(GF-54 3點(diǎn)彎曲夾具(LL0YD instruments Ltd.))進(jìn)行測(cè)定。一旦將夾具的彎曲中心調(diào)整到40mm的跨度后，即將標(biāo)本放 到其上，在整個(gè)彎曲測(cè)試期間向標(biāo)本施加壓縮力(LF plus系列，LLOYD instruments Ltd, Hampshire, UK) 0將延伸速率設(shè)為15mm/min。進(jìn)行彎曲測(cè)試，直到標(biāo)本破裂。實(shí)施例1海綿對(duì)液體的攝入與真空干燥過(guò)程后明膠海綿的厚度及外觀的關(guān)系。
此實(shí)驗(yàn)的目的是確定海綿對(duì)液體的攝入對(duì)干燥后海綿厚度和外觀的影響。將非 離子表面活性劑NP40加入液體配方中，以改變海綿對(duì)液體的攝入。為此，將7X5X1(厚 度)cm 的 SP0NG0STAN 海綿(由 Johnson &Johnson 提供；目錄號(hào) MS 0002)切成 2.5X2. 5X Icm的大小。將這些重量為80_90mg的海綿放進(jìn)具有各種液體配方和體積的塑 料托盤(pán)(3X3X0.2(深度)cm)中3分鐘。下表1列出了本研究的設(shè)計(jì)。水化因毛細(xì)管作 用而發(fā)生。通過(guò)在潤(rùn)濕過(guò)程前后對(duì)海綿稱(chēng)重來(lái)定量監(jiān)測(cè)海綿對(duì)液體的攝入(其中Img被視 為 μ )。此后，如上所述將海綿在真空烘箱中干燥，并測(cè)量它們的厚度。下表1詳細(xì)列出 了結(jié)果。表1 在不同的配方中海綿對(duì)液體的攝入以及干燥過(guò)稈后海綿的厚度。
權(quán)利要求
一種制造包含蛋白質(zhì)或肽活性成分的改進(jìn)的交聯(lián)明膠海綿的方法，包括以下步驟a)提供具有至少一個(gè)表面的交聯(lián)明膠海綿；b)均勻地將包含蛋白質(zhì)或肽活性成分的液體施加到所述海綿的所述至少一個(gè)表面上，其中施加的所述液體的體積等于或小于a)中所述海綿的體積的5％；以及c)將所述海綿干燥，從而獲得柔韌、干燥的交聯(lián)明膠海綿，所述海綿在其至少一個(gè)表面上具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或肽活性成分層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液體施加步驟在單個(gè)階段中進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液體不含氨基己酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)使用輥進(jìn)行所述液體施加步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述液體施加步驟包括以下步驟a)提供具有外表面的旋轉(zhuǎn)輥，其中所述外表面的至少一部分與含有所述液體的貯存器 接觸；b)旋轉(zhuǎn)所述輥以用所述液體覆蓋所述外表面；c)使所述輥的所述外表面與所述海綿的所述至少一個(gè)表面接觸；以及d)使所述輥的所述外表面和所述海綿的所述至少一個(gè)表面彼此相對(duì)移動(dòng)；從而將所述液體沉積到所述海綿的所述至少一個(gè)表面上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述外表面包括多個(gè)能夠容納所述液體的空腔。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)使用液體分配器進(jìn)行所述液體 施加步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中通過(guò)使用PipeJetTM技術(shù)進(jìn)行所述液體施加步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述干燥海綿的厚度和柔韌性基本 上類(lèi)似于a)中所述海綿的厚度和柔韌性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中保留了a)中所述海綿厚度的至少75%。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述層的厚度等于或小于干燥步 驟后所述海綿總厚度的24%。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)選自下列的方法進(jìn)行所述干 燥步驟真空烘箱、冷凍干燥和風(fēng)干。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中通過(guò)真空烘箱進(jìn)行所述干燥步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述活性成分包含凝血酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體中凝血酶的活性在 約2至約15，000IU/ml的范圍內(nèi)，在約2至約4，000IU/ml的范圍內(nèi)，或在約4，000至約 10, 000IU/ml的范圍內(nèi)。
16.一種改進(jìn)的、干燥的交聯(lián)明膠海綿，所述海綿在其至少一個(gè)表面上具有蛋白質(zhì)或肽 活性成分層，所述層的平均厚度不大于所述海綿總厚度的約24%，其中所述層是穩(wěn)定的，并 基本上均勻地分布在整個(gè)所述表面上；并且所述海綿的厚度和柔韌性也基本上類(lèi)似于原來(lái) 的對(duì)應(yīng)未分層明膠海綿的厚度和柔韌性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的海綿，其中所述層中不含潤(rùn)濕劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的海綿，其中所述活性成分包含凝血酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的海綿，其中凝血酶活性在約1至約300IU/cm2的范圍內(nèi)，在 約10至約40IU/cm2的范圍內(nèi)，或在約20至約40IU/cm2的范圍內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的海綿，用于外科手術(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的海綿，用于促進(jìn)凝血。
22.一種包裝，包含根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的無(wú)菌交聯(lián)明膠海綿。
23.一種促進(jìn)凝血的方法，包括向傷口或出血部位給予根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng) 所述的交聯(lián)明膠海綿，或使用根據(jù)權(quán)利要求22所述的包裝。
24.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的交聯(lián)明膠海綿或根據(jù)權(quán)利要求22中所述的 包裝的用途，用于促進(jìn)凝血。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有活性成分層的、改進(jìn)的干燥交聯(lián)明膠海綿，及其制備方法和用途。
文檔編號(hào)A61L15/64GK101970021SQ200980107724
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者E·希特里特, G·托默, I·努爾, L·巴 申請(qǐng)人:奧姆里克斯生物藥品有限公司