專利名稱：Fhl3在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四個半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白的新醫(yī)藥用途，具體涉及四個半LIM結(jié)構(gòu)域蛋 白3(FHL3)在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
四個半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白(Four and a Half LM domains protein,下文簡稱FHL) 家族屬于LIM超家族，其家族成員由4個半LM結(jié)構(gòu)域組成。LIM結(jié)構(gòu)域由約50個氨基酸 組成，富含半胱氨酸，形成2個鋅指結(jié)構(gòu)。LIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)許多蛋白與蛋白之間的相互作用， 調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白、酶以及轉(zhuǎn)錄因子的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FHL家族有5個成員，它們分別是 FHLl 、 FHL2、 FHL3、 FHL4和FHL5/ACT。 FHL成員的表達(dá)具有組織特異性，F(xiàn)HL1 、 FHL2和FHL3 主要在骨骼肌和心肌中表達(dá)，F(xiàn)HL4和FHL5/ACT主要在睪丸中表達(dá)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL家族的 功能主要表現(xiàn)在三個方面第一方面，F(xiàn)HL家族蛋白在肌細(xì)胞的生長及分化過程具有重要 作用；第二方面，F(xiàn)HL家族的成員可作為轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子發(fā)揮作用；以及第三方面，F(xiàn)HL 家族成員可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有重要功能。 腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的常見疾病。在西醫(yī)領(lǐng)域，目前腫瘤治療的傳 統(tǒng)模式主要有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和生物學(xué)治療?；蛑委熓墙臧l(fā)展起來的 一類新治療方法，基因治療的主要理論依據(jù)是基于腫瘤是一類"多基因病"，目前認(rèn)為腫瘤 的基本發(fā)病機(jī)理是由于基因表達(dá)調(diào)控異常、生長因子分泌功能失常、信號傳導(dǎo)異常、使細(xì)胞 發(fā)生惡性增殖而發(fā)生的。因此，從理論上分析，從基因水平調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)過程是治療 腫瘤較為理想的手段和途徑。近年來隨著基因工程的飛速發(fā)展，基因治療法已經(jīng)開始用于 腫瘤的治療。但是，即便如此，臨床上仍然需要安全、有效的腫瘤治療的新方案。
目前，F(xiàn)HL3在人類腫瘤中的表達(dá)情況還不清楚，F(xiàn)HL3是否能抑制人類腫瘤細(xì)胞的 生長及如何調(diào)節(jié)這種生長的分子機(jī)理也不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供FHL3的新醫(yī)藥用途，例如在制備用于治療腫瘤的藥物中的 用途，或通過基因治療等方法用于治療腫瘤。 本發(fā)明人在研究中令人意外地發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3可以調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因在生物體內(nèi) 的表達(dá)，并由此進(jìn)一步抑制哺乳動物特別是人類的腫瘤細(xì)胞的生長，為腫瘤的臨床治療提 供了 一種全新的有益方案。基于該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。 —方面，本發(fā)明提供了FHL3在制備用于調(diào)節(jié)癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細(xì) 胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途。 基于本發(fā)明第一方面的用途，本發(fā)明第二方面提供了FHL3在制備用于抑制哺乳 動物腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。 本發(fā)明第三方面提供了一種表達(dá)載體，其含有編碼FHL3的核苷酸序列。在一個實 施方案中，所述的載體是質(zhì)粒或病毒。在另一個實施方案中，所述的病毒是腺病毒。
本發(fā)明第四方面提供了本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體在制備用于調(diào)節(jié)癌基因 和/或抑癌基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途。 本發(fā)明第五方面提供了本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體在制備用于抑制哺乳動
物腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。 下面進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。 本發(fā)明第一方面提供了 FHL3在制備用于調(diào)節(jié)癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途。 本發(fā)明所述的FHL3是一種已知的蛋白質(zhì)，英文全稱為four anda half LIM domains 3，其在NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)給定的基因編號為BC011697。 FHL3 可以通過多種途徑獲得，例如用PCR方法從乳腺cDNA文庫(Clontech， USA)中擴(kuò)增含280 個氨基酸的完整編碼區(qū)FHL3 cDNA序列。 另外，如本文使用的，術(shù)語"癌基因"是指其編碼的產(chǎn)物與細(xì)胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化有關(guān) 的基因，它能促進(jìn)細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)化。如本文使用的，術(shù)語"抑癌基因"是癌基因的反義詞， 其正常功能是抑制細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生。 通過本發(fā)明人的深入研究，發(fā)現(xiàn)FHL3可以調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)癌基因的表達(dá)，和 /或可以調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)抑癌基因的表達(dá)。更具體地說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)FHL3可以抑 制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)癌基因的表達(dá)，和/或可以促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)抑癌基因的表達(dá)。所述 的哺乳動物細(xì)胞可以是來自哺乳動物任何組織或器官的細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述哺乳動物細(xì) 胞包括但不限于來自以下組織或器官的細(xì)胞乳腺、肝臟、肺臟、胃、前列腺、腸、腎、子宮、卵 巢、皮膚。更進(jìn)一步地，所述哺乳動物細(xì)胞包括但不限于來自以下組織或器官的細(xì)胞乳腺、 肝臟、肺臟。另一方面，所述的哺乳動物細(xì)胞可以是在體細(xì)胞，也可以是離體細(xì)胞，雖然本發(fā) 明是通過采用離體細(xì)胞進(jìn)行試驗發(fā)現(xiàn)的這些結(jié)果，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，通過本發(fā)明 的方案和結(jié)果可以容易在哺乳動物的在體細(xì)胞中獲得同樣結(jié)果。此外，基于本發(fā)明的產(chǎn)業(yè) 用途，所述的哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物的在體細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)是實現(xiàn)本發(fā)明的基礎(chǔ)。
基于本發(fā)明第一方面的用途，本發(fā)明第二方面提供了FHL3在制備用于抑制哺乳 動物腫瘤和/或癌細(xì)胞生長的藥物中的用途。 用于本文的術(shù)語"腫瘤"和"癌"，其含義和兩者關(guān)系是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并 且二者在許多情況下可以互換使用。所述的腫瘤和/或癌可以是醫(yī)學(xué)上已知的任何腫瘤， 包括惡性腫瘤和/或癌癥。優(yōu)選地，所述的腫瘤(包括惡性腫瘤和/或癌癥)包括，但不限 于 惡性腫瘤，包括但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌)、 結(jié)腸癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌(包括鱗狀細(xì)胞癌)；
中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括但不限于星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；以及
其他腫瘤，包括但不限于黑素瘤。 更優(yōu)選地，所述的腫瘤(包括惡性腫瘤和/或癌癥)選自乳腺癌、肝癌、肺癌(包 括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌)、胃癌、結(jié)腸癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的腫瘤(包括惡性腫瘤和/或癌癥)選自乳腺癌、肝癌、肺 癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌)。 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，所述的哺乳動物的腫瘤和/或癌細(xì)胞可以是在體細(xì)胞，也可以是離體細(xì)胞，雖然本發(fā)明采用了離體細(xì)胞進(jìn)行試驗，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，通 過本發(fā)明的方案和結(jié)果可以容易在哺乳動物的在體細(xì)胞中獲得同樣結(jié)果。此外，基于本發(fā) 明的產(chǎn)業(yè)用途，所述的哺乳動物的腫瘤和/或癌細(xì)胞優(yōu)選是罹患腫瘤和/或癌癥的哺乳動 物的在體細(xì)胞。 用于本文的術(shù)語"哺乳動物"是指罹患本發(fā)明所述腫瘤和/或癌癥的受試者，其包
括但不限于豬、狗、貓、牛、羊等家畜和人類。優(yōu)選地，所述的哺乳動物是人類。 本發(fā)明第三方面提供了一種表達(dá)載體，其含有編碼FHL3的核苷酸序列。進(jìn)一步
的，所述的載體包括但不限于可以作為表達(dá)載體使用的任何質(zhì)粒、病毒和噬菌體。優(yōu)選的，
所述的載體是質(zhì)粒和病毒。更進(jìn)一步的，所述的病毒可以是本領(lǐng)域已知的可用作載體的病
毒，優(yōu)選的，所述的病毒是腺病毒。 本文所述的術(shù)語"表達(dá)載體"，其含義是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且通常是指含 有一個啟動子順序，能有效地促使插入的目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯出該插入基因編碼 的蛋白產(chǎn)物的載體。 本發(fā)明第四方面提供了本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體在制備用于調(diào)節(jié)癌基因 和/或抑癌基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途。所述的表達(dá)載體可以作為所述藥 物的一種組成部分。 本發(fā)明第五方面提供了本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體在制備用于抑制哺乳動 物腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。所述的表達(dá)載體可以作為所述藥物的一種組成部分。
根據(jù)本發(fā)明，含有FHL3的藥物，或者含有編碼FHL3的核苷酸序列的表達(dá)載體的 藥物，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何途徑給予有治療需求的受試者，例如哺乳動物特別是 人類。所述的給藥途徑包括但不限于全身給藥、皮膚局部給藥、病灶區(qū)局部給藥等。特別 地，所述的給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、腫瘤病灶區(qū)、 經(jīng)肺吸入或吹入、胃腸外、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸。更特別地，所述的給藥途徑包括但不限于 靜脈內(nèi)和腫瘤病灶區(qū)。例如，非限制性地，根據(jù)本發(fā)明的含有FHL3的藥物或者含有編碼 FHL3的核苷酸序列的表達(dá)載體的藥物，其可通過腫瘤病灶區(qū)局部注射或者通過靜脈注射給 藥。具體而言，可以參考有關(guān)重組質(zhì)粒和腺病毒的本領(lǐng)域公知的給藥方式給予有治療需求 的受試者，例如參考Clayman GL et al. J Clin Oncol， 1998， 16 :2221-2232和Martin B et al. Cancer Res，1999，59 :1391-1399中的方法通過腫瘤部位局部注射給藥，或者參考Reid T et al. Cancer Gene Ther， 2002， 9 :979-986中的方法通過靜脈注射給藥。以上文獻(xiàn)以其 全部內(nèi)容通過引用并入本文。 根據(jù)本發(fā)明，所述的藥物可以是本領(lǐng)域公知的任何可用于給藥的藥物形式，包括 藥物組合物、藥物制劑等。具體地說，例如是用于局部給藥的制劑例如栓劑、軟膏劑、乳膏劑 等；例如是用于胃腸外給藥的制劑，例如局部注射用制劑和全身注射用制劑，具體劑型可以 例如是注射用溶液劑、注射用粉針劑等。對于本發(fā)明的實施而言，本發(fā)明的藥物優(yōu)選是用于 胃腸外給藥的制劑，包括但不限于局部注射用制劑和全身注射用制劑，具體劑型包括但不 限于注射用溶液劑和注射用粉針劑。更優(yōu)選的，所述的藥物是無菌的注射用含水溶液劑，或 者是無菌的用于臨床使用前用注射用水復(fù)溶配制的粉針劑，特別是冷凍干燥粉針劑。
另外，根據(jù)下文中提供的研究結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定在哺乳動物 中使用時有效劑量。通常，治療有效量按受試者的體重計，例如可以是1 X 109至1 X 1014VP/kg體重/天，優(yōu)選1 X 101Q至1 X 1013VP/kg體重/天，更優(yōu)選1 X 1011至1 X 1012VP/kg體重/天。所述劑量單位中的"VP"是指病毒顆粒數(shù)(Viral Particle)的縮寫?？梢詫⒁惶斓膭┝吭谝惶熘幸淮涡匀拷o與受試者，也可以在一天內(nèi)將需要的劑量分成兩個、三個、四個或更多個小劑量以合適的間隔給藥。所述小劑量可以配制成單元劑量形式，例如每個單元劑量形式含有日總劑量細(xì)分適宜次數(shù)的相應(yīng)量。當(dāng)然，也可以以一定的時間周期給藥，例如一天給藥一次、兩天給藥一次、一周給藥一次、一月給藥一次等。 另一方面，本發(fā)明提供的藥物在具體的臨床案例中，它們的具體使用量可因多種因素而可能需要作相應(yīng)的變化，這些因素包括但不限于受試者病況的嚴(yán)重程度，受試者的年齡、性別、體重，給藥途徑，藥物劑型等等。 根據(jù)本發(fā)明的研究結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過載體特別是腺病毒獲得的FHL3表達(dá)載體能夠有效抑制多種人類腫瘤細(xì)胞的生長，并且可以通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)從而抑制多種人類腫瘤細(xì)胞的生長。


圖1顯示FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體酶切鑒定結(jié)果，其中1為DNA標(biāo)記物；2為pcDNA3 ;3為pcDNA3-FHL3。 圖2顯示FHL3重組腺病毒載體酶切鑒定結(jié)果，其中1為DNA標(biāo)記物；2為pAdeasy-1 ;3為pAdeasy-FHL3。 圖3顯示FHL3重組腺病毒感染ZR75-1細(xì)胞后高表達(dá)FHL3，其中l(wèi)為pAdeasy-l ;2為pAdeasy-FHL3。 圖4顯示FHL3重組腺病毒感染腫瘤細(xì)胞可抑制該腫瘤細(xì)胞的生長，其中A為H印G2 ;B為MCF-7 ;C為H460。 圖5顯示FHL3重組腺病毒感染H印G2細(xì)胞抑制其集落形成，其中A為集落形成圖；B為集落形成數(shù)比較圖。 圖6顯示FHL3重組腺病毒注射能抑制肝癌細(xì)胞株H印G2植入的腫瘤生長。
圖7顯示FHL3重組腺病毒注射的瘤塊中高表達(dá)FHL3蛋白，其中l(wèi)為pAdeasy-l ;2為pAdeasy-FHL3。 圖8顯示FHL3重組腺病毒感染H印G2細(xì)胞影響癌基因及抑癌基因的表達(dá)，其中1為pAdeasy-1 ;2為pAdeasy-FHL3。 圖9顯示FHL3重組腺病毒注射的瘤塊中影響癌基因及抑癌基因的表達(dá)，其中1、pAdeasy-1;2、pAdeasy-FHL3。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實施例僅僅是
用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。 本部分對本發(fā)明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為
實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡
可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作
方法是本領(lǐng)域公知的。
實施例1、 FHL3哺乳動物細(xì)胞表汰載體和FHL3重組腺病毒載體
(一)、方法 1、FHL3哺乳動物細(xì)胞表汰載體的構(gòu)建 按常規(guī)方法從乳腺cDNA文庫(購自美國Clontech公司)中PCR擴(kuò)增FHL3基因的完整編碼區(qū)序列，PCR引物為5' -CGGGATCCATGAGCG AGTCATTTGAC-3'和5' -GCTCTAGATTAGGGCCCTGCCTGGAA-3' ，PCR反應(yīng)條件為94。C 5min后，94。C lmin，60。C lmin，72。C lmin進(jìn)行30次循環(huán)，最后72°C 7min。分別用BamHI和Xba I酶(購自英國Biolabs公司)在37t:下酶切PCR產(chǎn)物和相應(yīng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體(pcDNA3，購自美國Invitrogen公司)，酶切后的PCR產(chǎn)物和載體用T4 DNA連接酶(購自美國Promega公司)在12-16t:下進(jìn)行連接，得到重組載體(其含有CMV啟動子/增強(qiáng)子、FHL3基因的完整編碼區(qū)序列、BGH polyA終止信號、氨芐青霉素抗性基因)，將該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，獲得轉(zhuǎn)化子。提取重組載體，用BamHI和Xba I酶酶切鑒定重組載體；DNA序列測定確定FHL3基因的完整編碼序列是否完全正確；Western印跡分析重組FHL3蛋白是否表達(dá)，即用常規(guī)方法將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用兔抗人FHL3抗體(購自美國ProteinTech公司)進(jìn)行反應(yīng)，然后用羊抗兔IgG抗體(購自美國Santa Cruz Biotech公司)進(jìn)行反應(yīng)和顯色。FHL3是本領(lǐng)域已知的。其中，F(xiàn)HL3基因的完整編碼區(qū)DNA序列以及FHL3基因編
碼的氨基酸序列參見下文序列表部分的描述。 2、FHL3重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 按常規(guī)方法PCR擴(kuò)增FHL3基因的完整編碼區(qū)序列，PCR引物為5' -GGGGTACCATGAGCGAGTCATTTGAC -3'和5' -CCCAAGCTT TTAGGGCCCTGCCTGGCT-3'，PCR反應(yīng)條件為94 °C 5min后，94t: lmin，6(TC lmin，72°C lmin進(jìn)行30次循環(huán)，最后72°C 7min。分別用Kpn I和Xbo I酶(購自英國Biolabs公司)在37。C下分別酶切PCR產(chǎn)物和相應(yīng)腺病毒表達(dá)載體(pShuttle-CMV，購自美國Stratagene公司)，酶切后的PCR產(chǎn)物和載體用T4 DNA連接酶(購自美國Promega公司)在12-16"C下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，獲得轉(zhuǎn)化子。提取重組載體，用Kpn I和Xhol酶酶切鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；DNA序列測定確定FHL3基因的完整編碼序列是否完全正確；Western印跡分析重組FHL3蛋白是否表達(dá)。 獲得上述重組質(zhì)粒后，用Pmel(購自英國Biolabs公司)在37。C下酶切含有FHL3基因完整編碼序列的pShuttle-CMV載體，切膠回收線性化的片段，回收產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化含有pAdEasy-l的BJ5183細(xì)胞(購自美國Stratagene公司)，涂卡那平板，37。C孵育16-20小時。觀察卡那平板，長出大、小兩種菌落，挑取較小的5個菌落于卡那抗性的培養(yǎng)基中，37t:，200rpm搖床中過夜，提取質(zhì)粒，PacI(購自英國Biolabs公司)在37"下酶切，0. 7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，含有3. 0kb或4. 5kb大小片段的即表明重組成功。由于BJ5183細(xì)胞目的載體產(chǎn)量較低，故將成功重組的載體常規(guī)轉(zhuǎn)化XL-10 Gold感受態(tài)細(xì)胞(購自美國Stratagene公司)以擴(kuò)增載體，涂卡那平板，37"C孵育16-20小時，挑取單克隆，所得菌液即為高擴(kuò)增目的載體的XL-10 Gold細(xì)胞。
3、FHL3重組腺病毒載體的包裝和鑒定 Pacl(購自英國Biolabs公司)酶切重組好的腺病毒載體以暴露出pShuttle-CMV載體上的左右末端重復(fù)序列(ITR)，等體積酚氯仿抽提以去除酶等雜質(zhì)，用乙醇沉淀回收DNA，測定濃度后，按公司提供的說明書用轉(zhuǎn)染試劑1 ipof ectamine 2000 (購自美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞(AD293細(xì)胞是購自美國Stratagene公司的一種哺乳動物細(xì)胞株，由HEK293細(xì)胞衍生而來，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁能力強(qiáng)，用于產(chǎn)生感染性病毒顆粒)，轉(zhuǎn)染前一天將AD293細(xì)胞接種至24孔板，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為70-80 % ，轉(zhuǎn)染后4-6小時換成5%血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)，即細(xì)胞腫脹、變圓、漂浮。繼續(xù)培養(yǎng)，待完全CPE時收獲病毒輕輕吹打使細(xì)胞脫壁，將細(xì)胞和上清一并收集于EP管中，在-S(TC和37°C之間反復(fù)凍融3次以釋放病毒，2500rpm離心15分鐘以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，作為種子病毒存于-8(TC備用。同時，快速CPE法測定種子病毒液的感染滴度，具體方法如下將AD293細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24小時，細(xì)胞密度達(dá)到90%時，細(xì)胞數(shù)為5 X 105細(xì)胞/孔，將各孔中的培養(yǎng)液吸出，每孔加入0. 5ml的101至109倍稀釋的病毒液(用完全培養(yǎng)基稀釋)，2小時后換成正常的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時后觀察CPE情況，選出發(fā)生100% CPE的最高稀釋倍數(shù)，用以下公式計算病毒滴度
》丄 a (5xl()5細(xì)胞/孔)xl0x稀釋倍數(shù)
感染滴度(pfuZml)--— -
病毒液體積 取上述病毒液感染ZR75-1等乳腺癌細(xì)胞，感染強(qiáng)度(multiplicityofinfection,簡寫為MOI)為50個噬斑形成單位(plaque forming unit,簡寫為pfu) /細(xì)胞，前一天將細(xì)胞接種于24孔板，感染時細(xì)胞密度為80-90% ，感染后2小時換成無病毒的新鮮培養(yǎng)基，48小時后收集細(xì)胞，用兔抗人FHL3的特異性抗體(購自美國ProteinTech公司)Western免疫印跡方法檢測FHL3基因的表達(dá)情況。表達(dá)成功后進(jìn)行下一步的擴(kuò)增與純化。
4、FHL3重組腺病毒載體的擴(kuò)增與純化 將AD293細(xì)胞接種于15cm平皿，待細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時，加入病毒液，M0I為2-5pfu/細(xì)胞。感染48小時左右細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE時，棄上清，用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞凍存于-80°C 。累積到50-60個平皿時統(tǒng)一純化病毒。 將收集的AD293細(xì)胞于-8(TC和37"之間反復(fù)凍融3次，2500rpm離心15分鐘去除細(xì)胞碎片。配制CsCl密度梯度溶液取30g的CsCl，加PBS(每升水溶液中含NaCl 8g、KC1 0. 2g、Na2HP04 1. 44g、KH2P040. 4g， pH7. 4)至終體積42. 5ml，得密度為1. 5g/ml的CsCl溶液；取15mll. 5g/ml的CsCl，加PBS至終體積21ml，得密度為1. 35g/ml的CsCl溶液；取llml的1. 5g/ml的CsCl，加PBS至終體積20ml，得密度為1. 25g/ml的CsCl溶液。依次將0. 5ml的1. 5g/ml的CsCl溶液、2. 5ml的1. 35g/ml的CsCl溶液、2. 5ml的1. 25g/ml的CsCl溶液加入到12ml超速離心管中，將待純化病毒液加于各管CsCl梯度液上，35000rpm， l(TC，離心1. 5小時，在1. 35g/ml的CsCl溶液和1. 25g/ml的CsCl溶液之間可觀察到白色霧狀病毒帶，收集病毒帶，并與1. 35g/ml的CsCl溶液混合，35000rpm， l(TC ，離心5. 5小時，進(jìn)一步純化病毒，以Hanks液為透析液在4t:下透析病毒，每2小時更換一次透析液，共更換5次，取出純化的病毒液，即含有FHL3重組腺病毒載體的溶液，加無菌甘油至終濃度為10%，分份包裝，在-7(TC下保存。
5、FHL3重纟目腺病毒純度和滴度的測l定
取24 ill純化的病毒，加入84 ill的PBS禾P 12 的10% SDS，混勻，以108 的PBS加12iU的0% SDS為空白對照，測定260nm和280nm波長處的光吸收值，即0D260nm和OD，，值，據(jù)此估算病毒的純度。病毒的純度=0026。 值/0028。 值，該比值> 1.3時，表明病毒純度較高。然后計算病毒顆粒滴度(VP/ml)。以1個0026。 值相當(dāng)于1. 1X10"病毒顆粒(VP)計算病毒顆粒滴度。病毒顆粒滴度(VP/ml) = OD邪?？е礨I. 1X1012X稀釋倍數(shù)。
有限稀釋法測定病毒的感染滴度(IU/ml):取10 iil純化的病毒，加至990 iil含有5% FBS的DMEM培養(yǎng)基中(102稀釋)，混勻后取出100 y l，稀釋于900 y 1含有5% FBS的匿EM培養(yǎng)基中(103稀釋)，以此類推直到1012稀釋。同時將AD293細(xì)胞接種于96孔板，50 ii 1/孔，細(xì)胞數(shù)為1 X 104細(xì)胞/孔。然后加入50 iil的105至1012稀釋的病毒液，共做8個稀釋梯度，每個梯度做10個復(fù)孔。感染后第10至12天觀察CPE，計數(shù)發(fā)生CPE的最高稀釋倍數(shù)下的CPE孔數(shù)，根據(jù)以下公式計算病毒的感染滴度
發(fā)生CPE的最高稀釋倍數(shù)下的孔數(shù)
感染滴度(IU/ml戶-x稀釋倍數(shù)
此稀釋倍數(shù)下感染病毒液總體積 6、哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染在HEK293細(xì)胞(HEK293細(xì)胞是購自美國ATCC細(xì)胞庫的一種永生化的人胚腎細(xì)胞，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁能力差)轉(zhuǎn)染前24h，用含10X新生牛血清的匿EM培養(yǎng)基將細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中。接種細(xì)胞密度以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)90%為宜。按公司提供的說明書用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
7、 Western免疫印跡分析 (1) SDS-PAGE電泳將變性的細(xì)胞總蛋白離心后以每孔20 y g的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電壓120V，約1. 5h。
(2)轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；電壓15V，轉(zhuǎn)移約2h。
(3)封閉5%脫脂奶粉(用TBST溶液配制，TBST溶液為每升水溶液中含Tris2. 42g、 NaCl 8g、 Tween-2010ml， pH7. 6)室溫封閉硝酸纖維素膜lh或4。C封閉過夜。
(4) —抗結(jié)合在硝酸纖維素膜上，加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的一抗(兔抗人FHL3抗體，購自美國ProteinTech公司)，室溫輕搖lh， TBST溶液洗膜3次，每次7min。 (5) 二抗結(jié)合在硝酸纖維素膜上，加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG(羊抗兔IgG抗體，購自美國Santa Cruz Biotech公司)，室溫輕搖lh，TBST溶液洗膜3次，每次7min。 (6)顯影按公司提供的說明(美國Pierce公司)，用化學(xué)發(fā)光法顯色5min，壓片顯影。
( 二 )結(jié)果 1、FHL3哺乳動物細(xì)朐表汰載體和FHL3重纟目腺病毒載體的鑒定
FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體和FHL3重組腺病毒載體經(jīng)酶切、DNA序列測定表明，插入到載體中的FHL3基因的完整編碼區(qū)序列完全正確，即FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體(pcDNA3-FHL3)經(jīng)BamHI和Xbal酶切后，可切出大小約840bp的FHL3完整編碼區(qū)序列，而相應(yīng)空載體(pcDNA3)不能切出此條帶(參見圖1);類似地，F(xiàn)HL3重組腺病毒載體(pAdeasy-FHL3)經(jīng)PacI酶切后，可切出大小約4. 5kb的條帶(參見圖2)，而相應(yīng)的空載體(pAdeasy-l)不能切出此條帶，表明已重組成功。
2、FHL3重纟目腺病毒的純度和滴度測l定 快速CPE法測定FHL3重組腺病毒和相應(yīng)對照重組腺病毒的滴度分別為4. 2X 108pfu/ml和4. OX 108pfu/ml。 FHL3重組腺病毒和相應(yīng)對照重組腺病毒經(jīng)擴(kuò)增純化后的純度分別為1. 33和1. 34，說明純度較高。純化后的重組腺病毒和相應(yīng)對照重組腺病毒的顆粒滴度分別為1. OX 1012VP/ml和1. 2X 10"VP/ml，用有限稀釋法測定的感染滴度分別為3. 2X 10lclIU/ml和4. 3X 1010IU/ml。 3、FHL3哺gUM勿細(xì)朐表汰載體或重會目腺病毒介導(dǎo)的FHL3蛋白的表汰將FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞或用50M0I重組腺病毒感染人
乳腺癌ZR75-1細(xì)胞，用FHL3抗體進(jìn)行Westernblot，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染或感染后的細(xì)胞均能表
達(dá)FHL3蛋白(參見圖3，其中代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染ZR75-1細(xì)胞后能高表達(dá)
FHL3， FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后有類似結(jié)果，但數(shù)據(jù)未列出)。 實施例2、 FHL3抑制體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)朐的牛長( 一 )方法 用結(jié)晶紫實驗測定FHL3對多種腫瘤細(xì)胞生長的影響，步驟如下用0. 25%胰酶(購自美國Sigma-Aldrich公司)消化多種腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞株(MCF7、 ZR75-1)、肝癌細(xì)胞株(H印G2、 S匪C7721)、肺癌細(xì)胞株(H460)。細(xì)胞計數(shù)后，稀釋至合適的濃度，將0. 5ml細(xì)胞液放入24孔板中，使每孔中的細(xì)胞數(shù)約為10， 000個。按實施例1中所述方法將FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染這些腫瘤細(xì)胞或用20-100M0I的FHL3重組腺病毒感染這些腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)1-4天后，除去培養(yǎng)基，每孔加入0. 5ml的1 %戊二醛(固定液)，靜止15-20min，去掉戊二醛。每孔加入O. 5ml結(jié)晶紫(購自美國Sigma-Aldrich公司)，放置15min (結(jié)晶紫儲存于室溫)，用自來水浸沒并沖洗幾次，蒸餾水室溫浸沒15min，棄盡蒸餾水，在空氣中干燥24孔(需要時過夜)，每孔加入0. 5ml的sorenson's溶液(每升水溶液中含有:枸櫞酸鈉8. 967g、0. IN HC1 0. 195L、90%乙醇0. 5L)，在水平搖床上搖動30min，每孔取100 iil至96孔板，在590nm的波長處測定OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞相對生長速率。
(二)結(jié)果 結(jié)果表明，F(xiàn)HL3的表達(dá)能抑制上述所有腫瘤細(xì)胞的生長(參見圖4，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染乳腺癌細(xì)胞株MCF7、肝癌細(xì)胞株H印G2和肺癌細(xì)胞株H460能抑制這些細(xì)胞的生長，其它細(xì)胞株有類似結(jié)果，但數(shù)據(jù)未列出)。
實施例3、 FHL3抑制多種腫瘤細(xì)胞的錨定不依賴生長
( 一 )方法 用軟瓊脂實驗測定FHL3對腫瘤細(xì)胞錨定不依賴生長的影響。首先，按實施例1中所述方法將FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞或用20-100M0I的FHL3重組腺病毒感染腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞株(MCF7)、肝癌細(xì)胞株(H印G2)、肺癌細(xì)胞株(H460)，然后采用60mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中加入3ml含0. 7%瓊脂的DMEM培養(yǎng)基(購自美國Invitrogen公司)，凝固后在其上加入3ml含上述20， 000個腫瘤細(xì)胞和0. 25%瓊脂的DMEM培養(yǎng)基，每組細(xì)胞設(shè)3個平行樣，培養(yǎng)3周后在倒置顯微鏡下計數(shù)每組細(xì)胞的集落形成數(shù)。
(二)結(jié)果
結(jié)果表明，F(xiàn)HL3的表達(dá)能抑制上述所有腫瘤細(xì)胞的集落形成(參見圖5，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染肝癌細(xì)胞株H印G2能抑制細(xì)胞的錨定不依賴生長，其它細(xì)胞株有類似結(jié)果，但數(shù)據(jù)未列出)。 實施例4、 FHL3抑制裸鼠腫瘤細(xì)朐'的牛長
( 一 )方法 按實施例1中所述方法將FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株H印G2。
將1 X 107個上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別接種于5周齡雌性BALB/c裸鼠背部右后側(cè)，共分4組，即FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞組和相應(yīng)的空載體轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞組；注射FHL3重組腺病毒的腫瘤細(xì)胞組和注射相應(yīng)對照病毒的腫瘤細(xì)胞組。每組各10只裸鼠。對于腺病毒組而言，待腫瘤生長到長約lcm時，在腫瘤部位直接注射腺病毒，注射劑量為1X1(TVP。觀察接種部位有無滲出、腫瘤生長及裸鼠狀況。測量腫瘤的最大直徑L(cm)和最小直徑D(cm)，按如下公式計算各組腫瘤體積V(cm3)的大小腫瘤體積(cm3) =L2XD Xl/2。待細(xì)胞移植約10周，處死各組動物，取部分瘤塊，用冰冷的0. 9%生理鹽水沖洗干凈，放入5ml離心管中，立即加入lml預(yù)冷至0t:的裂解液(1XPBS，1% NP-40，0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS， 1/1000的蛋白酶抑制劑)，在冰浴中勻漿，按實施例1中的Western免疫印跡方法分析瘤塊中FHL3蛋白的表達(dá)。
(二)結(jié)果 裸鼠開始出現(xiàn)瘤塊后，每周測量瘤塊大小，計算瘤塊體積。結(jié)果表明，F(xiàn)HL3能抑制裸鼠中上述腫瘤細(xì)胞的生長(參見圖6，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒注射能抑制肝癌細(xì)胞株H印G2植入的腫瘤生長)。Western免疫印跡分析表明，注射FHL3重組腺病毒的瘤塊中高表達(dá)FHL3蛋白，而注射相應(yīng)對照腺病毒的瘤塊中低表達(dá)FHL3蛋白(參見圖7)。
實施例5、FHL3能抑制腫瘤細(xì)胞中癌基因的表達(dá)而促進(jìn)抑癌基因的表達(dá)
( 一 )方法 將1 X 106個細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將FHL3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株或用100M0I的FHL3重組腺病毒感染腫瘤細(xì)胞株，這些腫瘤細(xì)胞株包括乳腺癌細(xì)胞株MCF7和ZR75-1、肝癌細(xì)胞株H印G2和S匪C7721、肺癌細(xì)胞株H460。將這些腫瘤細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時后，收集細(xì)胞，按實施例1中的方法分別用FHL3抗體(兔抗人FHL3抗體，購自美國ProteinTech公司)、p21(兔抗人p21抗體，購自美國Santa CruzBiotech公司)和pl5抑癌蛋白抗體(兔抗人pl5抗體，購自美國Santa Cruz Biotech公司)、c-myc癌蛋白抗體(鼠抗人c-myc抗體，購自美國Santa Cruz Biotech公司)進(jìn)行Western免疫印跡分析，檢測上述腫瘤細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。 另外，取實施例4中的裸鼠腫瘤組織，用Western免疫印跡分析檢測腫瘤組織中p21和c-myc蛋白的表達(dá)情況。
(二)結(jié)果 結(jié)果表明，F(xiàn)HL3均在上述腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，F(xiàn)HL3的過量表達(dá)抑制了 c-myc癌蛋白的表達(dá)，但升高了 p21和p15抑癌蛋白的表達(dá)(參見圖9，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染肝癌細(xì)胞株H印G2后FHL3、 c-myc、 p21和p15蛋白的表達(dá)情況，其它細(xì)胞株有類似結(jié)果，但數(shù)據(jù)未列出)。 另外，將裸鼠腫瘤組織用Western免疫印跡分析檢測p21和c-myc蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果與上述體外實驗結(jié)果一致(參見圖10)。 盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。
序列表
〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所〈120〉FHL3在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途〈210〉1〈211〉843〈212〉DNA〈220〉
〈223〉FHL3基因的完整編碼區(qū)〈400〉1
60
120
180
240
300
360
420
■
540
600
660
720
780
gctgagtgccttccacgaggacctgccaggtgctccgctt
tttgtgcccgcgctgcgccctggcatcgagacctcccgggtgcagcagctgaccgacact
catttgactggcggcccctaagcagcttatgctgcttccg
gtggggagacagcactgctt
3C33gggtgC
gctgcagc肌aatgtctggtatg肌gatccgcaagcgccc
ggC3CC3C肌
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aacgagtccctgctatgacatcg叫g(shù)gagctgccagcgctgactgctactgggtcccggaggctgtg肌cgtgccctgct
C3gggtgg3g
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caagtacatccaacacctgtagaccgccattgaacccttcttcctcgcagtggaggccagctcccgttctgtttgctccttgatcagccggcagcagttctgcacctaaggtcctttgaacctggtgggc
cagggcttcg taccggatgg agaccaagtg ctctgccagg gctgtagcca ggcagggccc840 ta a
843 〈210>2 〈211>280 〈212>PRT 〈220〉 〈223〉FHL3基因編碼的氨基酸序列 〈400>2 MSESFDCAKC NESLYGRKYI QTDSGPYCVP CYDNTFANTC AEC亂IGHD SRELFYEDRH60 FHEGCFRCCR CQRSUVDEPF TCQDSE1XCN DCYCSAFSSQ CSACGETVMP GS肌EYGGQ120 TWHEHCFLCS GCEQPLGSRS FVPDKGAHYC VPCYENKFAP RCARCSKTLT QGGVTYRDQP180 WHRECLVCTG CQTPLAGQQF TSRDEDPYCV ACFGELFAPK CSSCKRPIVG LGGGKYVSFE240 DRHWHHNCFS CARCSTSLVG QGFVPDGDQV LCQGCSQAGP280
權(quán)利要求
FHL3在制備用于調(diào)節(jié)癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物用于抑制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)癌基因的表 達(dá)和/或促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)抑癌基因的表達(dá)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的哺乳動物細(xì)胞選自在體細(xì)胞和離體細(xì)胞。
4. FHL3在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述的腫瘤選自惡性腫瘤，包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì) 胞肺癌)、卵巢癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌(包括鱗狀細(xì)胞癌)；中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括但不限于星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；以及 其他腫瘤，包括但不限于黑素瘤。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的腫瘤選自乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸 癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌。
7. —種表達(dá)載體，其含有編碼FHL3的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其中所述的載體選自質(zhì)粒、病毒和噬菌體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述的載體是病毒。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，其中所述的載體是腺病毒。
11. 權(quán)利要求7至10任一項所述的表達(dá)載體在制備用于調(diào)節(jié)癌基因和/或抑癌基因在 哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途。
12. 權(quán)利要求7至IO任一項所述的表達(dá)載體在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞生長的 藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及FHL3在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。具體地說，本發(fā)明涉及FHL3在制備用于調(diào)節(jié)癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途，以及FHL3在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及一種含有編碼FHL3的核苷酸序列的表達(dá)載體，以及所述表達(dá)載體在制備用于調(diào)節(jié)癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的藥物中的用途，和表達(dá)載體在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。本發(fā)明的表達(dá)載體能夠有效抑制多種人類腫瘤細(xì)胞的生長，并且可以通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)從而抑制多種人類腫瘤細(xì)胞的生長。
文檔編號A61K48/00GK101744848SQ20081018243
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者丁麗華, 嚴(yán)景華, 葉棋濃, 楊曉, 牛暢, 秦璽, 程龍, 黃翠芬 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所